ES2621452T3 - Método para retirar impurezas de material biopolimérico - Google Patents

Abstract

Método de reducción de los niveles de lipopolisacárido en un material biopolimérico 5 que contiene lipopolisacáridos, comprendiendo dicho método las etapas consecutivas de: a. Proporcionar una solución acuosa que contiene 0,05-50 % en peso de material biopolimérico que contiene lipopolisacárido disuelto; 0,001-10 % en peso de un surfactante; 0,05-15 % en peso de sólido adsorbente; y al menos 50 % en peso de agua; b. Permitir que el adsorbente adsorba lipopolisacáridos; c. Separar el adsorbente sólido que contiene lipopolisacáridos adsorbidos de la solución acuosa restante mediante centrifugación, sedimentación o filtración; y d. Recuperación del material biopolimérico que contiene un nivel reducido de lipopolisacáridos de la solución acuosa separada; donde el material biopolimérico es un alginato.

Description

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Metodo para retirar impurezas de material biopolimerico Campo tecnico de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a un metodo para eliminar endotoxinas, tales como lipopolisacaridos, a partir de material biopolimerico, donde el material biopolimerico es un alginato.

El metodo de la presente invencion permite la produccion de materiales biopolimericos que contienen niveles extremadamente bajos de lipopolisacaridos.

El presente metodo es muy solido y no requiere equipos sofisticados, intensivos en capital.

Antecedentes de la invencion

[0002] Los lipopolisacaridos son endotoxinas potenciales, es decir, compuestos toxicos, naturales encontrados dentro de patogenos internos tales como bacterias.

Clasicamente, una "endotoxina" es una toxina, que a diferencia de una "exotoxina", no se segrega en forma soluble por bacterias vivas, sino que es un componente estructural de las bacterias que se libera principalmente cuando las bacterias son lisadas.

[0003] El lipopolisacarido (LPS) o lipo-oligo-sacarido (LOS) es un ejemplo prototfpico de una endotoxina que se encuentra en la membrana externa de varias bacterias gram-negativas.

El termino LPS se usa a menudo de forma intercambiable con endotoxina, debido a su descubrimiento historico.

En el siglo XIX se entendio que las bacterias podrfan segregar toxinas en su ambiente, lo que se conocio ampliamente como "exotoxina". El termino endotoxina vino del descubrimiento de que partes de bacterias gram-negativas en si mismas pueden causar toxicidad, por lo tanto la nombrada endotoxina. Estudios sobre la endotoxina de los siguientes 50 anos revelaron que los efectos de "endotoxina" eran de hecho debido a los lipopolisacaridos. La unica bacteria gram- positiva conocida que produce endotoxina es la Listeria monocytogenes.

[0004] LPS consisten en una cadena de polisacaridos (azucar) y una fraccion lipfdica, conocida como lfpido A que son responsables de los efectos toxicos.

La cadena polisacarida consiste en bacterias muy variables diferentes.

LPSs son de aproximadamente 10 kDa en tamano pero puede formar agregados grandes de hasta 1000 kDa.

Los seres humanos son capaces de producir anticuerpos a LPSs despues de la exposicion pero generalmente se dirigen a la cadena de polisacaridos y no protegen contra una amplia variedad de endotoxinas.

La inyeccion de una pequena cantidad de LPS en seres humanos voluntarios produjo fiebre, una reduccion de la presion sangufnea, y activacion de inflamacion y coagulacion.

LPSs son en parte grande responsables de las manifestaciones clfnicas dramaticas de infecciones con bacterias gram- negativas patogenas, tales como de Neisseria meningitidis, el patogeno que causa meningitis fulminante.

[0005] En la producdon farmaceutica, es necesario eliminar LPSs de contenedores de medicamentos, puesto que incluso cantidades pequenas de esta endotoxina provocaran padecimientos, que no enfermedad, en seres humanos. Normalmente, se usa para este proposito un horno de depirogenacion.

Se requieren temperaturas de aproximadamente 400 °C para descomponer esta sustancia.

Con base en material de embalaje primario como jeringas o viales, una temperatura de vidrio de 250°C y un tiempo de retencion de 30 min es normal para conseguir una reduccion de 3log en los niveles de endotoxina.

[0006] Asimismo, se debe asegurar que las endotoxina sean retiradas de biopolfmeros de calidad farmaceutica, tales como alginato, goma xantana y gelatina.

Con este fin, se han propuesto diferentes metodos en el estado de la tecnica.

[0007] El documento WO 93/13136 describe un proceso para la purificacion de polisacaridos que comprende:

• La filtracion de una solucion de polisacaridos que tiene una concentracion inferior a 1% a traves de un primer filtro de nitrocelulosa con un tamano de poros de al menos 45 micras;

• La filtracion de la solucion resultante a traves de un segundo filtro de nitrocelulosa con un tamano de poros inferior a 12 micras;

• La filtracion de la solucion resultante a traves de una membrana con un tamano de poros inferior a 12 micras, donde dicha membrana se modifica con polipeptidos para enlazar impurezas hidrofobicas; y

Dializar la solucion resultante con una membrana con un tope de peso molecular inferior a la primera membrana de ultrafiltracion.

[0008] El proceso descrito en el documento WO 93/13136 no es adecuado para el tratamiento de soluciones viscosas y no es muy solido.

[0009] El documento US 5,589,591 describe un metodo para hacer una composicion de arabinogalactano altamente

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purificada, sustancialmente sin endotoxina, que comprende las etapas de:

(i) La eliminacion de una preparacion que contiene arabinogalactano por ultrafiltracion, materiales de un peso molecular que son inferiores al peso molecular de la composicion de arabinogalactano, y recoger la fraccion que contiene arabinogalactano de la misma;

(ii) a partir de ahf, eliminacion de la fraccion que contiene arabinogalactano por ultrafiltracion, endotoxina y materiales de un peso molecular que son mayores que el peso molecular de arabinogalactano; y

(iii) recoger la fraccion resultante que contiene arabinogalactano, que ha resultado sustancialmente sin endotoxina.

[0010] Lo que se ha dicho anteriormente en relacion al documento WO 93/131 36 se aplicable igualmente a esta Patente de EE.UU.

[0011] El documento WO 00/09566 describe un metodo para obtener alginato ultrapuro, donde dicho metodo comprende las etapas de:

• Extraccion de un material disuelto consistente en algas o alginato crudo que utiliza un agente complejante tal como EDTA o carbon activado;

• Filtracion de la solucion;

• Precipitacion del alginato contenido en la solucion; y

• Recuperacion del alginato precipitado.

[0012] El documento WO 00/09566 describe tambien una forma de realizacion donde antes de la filtracion los componentes celulares y partfculas se sedimentan con la ayuda de agentes aglutinantes porosos tales como diatomita, celulosa o materiales de reciclaje a partir de fuentes renovables. El proceso descrito en la solicitud de patente internacional tiene el inconveniente de que los agentes aglutinantes porosos son diffciles de precipitar a partir de fluidos viscosos, incluso a fuerza centrffuga aumentada. Si tales fluidos viscosos muestran adicionalmente una alta densidad especffica, es casi imposible separar el material insoluble de la fase acuosa.

