ES2620957T3 - Liporrelleno con células madre derivadas de tejido adiposo expandidas ex vivo para el relleno mamario cosmético o para el relleno y/o rejuvenecimiento facial - Google Patents

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Abstract

Un método para fabricar una composición que comprende células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario (P0) expandidas ex vivo mezcladas con tejido de grasa recogido; comprendiendo el método - expandir ex vivo las ASC de una fracción vascular estromal (SVF) aislada en un medio de crecimiento que consiste en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio esencial mínimo alfa (α-MEM), penicilina-estreptomicina al 1-5 %, 1-5 IU/ml de heparina libre de conservantes y lisado de plaquetas humanas agrupadas (pHPL) al 2-20 %, - cosechar dichas ASC en el pase primario (P0), y - mezclar dichas ASC con tejido de grasa recogido a una relación de 20 x 106 - 20 x 107 ASC/ml de grasa.

Description

DESCRIPCION
Liporrelleno con celulas madre derivadas de tejido adiposo expandidas ex vivo para el relleno mamario cosmetico o para el relleno y/o rejuvenecimiento facial.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una composicion para su uso en el relleno de tejido blanco, comprendiendo dicha composicion injertos de grasa enriquecida con celulas madre derivadas de tejido adiposo expandidas ex vivo. Estos 10 se pueden usar para el relleno/aumento mamario cosmetico o para el relleno y/o rejuvenecimiento facial.
Descripcion de la invencion
Un desaffo frecuente en la cirugfa plastica es la correccion de defectos de volumen y el aumento del volumen 15 existente. A la hora de corregir defectos de volumen o de aumentar el tejido existente, con frecuencia es necesario usar material de relleno, llamado "relleno" o "implante". El injerto de grasa autologa (liporrelleno) permite la reparacion y el aumento de tejidos blandos (por ejemplo, aumento mamario cosmetico) y se usa cada vez mas en cirugfas tanto esteticas como reconstructivas. Se ha considerado al tejido graso autologo como un relleno ideal para el aumento de tejido blando dado que es biocompatible, versatil, de aspecto natural, no inmunogeno, economico y 20 facilmente obtenible con una morbilidad del sitio donante baja 1,2 Sin embargo, el injerto de grasa trasplantado tiene una supervivencia impredecible y a menudo baja, motivo por el cual los investigadores han buscado nuevas maneras de aumentar su viabilidad. Un estudio realizado en animales que investigo el injerto de grasa xenogenico enriquecido con celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ASC) ha indicado que la tecnica es valida y reproducible, y que tiene como resultado un volumen residual mayor del trasplante en comparacion con el 25 no enriquecido 3 Un estudio reciente realizado en humanos ha demostrado y confirmado la ventaja y el efecto notable de la incorporacion de ASC al injerto de grasa para un mayor volumen residual y una mejor calidad del tejido trasplantado 4
En la industria cosmetica, las soluciones disponibles para el relleno/rejuvenecimiento facial cosmetico son 30 predominantemente artificiales (por ejemplo, toxina botulfnica tipo A, hialuronico, colageno, hidroxilapatita de calcio, acido poliactico, microesferas de metacrilato de polimetilo). Por lo tanto, los resultados con frecuencia terminan pareciendo poco naturales debido a la escasa versatilidad y biocompatibilidad. Los rellenos artificiales se descomponen con el paso del tiempo con posibles efectos secundarios ffsicos adversos que varfan de diversos sfntomas de enfermedad hasta defectos esteticos. El tejido graso autologo se considera una solucion de relleno 35 ideal, como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, los resultados para los pacientes tratados con grasa autologa para el relleno/rejuvenecimiento facial (es decir, sin enriquecimiento de celulas madre) puede terminar siendo desproporcionados, debido a la supervivencia impredecible del injerto.
Algunos cirujanos sugieren que se puede lograr un enfoque mejor y mas predecible en cuanto a los injertos al anadir 40 la denominada "fraccion vascular estromal" (SVF) al trasplante 5 . La SVF es el sedimento celular que se forma cuando se recolecta tejido adiposo mediante liposuccion y las celulas de grasa son digeridas enzimaticamente mediante el uso de colagenasa. Se sabe que la SVF contiene una pequena cantidad de celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC).
