ES2628048T3 - Composición de polisacárido sulfatado - Google Patents
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Abstract
Composición que comprende al menos un polisacárido sulfatado y al menos un ingrediente alimentario para su utilización en el tratamiento o la prevención de una infección provocada por al menos un microsporidio en ser humano o animal.
Description
DESCRIPCION
Composicion de polisacarido sulfatado
5 [0001] La invencion se refiere a una composicion a base de al menos un polisacarido sulfatado,
concretamente derivado de un alga, y asociado a al menos un ingrediente alimentario para una utilizacion en el tratamiento o la prevencion de una infeccion provocada por un microsporidio en ser humano o animal.
Esta posee propiedades utiles como agente antiparasitario en ser humano o animal; para el tratamiento o la prevencion de una infeccion provocada por al menos un microsporidio en ser humano o animal; en particular para el 10 tratamiento o la prevencion en abeja de una infeccion provocada por el microsporidio Nosema, preferentemente Nosema ceranae o Nosema apis, o tambien para estimular las defensas inmunitarias de la abeja.
[0002] La invencion tambien se refiere a una composicion que comprende un polisacarido sulfatado para una utilizacion como agente antiparasitario en ser humano o animal en el tratamiento o la prevencion de al menos una
15 infeccion causada por al menos un microsporidio en ser humano o animal, preferentemente por el microsporidio Nosema en abeja. La invencion tambien se refiere a una composicion que comprende un polisacarido sulfatado para una utilizacion en un procedimiento para tratar o prevenir una infeccion causada por al menos un parasito en abeja. La descripcion tambien se refiere a un procedimiento de produccion de miel en presencia de una infeccion causada por al menos un parasito, que comprende la administracion a abeja de una composicion segun la invencion. La 20 descripcion tambien se refiere a un procedimiento para mantener la polinizacion de las plantas por abejas infectadas por al menos un parasito, que comprende la administracion de una composicion segun la invencion. La invencion tambien se refiere a una composicion para utilizacion en un procedimiento para estimular las defensas inmunitarias en abeja, que comprende la administracion de una composicion segun la invencion. El documento US 2003/0181416 se refiere a un procedimiento de tratamiento de infeccion microbiana de mamlferos por medio de un polisacarido 25 sulfatado.
[0003] El documento JP 11080003 describe un agente de tratamiento antiparasitario que comprende un polisacarido sulfatado. El documento JP 11080003 describe de manera generica fucoidano, ramnano sulfatado y carragenano como polisacaridos.
30
[0004] El documento Chen et al (Growth-inhibitory effect of a fucoidan from brown seaweed Undaria pinnatifida on Plasmodium parasites de Chen et al, publicado en septiembre de 2008) presenta los resultados de un estudio del efecto antiparasitario sobre Plasmodium falciparum y Plasmodium berghei de tres fracciones de fucoidano derivadas de un alga parda, Undaria pinnatifida.
35
[0005] El documento WO 02/02189 describe la utilizacion de polisacaridos sulfatados, concretamente de celulosa sulfatada o de dextrano sulfatado, en tratamientos antiparasitarios. Estos polisacaridos pueden administrarse en forma de capsulas comestibles o tambien en forma de crema o de gel.
40 [0006] El documento US 2011/0172156 se refiere a la administracion de polisacaridos sulfatados para
mejorar la coagulacion sangulnea en un paciente. Estos polisacaridos pueden extraerse de algas pardas.
[0007] El documento WO 2009/144711 describe una composicion nutritiva o cosmetica que comprende un metal y un polisacarido sulfatado derivado de una microalga roja. Esta composicion tiene el objetivo de permitir la
45 administracion del metal que contiene. Esta es util para tratamientos nutricionales o dermatologicos y posee propiedades antimicrobianas.
[0008] El documento PT 103983 describe la utilizacion de polisacaridos sulfatados como agentes antivirales o antibacterianos.
50
[0009] Ninguno de estos documentos se refiere a la prevencion o el tratamiento de una infeccion provocada por un microsporidio en ser humano o animal.
[0010] Los microsporidios, organismos eucariotas unicelulares emparentados con los hongos, son parasitos 55 intracelulares obligatorios que forman esporas de pequeno tamano que pueden persistir en el medio ambiente
durante muchos meses. Entre las 1300 especies catalogadas actualmente, la mayorla parasita a artropodos y peces. Ciertos microsporidios estan, de este modo, en el origen de perdidas economicas consiguientes en acuicultura, concretamente en la crla de salmones o de camarones. Varias especies son tambien responsables de diversas infecciones en mamlferos incluyendo en el ser humano.
[0011] La nosemosis, cuyo agente causante es el microsporidio Nosema sp., es una de las enfermedades que aparece con mayor frecuencia en abejas adultas. Este microsporidio ataca a las celulas del epitelio intestinal del insecto y provoca una nosemosis aguda caracterizada por restos de diarrea en las colmenas. Puede reducir la
5 esperanza de vida de las colonias. Recientemente, Nosema ceranae un microsporidio parasito de la abeja asiatica (Apis cerana), ha sido detectado en colonias de abejas europeas (Apis mellifera) que presentan signos de debilitamiento (Higes et al, Nosema ceranae, a new microsporidian parasite in honeybees in Europe. J Invertebr Pathol (2006), 92(2), 93-95; Cox-Foster et al, A metagenomic survey of microbes in honey bee colony collapse disorder. Science (2007) 318(5848), 283-287).
10
[0012] Dada la importancia ecologica (biodiversidad), agronomica (rendimiento agricola) y economica (apicultura) que reviste la abeja debido a sus actividades de polinizacion y de produccion de miel, la aparicion de este microorganismo ha planteado numerosas preocupaciones en la comunidades cientlfica y aplcola.
15 [0013] Por otro lado, la infeccion por Nosema ceranae provoca un descenso de la inmunidad en abeja
(Antunez et al, Immune suppression in the honey bee (Apis mellifera) following infection by Nosema ceranae (Microsporidia). Environ Microbiol (2009) 11 (9), 2284-2290), haciendole, de este modo, mas susceptible a las demas infecciones.
20 [0014] La principal molecula utilizada en tratamiento contra la nosemosis es la fumagilina. Sin embargo, esta
molecula ha sido prohibida recientemente en numerosos palses europeos, incluyendo Francia.
[0015] De este modo, la busqueda de nuevas moleculas resulta necesaria para identificar tratamientos antiparasitarios eficaces, sin efecto perjudicial para el huesped parasitado y que no generan residuos peligrosos en
25 los productos alimentarios derivados de la colmena.
[0016] La composicion utilizada segun la invencion permite aportar una solucion a todos o parte de estos problemas o inconvenientes del estado de la tecnica.
30 [0017] De este modo, la invencion proporciona una composicion que comprende al menos un polisacarido
sulfatado y al menos un ingrediente alimentario, para su utilizacion en el tratamiento o la prevencion de una infeccion provocada por un microsporidio en ser humano o animal.
[0018] De este modo, el ingrediente alimentario de la composicion segun la invencion corresponde a la 35 porcion de esta composicion que excluye el polisacarido sulfatado.
[0019] De manera ventajosa, la concentracion en peso de polisacarido sulfatado en la composicion segun la invencion va del 0,01 al 2 %, preferentemente entre el 0,1 y el 1 %.
40 [0020] De manera preferida, la composicion segun la invencion comprende un polisacarido sulfatado que es
de origen natural.
[0021] De manera ventajosa, la composicion segun la invencion puede comprender al menos un polisacarido sulfatado derivado de una macroalga, de una microalga o de una cianobacteria o tambien una mezcla de
45 polisacaridos sulfatados derivados de una macroalga, de una microalga o de una cianobacteria.