[0013] El documento US 6,451,772 divulga un metodo para la preparacion de una composicion de biopolfmero que comprende una sal de un biopolfmero con un contenido de endotoxina menor que aproxmadamente 100 unidades de endotoxina por gramo, que comprende las etapas de

(i) contactar una solucion acuosa de una sal de biopolfmero con un material hidrofobico, tales como poliestireno, polipropileno o polfmeros de fluorocarbono, para adsorber endotoxina sobre dicho material; y

(ii) precipitacion de la sal de biopolfmero que tiene un contenido de endotoxina inferior a aproximadamente 100 unidades de endotoxina por gramo a partir de la solucion mediante la mezcla de un solvente organico mezclable con agua con la solucion.

[0014] La patente de EE.UU. tambien describe un metodo donde la etapa de precipitacion se sustituye por una extraccion lfquido-lfquido utilizando un solvente no mezclable con agua. Ademas, se menciona que en el caso de alginatos, la solucion de biopolfmero acuosa se puede contactar con carbon activado para eliminar polifenoles. Inconvenientes importantes del metodo descrito en el documento US 6,451,772 son que (i) es imposible practicamente evitar la coprecipitacion de la sal de biopolfmero y el material hidrofobico despues de la adicion del fluido organico mezclable con agua y (ii) poca transferencia de masa durante la extraccion lfquido-lfquido.

[0015] El documento EP-A 0 072 513 describe un proceso para la preparacion de un polisacarido bacteriano capsular antigenico a partir de un medio de cultivo o una solucion que comprende al menos un paso de precipitacion por formacion de un complejo entre un derivado poliionico del medio - siendo el derivado poliionico al menos dicho polisacarido - y una sal de amonio cuaternario, donde al menos una precipitacion del complejo se realiza en un soporte poroso inerte constituido por celulosa, una sal de metal alcalinoterreo sustancialmente insoluble en agua, hidroxido u oxido alumfnico, oxido de silicona, un silicato o un aluminosilicato.

En el ejemplo 1 de la solicitud de patente europea Celite ® 545 (diatomita) y Cetavlon® (un surfactante cationico) se agregan a una masa fermentada que contiene polisacarido bacteriano.

Despues de 5 horas, un complejo de polisacarido/Cetavlon® y de Celite ® 545 se afslan por la decantacion del sobrenadante.

[0016] O. Adam et al. (Anal.Biochem 225 (1995), 321-327 describe un metodo para eliminar endotoxinas de exopolisacaridos por una separacion de fase inducida por la temperature con Triton X-114. D. Petsch & F.B. Anspach, Journal of Biotechnology 76 (2000), 97- 119 describe tambien un metodo para eliminar endotoxinas basado en Triton X- 114. Los procesos descritos en estos papeles tienen diferentes desventajas. Debido a la naturaleza heterogenica de la endotoxina y la distribucion de equilibrio de LPS en los sistemas de lfquido de 2 fases, la reduccion de la endotoxicidad final del alginato esta limitada. Ademas, el metodo no es adecuado para el tratamiento de fluidos viscosos a menos que se apliquen fuerzas centrffugas muy altas para separar las fases.

Finalmente, es muy diffcil separar de forma cuantitativa la fase lfquida superior de la fase lfquida inferior, causando que el proceso no sea muy solido.

Resumen de la invencion

[0017] Los inventores han desarrollado un metodo particularmente solido para la reduccion de niveles de LPS en

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alginatos. El metodo de la presente invencion se puede poner en practica en equipo estandar.

Ademas, el presente metodo se puede usar ventajosamente para conseguir reducciones de 4log en exceso en los niveles LPS, dando como resultado niveles de endotoxina que son suficientemente bajos (bastante debajo de 30 unidades de endotoxina /g) para hacer posible el uso de biopolfmeros tratados en la cirugfa, incluyendo cirugfa craneal y espinal. El metodo de la presente invencion se caracteriza por que comprende las etapas sucesivas de:

a) proporcionar una solucion acuosa que contiene 0,05-50 % en peso de material biopolimerico que contiene LPS disuelto; 0,001-10 % en peso de un surfactante; 0,05-15 % en peso de solido adsorbente y al menos 50 % en peso de agua;

b) permitir que el adsorbente adsorba LPS;

c) separar el adsorbente solido que contiene LPS adsorbido de la solucion acuosa restante; y

d) recuperacion del material biopolimerico con un nivel reducido de LPS de la solucion acuosa separada.

[0018] Los implantes craneales y espinales tienen que cumplir los estandares mas altos en cuanto a los niveles de LPS puesto que cualquier LPS presente en estos implantes puede filtrarse en el fluido intratecal, que esta en contacto directo con el cerebro (barrera cerebral sin sangre).

En EE.UU los implantes y farmacos craneales y espinales pueden contener no mas de 14 unidades de endotoxina (EU) por dis positivo.

El contenido ultrabajo de LPS de los biopolfmeros obtenidos por el presente metodo hace posible emplear estos biopolfmeros en dispositivos medicos (por ejemplo sellantes) para cirugfa espinal (por ejemplo, procedimientos de laminotomfa o laminectomfa lumbar posterior para reducir la formacion de cicatriz epidural postoperatoria) o cirugfa craneal (por ejemplo sellado de la dura despues de la cirugfa por aplicacion de sellante sobre suturas para prevenir la fuga de fluido cerebroespinal).

Dispositivos medicos que contienen biopolfmeros ultrapuros (por ejemplo, alginatos) obtenidos por el presente metodo se pueden aplicar a la cirugfa espinal o craneal sin el riesgo de superar el lfmite superior anteriormente mencionado de 14 unidades de endotoxina.

[0019] Aunque los inventores no desean estar atados por la teorfa, se cree que el surfactante empleado en el presente metodo causa disolucion de agregados de LPS que tfpicamente tienen un tamano de aproximadamente 1 MDa. La disolucion de estos agregados facilita inmensamente el aislamiento eficaz de los LPSs conforme a la presente invencion.

Ademas, a diferencia de los sistemas de extraccion de lfquidos de 2 fases de la tecnica anterior, el presente metodo emplea un sistema de extraccion de 3 fases en el que el equilibrio se empuja hacia la fase solida, permitiendo asf que se consigan reducciones extraordinarias de los niveles de LPS.

[0020] En el presente metodo, el aislamiento de LPS del material biopolimerico se consigue usando un adsorbente solido para adsorber los LPSs que han llegado a dispersarse en la fase acuosa. El aislamiento de desagregados de los LPSs del biopolfmero y la fase acuosa se consigue de una manera muy eficaz, permitiendo que los LPSs sean adsorbidos por el adsorbente y sean eliminados posteriormente por el adsorbente mediante, por ejemplo, sedimentacion, centrifugacion o filtracion. Se descubrio que el adsorbente solido no solo retiro eficazmente los LPSs de la solucion biopolimerica, sino tambien el surfactante.

