ES2626204T3 - Micropartículas que portan células y sustancias activas - Google Patents

Abstract

Micropartícula a base de un material biocompatible y biodegradable, dicha partícula comprende en su superficie células de interés elegidas entre células embrionarias o células madre y comprende moléculas de al menos una sustancia activa sobre dichas células o su entorno durante el implante de las micropartículas elegida entre factores de crecimiento, citoquinas, inmunomoduladores o factores que actúan sobre la diferenciación celular, siendo dichas moléculas liberadas por las micropartículas de forma prolongada y controlada, estando dicha micropartícula revestida con un compuesto que permite la adhesión de las células, siendo además dicho compuesto opcionalmente activo sobre dichas células, elegido entre poli-D-lisina, poli-L-lisina, poliornitina, polietilenamina, o molécula sintética o no que pertenezca a la matriz extracelular elegida entre similar a fibronectina, polímeros sintéticos sobre los que se injertan secuencias RGD o lisina o una mezcla de los mismos, y dicha micropartícula tiene un diámetro comprendido entre 10 y 500 μm, y dicho material biodegradable y biocompatible es un polímero o un copolímero de poliéster.

Description

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DESCRIPCION

Micropartfculas que portan celulas y sustancias activas Sector de la tecnica

La presente invencion se refiere al campo de la preparacion y del trasplante de celulas utiles en el contexto de terapia celular para reparacion tisular o para transferencia genetica, o incluso para vacunacion. Particularmente, la invencion tiene como objeto micropartfculas a base de un material biocompatible y biodegradable, que comprende celulas de interes y factores de crecimiento o citoquinas.

Estado de la tecnica

La terapia celular, mediante injerto de celulas autologas o no autologas, constituye una herramienta terapeutica importante que en la actualidad se desarrolla esencialmente en hematobiologia, pero se deberia aplicar a otras especialidades, debido a los conocimientos adquiridos sobre celulas madre y su identificacion en la mayoria de los tejidos, desde el musculo al sistema nervioso central. La identificacion y caracterizacion crecientes de citoquinas y factores de crecimiento permiten prever la posibilidad de controlar in vitro y/o in vivo la proliferacion y la diferenciacion de estas celulas y modular su entorno tisular (fenomenos inmunologico de rechazo, angiogenesis). A pesar de estos avances en biologia celular, el desarrollo clinico de los trasplantes de celulas en la actualidad sigue siendo limitado, debido principalmente a la baja tasa de supervivencia de las celulas implantadas, que puede estar relacionado con la mortalidad no especifica (muerte celular por necrosis o apoptosis) debido a los procedimientos de recogida, conservacion, transformacion y administracion o a un rechazo inmunologico (en alo y xenoinjertos), es decir, a la ausencia de integracion en el tejido hospedador.

Para reducir esta mortalidad celular, se propuso la utilizacion de microperlas no biodegradables sobre las que se adhieren las celulas, que sirven como transportadores o « microvehiculos ». La supervivencia y la funcion de los hepatocitos mejoran, por ejemplo, cuando estas celulas se injertan, adherentes a microperlas de vidrio o de dextrano (CytodexR) (Demetriou et al, 1986; Te Velde et al., 1992). Esta estrategia permitio obtener resultados mas interesantes que con hepatocitos microencapsulados. Mas recientemente, estas mismas microperlas se han utilizado para cultivar e injertar queratinocitos humanos para reconstituir la cobertura cutanea en ratones desnudos (Voigt et al., 1999). Este enfoque tambien se ha utilizado para injertar celulas neurocromafines o neuronas embrionarias dopaminergicas en un modelo murino de la enfermedad de Parkinson. En este modelo, la supervivencia de las celulas trasplantadas en el cuerpo estriado aumenta en gran medida cuando se adhieren previamente a las micropartfculas de vidrio o dextrano, y permiten una mejora del comportamiento de los animales (Cherskey et al., 1996; Saporta et al., 1997; Borlongan et al., 1998). Del mismo modo, se ha observado (Saporta et al., 1997) que las celulas fetales humanas adheridas en microperlas de dextrano sobreviven al menos tres meses sin tratamiento inmunosupresor, mientras que sin micropartfculas estas celulas se rechazan rapidamente.

Otro enfoque, mas reciente, que permite aumenta la supervivencia de las celulas injertadas es la administracion, en combinacion con el injerto, de factores de crecimiento. Estas proteinas que pueden actuar sobre la proliferacion, diferenciacion, activacion y supervivencia de las celulas, constituyen una contribucion importante en injerto celular. Aunque ahora es posible disponer de factores de crecimiento recombinantes humanos, su administracion presenta una dificultad debido a que estas proteinas tienen una semivida corta y atraviesan el mal cieilas barreras biologicas. Ademas tienen una accion pleiotropica, que puede ser la causa de efectos secundarios no deseados. Ninguno de los modos de administracion desarrollados en la actualidad es completamente satisfactorio y aplicable en clinica rapidamente.