[0022] Como ejemplos de polisacaridos sulfatados de origen natural, la composicion segun la invencion comprende preferentemente al menos un polisacarido sulfatado derivado de una macroalga, seleccionada preferentemente entre macroalgas rojas, macroalgas verdes o macroalgas pardas.
50
[0023] De manera mas preferida, la composicion segun la invencion comprende al menos un polisacarido sulfatado derivado
- de una macroalga roja, concretamente seleccionada entre las rodoflceas productoras de agar, de carragenanos, de 55 porfiranos, de funoranos o de galactanos sulfatados complejos, preferentemente de los generos Gracilaria,
Halymenia, Gelidium, Pterocladia, Acanthopeltis, Campylaephora, Ceranium, Euchema , Chondrus, Porphyra, Laurencia, Furcellaria, Gloiopeltis e Iridea;
- de una macroalga verde, concretamente seleccionada entre las cloroflceas que producen polisacaridos de tipo ulvano, preferentemente del genero Ulva;
- de una macroalga parda, concretamente seleccionada entre las feoflceas productoras de fucanos sulfatados, preferentemente de los generos Fucus, Aschophyllum o Cladosiphon.
[0024] Los polisacaridos derivados de las macroalgas rojas estan construidos preferentemente basandose en 5 una sucesion lineal de unidades de 3-b-galactopiranosa y 4-a-galactopiranosa que se alternan regularmente. La
unidad de b-galactosa pertenecen siempre a la serie D, mientras que la unidad a-galactosa es de configuracion D en los carragenanos y L en los agarocoloides (por ejemplo agar, porfirano, funorano). Por otro lado, una parte de los residuos 4-a-galactopiranosas puede existir en forma de 3,6-anhidrogalactosa. La forma 3,6-anhidrogalactosa se obtiene mediante una elimination del ester de sulfato portado por el carbono 6 de la unidad de a-galactosa unido en 10 4, bajo la action de galactosa-6-sulfurilasas durante la bioslntesis o mediante un tratamiento alcalino. Ciertos grupos hidroxilo de estas unidades galactopiranosa pueden estar sulfatados, metilados, piruvilados o incluso sustituidos por un monosacarido
[0025] Los galactanos sulfatados derivados de macroalgas rojas pueden estar representados por la formula 15 (I) (Delattre et al, Galactans: An Overview of their Most Important Sourcing and Applications as Natural
Polysaccharides. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2011, 54: 1075-1092):
20 en la que:
25
Ra2 representa Ra4 representa Ra6 representa Rb2 representa Rb3 representa Rb6 representa
un atomo de hidrogeno o SO3';
un atomo de hidrogeno, SO3' o acido piruvico;
un atomo de hidrogeno, un grupo metilo, SO3' o acido piruvico;
un atomo de hidrogeno, un grupo metilo o SO3';
un atomo de hidrogeno;
un atomo de hidrogeno o SO3-.
[0026]
Como ejemplos de macroalgas verdes, pueden mencionarse las especies que pertenecen a los
30 generos Ulvella, Ulva, Caulerpa, Codium, Bryopsis.
[0027] En general, tres familias de polisacaridos componen los polisacaridos matriciales de algas verdes.
[0028] La primera, mayoritaria, esta constituida por un xilorramnoglucuronano sulfatado designado por el 35 termino ulvano.
[0029] Los pollmeros de este tipo son solubles en agua y se distinguen de los otros polisacaridos extraldos
de algas por su importante contenido de ramnosa (del 30 al 50 %), de acido glucuronico (del 10 al 20 %) y de sulfato (del 16 al 19 %) (Lahaye et al, Structure and function properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds; 40 Biomacromoleculs 8 (2007): 1765-1774; Lahaye, NMR spectroscopic characterization of oligosaccharides from two
Ulva rigida ulvan samples (Ulvales, Chlorophyta) degraded by a lyase. Carbohydrate Research (2008) 314: 1-12). En la especie Ulva lactuca, los principales motivos estan compuestos por ulvanobiuronato-3-sulfato de tipo A que comprende a-L-ramnosa-3-sulfato unido al acido p-D-glucuronico mediante un enlace de tipo (1,4) y ulvanobiuronato-3-sulfato de tipo B que comprende a-L-ramnosa-3-sulfato unido al acido a-L-iduronico mediante un 5 enlace de tipo (1,4) (McKinnel et al, The acid polysaccharide from the green seaweed, Ulva lactuca. Journal of Chemical Society (1962) 398-399.; Quemener et al, Sugar determination in ulvans by a chemical-enzymatic method coupled to high performance anion exchange chromatography. Journal of Applied Phycology (1997) 9: 179-188). Estos motivos derivados de ulvano han sido completados recientemente mediante la identificacion de estructuras de tipo ulvanobiosas (Robic, A., Rondeau-Mouro, C., Sassi, J.F., Lerat, Y., Lahaye M. (2009). Structure and interactions 10 of ulvan in the cell wall of the marine green algae Ulva rotundata (Ulvales, Chlorophyceae). Carbohyd. Pol. 10: 210216).
[0030] Los ulvanos pueden estar representados por las formulas A3s, B3s, U3s y U23s:
[0031] La segunda familia de polisacaridos esta compuesta por D-xiloglucanos unidos en p-(1,4) y por D- glucuronanos unidos en b-(1,4). Estos compuestos tambien pueden estar representados mediante las formulas A3s,
20 B3s, U3s y U2'3s.
[0032] La ultima familia esta representada por «celulosa» amorfa, que contiene residuos de xilosa. En las algas verdes de del orden de las Cladophorales y de las Codiales, tambien se pueden encontrar xiloarabinogalactanos sulfatados. Estos son pollmeros compuestos por galactosa, por arabinosa y por xilosa.
25 Constan de aproximadamente el 17 % de sulfato. Realmente, no hay ninguna unidad repetitiva, sino mas bien porciones que constan de bloques de (1,4)-L-arabinosas, separadas por unidades de D-galactosas. Todas las unidades de D-xilosas y una parte de las unidades de D-galactosas estan en posicion terminal.
[0033] De manera ventajosa, la macroalga parda se selecciona entre las feoflceas productoras de fucanos 30 sulfatados, preferentemente del genero Fucus, Aschophyllum o Cladosiphon.
[0034] Los fucanos representan un conjunto de polisacaridos sulfatados que comprenden mayoritariamente L-fucosa pero tambien otras osas como galactosa, manosa, xilosa y acidos uronicos (Melo et al, Isolation and characterization of soluble sulphated polysaccharide from the red seaweed Gracilaria cornea. Carbohydrate
35 Polymers (2002) 49: 491-498) cuyo contenido es inferior al 10 % (Berteau et al, Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide. Glycobiology (2003) 13 (6): 29-40).
[0035] Los fucanos extraldos de las algas del orden de las Fucales (Fucus sp., Ascophyllum sp.) son
polisacaridos altamente ramificados (Berteau et al 2003; Patankar et al, 1993; Bilan et al, 2002, 2004, 2006) formados por una cadena principal compuesta por L-fucosas unidas en a-(1,3) o en b-(1,4) y sustituidos de forma variable por 1 o 2 no azucares (sulfato o acetato) en el C2, el C3 o el C4. Estos son homofucanos (Chevolot et al, 1999, 2001; Bilan et al, 2002, 2004, 2006; Chizhov et al, 1999). Las ramificaciones pueden ser monosacarldicas 5 (Chizhov et al, A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum. Carbohydrate Research (1999) 320: 108119)), trisacarldicas (Bilan et al, A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus. Carbohydrate Research (2004), 339: 511-517) o tetrasacarldicas (Bilan et al, Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens. Ag. Carbohydrate Research (2002) 337: 719-730). Finalmente, la presencia de xilosa o galactosa en pequena cantidad pudo ser detectada pero no se pudo determinar su ubicacion (Bilan et al, 2002).