[0021] Para conseguir reducciones muy altas en los niveles de LPS, la secuencia anteriormente mencionada de las etapas a) hasta c) se puede repetir varias veces hasta que el contenido de LPS del biopolfmero se haya reducido hasta el nivel deseado.

Descripcion detallada de la invencion

[0022] Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un metodo de la reduccion de los niveles de LPS en un material biopolimerico que contiene LPS, donde el material biopolimerico es un alginato, que comprende las etapas consecutivas de:

a) proporcionar una solucion acuosa que contiene 0,05-50 % en peso de material biopolimerico que contiene LPS disuelto; 0,001-10 % en peso de un surfactante; 0,05-15 % en peso de solido adsorbente; y al menos 50 % en peso de agua;

b) permitir que el adsorbente adsorba LPSs;

c) separar el adsorbente solido que contiene los LPSs adsorbidos de la solucion acuosa restante; y

d) recuperacion del material biopolimerico con un nivel reducido de LPS de la solucion acuosa separada.

[0023] El termino "biopolfmero" como se utiliza en este caso se refiere a alginatos

[0024] En el presente metodo los LPSs se pueden adsorber directa y/o indirectamente por el adsorbente solido.

La adsorcion indirecta puede ocurrir, por ejemplo, si una fase surfactante que contiene LPS se liga por el adsorbente solido. Debido a la naturaleza anfifflica de surfactantes y muchos LPSs, el presente metodo puede emplear adecuadamente adsorbentes hidrofflicos (por ejemplo arcillas) asf como adsorbentes hidrofobicos (por ejemplo carbon activado) para eliminar los LPSs,

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[0025] Estan disponibles varios ensayos biologicos para medir los niveles de LPS, tal como la prueba de pirogeno de conejo (Farmacopea de EEUU (1960) 16a revision, p. 887. (Farrmacopea de EE.UU. (1960) 16a revision, p. 887. Mack Printing Co., Easton, Pa.) y el ensayo sobre el lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (F.C. Pearson et al., J. Clin Microbial. 21 (1985), 865-868), y el ensayo sobre la mortalidad de embrion de pollo (R.T. Smith, and L. Thomas, J. Exp. Med. 104 (1956) 217-231), y la prueba de mortalidad de ratones cebados de galactosamina (C. Galanos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 59 39-5943.). El ensayo LAL es muy sensible y economico. Se puede conseguir con este ensayo una sensibilidad de 0,02 EU ml-1 (metodo de punto final). El ensayo turbidimetrico cinetico LAL se puede usar adecuadamente incluso si se requiere sensibilidad mas alta (J.F. Remillard et al., Prog Clin Biol Res. 231 (1987) 197210), y particularmente se aplica a criba de placa.

[0026] Segun una forma de realizacion particularmente preferida de la presente invencion, el surfactante empleado en el presente metodo es un surfactante lfquido de formacion de micela, mas particularmente un surfactante de formacion de micela que se puede usar adecuadamente para llevar a cabo una separacion de fase micelar o extraccion en punto de nube (CPE) para eliminar los LPSs de la solucion biopolimerica acuosa.

Por consiguiente, el presente metodo emplea ventajosamente una solucion acuosa que contiene un surfactante de formacion de micela en una concentracion superior a la concentracion de micela crftica, donde esta fase acuosa provoca la separacion de fase en una fase acuosa y una fase surfactante antes de la separacion del adsorbente solido de la fase acuosa restante.

El uso de extraccion en punto de nube en el presente metodo ofrece la ventaja importante de que se retiene una cantidad pequena o ningun residuo de surfactante en el material biopolimerico recuperado libre de lPs.

Los inventores han descubrieron que si se usa una cantidad adecuada de adsorbente solido, no solo se elimina el surfactante de fase separada (dispersada) sino sorprendentemente tambien se eliminaron eficazmente los surfactantes disueltos por el adsorbente. Por tanto, no son necesarias operaciones adicionales de limpieza para eliminar restos de surfactante del material biopolimerico recuperado.

[0027] La extraccion en punto de nube hace uso del hecho de que a bajas concentraciones de surfactante por encima de la concentracion de micela crftica, las soluciones micelares de por ejemplo surfactantes no ionicos o ligeramente polares pueden existir como fases de lfquido isotropico homogeneo.

La separacion de fase se puede producir en este rango de concentracion, por ejemplo, mediante el aumento temperatura a la temperature en la que el surfactante suelta su hidrosolubilidad ("punto de nube").

En muchas de estas separaciones de fase, la fase micelar isotropica unica se separa en dos fases isotropicas, donde ambas pueden contener surfactante, pero difieren en la concentracion total de surfactante.

En la fase surfactante rica en micelares se concentrara cualquier componente organico hidrofobico originalmente presente en la muestra sometida a la etapa de separacion de fase.

[0028] La "concentracion crftica de micela", a menos que se indique lo contrario, se define como la concentracion en la que los surfactantes en la solucion libre estan en equilibrio con surfactantes en forma agregada. La autoorganizacion de las moleculas de un surfactante depende de la concentracion del surfactante presente en la solucion. Por debajo de la concentracion crftica de micela, los surfactantes forman una capa unica en la superficie lfquida y estan dispersados en la solucion.

A la primera concentracion crftica de micela (CMC-I), el surfactante se organiza en micelas esfericas, en la segunda concentracion crftica de micela (CMC-II) en tuberfas alargadas, y en el punto laminar (LM o III de CMC) en laminas apiladas de tuberfas.

[0029] En el metodo de extraccion en punto de nube de la presente invencion se puede usar cualquier surfactante de formacion de micela, suponiendo que resultara factible provocar la separacion de fases de la solucion micelar. Ventajosamente, el presente metodo emplea un surfactante de formacion de micela que despues de la separacion de fase, forma gotitas con una densidad que excede la densidad de la fase de biopolfmero acuoso. Por tanto, se puede asegurar que bajo la influencia de la fuerza de gravedad y/o centrffuga tanto la fase de surfactante como el adsorbente solido se acumularan como un sedimento que se puede separar facilmente mediante por ejemplo simple decantacion. Por consiguiente, conforme a una forma de realizacion preferida, en la "temperatura en punto de nube", el surfactante de formacion de micela tiene una densidad de mas de 1,03 g/ml, preferiblemente mas de 1,05 g/ml.

[0030] La separacion de fase de la solucion acuosa micelar en una fase acuosa y una fase surfactante se produce preferiblemente sometiendo la solucion a aumento de temperatura, adicion de sal, cambio de pH y/o estres osmotico.

De la forma mas preferible, la separacion de fase se consigue mediante el aumento de temperatura de la solucion acuosa.

Segun una forma de realizacion particularmente preferida del presente metodo, la solucion acuosa micelar tiene una temperatura en el rango de 0-99 °C, mas preferiblemente en el rango de 5-95 °C y la separacion de fase se produce mediante el aumento de temperatura de al menos 5 °C, preferiblemente de al menos 10 °C.