Uno de los primeros modos de administracion propuesto consistia en injertar las celulas en una suspension que contenia el factor de crecimiento. Este enfoque, aunque es sencillo, no permite actuar sobre las celulas a largo plazo. Un segundo modo de administracion consiste en cotrasplantar un tejido identificado para producir el factor de crecimiento elegido, por ejemplo los coinjertos de nervio periferico-celulas cromafines (Date et al., 1996), o los coinjertos de hepatocitos-islotes de Langerhans (Kneser et al., 1999). La supervivencia en ocasiones limitada de estos coinjertos y la incapacidad de controlar las dosis de los factores de crecimiento limitan considerablemente esta estrategia. Los avances en biologia molecular ahora permiten obtener celulas modificadas geneticamente que producen un factor de crecimiento, y que se pueden utilizar en coinjertos o como injerto propiamente dicho (Menei et al., 1998; Wood y Prior, 2001). Sin embargo, este enfoque permanece limitado por problemas eticos, riesgos biologicos, y el control de las dosis liberadas. Por lo tanto, se ha informado de injertos de celulas nerviosas, tales como celulas PC12 neuroendocrinas (Menei et al., 1989; Dehaut et al., 1993) o celulas de Schwann normales o geneticamente modificadas para producir un factor neurotrofico (Montero-Menei et al., 1992; Menei et al., 1998).

Tambien se han descrito micropartfculas biodegradables que liberan moleculas neuroactivas, de forma controlada y sostenida (Menei et al., 1997; Benoit et al., 1999). Estas microesferas estan constituidas por un biopolimero de tipo poli(acido lactico-co-acido glicolico) (PLGA). Son biocompatibles con el tejido nervioso y se degradan completamente en varios meses (Menei et al., 1993; 1994b; Veziers et al., 2000). Su tamano de varias decenas de micrometros permite un implante estereotactico en el cerebro, a nivel de su diana farmacologica, utilizando las mismas

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microjeringas que para los implantes de celulas (Menei et al, 1994a). Se han utilizado con exito en un estudio clinico de fase I para quimioterapia intersticial de los tumores cerebrales (Menei et al., 1999).

Tambien se han desarrollado microesferas que liberan de proteinas, en particular factores de crecimiento y citoquinas. El « factor de crecimiento nervioso » (NGF), es una sustancia interesante ya que esta entre las caracterizadas desde hace mas tiempo. Por lo tanto, se han descrito microesferas que pueden liberar NGF durante al menos dos meses (Pean et al., 1998; Pean et al., 1999). Su interes terapeutico se ha demostrado en dos modelos animales de enfermedades neurodegenerativas: modelo murino de la enfermedad de Alzheimer, (Pean et al., 2000) y el modelo murino de la Corea de Huntington (Menei et al., 2000).

En el campo de los tumores, se han formulado microesferas de PLGA capaces de liberar citoquinas inmunoestimulantes despues del implante intratumoral (Mullerad et al., 2000, Pettit et al., 1997). Por lo tanto, se ha propuesto la utilizacion de microesferas biodegradables para la liberacion de citoquinas sin el contexto de vacuna antitumoral (Golumbek et al., 1993), pero, en este estudio, las microesferas se mezclan simplemente con las celulas inmediatamente antes de la inyeccion. Del mismo modo, ya se ha propuesto la preparacion de vacuna constituida por microesferas revestidas de antigenos bacterianos o de vesiculas de la membrana, pero sin que la microesfera pueda liberar una molecula inmunoestimulante (Mescher y Rogers, 1996, Mesher y Savelieva, 1997).

El documento WO9323088 describe microparticulas con celulas de piel en la superficie para el tratamiento de heridas cutaneas.

Objeto de la invencion

El objeto de la presente invencion es ofrecer ahora una combinacion de celulas (o fracciones de celulas) y sustancias activas sobre estas celulas, tales como factores de crecimiento o citoquinas, al nivel de las mismas microparticulas para el injerto de celulas en terapia celular o vacunacion.

Las competencias de los inventores les permitieron desarrollar microvehiculos farmacologicamente activos, tambien denominados en lo sucesivo « MPA » que liberan factores de crecimiento de forma prolongada y controlada. Estas microparticulas de varias decenas de micrometros de diametro estan constituidas por polimeros biodegradables y biocompatibles que permiten la adherencia de las celulas o de fragmentos celulares gracias a las propiedades en particular del polimero o a un revestimiento que puede ser biologicamente activo. Los MPA no presentan un riesgo biologico y son notables ya que:

- Pueden servir de soporte para el cultivo de celulas. La adhesion preferente de las celulas a injertar sobre las microparticulas permite su preparacion, es decir, su transformacion in vitro sin utilizar para su recogida, enzimas proteoliticas de origen animal des aconsejadas por razones de seguridad sanitaria evidentes.

- Pueden servir de soporte para las celulas injertadas y se pueden degradar sin toxicidad despues del implante, sin interferir con la integracion de las celulas injertadas.

- Pueden liberar uno o varios factores de crecimiento o citoquinas durante un periodo de tiempo programado y a una dosis determinada.

- Pueden estimular la supervivencia y la diferenciacion de las celulas injertadas, modificar su microentorno, asi como su integracion en el tejido hospedador.

Por lo tanto, la invencion tiene como objeto microparticulas a base de un material biocompatible y biodegradable, caracterizadas por que comprenden, en su superficie, celulas de interes y por que comprenden moleculas de al menos una sustancia activa sobre dichas celulas o su entorno durante el implante de las microparticulas, siendo dichas moleculas liberadas por las microparticulas de forma prolongada y controlada.