10
[0036] Como otro polisacarido de origen natural, la composition segun la invention tambien puede comprender preferentemente un polisacarido sulfatado derivado de una microalga, seleccionada preferentemente entre las microalgas rojas o las cianobacterias.
15 De manera tambien preferida, la composicion segun la invencion comprende al menos un polisacarido sulfatado derivado
- de una microalga roja seleccionada entre las especies que pertenecen al genero Porphyridium o al genero Rhodella;
20 - de una cianobacteria seleccionada entre las especies que pertenecen al genero Arthospira, como Arthospira platensis.
[0037] Los exopolisacaridos producidos por microalgas rojas marinas se describen principalmente en las especies que pertenecen a los generos Porphyridium y Rhodella. Estos polisacaridos son heteropollmeros
25 sulfatados de forma variable y compuestos por monosacaridos neutros (xilosa, glucosa, galactosa, manosa, arabinosa, fucosa), por monosacaridos metilados (3-O-metil xilosa, 3-O y 4-O-metil galactosa), por acidos uronicos (acido glucuronico) y por acidos uronicos metilados (2-O-metil-acido glucuronico). Los polisacaridos de las diferentes especies presentan varios tipos de enlaces glucosldicos pero tienen como punto comun la presencia de bloques constitutivos constituidos por un disacarido calificado de acido aldobiouronico (Arad et al, Red microalgal cell-wall 30 polysaccharides: biotechnological aspects. Current opinion in Biotechnology (2010) 21: 358-364; Capek et al, The extracellular proteoglycan produced by Rhodella grisea. International Journal of Biological macromolecules (2008) 43, 390-393).
[0038] Las cianobacterias producen exopolisacaridos de estructuras muy complejas y caracterizadas por la 35 presencia de acidos uronicos (acidos glucuronico y galacturonico) y de grupos sulfato que confieren una naturaleza
anionica al polisacarido. Se caracterizan ademas por la presencia de importantes tasas de grupos acetato, de fracciones peptldicas y de desoxi-monosacaridos. La mayor parte de los exopolisacaridos descritos en las cianobacterias estan compuestos por al menos 6 monosacaridos diferentes y, actualmente, se han podido identificar 12 monosacaridos en los EPS de cianobacterias. Entre las hexosas, se encuentran glucosa, galactosa, manosa y 40 fructosa. Las pentosas estan, por su parte, representadas principalmente por ribosa, xilosa y arabinosa, mientras que las desoxiosas identificadas son fucosa, ramnosa y metil ramnosa. En ciertos casos, se ha descrito la presencia de monosacariodos modificados como N-acetil glucosamina, 2,3-O-metil ramnosa y 3-O-metil glucosa. Estos diferentes monosacaridos estan unidos por una amplia gama de enlaces glucosldicos (Pereira et al, Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their 45 biosynthesis and assembly. FEMS Microbiol. Rev. (2009) 33: 917-941).
[0039] De manera tambien ventajosa, la composicion segun la invencion puede comprender al menos un polisacarido sulfatado obtenido mediante modification qulmica de un polisacarido. El polisacarido se obtiene entonces despues de haber sido modificado por via qulmica.
50
[0040] De manera habitual, la composicion segun la invencion comprende al menos un polisacarido sulfatado cuya tasa de sulfatacion en peso es superior o igual al 5 %, preferentemente esta tasa va del 5 al 50 %, ventajosamente del 5 al 30 %.
55 [0041] La composicion segun la invencion puede comprender cantidades relativamente grandes de al menos
un polisacarido sulfatado.
Generalmente, la concentration masica de polisacarido sulfatado en la composicion segun la invencion va de 50 a 1 000 mg/ml, preferentemente de 100 a 1 000 mg/ml, ventajosamente de 100 a 200 mg/ml.
[0042] La composicion segun la invencion comprende tambien al menos un ingrediente alimentario combinado con al menos un polisacarido sulfatado.
[0043] De manera ventajosa, la concentracion en peso del ingrediente alimentario en la composicion segun la 5 invencion va del 98 % al 99,99 %.
[0044] De manera general, el ingrediente alimentario de la composicion segun la invencion es un ingrediente que puede utilizarse en una composicion alimentaria destinada al ser humano o un animal. Este ingrediente alimentario responde concretamente a las condiciones de seguridad y de no toxicidad vinculadas a dicha utilizacion.
10 De manera preferida, la composicion segun la invencion comprende al menos un ingrediente seleccionado entre un agente proteico alimentario, un azucar incluyendo sacarosa, miel o una de sus mezclas.
[0045] De manera ventajosa, la composicion segun la invencion comprende un ingrediente alimentario cuya concentracion en peso en la composicion va del 98 % al 99,99 %, preferentemente del 99 al 99,9 %.
15
[0046] De manera preferida, la composicion segun la invencion comprende un ingrediente alimentario seleccionado entre miel, sacarosa, fructosa, glucosa o maltosa, preferentemente sacarosa, miel o sus mezclas.
[0047] Las mezclas preferidas de ingredientes alimentarios para la composicion segun la invencion se 20 seleccionan entre las mezclas de protelnas, de miel y de sacarosa; las mezclas de miel y de sacarosa. La
composicion segun la invencion puede comprender otras combinaciones de ingredientes alimentarios.
[0048] En la composicion segun la invencion, la relacion en peso (polisacarido sulfatado/ingrediente alimentario) puede variar de manera relativamente importante. Generalmente, la relacion en peso (polisacarido
25 sulfatado/ingrediente alimentario) en la composicion segun la invencion va de 0,0001 a 0,002, preferentemente de 0,0002 a 0,001, ventajosamente de 0,0002 a 0,0005.
[0049] La forma de la composicion puede definirse de manera bastante amplia. De este modo, la composicion segun la invencion puede presentarse concretamente en forma solida, pastosa o llquida. La descripcion
30 tambien se refiere a un procedimiento de preparacion de una composicion segun la invencion.
[0050] De manera general, el procedimiento de preparacion segun la invencion comprende la mezcla de al menos un polisacarido sulfatado y de al menos un ingrediente alimentario.
35 [0051] El procedimiento de preparacion de la composicion segun la invencion puede comprender,
concretamente, una etapa de sulfatacion de al menos un polisacarido.
[0052] Esta etapa de sulfatacion puede aplicarse a un polisacarido poco o no sulfatado o a un polisacarido sulfatado para aumentar en el la tasa de sulfatacion.
40
[0053] De manera preferida, el procedimiento de preparacion de una composicion segun la invencion que comprende un polisacarido sulfatado derivado de una macroalga, comprende:
- la disolucion del polisacarido sulfatado de la macroalga, opcionalmente despigmentado previamente, por 45 calentamiento a reflujo en agua a una temperatura que va de 50 a 100 °C,
- la precipitacion por al menos un disolvente polar o por dialisis del polisacarido sulfatado,
- el secado del polisacarido sulfatado.
[0054] El procedimiento de preparacion segun la invencion puede comprender una etapa previa de 50 despigmentacion de la macroalga, en particular por medio de al menos un disolvente que puede seleccionarse entre
acetona o cloroformo.
[0055] De manera ventajosa, la precipitacion puede realizarse por medio de un disolvente polar, por ejemplo etanol o propanol.