[0031] Preferiblemente, el surfactante empleado en el presente metodo es un polisacarido no ionico o anionico. Segun una forma de realizacion particularmente preferida, el surfactante es un surfactante no ionico. Los surfactantes no ionicos ofrecen la ventaja de que la separacion de fase se puede conseguir de forma relativamente facil, por ejemplo, mediante el aumento temperatura.

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Ejemplos de surfactantes no ionicos de formacion de micela que se pueden usar adecuadamente son:

• Alquiilfenol etoxilados representados por la formula CxH2x+1-C6H4-O-(C2H4O)nH, donde:

- x esta en la gama de 4-12; y

- n esta en la gama de 4-12

• Nonilfenoxi polietoxietanoles representado por la formula C15H24O(C2HO)n, donde n esta en la gama de 340, preferiblemente en la gama de 4-30

Monoesteres de sorbitano de polietilenglicol de acidos grasos con una longitud de cadena de 12-18 atomos de carbono (TWEEN), preferiblemente CH3(CH2)10CO2 (laureato) o CH3(CH2)7C2H2(CH2)7CO2- (oleato)

• 3-([3-Cholamidopropil]dimetilammonio)-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO)

[0032] En cuanto a los nonilfenoxi polietoxietanoles (nonoxinoles), nonoxinol-4 (n=4), nonoxinol-15 (n=15) y nonoxinol- 30 (n=30) son particularmente preferidos.

[0033] De la forma mas preferible, el surfactante de formacion de micela es un alquilfenol etoxilado tal y como se ha definido aquf anteriormente, donde x=8 y 7 <n<10.

Ejemplos de tales alquilfenol etoxilados son octilfenol etoxilados, tales como Triton X-114 y Triton X-100.

[0034] La cantidad de surfactante empleada en la solucion acuosa de inicio esta tfpicamente en la gama de 0,01-10 % en peso.

Preferiblemente, el surfactante se emplea en la solucion acuosa en una concentracion en la gama de 0,1-5 % en peso, de la forma mas preferible en la gama de 0,5-2 % en peso.

[0035] Una ventaja importante del presente metodo reside en el hecho de que se puede usar para procesar soluciones biopolimericas acuosas altamente viscosas, concentradas.

Por consiguiente, en una forma de realizacion preferida del presente proceso, la fase acuosa separada tiene una viscosidad cinematica de al menos 100 cSt a 20 °C.

Aun mas preferiblemente, la viscosidad cinematica a 20 °C es de al menos 500 cSt.

De la forma mas preferible, dicha viscosidad es de al menos 2500 cSt.

Normalmente, la viscosidad cinematica de la fase acuosa separada no excede de 15000 cSt a 20 °C.

La viscosidad cinematica puede estar determinada adecuadamente con un viscosfmetro de flujo inverso de tubo en U o un viscosfmetro rotativo Synchro-Lectric.

[0036] El adsorbente solido empleado en el presente proceso es insoluble en la solucion acuosa y tiene que ser capaz de adsorber LPS directa o indirectamente. Preferiblemente, el adsorbente solido es capaz de adsorber el surfactante que se usa en el presente metodo puesto que esto ayudara a evitar la contaminacion del material biopolimerico tratado con restos de surfactante. Ejemplos de adsorbentes solidos que se pueden emplear adecuadamente incluyen carbon activado, arcillas adsorbentes y combinaciones de los mismos. Ejemplos de arcillas adsorbentes incluyen: aluminio filosilicato, montmorillonita (y otros minerales del grupo de esmectita), sepiolita, dicalita, perlita, diatomita, caolinita, illita, zeolita, tierra diatomacea y combinaciones de los mismos.

De la forma mas preferible, la arcilla adsorbente es aluminio filosilicato adsorbente.

[0037] Resultados particularmente buenos se obtienen en el caso de que un adsorbente hidrofobico, tal como carbon activado, se emplee como el material adsorbente. Por lo tanto, segun una forma de realizacion preferida, el adsorbente solido comprende carbon activado. Aun mas preferiblemente, el adsorbente es carbon activado.

[0038] Segun otra forma de realizacion preferida, el adsorbente solido es una arcilla (por ejemplo un aluminio filosilicato absorbente). Las arcillas ofrecen la ventaja de que sedimentan rapidamente y que practicamente ningun adsorbente residual permanece en suspension. Ademas, los inventores han observado que estos minerales son un adsorbente muy eficaz de tanto el surfactante disperso como disuelto. Esta observacion se confirma por las conclusiones de A.G. Epantaleon et al., Use of activated clays in the removal of dyes and surfactants from tannery waste waters, Applied Clay Science 24 (2003) 105-110.

[0039] Otra propiedad ventajosa de las arcillas es su capacidad para arrastrar gotitas dispersadas y/o partfculas dispersadas.

Asf, cuando una capa de estos adsorbentes es introducida cerca de la superficie de la solucion de biopolfmero acuoso, dicha capa adsorbente descendera gradualmente al fondo del contenedor que retiene la solucion mientras simultaneamente filtra cualquier material disperso, tales como partfculas de carbon activado o gotitas de surfactante.

[0040] Se ha observado que el uso combinado de un adsorbente hidrofobico y una arcilla adsorbente, tal como aluminio filosilicato, permite una eliminacion muy eficaz del surfactante.

Aunque los inventores no desean estar atados por la teorfa, se cree que, especialmente si se consigue separacion del adsorbente solido por centrifugacion prolongada, la arcilla adsorbente forma la capa superior del sedimento y afsla el adsorbente hidrofobico subyacente al igual que el surfactante adsorbido sobre dicho adsorbente hidrofobico.

Como resultado, se minimiza eficazmente la contaminacion del sobrenadante durante por ejemplo la decantacion.

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[0041] En una forma de realizacion preferida, el adsorbente solido empleado en el presente metodo es un adsorbente microporoso. El uso de un adsorbente microporoso ofrece la ventaja de que se obtiene un area de superficie excepcionalmente alta, que se requiere para agrandar las relativamente debiles "fuerzas de dispersion de London".

El adsorbente solido microporoso empleado en el presente metodo tiene preferiblemente una microporosidad (MPV) de al menos 0,02 cm3g-1, de la forma mas preferible de al menos 0,25 cirrg'1 y un area de superficie BET (Sbet) de al menos 100 m2g-1, de la forma mas preferible de al menos 800 m2g-1.

[0042] El uso de una cantidad excesiva de solido adsorbente ofrece la ventaja importante que, en caso de extraccion en punto de nube, la fase surfactante es esencialmente adsorbida completamente sobre el material adsorbente, formando asf una masa solida que se puede separar muy facilmente por tecnicas de separacion solido-lfquido bien conocidas para un experto en la tecnica. Preferiblemente, el adsorbente solido que contiene la fase surfactante adsorbida es mas pesado que la fase de biopolfmero acuoso, de modo que sedimentara bajo la influencia de fuerza de gravedad y/o centrffuga.