De forma mas precisa, la invencion tiene como objeto microparticulas a base de un material biocompatible y biodegradable,

comprendiendo dichas particulas en su superficie celulas de interes elegidas entre celulas embrionarias o celulas madre,

comprendiendo dichas particulas moleculas de al menos una sustancia activa sobre dichas celulas o su entorno durante el implante de las microparticulas y que se eligen entre factores de crecimiento, citoquinas, inmunomoduladores o factores que actuan sobre la diferenciacion celular, siendo dichas moleculas liberadas por las microparticulas de forma prolongada y controlada,

estando dichas microparticulas revestidas con un compuesto que permite la adhesion de las celulas, siendo ademas dicho compuesto opcionalmente activo sobre dichas celulas, y elegido entre poli-D-lisina, poli-L-lisina, poliornitina, polietilenamina, o molecula sintetica o no que pertenezca a la matriz extracelular elegida entre una molecula similar a fibronectina, polimeros sinteticos sobre los que se injertan secuencias RGD o lisina o una mezcla de los mismos,

teniendo dichas microparticulas un diametro comprendido entre 10 y 500 pm, y siendo dicho material biodegradable

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y biocompatible un polimero o un copolimero de poliester.

La invencion admite varios modos de realizacion de acuerdo con el que las moleculas de al menos una sustancia activa se encuentran en la superficie y/o se incorporan en las microparticulas.

La incorporacion de la molecula activa se puede realizar durante el proceso de encapsulacion y/o despues de la formacion de las particulas. Segun las condiciones de trabajo, la matriz puede ser mas o menos porosa con una forma mas o menos esferica.

Las microparticulas estan constituidas por un polimero o por un copolimero de poliester biocompatible y biodegradable. Un polimero o copolimero de este tipo se elige por ejemplo entre el grupo que comprende los poli(a- hidroxiacidos), tales como polilactidas, polilactidas co-glicolidos, poli £-coprolactonas, PLGA, y sus mezclas. En un modo de realizacion ventajoso de la invencion, el polimero se elige entre las polilactidas. Las microparticulas presentan un diametro comprendido entre 10 y 500 pm. En efecto, los MPA que presentan la ventaja de poder adaptar el tamano de las microparticulas en funcion de las celulas adheridas.

La adhesion de las celulas sobre las microparticulas se permite mediante las propiedades en particular del polimero y mediante un revestimiento con un compuesto o mezcla de compuestos que permiten e la adhesion de las celulas y que pueden ser biologicamente activo(s). Por lo tanto, la invencion concibe la utilizacion de polimero sintetico que permite la adhesion celular por sus propiedades fisicoquimicas, o copolimeros sinteticos sobre las moleculas sur a partir de las cuales se injertan secuencias RGD o lisina (Varani et al., 1993). Los compuestos de revestimiento de las microparticulas que permiten la adhesion de las celulas se eligen entre el grupo que comprende poli-D-lisina, poli-L- lisina, poliornitina, polietilenamina, o cualquier otra molecula sintetica o no que pertenezca a la matriz extracelular tal como similar a fibronectina, o incluso la mezcla de los mismos.

Estas microparticulas comprenden moleculas de al menos una sustancia activa sobre las celulas o el entorno de estas celulas durante el injerto. Los metodos de encapsulacion de estas moleculas son diversos, y se puede mencionar un metodo de doble emulsion, o cualquier otro metodo fisicoquimico, mecanico o quimico. Tambien se puede tratar de una simple impregnacion de las microparticulas con dichas moleculas con el fin de fijar las en la superficie de las microparticulas. Las microparticulas liberan moleculas de esta sustancia, de forma prolongada y controlada.

De acuerdo con una primera forma de realizacion de la invencion, los MPA son utiles para la preparacion de composiciones farmaceuticas utiles en terapia celular para reparacion tisular o para transferencia genetica.

Las celulas de interes fijadas en la superficie de las microparticulas pueden ser diversas segun el tipo de injerto deseado, il se puede tratar de celulas embrionarias, o celulas madre. Estas celulas se pueden utilizar en diferentes patologias que necesiten una terapia celular. Por ejemplo, este es el caso de los injertos de hepatocitos y de los islotes de Langherans. En el caso de neurotrasplante, se puede tratar de una linea de celulas PC12 capaces de secretar dopamina y de diferenciarse en neuronas « de tipo simpatico » bajo el efecto del NGF.

Las moleculas de las sustancias incorporadas o en la superficie de los MPA son los factores de crecimiento, citoquinas, inmunomoduladores o factores que actuan sobre la diferenciacion celular, en particular los elegidos entre el grupo que comprende neurotrofinas tales como NGF, BNDF, NT-3, etc..., los TGFp, la familia del GDNF, los FGF, EGF, PDGF, interleuquinas tales como Il-1, Il-2, quimioquinas, acido retinoico, eritropoyetina, etc., o mezcla de los mismos.

Las moleculas liberadas por las microparticulas solas o en combinacion con el compuesto de revestimiento para la adhesion de las celulas favorecen la supervivencia de las celulas, su funcion u orientan la diferenciacion de las celulas madre hacia un fenotipo determinado. Tambien pueden modificar el entorno tisular, disminuyendo las reacciones inmunitarias y el rechazo o favoreciendo la integracion aumentando la angiogenesis. Estas moleculas tambien pueden servir incluso para controlar la expresion de un gen presente en una celula geneticamente modificada, y que esta bajo el control de un promotor que responde a estas moleculas.