55
[0056] De manera tambien ventajosa, el secado puede realizarse por liofilizacion o por medio de un horno, concretamente a una temperatura de 50 °C.
[0057] El procedimiento de preparacion segun la invencion puede repetirse varias veces para obtener un
grado de pureza del polisacarido satisfactorio.
[0058] De manera tambien preferida, el procedimiento de preparacion de una composicion segun la invention que comprende un polisacarido sulfatado derivado de una microalga, comprende:
5
- el cultivo de la microalga, preferentemente en un fotobiorreactor,
- la concentration del medio de cultivo despues de la extraction de la biomasa, al vaclo y a una temperatura que va de 30 °C a 50 °C,
- la extraccion del polisacarido sulfatado por diafiltracion, precipitation o dialisis,
10 - el secado del polisacarido sulfatado.
[0059] De manera ventajosa, la concentracion del medio se realiza a una temperatura de 40 °C.
[0060] De manera tambien ventajosa, la extraccion por precipitacion puede efectuarse por centrifugado.
15
[0061] De manera tambien ventajosa, el secado puede realizarse por liofilizacion o por medio de un horno, concretamente a una temperatura de 50 °C.
[0062] El procedimiento de preparacion segun la invencion puede repetirse varias veces para obtener un 20 grado de pureza del polisacarido satisfactorio.
[0063] De manera tambien preferida, el procedimiento de preparacion de una composicion segun la invencion emplea un polisacarido sulfatado obtenido mediante modification qulmica de un polisacarido.
25 [0064] Este polisacarido sulfatado puede prepararse mediante un procedimiento que comprende una etapa
de sulfatacion. Esta etapa de sulfatacion puede efectuarse mediante diferentes metodos conocidos por si mismos. Esta sulfatacion puede realizarse concretamente por medio de un complejo SO3/piridina o SO3/DMF.
[0065] El objetivo de esta etapa de sulfatacion es conferir al polisacarido una tasa de sulfatacion suficiente 30 para utilization de la composicion segun la invencion o tambien este objetivo pretende aumentar la tasa de
sulfatacion del polisacarido.
[0066] La invencion tambien se refiere a una composicion segun la invencion para su utilizacion:
35 - antiparasitaria en ser humano o animal;
- en el tratamiento o la prevention de una infection provocada por al menos un microsporidio en ser humano o animal;
- en el tratamiento o la prevencion en abeja de una infeccion provocada por el microsporidio Nosema, preferentemente Nosema ceranae o Nosema apis;
40 - para estimular las defensas inmunitarias de la abeja.
La description tambien se refiere a la utilizacion de una composicion segun la invencion as! como a una composicion segun la invencion para su utilizacion para la production de miel, en presencia de una infeccion provocada por al menos un parasito, y que comprende la administration a abejas de una composicion segun la 45 invencion. La descripcion tambien se refiere a la utilizacion de una composicion segun la invencion as! como a una
composicion segun la invencion para su utilizacion para mantener la polinizacion de las plantas por abejas
infectadas por al menos un parasito, y que comprende la administracion a abejas de una composicion segun la invencion.
50 [0067] La invencion tambien se refiere a una composicion segun la invencion para su utilizacion anterior,
simultanea, complementaria, secuenciada, alterna o posterior a un tratamiento para luchar contra Varroa destructor.
[0068] Varroa destructor es un acaro hematofago parasito de las abejas adultas, de las larvas y de las ninfas.
55 [0069] De este modo, la utilizacion de una composicion que comprende al menos un polisacarido sulfatado y
al menos un ingrediente alimentario es susceptible de mantener en el tiempo, incluso de favorecer la eficacia de un tratamiento para luchar contra Varroa destructor.
[0070] La composicion utilizada segun la invencion se define segun el conjunto de las caracterlsticas
generales, ventajosas o preferidas de la composition segun la invention.
[0071] La description describe tambien un kit que comprende:
5 - una composicion segun la invencion,
- un agente para la lucha contra o la prevention de Varroa destructor, as! como dicho kit para su utilization en la prevention o el tratamiento de las infecciones provocadas por el microsporidio Nosema y por Varroa destructor en abeja.
10 [0072] La invencion tambien se refiere a un polisacarido sulfatado definido para la composicion segun la
invencion, para su utilizacion:
- antiparasitaria en ser humano o animal;
- en el tratamiento o la prevencion de una infection provocada por al menos un microsporidio en ser humano o 15 animal;
- en el tratamiento o la prevencion en abeja de una infeccion provocada por el microsporidio Nosema, preferentemente Nosema ceranae o Nosema apis;
- para estimular las defensas inmunitarias de la abeja.
20 [0073] La invencion tambien se refiere a un polisacarido sulfatado definido para la composicion segun la
invencion para su utilizacion anterior, simultanea, complementaria, secuenciada, alterna o posterior a un tratamiento para luchar contra Varroa destructor.
[0074] El polisacarido segun la invencion se define segun el conjunto de las caracterlsticas generales, 25 ventajosas o preferidas del polisacarido de la composicion segun la invencion.
[0075] Los siguientes ejemplos se dan a modo de ilustracion de los diferentes aspectos de la invencion.
Preparation de los polisacaridos sulfatados 30
• Polisacarido sulfatado 1 (PS1): carragenano iota
[0076] La extraction se baso en una extraction alcalina (NaOH de 0,1 a 1 M) con calor (de 60 a 90 °C) durante varias horas, de una mezcla de algas rojas marinas que pertenecen a los generos Euchema, Kappaphycus,
35 Chondrus y Betaphycus. La suspension obtenida se filtro para eliminar los restos celulares y se precipito mediante adicion de isopropanol. El precipitado se prenso y se seco a continuation.
[0077] Los carragenanos iota comprenden una unidad de repetition de 3-b-D-galactopiranosas y 4-a-D- galactopiranosas que alternan regularmente. Esta ultima unidad este en forma anhidrogalactosa con tasas de
40 sulfatacion significativas (del 30 al 50 % de media). La tasa media de sulfatacion es del orden del 30 %
• Polisacarido sulfatado 2 (PS2)
[0078] La extraccion se realizo despues del cultivo de una microalga roja de tipo Rhodella violacea (cepa 45 LMGE) en medio Hemerick o f/2.
La extraccion de la biomasa derivada de este cultivo se realizo por centrifugado a 10000 g x 30 min a 10 °C. El sobrenadante se concentro a continuacion (x2) al vaclo a 60 °C y a continuacion se dializo 72 horas contra agua milliQ (9 banos) y a continuacion la fraction retenida se seco por liofilizacion.
50 [0079] La composicion en monosacaridos del PS2 obtenido de este modo se determino por cromatografla
ionica: xilosa (20 %), galactosa (3 %), glucosa (0,5 %), acido glucuronico (2,5 %), arabinosa (2 %), ramnosa (3 %). Los porcentajes son porcentajes masicos.
• Polisacarido sulfatado 3 (PS3)
55
[0080] La extraccion se realizo despues del cultivo en medio f/2 de una microalga roja de tipo Rhodella
violacea (Kornmann) Wehrmeyer CCAP 1388/5. La extraccion de la biomasa derivada de este cultivo se realizo por centrifugado a 10000 g x 30 min a 10 °C. El sobrenadante se concentro a continuacion (x2) al vaclo a 60 °C y a continuacion se dializo 72 horas contra agua milliQ (9 banos) y a continuacion la fraccion retenida se seco por
liofilizacion.