[0043] En el presente metodo la concentracion de surfactante en la solucion acuosa restante despues de la separacion del absorbente solido es de al menos 50 veces, preferiblemente al menos 2500 veces inferior a la concentracion de surfactante en la solucion acuosa de inicio.

Tfpicamente la concentracion de surfactante en la solucion acuosa restante despues de la separacion es inferior a 200 mg/kg, de la forma mas preferible menos de 4 mg/kg.

[0044] Los inventores han observado que el material adsorbente solido, despues de haber adsorbido la fase de surfactante, forma una especie de sedimento de pastel que puede retirarse facilmente mediante, por ejemplo, centrifugacion o filtracion.

Sin embargo, particularmente si el adsorbente solido contiene partfculas muy pequenas (por ejemplo en caso de carbon activado) y/o en el caso de que la solucion de biopolfmero acuoso sea muy viscosa, estas partfculas muy finas pueden permanecer suspendidas en la fase acuosa incluso despues de la separacion de la fase surfactante.

[0045] De forma imprevista, se descubrio que el carbon activado se puede retirar de forma cuantitativa anadiendo una arcilla adsorbente antes de la separacion de la fase acuosa de la fase surfactante. Se consigue la eliminacion practicamente cuantitativa de partfculas adsorbentes muy pequenas aunque la fase acuosa es altamente viscosa. En cambio, tecnicas de separacion solido-lfquido bien conocidas, tales como filtracion y centrifugacion, no son adecuadas para conseguir la eliminacion cuantitativa de partfculas adsorbentes de soluciones de biopolfmero viscoso.

Ademas, se ha observado que el uso combinado de carbon activado y arcilla adsorbente permite la eliminacion practicamente completa de LpSs.

Asf, segun una forma de realizacion preferida, la separacion de la fase acuosa de la fase surfactante comprende la adicion de carbon activado y arcilla adsorbente. De la forma mas preferible, la arcilla empleada en el presente metodo es una arcilla expansiva. Las arcillas no hinchables son menos adecuadas, especialmente si se utiliza el presente metodo para tratamiento de biopolfmeros cuya gelificacion se desencadena por cationes divalentes o trivalantes.

[0046] La arcilla adsorbente se usa ventajosamente en el presente metodo en una cantidad que excede al carbon activado.

De la forma mas preferible, la arcilla adsorbente se emplea en una cantidad 50% superior en peso al carbon activado. Expresado de forma diferente, la arcilla adsorbente se emplea preferiblemente en una cantidad de 1-10 % en peso, mas preferiblemente en una cantidad de 2-4 % en peso de la solucion acuosa.

[0047] En el presente metodo el adsorbente solido se puede incorporar en la solucion acuosa a etapas diferentes.

En principio, el adsorbente se puede dispersar en el agua incluso antes de anadir el surfactante.

Preferiblemente, sin embargo, el adsorbente se anade a la solucion despues de haber anadido el surfactante, y en caso de que se use un surfactante de formacion de micela, despues de que haya tenido lugar la separacion de fase en la fase surfactante y la fase acuosa.

[0048] Normalmente, el adsorbente solido se emplea en el presente metodo en una cantidad de 50-1000% en peso de la fase surfactante separada. Preferiblemente, el adsorbente se emplea en una cantidad de 100-300% en peso de la fase surfactante separada. Expresado de forma diferente, el adsorbente se emplea ventajosamente en una cantidad de 0.1-10% en peso de la solucion acuosa.

De la forma mas preferible, la cantidad empleada de adsorbente esta en el rango de 1-3% en peso de la solucion acuosa.

[0049] Tal y como se menciona aquf, el presente metodo puede usarse ventajosamente para eliminar LPSs.

[0050] Segun una forma de realizacion preferida, el material biopolimerico es de origen microbiano. Para el proposito de esta invencion, los biopolfmeros producidos por microorganismos recombinantes se consideran tambien biopolfmeros de origen microbiano.

[0051] Ejemplos de biopolfmeros de origen microbiano que puede ser despirogenados adecuadamente mediante el

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presente metodo incluyen alginato.

[0052] Segun una forma de realizacion parti cularmente preferida, el biopolfmero de origen microbiano es una sal de alginato, preferiblemente alginato de sodio.

[0053] El presente metodo es particularmente adecuado para despirogenar alginatos con un peso molecular particularmente alto. Por consiguiente, en otra forma de realizacion preferida, al menos el 80 % en peso del alginato que contiene LPS tiene un peso molecular de al menos 10 kDa (es decir, al menos 50 subunidades monomericas).

[0054] Normalmente, la solucion acuosa empleada en el presente proceso contiene de 0.1-50 % en peso de material biopolimerico. Como se ha explicado aquf anteriormente, las ventajas del presente metodo son particularmente pronunciadas en el caso de que la solucion acuosa contenga un nivel alto de material biopolimerico, puesto que el presente metodo se puede usar adecuadamente para despirogenar soluciones altamente viscosas. Por consiguiente, en una forma de realizacion particularmente preferida, la solucion acuosa contiene al menos 1 % en peso de material biopolimerico.

[0055] En el metodo segun la presente invencion la separaaon de la fase acuosa de la fase surfactante se consigue adecuadamente eliminando el adsorbente solido que contiene la fase surfactante adsorbida y LPS. Dicho adsorbente se puede retirar de la fase acuosa usando metodos de separacion solido-lfquido bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, centrifugacion, sedimentacion, filtracion etc.

[0056] Despues de la eliminacion del adsorbente solido, el material biopolimerico se puede separar de la fase acuosa usando una variedad de metodos incluyendo precipitacion, cristalizacion y secado. Segun una forma de realizacion particularmente preferida, el material biopolimerico es aislado del acuoso separado por medio de precipitacion. Aun mas preferiblemente, la recuperacion del material biopolimerico de la fase acuosa separada implica la precipitacion del material biopolimerico anadiendo al menos 10% en peso de agua de un solvente organico que es mezclable con agua. Ejemplos de solventes organicos que pueden ser usados adecuadamente incluyen alcoholes primarios C1-3, dioles C2-4, trioles C3-4, 2-propanol, cetonas C2-3 y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, el solvente organico es seleccionado del grupo consistente en etanal, n-propanol, i-propanol, acetona y combinaciones de los mismos.

De la forma mas preferible, el solvente organico empleado es etanol.

[0057] Los inventores han descubrieron que el solvente organico se puede retirar muy eficazmente del material biopolimerico precipitado por el aislamiento del precipitado y secandolo posteriormente por la extraccion de este con un gas licuado, un gas subcrftico o un gas supercrftico.

El termino "gas subcrftico", como se utiliza en este caso, se refiere a un gas comprimido que no esta ni en un estado supercrftico ni licuado, sino que ha sido presurizado a al menos 10 bar, preferiblemente a al menos 20 bar. Preferiblemente, el gas supercrftico, subcrftico o licuado tiene una presion de al menos 0.3xPc y una temperatura de al menos Tc-60 °C, representando Pc la presion crftica del gas y representando Tc la temperatura crftica del gas.