Por lo tanto, la invencion tambien tiene como objeto la utilizacion de microparticulas a base de un material biocompatible y biodegradable para la preparacion de una composicion farmaceutica destinada a la reparacion tisular o a la transferencia genetica, en la que dichas microparticulas comprenden en su superficie celulas de interes y comprenden moleculas de al menos una sustancia activa sobre dichas celulas o su entorno durante el implante de las microparticulas, siendo dichas moleculas liberadas por las microparticulas de forma prolongada y controlada.

Descripcion de las figuras

Otras ventajas y caracteristicas de la invencion apareceran con los ejemplos que siguen a continuacion con respecto a la preparacion y utilizacion de los MPA en el campo de neurotrasplante, en el que se hara referencia a las figuras adjuntas en las que:

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- La figura 1 es una representacion esquematica de los MPA de la invencion.

- La figura 2 muestra celulas PC12 adheridas a los MPA, observadas mediante microscopia optica (A) o mediante microscopia electronica de barrido (B).

- La figura 3 es un histograma que representa el comportamiento rotatorio inducido por anfetaminas de los diferentes grupos de ratas antes y despues del implante de: celulas PC12 con MPA (que por lo tanto liberan NGF), celulas PC12 con microparticulas de blanco (que no liberan NGF), celulas PC12 solas o despues de la inyeccion solamente del medio de cultivo.

- La figura 4 es una representacion esquematica de MPA para una vacuna antitumoral de acuerdo con la invencion.

Descripcion detallada de la invencion

Ejemplo 1: Presentacion general de los MPA para los injertos de celulas.

Los siguientes ejemplos se refieren al campo del neurotrasplante (injertos de celulas nerviosas en el sistema nervioso central). Se prepararon MPA biodegradables y biocompatibles de un diametro de 60 um. Estan constituidos por PLGA y estan revestidos con una fina capa de moleculas de adherencia sinteticas (poli-D-lisina y « similar a fibronectina ») y liberan un factor neurotrofico, el NGF, de manera continua (durante al -15 dias). Se utilizaron celulas que responden al NGF como la linea celular PC12, capaces de secretar dopamina y de diferenciarse en neuronas « de tipo simpatico » bajo el efecto de este factor. La eficacia de estos MPA se evaluo con exito, in vivo, utilizando modelos animal de la enfermedad de Parkinson.

Los neurotrasplantes se iniciaron en clinica en los anos 80, esencialmente en el contexto de la enfermedad de Parkinson (Menei et al., 1991a; 1991b). En la actualidad se buscan en forma de investigaciones clinicas y siguen esencialmente limitados por la disponibilidad de las celulas a injertar (celulas embrionarias) y la baja tasa de supervivencia de estas celulas despues del implante (de un 5 a un 10 %). Algunos estudios recientes muestran que la mayor parte de las neuronas mueren en la primera semana despues del trasplante, probablemente debido a una falta de soporte trofico, conexiones neuronales y una vascularizacion limitada (Emgard et al., 1999; Mahalik et al., 1994; Zawada et al., 1998). Se ha demostrado que los factores neurotroficos administrados en paralelo con las celulas injertadas mejoran su supervivencia, tambien actuan sobre su diferenciacion y el desarrollo de las sinapsis, ayudando de ese modo a su mejor integracion (Mahoney et al., 1999; Sautter et al., 1998; Yurek et al., 1996). Estos factores tambien pueden actuar de forma beneficiosa sobre el entorno de las celulas injertadas, modificando la reaccion inflamatoria y celular (Wei et al., 1999).

1) Eleccion del factor de crecimiento.

El NGF se eligio en un primer momento, porque es un factor trofico que presenta varios intereses en el contexto de los neurotrasplantes. Ademas de su accion neurotrofica, puede proteger, de forma no especifica, contra la excitotoxicidad responsable de una mortalidad precoz de las celulas injertadas (Strijbos y Rothwell, 1995; Carlson et al., 1999). El NGF presenta ademas un interes potencial en el contexto de los rechazos de injerto. Disminuye la expresion, sobre las celulas microgliales, de las moleculas inmunologicas esenciales para la activacion de los linfocitos T en el sistema nervioso central (Neumann et al., 1998; Wei y Jonakait, 1999, Aloisi et al., 2000) permitiendo de este modo impedir el rechazo o establecer una « inmunotolerancia » local.

2) Eleccion de las celulas.

Las celulas cromafines de la medula suprarrenal se han utilizado clasicamente para los injertos de celulas en el contexto de la enfermedad de Parkinson. En consecuencia, se utilizaron celulas de la linea PC12, que son bastante faciles de cultivar. En efecto, estas celulas sintetizan y liberan dopamina. Ademas, bajo la accion del NGF, detiene su proliferacion y se diferencian en neuronas « de tipo simpatico ». Las celulas PC12 tambien constituyen un buen modelo para determinar las condiciones de produccion de « microvehiculos », ya que no presentan propiedades de adherencia naturales y no se adhieren mas que a superficies revestidas con moleculas que estimulan la adherencia.