[0081] La composition en monosacaridos del PS3 obtenida de este modo se determino por cromatografla ionica: xilosa (20 %), galactosa (3 %), glucosa (0,5 %), acido glucuronico (2,5 %), arabinosa (2 %), ramnosa (3 %).
5 Los porcentajes son porcentajes masicos.
• Polisacarido sulfatado 4 (PS4)
[0082] La extraction se realizo despues del cultivo en medio f/2 de una microalga de tipo Rhodella maculata 10 CCAP 1388/2 (vease Evans et al, Studies on the synthesis and composition of extracellular mucilage in the
unicellular red alga Rhodella, J.Cell Sci, 1974, 16, 1-21).
[0083] La extraccion de la biomasa derivada de este cultivo se realizo por centrifugado a 10000 g x 30 min a 10 °C. El sobrenadante se concentro (x2) al vaclo a 60 °C y a continuation se dializo 72 horas contra agua milliQ (9
15 banos) y a continuacion la fraction retenida se seco por liofilizacion.
[0084] Los exopolisacaridos de Rhodella maculata comprenden glucidos (50 %), protelnas (16 %) y una parte significativa de sulfato (10 %). El monosacarido mayoritario es la xilosa. Tambien se identificaron acidos uronicos, galactosa y glucosa.
20
• Polisacarido sulfatado 5 (PS5)
[0085] La extraccion se realizo despues del cultivo en medio f/2 de una microalga de tipo Porphyridium purpureum (Bory) Drew & Ross (1965) CCAP 1380/1 A.
25
[0086] La extraccion de la biomasa derivada de este cultivo se realizo por centrifugado a 10000 g x 30 min a 10 °C. El sobrenadante se concentro a continuacion (x2) al vaclo a 60 °C y a continuacion se dializo 72 horas contra agua milliQ (9 banos) y a continuacion la fraccion retenida se seco por liofilizacion.
30 • Polisacarido sulfatado 6 (PS6)
[0087] La extraccion se realizo despues del cultivo en medio f/2 de una microalga de tipo Porphyridium marinum Kylin (1937) CCAP 1380/10.
35 [0088] La extraccion de la biomasa derivada de este cultivo se realizo por centrifugado a 10000 g x 30 min a
10 °C. El sobrenadante se concentro (x2) al vaclo a 60 °C y a continuacion se dializo 72 horas contra agua milliQ (9 banos) y a continuacion la fraccion retenida se seco por liofilizacion.
• Polisacarido sulfatado 7 (PS7)
40
[0089] La extraccion se realizo despues del cultivo en medio Zarouk de una cianobacteria de tipo Arthrospira platensis PCC8005. La extraccion de la biomasa derivada de este cultivo se realizo por filtration en vidrio fritado de porosidad (40 - 100 pm). La fraccion filtrada se concentro a continuacion (x2) al vaclo a 60 °C y a continuacion se dializo 72 horas contra agua milliQ (9 banos) y a continuacion la fraccion retenida se seco por liofilizacion.
45
[0090] Los exopolisacaridos de Arthrospira platensis se consideran generalmente heteropolisacaridos anionicos sulfatados. Los principales monosacaridos identificados son galactosa (14,9 %), xilosa (14,3 %), glucosa (13,2 %), fructosa (13,2 %), ramnosa (3,7 %), arabinosa (1 %), manosa (0,3 %) y acidos uronicos (13,5 % representados por el acido galacturonico y glucuronico) (Trabelsi et al, Partial characterization of extracellular
50 polysaccharide produced by Artrospira platensis. Biotechnol. Bioproc. Eng, 2009,14, 27-31).
• Polisacarido sulfatado 8 (PS8)
[0091] Algas secas de tipo Halymenia durvillei se lavaron con agua y a continuacion se secaron en el horno a 55 60°C.
[0092] La extraccion de los polisacaridos se realizo a continuacion por calentamiento a reflujo en agua milliQ (relation 1:20) durante 4 horas a 90 °C y a continuacion se efectuo una filtracion en filtros de porosidades decrecientes (de 160 a 40 pm). El filtrado obtenido de este modo se centrifugo a 10000 x g durante 30 min
(temperatura ambiente). El sobrenadante se precipito a continuacion mediante adicion de 3 volumenes de etanol al 96 %. El precipitado se recogio a continuacion por prensado o centrifugado (10000 x g, 20 min, temperatura ambiente) y a continuacion se seco por liofilizacion.
5 [0093] El PS8 comprende unidades de 3-b-d-galactopiranosa y unidades de 4-a-D/L-galactopiranosa.L
La unidad de 3-b-D-galactopiranosa esta sulfatada en posicion 2 (26 %) y 2/6 (58 %).
La unidad 4-a-D/L-galactopiranosa esta sulfatada en 6 (19 %) y en 2,6 (47 %) y ciertos residuos son de tipo 3,6 anhidrogalactopi ranosa.
El polisacarido esta ramificado con monosacaridos de tipo galactosa, xilosa, arabinosa y fucosa en cantidades 10 menores y tambien se detecto piruvato (1,8 %).
• Polisacarido sulfatado 9 (PS9)
[0094] La extraccion se realizo en un alga seca de tipo Ulva lactuca despigmentada mediante tratamiento con 15 etanol, acetona y cloroformo. La extraccion se efectuo por incubacion a reflujo durante 3 horas a 90 °C en una
solucion de oxalato de sodio 50 mM, pH6. Despues de centrifugado a 12000 x g, 30 min y 4 °C, el sobrenadante se
precipito con isopropanol, se recogio por centrifugado y a continuacion se liofilizo.
[0095] El polisacarido PS 9 se designa mediante el termino ulvano y esta constituido por acido D-glucuronico, 20 por acido D-irduronico, por D-xilosa, por L-ramnosa y por sulfato y esta designado como xilorramnoglucuronano
sulfatado. Se pudieron identificar unidades de repeticion calificadas de acidos aldobiouronicos (Ray et al, Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva «rigida» (Ulvales chlorophytal) chemical structure of ulvan. Carbohydrate Research, 1995, 274: 313-318).
25 Ejemplo 1: evaluacion de la citotoxicidad de polisacaridos sulfatados seaun la invencion
Cultivo de celulas HFF (fibroblastos de prepucio humano) en placa de 96 pocillos
[0096] A partir de un matraz de celulas HFF de 75 cm2 a confluencia, el medio de cultivo se retiro, a
30 continuacion se le anadieron 2 ml de tripsina-EDTA (tripsina al 0,025 % y EDTA al 0,01 %) (a 37 °C). El matraz se
aclaro a continuacion brevemente y la tripsina se retiro. A continuacion se anadieron 2 ml de tripsina-EDTA y el matraz se incubo 5 min en el horno a 37 °C.
[0097] Se anadieron 5 ml de medio de cultivo (MEM (PARA Laboratories GmbH) + Glutamina (2 mM) + 35 Fungizona (2,5 mg/ml) + Penicilina (100 unidades/ml) + estreptomicina (100 mg/ml) + Suero fetal de ternero
descomplementado al 15 %) y a continuacion el matraz se aclaro con una pipeta. El medio y las celulas se recuperaron a continuacion en un tubo. A continuacion se realizo un recuento en celda de Malassez.
[0098] Las celulas se centrifugaron a continuacion a 200 x g, durante 7 min, a continuacion se retiro el 40 sobrenadante. El sedimento se recupero en el medio de cultivo para obtener 105 celulas/ml.
[0099] 200 ml por pocillo de esta suspension se distribuyeron dejando vaclos los pocillos de las columnas 1 y 12 y de las filas A y H. Los pocillos dejados vaclos se llenaron con 200 ml de medio de cultivo para evitar la evaporacion.