En el presente proceso, el gas usado para extraer el solvente organico tiene preferiblemente una presion de al menos 10 bar, aun mas preferiblemente de al menos 20 bar

[0058] El gas licuado, subcrftico o supercrftico es seleccionado ventajosamente del grupo consistente en dioxido de carbono, oxido nitroso, etano, etileno propano, ciclopropano, propileno, butano, argon, nitrogeno y combinaciones de los mismos.

De la forma mas preferible, el gas empleado para secar el precipitado es dioxido de carbono.

[0059] Como se ha mencionado aquf anteriormente, el presente metodo puede ser empleado ventajosamente para reducir los niveles de LPS del alginato a niveles de traza o incluso menos.

Normalmente, el alginato recuperado obtenido por el presente proceso contiene menos de 100 unidades de LPS por gramo de alginato, mas preferiblemente menos de 10 unidades de LPS por gramo de alginato. La reduccion en el nivel de LPS conseguido en el presente proceso excede normalmente de un factor 1025. Aun mas preferiblemente, la reduccion en el nivel de LPS conseguida en el presente proceso excede de un factor 103. De la forma mas preferible, el ultimo factor de reduccion excede de 1035.

[0060] El presente metodo es particularmente adecuado para eliminar los lipopolisacaridos que contienen lfpido A Por consiguiente, en una forma de realizacion preferida de la invencion, el contenido de lfpido A del material biopolimerico recuperado es al menos 1025 veces inferior, mas preferiblemente al menos 103 veces inferior y de la forma mas preferible al menos 1035 veces inferior al contenido de lfpido A del material biopolimerico de inicio.

[0061] Como explicado aquf anteriormente, la presente invencion permite la fabricacion de alginatos ultrapuros en los que los niveles de LPS han sido reducidos hasta un nivel tan extremadamente bajo que se pueden usar en dispositivos medicos para cirugfa espinal o craneal.

Por tanto, la presente invencion permite la preparacion de dispositivos medicos, tales como sellantes, que se pueden usar en la cirugfa espinal o craneal.

[0062] Segun una forma de realizacion particularmente preferida, el alginato empleado en el presente sistema para

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entregar un sellante quirurgico es un alginato obtenido por un metodo como se ha descrito aquf anterionmente.

[0063] El alginato contenido en el presente sistema de entrega contiene ventajosamente menos de 50 EU, mas preferiblemente menos de 30 EU por gramo.

[0064] La invencion se ilustra posteriormente mediante los ejemplos siguientes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

[0065] El alginato de sodio fue disuelto en agua destilada a una concentracion final de 2,5% (p/p) y una viscosidad cinematica de 480 cSt. La viscosidad cinematica fue determinada con un viscosfmetro de flujo inverso en tubo U (Poutten Selfe & abrigo BS/IP/RF tamano 3; c=0.03023). La endotoxicidad fue determinada en 91.000 EU/g utilizando un ensayo turbidimetrico cinetico de Associates of Cape Cod, Inc.

[0066] Despues de anadir 1 vol.% de Triton X-114 (un octilfenol etoxilado con un HLB de 12.3 y que contiene de media 7.5 residuos etoxilatos) la suspension se agito con un mezclador durante 30 minutos a una temperatura justo por debajo del punto en nube del detergente (es decir 23°C a 1% v/v).

Posteriormente, el 3 % en peso del adsorbente aluminio fillosilicato (Montmorillonite, B-3378, ex Sigma-Aldrich) se disperso en la suspension, que fue llevada a 70°C y se agito durante otros 30 minutos.

[0067] Mil quinientos ml's de la suspension asf obtenida fueron transferidos a botellas de spin seco que fueron colocados en un rotor de angulo fijo Sorvall GSA precalentado (70°C).

Despues del centrifugado durante 60 min a 11.000 r.p.m. (27,000 x g) utilizando una centrifugadora Sorvall RC-5B plus, el sobrenadante fue recogido de forma cuantitativa por decantacion. La suspension se agito posteriormente durante 30 minutos a temperatura ambiente y se centrifugo durante 60 minutos a 11.000 r.p.m. La solucion resultante fue decantada y llevada a 60% etanol en peso y permitio la sedimentacion durante 30 min para dejar que precipitara y decolorara.

[0068] Se recogio el precipitado blanco claro y el fluido se exprimio con una prensa.

El precipitado tipo goma fue triturado y resuspendido en alcohol absoluto con la ayuda de una mezcladora. Despues de 30 minutos de compensacion, el precipitado fue recogido con una criba y comprimido. El producto comprimido contenfa todavfa aproximadamente el 75% (p/p) de material lfquido.

[0069] A continuacion, el producto fue vertido en un autoclave de 4,2 litros (UHDE GmbH, Dortmund) que se calento a 95°C mediante una envoltura, usando aceite de calentamiento. El dioxido de carbono fue presurizado a 150 bar utilizando una bomba de embolo (Orlita Prominent, Heidelberg) y se calento a 95°C antes de ser bombeado a traves del material tipo gel a 300 g/min durante 45 min. El producto formado de esta manera en el vaso fue recogido en el filtro en el fondo del vaso. El producto presento una estructura fibrosa como confirmado por S.E.M. y habfa adquirirido 10% de viscosidad (por gramo de producto secado). La recuperacion final fue de casi 85%. La endotoxicidad del producto final fue determinada en 350-400 EU/g, que corresponde a un factor 102.4 de purificacion.

Ejemplo 2

[0070] El alginato de sodio fue disuelto en agua destilada a una concentracion final de 4,5% (p/p) y una viscosidad cinematica de 2700 cSt. La endotoxicidad fue determinada en 91.000 EU/g utilizando un ensayo turbidimetrico cinetico de Associates of Cape Cod, Inc.

[0071] Despues de anadir 1 vol.% de Triton X-114, la suspension se agito con un mezclador para 30 minutos a una temperatura justo por debajo del punto de nube del detergente (es decir 23°C a 1% v/v). Posteriormente, 2 % en peso de carbon activado (Norit SX plus; MPV 0.35 cm3/g; Sbet 1051 m2/g) fue dispersado en la suspension, que fue llevada a 70°C y se agito durante otros 30 min.

[0072] Mil quinientos ml's de la suspension asf obtenida fueron transferidos a botellas Sorvall de spin seco que fueron colocadas en un rotor Sorvall GSA de angulo fijo precalentado (70°C). Despues del centrifugado durante 60 min a

11.000 r.p.m. (27.000 x g) utilizando una centrifugadora Sorvall RC-5B plus, el sobrenadante se recogio de forma cuantitativa por decantacion. En esta fase se descubrio que el producto intermedio, libre esencialmente de carbono, tenia una endotoxicidad de 600 EU/g.