El desarrollo clinico de los injertos de celulas embrionarias permanece limitado por problemas eticos. Por lo tanto, es necesario, de ahora en adelante, concebir otras fuentes celulares como las celulas madre nerviosas o las celulas madre mesenquimales de la medula osea (CSM). Estas ultimas se pueden extraer facilmente en el ser humano, se pueden diferenciar in vitro, siguiendo las condiciones de cultivo, en osteoblastos, condrocitos, miocitos, adipocitos o celulas madre nerviosas. Por lo tanto, las CSM diferenciadas en celulas madre nerviosas por el FGF basico que expresan el receptor de alta afinidad del NGF (trkA) se podrian utilizar en el contexto de la presente invencion.

3) Eleccion de los MPA.

El tamano signo en esta aplicacion es del orden de 60 um. En efecto, un tamano inferior presenta una superficie insuficiente para permitir la adherencia de un numero aceptable de celulas. Sin embargo, las microesferas no deben tener un diametro demasiado importante con el fin de poder ser reabsorbidas sin demasiadas dificultades y de ser administradas facilmente a traves de una aguja.

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Para la adhesion celular, las microparticulas de PLGA se revistieron con una molecula « similar a fibronectina » y poli-D-lisina. El uso de moleculas sinteticas y no de origen animal es indispensable para poder considerar una aplicacion clinica futura. Estas microesferas revestidas permiten in vitro una liberacion continua de NGF durante al menos quince dias. Para estudiar in vivo el efecto de los « microvehiculos » farmacologicamente activos, estos se implantaron en el cuerpo estriado de rata, despues de denervacion dopaminergica total mediante un agente neurotoxico (trata con Parkinson). Despues del implante, las celulas PC12 permanecen adheridas a las microparticulas de blanco (sin producto activo) o liberan NGF. Sobre animales tratados con « microvehiculos » que liberan NGF, las PC12 se diferencian y presentaban prolongaciones probablemente como respuesta a la liberacion del NGF. Esta diferenciacion va acompanada de efectos de comportamiento (ensayo de rotacion).

Las celulas PC12 no se utilizaron en este estudio mas que para preparar los MPA, pero se pueden usar otras celulas. Los injertos de celulas de origen embrionario han sido muy estudiados en modelos animales de enfermedades neurodegenerativas. Estos estudios han llevado ademas a la realizacion de ensayos clinicos en la enfermedad de Parkinson y en la Corea de Huntington. Sin embargo, los bajos efectos de estos injertos, recogidos por una fuerte mortalidad de las zonas injertadas conducen a reconsiderar la metodologia (Lindvall, 1997). En el contexto de la enfermedad de Parkinson y de los injertos de neuronas embrionarias dopaminergicas, los estudios han mostrado que la exposicion de estas celulas al GDNF (Tornqvist et al., 2000), o incluso la utilizacion de « microvehiculos » (Saporta et al., 1997) aumentan su supervivencia. Tambien se pueden preparar microparticulas que liberan GDNF para favorecer el injerto de neuronas dopaminergicas y embrionarias y estudiar su eficacia en ratas.

Ejemplo 2: Preparacion de los MPA PC12/NGF.

1) Preparacion de las microparticulas.

Las microparticulas se obtienen con el metodo de doble emulsion (H/L/H) evaporacion/ extraccion de disolvente.

La fase acuosa esta constituida por 60 jl de tampon citrato (16 mM, pH 6), 2,5 mg de HSA, (u otra molecula que tenga un poder tensioactivo) 90 jl de PEG 400 y 100 jg de NGF. Se disolvieron 50 mg - 150 mg de PLGA a 37,5/25 (Poli D,L-lactida-co-glicolido, Pm 21 000 Da, I = 1,7) u otro polimero biodegradable y biocompatible, en 2 ml de una solucion organica constituida por un 75 % de diclorometano y de un 25 % de acetona. La emulsion primaria se realiza a partir de estas dos fases por sonicacion a 0-4 °C (15 s, 5-6 W). Este emulsion primaria se anade con agitacion mecanica (200 rpm) a 30-150 ml de una solucion de alcohol polivinilico (0,8-4,5 %, 4-8 °C) que contiene un 10 % (P/V) de NaCl, que contiene de un 0 a un 2 % de diclorometano. La agitacion se mantiene de 1 a 7 min, a continuacion la emulsion secundaria se vierte en 400 ml de una solucion acuosa a un 10 % de NaCl con agitacion magnetica (25-50 min). La fase acuosa de extraccion se puede anadir en parte a la emulsion secundaria. Las microparticulas se filtran a continuacion (0,45 jm, HVLP, Millipore), se lavan 5 veces con 100 ml de agua destilada y a continuacion se liofilizan y se conservan a +4 °C.

El rendimiento de la encapsulacion es del orden de un 85 %, pero segun las condiciones de fabricacion se puede conseguir un 97 % (Pean et al., 1998).

2) Revestimiento de las microparticulas.

El revestimiento de las microparticulas mediante una asociacion « similar a fibronectina » (16 jg/jl) con poli-D-lisina (12 jg/jl) constituye la condicion que permite tener una adherencia y una diferenciacion optima de las celulas PC12.