45
Adicion de los polisacaridos sulfatados
[0100] Cuando las celulas estuvieron en confluencia en los pocillos (aproximadamente 48 h), el medio se aspiro con una bomba de vaclo a continuacion se anadieron 200 ml de medio de cultivo que contenla los diversos
50 polisacaridos a ensayar (estos se ensayan a 50, 100 y 200 mg/ml). Cada concentracion se ensayo por triplicado. Cada placa debla contener un control negativo (medio de cultivo sin extracto), un control positivo (medio de cultivo que contiene un 20 % de DMSO), y un control de fumagilina (a 1 mg/ml). Los resultados se reunen en la tabla 1.
Tabla 1
- Viabilidad ( %) Conclusion
- Control de celulas sanas
- 100 +/- 2,3 Control validado
- Control positivo DMSO
- 6,8 +/- 1,4 Citotoxico: control validado
- Control de fumagilina
- 99,1 +/- 12,2 No citotoxico: control validado
Ensayo de citotoxicidad
[0101] Despues de 96 h de incubacion, el medio contenido en los pocillos se aspiro con una bomba de vaclo 5 y a continuacion se anadieron 200 ml de medio de cultivo fresco y 50 ml de TCA (acido tricloroacetico) al 50 % y la
mezcla se dejo 5 min a temperatura ambiente y a continuacion 2 h a 4 °C.
[0102] El sobrenadante se retiro con una bomba de vaclo y se lavo 5 veces (mediante volteo de la placa de 96 pocillos) con 100 ml de agua destilada y a continuacion la placa se seco (1 h en la bomba de vaclo, o 2 h dada la
10 vuelta sobre la mesa de laboratorio). La placa, una vez seca, se pudo conservar, de este modo, a temperatura ambiente hasta la utilizacion.
[0103] Se anadieron 100 ml de sulforrodamina B (0,4 % en acido acetico al 1 %) y la mezcla se incubo 20 min a temperatura ambiente. La sulforrodamina B se retiro con ayuda de una bomba de vaclo. Se efectuo un lavado
15 repetido 5 veces (mediante volteo de la placa de 96 pocillos) con 100 ml de acido acetico al 1 % y a continuacion la placa se seco 5 min a temperatura ambiente dandole la vuelta.
[0104] Las protelnas se disolvieron con ayuda de 200 ml de Tris-Base (10 mM) durante 5 min sobre un plato con agitacion a temperatura ambiente. La DO (densidad optica) a 550 nm se midio con ayuda de un lector de
20 microplacas (Multiskan FC357, Thermo Scientific).
[0105] Los resultados se presentan en la tabla 2.
[0106] Se calcularon la media de la DO y la desviacion tlpica para cada muestra ensayada para llegar a una 25 conclusion sobre la toxicidad de los productos.
Tabla 2
- Viabilidad ( %) a 50 mg/ml Viabilidad ( %) a 100 mg/ml Viabilidad ( %) a 200 mg/ml Conclusion
- PS1
- 119,1 +/- 1,8 156 +/- 8 110+/-5 No citotoxico
- PS2
- 95,6 +/- 13,7 89,2 +/- 6 69,2 +/- 7,8 No citotoxico hasta 100 mg/ml
- PS3
- 101,3 +/- 8,5 108,1 +/- 20,8 110 +/- 13,5 No citotoxico
- PS4
- 94,2 +/- 5,2 98,7 +/- 20,8 97,3 +/- 8,8 No citotoxico
- PS5
- 81,1 +/-2,9 74,3 +/- 10 87,5 +/- 15,6 Considerado no citotoxico
- PS6
- 84,4 +/- 13 89 +/- 6,4 63,7 +/- 5 No citotoxico hasta 100 mg/ml
- PS7
- 144,7 +/- 30,6 136,7 +/- 21,8 139,6 +/- 18,2 No citotoxico
- PS8
- 143,7 +/- 35,7 142,2 +/- 31 96,7 +/- 22,3 No citotoxico
- PS9
- 149,4 +/- 16,1 141,4 +/- 18,3 124,5 +/- 20,2 No citotoxico
[0107] Los resultados muestran que los polisacaridos sulfatados segun la invencion no presentan 30 citotoxicidad, concretamente hasta 100 mg/ml.
Ejemplo 2: evaluacion de la actividad antiparasitaria in vitro sobre el microsporidio Encephalitozoon cuniculi, de polisacaridos sulfatados segun la invencion
35 Cultivo de celulas HFF (fibroblastos de prepucio humano) en placas de 48 pocillos
[0108] A partir de un matraz de celulas HFF de 75 cm2 a confluencia, el medio de cultivo se retiro y a continuacion se anadieron 2 ml de tripsina-EDTA (tripsina al 0,025 % y EDTA al 0,01 %) (a 37 °C).
40 [0109] El matraz se aclaro a continuacion brevemente y a continuacion se retiro la tripsina. A continuacion se
anadieron 2 ml de tripsina-EDTA (tripsina al 0,025 % y EDTA al 0,01 %) y el matraz se incubo 5 min en el horno a 37 °C. Se anadieron 5 ml de medio de cultivo (MEM (PARA Laboratories GmbH) + Glutamina (2 mM) + Fungizona (2,5 mg/ml) + Penicilina (100 unidades/ml) + Estreptomicina (100 mg/ml) + Suero fetal de ternero descomplementado al 15 %) y el matraz se aclaro con una pipeta. El medio y las celulas se recuperaron a continuacion en un tubo. Se efectuo 45 un recuento en celda de Malassez. A continuacion las celulas se centrifugaron a 200 x g durante 7 min. El sobrenadante se retiro a continuacion y el sedimento se recupero en el medio de cultivo para obtener 105 celulas/ml.
[0110] Se distribuyeron 400 ml de esta suspension/pocillo dejando vaclos los pocillos de las columnas 1 y 8 y de las filas A y F. Los pocillos dejados vaclos se llenaron con 400 ml de medio de cultivo para evitar la evaporacion.
Ensayo ELISA en microsporidios 5
[0111] Cuando las celulas estuvieron a confluencia en los pocillos (aproximadamente 48h), el medio se aspiro con ayuda de una bomba de vaclo. A continuacion se anadieron 400 ml de medio de cultivo que contenla los diversos polisacaridos a ensayar (estos se ensayaron a la mayor concentracion no citotoxica, es decir 100 o 200 mg/ml), a continuacion se incubaron 2 h con el horno a 37 °C.
10
[0112] Paralelamente, una solucion de esporas de Encephalitozoon cuniculi (obtenidas a partir de sobrenadante de cultivo mantenido en el laboratorio) a una concentracion de 5x105 esporas/ml se pre-incubo 2 h a 37 °C en medio de cultivo que contenla los polisacaridos a ensayar. Tambien se pre-incubaron esporas en las mismas condiciones pero sin polisacarido, habiendo servido estas esporas para infectar celulas utilizadas para
15 realizar el control negativo mencionado mas adelante. Esta se puso en contacto a continuacion durante 1 h a 37 °C con las celulas, estando siempre presente el polisacarido.
[0113] Despues de un lavado con PBS para eliminar las esporas no adherentes, los diversos polisacaridos se anadieron y se dejaron de este modo el tiempo de la manipulacion (5 dlas). Cada polisacarido se ensayo por
20 triplicado. Cada placa contenla un control «celulas sanas» no infectadas, un control negativo (celulas infectadas sin tratamiento) y un control positivo (celulas infectadas incubadas en presencia de fumagilina a 1 mg/ml).