[0073] Las trazas restantes de carbono en el sobrenadante se retiraron por la suspension de 3 % en peso de montmorillonita (Sigma B-3378) y 1% de Triton X-114 en la solucion con una mezcladora.

La suspension fue posteriormente agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugada durante 60 min a

11.000 r.p.m. La solucion resultante fue decantada y llevada a 60% de etanol en peso y se la dejo sedimentar durante 30 min para dejar que el alginato precipitara y decolorara.

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[0074] El precipitado blanco claro se recogio y el fluido fue exprimido con una prensa. El precipitado tipo goma fue triturado y resuspendido en alcohol absoluto con la ayuda de una mezcladora. Despues de 30 minutos de compensacion, el precipitado fue recogido con una criba y se comprimio.

El producto comprimido todavfa contenfa aproximadamente el 75% (p/p) de material lfquido.

[0075] El exceso de alcohol se retiro del producto exprimido por extraccion con dioxido de carbono supercrftico como realizado en el ejemplo 1, con un tiempo de extraccion reducido de 30 minutos.

[0076] El producto esencialmente seco se resolubilizo en agua de grado de inyeccion (esteril y apirogenico, B.Braun, Melsungen AG, Alemania) a una concentracion final de 8.0%. El fluido altamente viscoso (15000 cSt) fue transferido a una bomba de jeringa (ISCO 260D, Teledyne Isco, Lincoln USA) a temperatura ambiente y se pulverizo en un autoclave por medio del agujero central de 0.0013 cm2 de una boquilla coaxial de dos fluidos a 3.3 ml/min. El dioxido de carbono fue pulverizado alrededor del agujero central a traves de una abertura de 0,0122 cm2. El dioxido de carbono fue presurizado a 180 bar utilizando una bomba de embolo (Orlita Prominent, Heidelberg) y calentado a 95°C antes de ser pulverizado a 600 g/min.

El autoclave (UHDE GmbH, Dortmund) fue tambien calentado a 95°C.

[0077] El polvo formado de esta manera en el vaso fue recogido en el filtro en el fondo del vaso. S.E.M. revelaron agregados pequenos de estructuras globales con un diametro de cruce predominante inferior a 5 pm. La endotoxicidad del producto final fue determinada en 25 EU/g, que corresponde a un factor de purificacion 1036.

Ejemplo 3

[0078] Se repitio el Ejemplo 1, excepto que Triton X-114 fue sustituido por 0,1 % en peso de sulfato dodecil de sodio (Sigma L6026). Ademas, como no tiene lugar subdivision de fase con este solido, detergente ionico, la temperatura operativa era temperatura ambiente. Tambien, la concentracion de alginato tenia que bajar a 1,8% (185 cSt) para facilitar la eliminacion por centrifugado del carbon activado.

[0079] Despues de la precipitacion del alcohol, el producto fue secado como se describe en el ejemplo 2.

Aunque se obtuvo una reduccion 103 de la endotoxicidad, el producto todavfa requeria un paso de limpieza adicional para eliminar sulfato dodecil sodico residual.

Ejemplo 4 (no de acuerdo con la invencion)

[0080] Se preparo una solucion acuosa caliente (90°C) de gelatina (13.200 EU/g; 30% p/p).

La solucion fue helada temporalmente hasta justo debajo del punto en nube de Triton X-100 (un octilfenol etoxilaso que comprende de media 9.5 residuos etoxilados y que tiene un HLB de 13.4). Posteriormente, se anadio 1 % de vol. de volumenes de Triton X-100. Despues de la agitacion durante 5 minutos, la suspension fue calentada a 90°C para provocar la separacion de fase. Posteriormente, se disperso en la suspension 2 % en peso de carbon activado prelavado (Norit SX mas). El prelavado de Norit servia para la eliminacion de las particulas mas pequenas.

[0081] La temperatura de suspension fue mantenida a 80°C y agitada durante 30 min. Tres litros de la suspension fueron transferidos a contenedores que se colocaron en un rotor Beckmann JA-10 de angulo fijo precalentado (80°C). Despues de 30 min de centrifugado a 10.000 r.p.m. (17.700 x g) en una centrifugadora Beckman J2-21 superseed, el sobrenadante se decanto suavemente.

Las trazas de carbono fueron retiradas por filtrado de la solucion caliente sobre la lana de vidrio apirogenica que fue colocada encima de un filtro cubierto de arena.

[0082] La solucion caliente clarificada fue transferida a una bomba de jeringa (ISCO 260D, Teledyne ISCO, Lincoln EE.UU) que soportaba una envoltura de calentamiento. La solucion fue pulverizada a 90°C en un autoclave UHDE de 4 litros a traves del agujero central de 0.0013 cm2 de una boquilla coaxial de dos fluidos a 2.5 ml/min.

El vaso fue presurizado con dioxido de carbono a 150 bar utilizando una bomba de embolo (Orlita Prominent, Heidelberg) y calentado a 90°C antes de ser pulverizado a 500 g/min. El dioxido de carbono fue pulverizado alrededor del agujero central a traves de una abertura de 0,0122 cm2. El polvo formado de esta manera en el vaso fue recogido en el filtro en el fondo del vaso.

[0083] La reduccion de endotoxicidad resulto ser un factor 1021, como determinado con el ensayo turbidimetrico cinetico de Associates of Cape Cod, Inc.

Ejemplo 5

[0084] El alginato de sodio (525 KDa, 40 % en peso de guluronato) Danisco Grindsted PHU-156 fue disuelto en agua de osmosis inversa a una concentracion final de 1,9 % (p/p) y una viscosidad cinematica de 5,500 cSt. La viscosidad cinematica fue determinada mediante ajuste de curvas con extrapolacion usando un viscosimetro de flujo invertido con tubo en U (Poutten Selfe & Lee BS/IP/RF tamano 3; c=0.03023).

La endotoxicidad fue determinada en 110.000 EU/g utilizando un ensayo turbidimetrico cinetico de Associates of Cape

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Cod, Inc. (designado a continuacion como "el metodo de coagulacion del gel" ).

[0085] Despues de la adicion de 1 % en peso de Triton X-114, la suspension se agito con un mezclador durante 30 minutos a una temperature de 10 grados por debajo del punto de nube del detergente (es decir 23°C a 1% v/v).

Despues de aumentar la temperature al menos 10 grados mas alla del punto de nube 1,5 % en peso de carbon activado (Norit SX mas; MPV 0,35 cm3/g; Sbet 1051 m2/g) fue dispersado en la suspension, que fue llevada a 70°C y agitada durante otros 30 min. Posteriormente 2,25 % en peso de montmorillonita ((Sigma B-3378) fueron dispersados en la suspension y se continuo con la agitacion durante otros 30 minutos a 70°C.

[0086] Los 6 litros de suspension asf obtenida fueron transferidos a botellas de polipropileno de 1 litro que fueron colocadas en un rotor de angulo fijo JLA-8.1000.