Las condiciones de revestimiento de las microparticulas (velocidad y tiempo de agitacion) se ajustaron por agitacion de la suspension de microesferas en presencia de moleculas de tipo « similar a fibronectina » y poli-D-lisina. Despues de diferentes ensayos, los inventores eligieron una velocidad de agitacion de 15 revoluciones por minuto (rpm) y una duracion de revestimiento de 2 horas a 37 °C.

3) Adhesion de las celulas sobre las microparticulas.

Para desarrollar las condiciones de adherencia de las celulas en los « microvehiculos », se sometieron a ensayo diferentes velocidades y tiempos de agitacion de las celulas en presencia de microparticulas. Por lo tanto la adherencia de las celulas PC12 era maxima para una agitacion a 3 rpm durante 4 horas a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %.

Los ensayos de separacion de celulas individuales adheridas a las microparticulas llevaron a centrifugar la suspension de microparticulas/celulas a 135 g durante 10 segundos. Este tratamiento, asi como el paso del residuo en una jeringa Hamilton de 10 jl, utilizada para los injertos, no produce una disminucion del numero de microparticulas que presentan celulas en su superficie. En estas condiciones, y despues de hacer el recuento con microscopio de la suspension de microparticulas/celulas, fue posible obtener aproximadamente un 90 % de las microparticulas con celulas adherentes en su superficie. Como promedio, se encuentran de 8 a 10 celulas por

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« microvehiculo ». Por el contrario, cuando las microesferas no se revisten, solamente un 5 % de las mismas poseen celulas pegadas en su superficie. Por lo tanto, el revestimiento de las microparticulas mediante una asociacion de tipo similar a fibronectina y poli-D-lisina, es fundamental para que las celulas se adhieran a esto. Esta adherencia se confirmo mediante imagenes de microscopia a electronica de barrido (figura 2).

4) Caracterizacion in vitro

El revestimiento se caracterizo por microscopia de fuerza atomica y muestra que este revestimiento se deposita de manera uniforme sobre la particula y disminuye la porosidad de su superficie. En las condiciones de revestimiento mencionadas anteriormente, el espesor del revestimiento es de 20 nm. Despues de la liofilizacion, el revestimiento permanece intacto y mantiene su eficacia de adherencia y diferenciacion en un ensayo de adherencia in vitro.

En las condiciones de adherencia mencionadas anteriormente cuando 1,5 x 105 celulas se ponen en presencia de los MPA, sobre cada MPA se adhieren 5 x 104 celulas como promedio.

Ejemplo 3: Resultados de los MPA NGF/PC12 en modelos animales.

Los MPA liberan NGF de forma prolongada y controlada. En efecto, los primeros resultados de la cinetica de liberacion in vitro, muestran que para 200 pg de NGF encapsulado, un 15 % se libera de forma continua durante las dos primeras semanas. De ese modo, el implante de 0,5 mg de MPA daria lugar a la liberacion de 5-10 ng de NGF al dia, lo que esta de acuerdo con las cantidades necesarias para una accion de NGF sobre las celulas.

Despues del implante en el cuerpo estriado denervado de « ratas con Parkinson », las celulas PC12 permanecen bien adheridas sobre las microparticulas. Las celulas transportadas siempre expresan tirosina hidroxilasa y por lo tanto son capaces de producir dopamina. Dos semanas despues del implante, las microparticulas no siempre se degradan y aun sirven como soporte para las celulas. En efecto, todavia son esfericas y presentan un aspecto bastante liso, sin poros de vacuolizacion. De forma general, las celulas adheridas a las microparticulas, con o sin NGF, tienen un aspecto diferenciado en comparacion con el de las celulas injertadas son las en el cuerpo estriado. Mediante la observacion de estas celulas con gran aumento, se observa que en las microparticulas que liberan NGF, las prolongaciones son mas largas representando aproximadamente de 2 a 3 veces el tamano del cuerpo celular (figura 2B). En el nivel de comportamiento, los primeros resultados de los ensayos de rotacion inducidos por anfetamina, muestran que solamente mejoran las ratas que recibieron las celulas con microparticulas que liberan NGF (figura 3). Entre los resultados, parece que las celulas PC12 adheridas a las microparticulas que no liberan NGF dejan de proliferar.

Resultados en modelos animales

Un inmunoetiquetado con un anticuerpo que reconoce el sitio activo del NGF dos semanas despues del implante de las microesferas en el cuerpo estriado de la rata con « Parkinson » muestra que el NGF se libera bastante en una forma biologicamente activa. A las dos semanas, todavia se detecta NGF es incluso en los MPA y se libera alrededor de manera uniforme y sobre una distancia de al menos 40 pm.

En ciertos lugares alrededor de los MPA que liberan NGF tambien se observan redes de neuritas, lo que demuestra una buena liberacion del factor de crecimiento que estimula de ese modo la diferenciacion de celulas PC12.

Las celulas PC12, como otras lineas celulares o incluso celulas madre, pueden formar tumores despues del implante. Los marcadores de proliferacion muestran que en los injertos de celulas PC12 se adhirio a MPA hay una disminucion en el numero de celulas en proliferacion. Este efecto es mas pronunciado con los MPA que liberan NGF.