45 El documento DE 10 2011 121982 B3 describe el uso de celulas madre derivadas de tejido adiposo expandidas para reconstruir los defectos de la piel.
Es importante diferenciar entre los siguientes terminos:
50 1) Liporelleno convencional: unicamente grasa
2) Lipotransferencia asistida por celulas: Grasa + SVF
3) Liporelleno enriquecido con celulas madre: Grasa + ASC expandidas ex vivo
4) Relleno de celulas madre: ASC expandidas ex vivo
55 En la solicitud de patente actual, se hace referencia unicamente a los terminos 3) y 4) anteriores.
Definicion de las celulas madre a la que se hace referencia en la solicitud de patente actual:
Celulas que se adhieren a una superficie de cultivo al sembrar y cultivar la fraccion vascular estromal.
Se pueden usar celulas autologas o alogenicas para aplicaciones tanto mamarias como faciales.
La presente invencion es especialmente adecuada para el relleno y rejuvenecimiento facial cosmetico y para el 5 relleno/aumento mamario cosmetico.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a una composicion que comprende celulas madre derivadas de tejido adiposo 10 (ASC) expandidas ex vivo mezcladas con tejido graso recolectado en una relacion de 20 x 106 - 20 x 107 ASC/m de grasa, y el uso de injertos de grasa enriquecidos con celulas madre derivadas de tejido adiposo expandidas ex vivo como un agente para el relleno/aumento mamario cosmetico o para el relleno/rejuvenecimiento facial.
Procedimiento quirurgico para recolectar ASC
15
Los pacientes reciben una pequena liposuccion ambulatoria.
Se recolectaran lipoaspirados mediante tecnicas de liposuccion esteriles estandares. Una solucion humectante se infiltra en la gasa subcutanea a traves de incisiones. El lipoaspirado se consigue con un dispositivo de liposuccion 20 estandar (por ejemplo, Vibrasat®) y se sella en un recipiente esteril. El lipoaspirado se transporta al laboratorio clfnico de celulas madre.
Aislamiento y cultivo de ASC
25 El aislamiento y la expansion ex vivo de ASC se realizara de acuerdo con un protocolo aprobado, en un laboratorio
aprobado para las buenas practicas de fabricacion (GMP) y la expansion clfnica de celulas madre, en un laboratorio
de terapia celular.
El lipoaspirado se lava con una solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifuga. Para aislar la fraccion 30 vascular estromal (SVF), el sobrenadante se incuba y se digiere enzimaticamente con colagenasa (calidad GMP). La actividad enzimatica se neutraliza a traves del uso de un medio de crecimiento. La suspension se filtra usando un filtro de 60-100 pm y se centrifuga. El sedimento celular se suspende de nuevo en un medio de cultivo y se cuentan las celulas en el sedimento que contienen la SVF. Una forma alternativa de aislar la SVF es mediante el uso de un sistema cerrado, por ejemplo, el sistema GID SVF-1™. La SVF se siembra en el medio de cultivo que consiste en el 35 medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o el medio esencial mmimo alfa (a-MEM), penicilina-
estreptomicina al 1-5 %, 1-5 lU/ml de heparina libre de conservantes y lisado de plaquetas humanas agrupadas
(pHPL) al 2-20 %, o cualquier otro medio de crecimiento alternativo, por ejemplo, suero fetal bovino. Se incuban los cultivos primarios (P0). Se descartan las celulas no adherentes, los matraces de cultivo celular se aclaran cuidadosamente con PBS, y el medio se remplaza. El medio se cambia cada 3-7 dfas. Durante el cultivo y el dfa de 40 la recoleccion de ASC, se examinaran todos los matraces/pilas de cultivos para determinar la contaminacion por patogenos.