[0114] Al final de la manipulacion, el medio de cultivo de cada pocillo se elimino y se efectuo un lavado con 200 ml de PBS. Los pocillos se fijaron individualmente con 100 ml de metanol durante 20 minutos, a -80 °C a
25 continuacion, las celulas se saturaron con 100 ml de una solucion de saturacion (Tris 100 mM, BSA al 2 %) durante una noche a 4 °C.
[0115] La solucion de saturacion se elimino a continuacion con ayuda de una bomba de vaclo, a continuacion se anadieron 100 ml de suero de conejo infectado de forma natural (anticuerpos primarios) diluido a 1/1000 en el
30 tampon de dilucion para anticuerpo (Tris 10 mM pH=7,4, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 %, BSA al 0,2 %). La mezcla se incubo durante 2 h a 37 °C. A continuacion se efectuo un lavado repetido 5 veces con 200 ml de la solucion de lavado (Tween 20 al 0,05 %, Tris 10 mM pH=9,8). Se anadieron 100 ml del anticuerpo secundario anti- IgG de conejo (conjugado de IgG AP, Promega 1 mg/ml) acoplado a fosfatasa alcalina diluido a 1/10000 en el tampon de dilucion para anticuerpos. La mezcla se incubo durante 1 h, a 37 °C y a continuacion se efectuo un 35 lavado repetido 5 veces con 200 ml de la solucion de lavado.
[0116] Se anadieron 200 ml de MUP a 10 mM (fosfato de 4-metilumbeliferilo) diluido a 1/100 en la solucion de revelacion (MgCl2 1 mM, Na2CO3 50 mM pH=9,8), a continuacion la mezcla se incubo durante 30 min en la oscuridad, con agitacion ligera.
40
[0117] La lectura se realizo en el Fluoroscan con una longitud de onda de excitacion y de emision de 355 nm y 460 nm, respectivamente.
[0118] Los resultados se presentan en la tabla 3.
45
[0119] Los datos de inhibicion del desarrollo parasitario se calcularon teniendo en cuenta las siguientes informaciones: el control «celulas sanas» corresponde al blanco, el control negativo (celulas infectadas sin tratamiento) corresponde al 100 % de desarrollo parasitario.
50 [0120] La capacidad de inhibicion de los polisacaridos ensayados se evaluo segun la siguiente escala:
- < 30 %: inhibicion debil,
- entre el 30 y el 40 %: inhibicion media,
- entre el 40 y el 50 %: inhibicion satisfactoria,
55 - entre el 50 y el 70 %: inhibicion fuerte,
- entre el 70 y el 90 %: inhibicion muy fuerte,
- > 90 %: inhibicion excelente.
Tabla 3
- Producto
- Inhibicion del desarrollo parasitario ( %) Conclusion
- PS1 (200 mg/ml)
- 34,5 +/- 5 inhibicion media
- PS2 (100 mg/ml)
- 34,1 +/- 11,9 inhibicion media
- PS3 (200 mg/ml)
- 46,8 +/- 8,7 inhibicion satisfactoria
- PS4 (200 mg/ml)
- 29,9 +/- 4 inhibicion media
- PS5 (200 mg/ml)
- 99,4 +/- 1,1 inhibicion excelente
- PS6 (100 mg/ml)
- 90,3 +/- 16,7 inhibicion excelente
- PS7 (200 mg/ml)
- 48,3 +/- 11,3 inhibicion satisfactoria
- PS8 (200 mg/ml)
- 35,7 +/- 7,4 inhibicion media
- PS9 (200 mg/ml)
- 35,9 +/- 0,7 inhibicion media
[0121] Los resultados muestran que los polisacaridos sulfatados segun la invencion presentan una actividad
antiparasitaria sobre microsporidio satisfactoria. Los polisacaridos sulfatados derivados de una microalga del genero 5 Porphyridium muestran una excelente actividad inhibidora.
Ejemplo 3: evaluacion de la actividad inhibidora in vivo de polisacaridos sulfatados segun la invencion sobre la nosemosis en abejas
10 [0122] Los resultados presentados en este apartado se obtuvieron en abejas de verano.
[0123] Recuperacion de abejas emergentes (nacientes) y mantenimiento en caja de cria
[0124] Despues de haber recuperado un marco (o varios segun la necesidad de abejas) de panal de cria de 15 la colmena por medio de un porta-marcos de vidrio, este se coloco en el horno a 34 °C durante un periodo de 24 a
48 h para dejar a las abejas emerger de sus alveolos. A continuacion las jovenes abejas se recuperaron en el marco con ayuda de una pinza de entomologo y se colocaron en las cajas de cria a razon de 50 abejas/caja. Se anadio 1/6 de un palito de PseudoQueen (Contech enterprises, Canada) a cada una de las cajas.
20 Alimentacion de las abejas
[0125] Cada uno de los tratamientos polisacarldicos se realizo por triplicado (3 cajas/tratamiento). Cada manipulacion contenla un control «abejas sanas» (abejas no infectadas y no tratadas), un control «abejas infectadas» (abejas infectadas experimentalmente y no tratadas) y un control de fumagilina; siendo estos controles
25 tambien por triplicado.
[0126] Las abejas fueron alimentadas durante 3 dlas antes de la infeccion con sirope en solitario (controles «abejas sanas» y «abejas infectadas»), con sirope con adicion de 1 mg/ml de fumagilina (control de fumagilina) o con sirope que contenla los diversos polisacaridos sulfatados a ensayar (a la concentracion no citotoxica mas elevada,
30 es decir 100 o 200 mg/ml). Estando el sirope constituido por el 50 % de sacarosa, con la adicion del 1 % de protelnas (Provita'bee, Laboratoires Corylis, Francia).
[0127] La alimentacion de las abejas se realizo gracias a tubos de plastico transparentes de 5 ml perforados en su extremo para que las abejas puedan alimentarse.
35
Infeccion individual de las abejas por Nosema ceranae
[0128] Las abejas ayunaron durante 30 a 60 min antes de la infeccion. Durante este tiempo, se preparo una solucion de esporas de Nosema ceranae diluyendo estas en sirope de alimentacion a razon de 125000 esporas para
40 3 ml. Cada abeja se infecto con 125000 esporas.
[0129] Las abejas se gasearon a continuacion con CO2 (aproximadamente 1 min/caja). Cuando las abejas comenzaron a despertarse, estas se extrajeron con ayuda de una pinza de entomologo. Las abejas se infectaron a continuacion individualmente por via oral, con ayuda de una pipeta que contenla 3 ml de la solucion de esporas
45 preparada (procurando que la totalidad de los 3 ml sea bebida por la abeja). Se realizo la misma manipulacion con las cajas del control «abejas sanas» procurando darles solamente sirope de alimentacion en solitario. Se colocaron 45 abejas por caja.
[0130] Despues de la etapa de infeccion, a cada una de las cajas se le anadieron los tubos de alimentacion correspondientes a las diferentes condiciones (sirope en solitario para controles «abejas sanas» y «abejas infectadas», sirope con adicion de 1 mg/ml de fumagilina para control de fumagilina, sirope que contenla los diversos polisacaridos sulfatados). Las abejas se colocaron en el horno a 33 °C (higrometrla 60 - 70 %), y se alimentaron de
5 forma continua durante un periodo de 20 dlas.
Seguimiento de la manipulacion durante la fase de post-infeccion
[0131] Durante la fase de post-infeccion (de una duracion de 20 dlas), se contaron y retiraron diariamente las 10 abejas muertas en cada una de las cajas para efectuar el seguimiento de mortalidad. Los tubos de alimentacion se
sustituyeron cada dos dlas hasta el final de la manipulacion. Sera posible pesar los tubos de alimentacion con vistas a un seguimiento del consumo de los diferentes tratamientos por las abejas.