La muerte de las celulas por apoptosis tambien disminuye injerto de las celulas PC12 adheridas a los MPA liberando o no NGF.

Al nivel de comportamiento, el ensayo de rotaciones inducidas por anfetamina, muestran que solo las ratas que recibieron las celulas con los MPA que liberan NGF mejoraron lo que confirma la eficacia de los MPA en este modelo.

Ejemplo 4 Preparacion de los MPA que liberan GDNF que transportan Celulas embrionarias dopaminergicas (E- dopa)

Despues de la incubacion de los MPA revestidos con poli-D-lisina con celulas en un ciclo de rotacion de 6 revoluciones por minuto durante al menos una hora, las celulas E-dopa se adhieren a la superficie de un 70 % a un 90 % de los MPA. El numero de celulas adheridas es bastante variable, de aproximadamente 5-30 celulas por MPA.

Ejemplo 5: Presentacion general de los MPA para la vacunacion antitumoral (no reivindicado)

La experiencia clinica de los inventores en vacunacion antitumoral asi como los resultados publicados en la bibliografia confirman que el cultivo de las celulas tumorales es una etapa limitante en este enfoque. El rendimiento

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es bajo y el tiempo para obtener el numero de celulas necesario a menudo es incompatible con la rapidez de la evolucion del tumor. Las celulas autologas son en la actualidad la fuente mas apropiada de Antigenos especificos de tumor (AST), ya sea para la carga de las celulas dendriticas in vitro, o la vacunacion subcutanea, es util desarrollar un sistema que se pueda preparar rapidamente, a partir de pocas celulas, capaz de presentar la mayoria de los antigenos tumorales asi como un adyuvante para las celulas dendriticas.

Para esto, los inventores formulan particulas bioartificiales que se basan en el concepto de microvehiculos farmacologicamente activos (MPA), desarrollado en el INSERM ERIT-M 0104. Se trata de microesferas 5 a 30 pm (aproximadamente) de diametro, constituidas por un copolimero biocompatible y biodegradable (como poli[acido lactico-co-acido glicolico] o PLGA), que pueden liberar un adyuvante tal como una citoquina proinflamatoria (tal como GM-CSF, IL-2, IL12 o lL-18) de forma prolongada y controlada. Por sus propiedades de superficie (formacion de pelicula con moleculas de adhesion celular sinteticas), estas microparticulas pueden en superficie antigenos tumorales preparados a partir de celulas autologas tumorales (vesiculas de membrana, cuerpos apoptoticos, exosomas, extracto de proteina, ARNm, ADN).

Estos MPA que portan antigenos tumorales en su superficie y que liberan un adyuvante de una manera controlada, tal como una citoquina estan destinados a:

- su puesta en contacto con celulas dendriticas in vitro (en el contexto de vacunacion con celulas dendriticas obtenidas a partir de celulas madre sanguineas)

- o para su administracion al paciente directamente, por via subcutanea, intradermica o intramuscular.

El caracter inmunogeno del MPA no solo se debe a la asociacion del antigeno tumoral y de la liberacion de citoquina prolongada, sino tambien a la presentacion del antigeno en un sistema de microparticulas. Se trata de un modo de presentacion ideal para el reconocimiento del antigeno por las celulas dendriticas. Esta estimulacion inmunitaria no especifica, o el papel adyuvante de las microparticulas, se ha demostrado desde hace mucho tiempo (Mescher y Rogers, 1996, Mesher y Savelieva, 1997; Nakaoka et al., 1995, Rogers y Mescher 1992, Scheicher et al., 1995a, 1995b, Venkataprasad et al., 1999).

Ya se ha descrito que las microesferas de PLGA pueden liberar citoquinas inmunoestimulantes y/o antitumorales (Golumbek et al., 1993; Mullerad et al., 2000, Pettit et al., 1997), y los inventores ya han mostrado su capacidad para desarrollar en laboratorio microesferas que liberan agentes antitumorales o proteinas recombinantes (Menei et al., 1996, 1999, 2000; Pean et al., 2000).

Ejemplo 6: Portadores de AMP de membranas plasmaticas en la vacunacion anti-glioma (no reivindicado)

Las microesferas de PLGA utilizadas (con y sin una citoquina de activacion, GM-CSF) se fabricaron con la tecnica de evaporacion de disolvente como se ha descrito previamente (Menei et al., 1993, Menei et al., 96, Pean et al., 2000). Una filtracion, permitio seleccionar las microesferas de tamanos pequenos (de 5 a 30 pm de diametro).