Despues del centrifugado durante al menos 12 horas a 7,000 r.p.m. (12,300 x g) utilizando una centrifugadora Beckman Avanti J-26 XP High Performance, el sobrenadante fue recogido de forma cuantitativa por decantacion. La solucion resultante fue llevada a 50% de etanol por volumen, se mezclo y se dejo sedimentar durante al menos 1 h para dejar al alginato precipitar y decolorar.

[0087] El precipitado blanco claro fue concentrado en una criba. El precipitado tipo goma fue ademas comprimido por centrifugado a temperatura ambiente durante 30 min. a 5000 r.p.m. en la centrifugadora descrita anteriormente. El precipitado blanco fue triturado y resuspendido en alcohol absoluto con la ayuda de una mezcladora. Despues de 30 minutos de compensacion, el precipitado fue recogido con una criba y comprimido por centrifugado repetido (30 min a 5000 r.p.m.).

El producto comprimido todavfa contenfa aproximadamente el 75% (p/p) de sustancia lfquida.

[0088] A continuacion, el producto fue vertido en un autoclave de 4,2 litros (UHDE GmbH, Dortmund) que fue calentado a 95°C mediante una envoltura, usando aceite de calentamiento.

El dioxido de carbono fue presurizado a 150 bar utilizando una bomba de embolo (Orlita Prominent, Heidelberg) y calentado a 95°C antes de ser bombeado a traves del material tipo gel a 300 g/min durante 45 min. El producto formado asf en el vaso fue recogido en el filtro en el fondo del vaso.

El producto presentaba una estructura fibrosa como confirmado por S.E.M. y habfa adquirido una viscosidad de 10% (por gramo de producto secado).

[0089] La recuperacion final fue casi del 75%. La endotoxicidad del producto final fue determinada como <30 EU/g, que se encuentra por debajo del lfmite de deteccion.

Ejemplo 6

[0090] El alginato de sodio ISP Manugel DMB (150 Kda, 63 % en peso guluronato) fue disuelto en agua de osmosis inversa a una concentracion final de 2,8 % (p/p) y una viscosidad dinamica de 6.000 mPa.s.

La viscosidad fue medida a varias concentraciones de alginato (que varfan a partir de 0.4-3%) en la solucion salina utilizando un viscosfmetro rotativo Synchro-Lectric (Brookfield Engineering Laboratories Inc., MA) puesto en funcionamiento a 20°C. La endotoxicidad fue determinada en 1,1 * 106 EU/g utilizando el metodo de coagulacion de gel.

[0091] La solucion fue tratada exactamente como se describe en el ejemplo 5 hasta la fase en que se recogio el precipitado blanco claro y el fluido se exprimio con una prensa. El precipitado tipo goma fue triturado y resuspendido en 6 litros de una mezcla 1:1 de etanol absoluto y agua de grado inyeccion (esteril y apirogenica, B.Braun, Melsungen AG, Aemania) para decoloracion extendida durante otra hora. Despues de la compensacion repetida en alcohol absoluto, el precipitado fue recogido con una criba y comprimido. El producto comprimido todavfa contenfa aproximadamente el 75% (p/p) de material lfquido. El secado se realizo como se describe en el ejemplo 1.

La recuperacion final fue de casi el 70%.

La endotoxicidad del producto final fue determinada como 60 EU/g, que corresponde a un factor de purificacion de 4.3log.

Ejemplo 7

[0092] El alginato de sodio ISP Manucol LD (de bajo PM, 39 % en peso de guluronato) fue disuelto en agua de osmosis inversa a una concentracion final de 24,0 % en peso. La endotoxicidad fue determinada en 4,3 * 104 EU/g utilizando el metodo de coagulacion de gel.

[0093] La solucion fue tratada exactamente como se describe en el ejemplo 6 con la excepcion de que se uso para la compensacion agua de osmosis inversa (en vez de agua de calidad de inyeccion).

La recuperacion final fue de 72%. La endotoxicidad del producto final fue 2*103 EU/g, indicando que debe ser empleada un agua altamente purificada durante la compensacion para maximizar los niveles de despirogenizacion.

La muestra purificada fue analizada tambien en cuanto a posibles trazas de Triton X-114. Con este fin la muestra fue sometida a mediciones de fndice de refraccion y TLC (P.Strop & AT. Brunger (2005) Protein Sci. 14,2207-2211), comparable con la espectroscopia de UV directa. Se detectaron niveles de Triton X-114 a una concentracion de 0,010,02 %, que esta bastante por debajo de la especificacion de 0,1%.

Claims (11)

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   REIVINDICACIONES

   1. Metodo de reduccion de los niveles de lipopolisacarido en un material biopolimerico que contiene lipopolisacaridos, comprendiendo dicho metodo las etapas consecutivas de:

   a. Proporcionar una solucion acuosa que contiene 0,05-50 % en peso de material biopolimerico que contiene lipopolisacarido disuelto; 0,001-10 % en peso de un surfactante; 0,05-15 % en peso de solido adsorbente; y al menos 50 % en peso de agua;

   b. Permitir que el adsorbente adsorba lipopolisacaridos;

   c. Separar el adsorbente solido que contiene lipopolisacaridos adsorbidos de la solucion acuosa restante mediante centrifugacion, sedimentacion o filtracion; y

   d. Recuperacion del material biopolimerico que contiene un nivel reducido de lipopolisacaridos de la solucion acuosa separada;

   donde el material biopolimerico es un alginato.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, donde la solucion acuosa contiene un surfactante de formacion de micela en una concentracion superior a la concentracion de micela crftica y donde, antes de la separacion del adsorbente solido de la fase acuosa restante, dicha solucion acuosa se provoca para separacion de fase en una fase acuosa y una fase surfactante.
3. 3. Metodo segun la reivindicacion 2, donde el surfactante de formacion de micela tiene una densidad de mas de 1,03 g/ml en la temperatura en punto de nube.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 2 o 3, donde el surfactante de formacion de micela es un alquilfenol etoxilado representado por la formula CxH2x+1-C6H4-O-(C2H4O)nH, donde:

   • x es ta en el rango de 4-12; y

   • n es ta en el rango de 4-12.
5. 5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase acuosa separada tiene una viscosidad de al menos 100 cSt a 20 °C.
6. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el adsorbente solido es seleccionado del grupo consistente en carbon activado, arcillas adsorbentes y combinaciones de los mismos.
7. 7. Metodo segun la reivindicacion 6, donde el adsorbente solido comprende carbon activado.
8. 8. Metodo segun la reivindicacion 6 o 7, donde el adsorbente solido comprende una arcilla.
9. 9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 2-8, donde la separacion de fase se produce por aumento de temperatura, adicion de sal, cambio de pH y/o estres osmotico.
10. 10. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el biopolfmero es una sal de alginato, preferiblemente alginato de sodio.
11. 11. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la recuperacion del material biopolimerico de la fase acuosa separada implica la precipitacion del material biopolimerico anadiendo al menos 10% en peso de agua de un solvente organico que es mezclable con agua.