[0132] Al cabo de los 20 dlas, se sacrificaron 30 abejas vivas (10 abejas/caja) para cada una de las 15 condiciones ensayadas, para realizar un recuento de esporas de Nosema ceranae con el fin de evaluar la carga
parasitaria de las abejas. Para ello el intestino y la ampolla rectal de cada una de las abejas se diseccionaron y a continuacion se trituraron con un triturador de Potter en 100 ml de PBS. Despues de 3 lavados, se realizo el recuento en celdas de Kovacs.
20 [0133] Los resultados se presentan en la tabla 4.
Tabla 4
- Mortalidad a 20 d post-infeccion ( %) Variation de la carga parasitaria
- Control «abeias infectadas»
- 53,3 +/- 13,6 Ninguna
- Control de fumagilina
- 25,9 +/- 16,7 Descenso del 63,4 %
- PS1 (200 mg/ml)
- 60 +/- 8 Descenso del 26,4 %
- PS3 (200 mg/ml)
- 41,5 +/- 19 Descenso del 0,6 %
- PS5 (200 mg/ml)
- 43,7 +/- 6,8 Descenso del 20,4 %
- PS6 (100 mg/ml)
- 35,6 +/-10,2 Descenso del 33,8 %
- Mezcla PS1-PS5 (100 mg/ml cada uno)
- 54,8 +/- 26,5 Descenso del 6,25 %
[0134] Los resultados muestran un descenso significativo de la mortalidad de las abejas cuando fueron 25 alimentadas con una composicion que comprendla un polisacarido sulfatado segun la invencion.
[0135] El polisacarido sulfatado PS6 derivado de Porphyridium marinum muestra concretamente un descenso importante de la mortalidad en las abejas.
30 [0136] De este modo los polisacaridos sulfatados segun la invencion permiten limitar el desarrollo del parasito
(ilustrado mediante el descenso del numero de esporas) y, de este modo, disminuir significativamente la mortalidad en las abejas afectadas de nosemosis.
Claims (10)
- REIVINDICACIONES1. Composicion que comprende al menos un polisacarido sulfatado y al menos un ingrediente alimentario para su utilization en el tratamiento o la prevention de una infection provocada por al menos un microsporidio en5 ser humano o animal.
- 2. Composicion para una utilizacion segun la reivindicacion anterior, en la que el ingrediente alimentario se selecciona entre un agente proteico alimentario, un azucar incluyendo sacarosa, miel o sus mezclas.10 3. Composicion para una utilizacion segun las reivindicaciones anteriores, en la que el polisacaridosulfatado es de origen natural.
- 4. Composicion para una utilizacion segun las reivindicaciones 1 a 3, que comprende un polisacarido sulfatado derivado de una macroalga, seleccionada preferentemente entre macroalgas rojas, macroalgas verdes o15 macroalgas pardas o derivado de una microalga, seleccionada preferentemente entre microalgas rojas o cianobacterias; o tambien una mezcla de dichos polisacaridos sulfatados.
- 5. Composicion para una utilizacion segun la reivindicacion anterior, en la que:20 - la macroalga roja se selecciona entre las rodoflceas productoras de agar, de carragenanos, de porfiranos, de funoranos o de galactanos sulfatados complejos, preferentemente del genero Gracilaria, Halymenia, Gelidium, Pterocladia, Acanthopeltis, Campylaephora, Ceranium, Euchema , Chondrus, Porphyra, Laurencia, Furcellaria, Gloiopeltis e Iridea;- la macroalga verde se selecciona entre las cloroflceas que producen polisacaridos de tipo ulvanos, 25 preferentemente del genero Ulva;- la macroalga parda se selecciona entre las feoflceas productoras de fucanos sulfatados, preferentemente del genero Fucus, Aschophyllum o Cladosiphon.
- 6. Composicion para una utilizacion segun la reivindicacion 4 o 5, en la que el polisacarido sulfatado30 derivado de una macroalga se obtiene o es susceptible de obtenerse mediante un procedimiento que comprende lasetapas de:- disolucion del polisacarido sulfatado de la macroalga, opcionalmente despigmentado previamente, por calentamiento a reflujo en agua a una temperatura que va de 50 a 100 °C,35 - precipitation del polisacarido sulfatado por medio de al menos un disolvente polar o por dialisis,- secado.
- 7. Composicion para una utilizacion segun la reivindicacion 4, en la que:40 - la microalga roja se selecciona entre las especies que pertenecen al genero Porphyridium o al genero Rhodella;- la cioanobacteria es Arthospira platensis.
- 8. Composicion para una utilizacion segun la reivindicacion 4 o 7, en la que el polisacarido sulfatadoderivado de la microalga se obtiene o es susceptible de obtenerse mediante un procedimiento que comprende45- el cultivo de la microalga, preferentemente en un fotobiorreactor,- la concentration, despues de la extraction de la biomasa, del medio de cultivo al vaclo y a una temperatura que va de 30 °C a 50 °C,- la extraccion del polisacarido sulfatado por diafiltracion, por precipitacion o por dialisis,50 - el secado del polisacarido sulfatado.
- 9. Composicion para una utilizacion segun las reivindicaciones 1 u 8, en la que- el polisacarido sulfatado se obtiene mediante modification qulmica de un polisacarido; o55 - el polisacarido sulfatado se prepara o es susceptible de prepararse mediante un procedimiento que comprende una etapa de sulfatacion; o- el polisacarido sulfatado tiene una tasa de sulfatacion en peso superior o igual al 5 %, preferentemente que va del 5 al 50 %, ventajosamente del 5 y al 30 %; o- la concentracion masica de polisacarido sulfatado en la composicion va de 50 a 2000 mg/ml, preferentemente entre100 y 1000 mg/ml, ventajosamente entre 100 y 200 mg/ml; o- la relacion en peso (polisacarido sulfatado/ingrediente alimentario) va de 0,0001 a 0,002, preferentemente de 0,0002 a 0,001, ventajosamente de 0,0002 a 0,0005; o- el ingrediente alimentario se selecciona entre sacarosa, fructosa, glucosa o maltosa, preferentemente sacarosa, 5 miel o sus mezclas; o- la concentracion en peso de polisacarido sulfatado en la composicion va del 0,01 al 2 %, preferentemente del 0,1 y al 1 %; o- la concentracion en peso del ingrediente alimentario en la composicion va del 98 % al 99,99 %.10 10. Composicion para una utilizacion segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores- para su utilizacion en el tratamiento o la prevencion en abeja de una infeccion provocada por el microsporidio Nosema, preferentemente Nosema ceranae o Nosema apis; o- para su utilizacion simultanea para estimular las defensas inmunitarias de la abeja; o15 - para su utilizacion anterior, simultanea, complementaria, secuenciada, alterna o posterior a un tratamiento para luchar contra Varroa destructor.
- 11. Polisacarido sulfatado definido por una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, para su utilizacion en el tratamiento o la prevencion de una infeccion provocada por al menos un microsporidio en ser humano o animal.20
- 12. Polisacarido sulfatado para una utilizacion segun la reivindicacion 11- para su utilizacion en el tratamiento o la prevencion en abeja de una infeccion provocada por el microsporidio Nosema, preferentemente Nosema ceranae o Nosema apis; o25 - para su utilizacion simultanea para estimular las defensas inmunitarias de la abeja; o- para su utilizacion anterior, simultanea, complementaria, secuenciada, alterna o posterior a un tratamiento para luchar contra Varroa destructor.
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