La purificacion de las membranas plasmaticas de las celulas GS-9L se realizo incubando 1,5.108 celulas durante 15 minutos a 4 °C en un tampon hipotonico (KCl 42 mM, Hepes 10 mM a pH 7, MgCl2 4,5 mM y un 1 % de inhibidores de proteasas) mediante la realizacion de aproximadamente 50 pasajes en una jeringa de calibre 30. A continuacion, las celulas interrumpidas de ese modo se centrifugaron (250 g, 10 minutos; 4 °C) para separar las membranas en el sobrenadante de las celulas no lisadas y de los nucleos sedimentados en un residuo. A continuacion, las membranas se recuperan despues de una etapa de ultracentrifugacion (100 000 g, 90 minutos, 4 °C). A continuacion se colocaron en un sistema bifasico de polietilenglicol (PEG 8000) / Dextrano T500 equilibrado con 48 horas de antelacion, para ser centrifugadas a continuacion (3 000 g, 15 minutos, 4 °C)). Las membranas plasmaticas se colocan a continuacion en la interfase del sistema bifasico, por afinidad hacia las dos fases. Despues de la recuperacion, se realizaron 2 lavados en un tampon de sacarosa 0,25 M, Tris HCl 1 M (100 000 g, 30 minutos, 4 °C). Las membranas se conservaron en este mismo tampon a -80 °C hasta su utilizacion). Entre los protocolos de adsorcion y de formulacion sometidos a ensayo, el que parece ser el mas eficaz pone en presencia las membranas y las microesferas sin revestimiento previo en tampon Tris a pH 6,8. Otros protocolos de adsorcion optimos para las fracciones proteicas, vesiculas de membrana, cuerpos apoptoticos y exosomas estan en proceso de elaboracion. Estos protocolos se validan mediante radioetiquetado de las fracciones proteicas con I125, por inmunofluorescencia directa de marcadores de membrana con microscopia confocal y a continuacion mediante el analisis de la actividad de las estructuras adsorbidas.

Ejemplo de adsorcion de membranas plasmaticas de celulas GS-9L en las microesferas de PLGA (no reivindicado): La preparacion de membranas plasmaticas purificadas se sonico durante 30 segundos para reducir el tamano de los agregados de vesiculas de membrana. El equivalente de 10 pg de proteinas de membrana se colocaron a continuacion en presencia de 20 000 microesferas de PLGA. El conjunto se coloco bajo rotacion (60 rpm) durante toda la noche a 4 °C.

Con el fin de determinar la cantidad de proteinas de membrana recuperadas, se realizo una dosificacion aplicando el ensayo de Lowry. La concentracion proteica de las muestras se pudo calcular utilizando una gama patron de BSA (comprendida entre 0,2 y 1 pg/pl). La alicuota, denominada alicuota inicial (Ai), extraida al comienzo de la

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purificacion (justo despues de la lisis) y que contiene el conjunto de las proteinas de la celula, presentaba una concentracion proteica entre 7000 y 10 000 ug/ul. Por el contrario, al final del enriquecimiento, se obtiene una concentracion de proteina entre 200 y 300 ug/ul. Por lo tanto, los inventores recuperaron un 3 % de las proteinas totales.

El perfil de las proteinas aisladas se analizo por migracion sobre gel de poliacrilamida mostrando un perfil de migracion intermedia de los perfiles de las fracciones solubles y no solubles de los lisados celulares. La fraccion no soluble es la que contiene predominantemente proteinas de membrana. La dosificacion de la actividad especifica de la 5’-nucleotidasa y del ligando de Fas-ligado mediante transferencia de Western es coherente con un enriquecimiento de estas proteinas de membrana, lo que demuestra la naturaleza de membrana del material de enriquecido. La inmunofluorescencia directa de marcadores de membrana con microscopia confocal (5’-nucleotidasa integrina, ICAM-1) confirma la fijacion de las proteinas de membrana sobre la microparticula.

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   REIVINDICACIONES

   1. Micropartfcula a base de un material biocompatible y biodegradable, dicha particula comprende en su superficie celulas de interes elegidas entre celulas embrionarias o celulas madre y comprende moleculas de al menos una sustancia activa sobre dichas celulas o su entorno durante el implante de las micropartfculas elegida entre factores de crecimiento, citoquinas, inmunomoduladores o factores que actuan sobre la diferenciacion celular, siendo dichas moleculas liberadas por las micropartfculas de forma prolongada y controlada,

   estando dicha micropartfcula revestida con un compuesto que permite la adhesion de las celulas, siendo ademas dicho compuesto opcionalmente activo sobre dichas celulas, elegido entre poli-D-lisina, poli-L-lisina, poliornitina, polietilenamina, o molecula sintetica o no que pertenezca a la matriz extracelular elegida entre similar a fibronectina, polimeros sinteticos sobre los que se injertan secuencias RGD o lisina o una mezcla de los mismos, y dicha micropartfcula tiene un diametro comprendido entre 10 y 500 pm, y dicho material biodegradable y biocompatible es un polimero o un copolimero de poliester.
2. 2. Micropartfcula de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el poliester es un poli (a-hidroxiacido).
3. 3. Micropartfcula de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que el poli (a-hidroxiacido) es una polilactida o una polilactida co-glicolido.
4. 4. Micropartfcula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que las moleculas incorporadas en las micropartfculas son las de al menos una sustancia activa elegida entre el grupo de los factores de crecimiento.
5. 5. Micropartfcula de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que dicha sustancia activa se elige entre el grupo que comprende NGF, BNDF, NT-3, los TGFp, la familia del GDNF, los FGF, EGF y PDGF.
6. 6. Micropartfcula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, teniendo dicha micropartfcula un diametro de 60 pm.
7. 7. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, siendo dichas celulas madre celulas madre nerviosas o celulas madre mesenquimales de la medula osea.
8. 8. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en las que dichas moleculas son liberadas por las micropartfculas de forma prolongada y controlada durante al menos 15 dias.
9. 9. Micropartfculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su utilizacion para la reparacion tisular.