Produccion de pHPL
45 El pHPL puede fabricarse segun lo descrito por Schallmoser et al. 7, con modificaciones menores. En resumen, despues del consentimiento informado, se recolectan unidades de sangre entera de donantes de sangre sanos. Todas las donaciones de sangre se analizan en busca de marcadores de enfermedades infecciosas, de conformidad con la legislacion existente. Las capas leucocitarias se separan de los globulos rojos y el plasma. Cuatro unidades de capas leucocitarias se agrupan con 1 unidad de plasma en 1 unidad de plasma rico en plaquetas (PRP) y se 50 almacenan de -20 °C a -80 °C. Se descongela un mfnimo de diez unidades de PRP en un bano de agua y luego se agrupan en un unico lote de PRP. El lote de PRP agrupado se divide en fracciones alfcuotas mas pequenas y se congela de -20 °C a -80 °C. A continuacion, todas las bolsas en alfcuotas del lote de PRP agrupado unico se descongelan en un bano de agua y se centrifugan (por ejemplo, a 4000 g durante 15 min) para sedimentar los fragmentos de plaquetas. Por ultimo, el sobrenadante que contiene pHPL se transfiere a bolsas nuevas y se 55 almacena a una temperatura de -40 °C a -80 °C para su uso posterior en la preparacion del medio de cultivo celular.
Se recolectan ASC en P0-P4. Todos los matraces/pilas de cultivo celular se lavan con PBS y las celulas se separan de la superficie plastica mediante procesamiento qufmico (por ejemplo, Tryple Select) o ffsico. La suspension que contiene las ASC se centrifuga (por ejemplo, a 300 g durante 5 min), se elimina el sobrenadante y se recoge el
sedimento celular despues de la resuspension en PBS. El sedimento celular de ASC se lava con PBS, centrifugando las ASC y descartando el sobrenadante despues de cada procedimiento de lavado. Las celulas se cuentan tres veces y se calculara el recuento promedio. Las ASC se controlaran cuidadosamente antes de liberarlas para uso clfnico, incluyendo 1) Ausencia de contaminacion por patogenos 2) Viabilidad de las ASC de mas del 90 % 3) 5 Morfologfa, que se evalua como caracterfstica para las ASC. Las ASC se transportaran en recipientes esteriles aprobados.
Liposuccion, preparation de injertos y procedimiento de liporrelleno
10 El procedimiento quirurgico se realiza con anestesia local o general. Se cosechan lipoaspirados mediante tecnicas de liposuccion esteriles estandares. A traves de incisiones, se infiltra una solucion humectante (por ejemplo, solucion de Kleins) en el sitio donante mediante el uso de un infiltrador de punta roma. La canula de recogida tiene un diametro de 2-5 mm con una punta roma, conectada a un dispositivo de recogida (por ejemplo, Vibrasat®). Si es necesario, el lipoaspirado se lava usando una solucion salina. El lipoaspirado recogido se deja sedimentar, se hace 15 girar o se centrifuga (por ejemplo, a 100 g durante 5 min). Despues del procedimiento de separacion, la capa oleosa (nivel superior) se decanta y la capa acuosa (nivel inferior) tambien se drena de las jeringas. La capa intermedia, compuesta por un injerto predominantemente de grasa, se usa para el trasplante.
Aplicaciones de la invencion:
20
Relleno mamario cosmetico: El tejido de grasa recogido se mezcla con las ASC expandidas ex vivo cosechadas a una relacion de 20 x 106 - 20 x 107ASC/ml de grasa, y se inyecta en forma de alfcuotas en los senos para un aumento cosmetico.
25 Ejemplo de tecnica de inyeccion:
El injerto de grasa enriquecida se inyecta en los senos usando una aguja larga de forma horizontal (paralela al cuerpo) para evitar danar las estructuras fuera del tejido mamario. La aguja se inserta desde varios puntos alrededor del margen de la areola y en varios puntos en el pliegue inflamatorio en direcciones y 30 planos variables para lograr una distribucion uniforme y de aspecto natural del injerto.
Para el relleno facial y la correccion de arruggs: El tejido de grasa cosechados se mezcla con las ASC expandidas en vivo cosechadas a una relacion de 20 x 106 - 20 x 107 ASC/ml de grasa. La cantidad de celulas madre aumentara en funcion de la cantidad de relleno que se necesite; cuanto menos relleno se necesite, mayor sera la concentracion 35 de ASC. Si el efecto deseado es estrictamente una cuestion de mejora de la calidad del tejido, se usaran ASC en solitario, disueltas en PBS, con el fin de distribuir las celulas de manera uniforme. Ejemplo de tecnica de inyeccion:
Cuando se usan como un relleno, los injertos de grasa se inyectan como alfcuotas con una aguja larga de forma horizontal (paralela a la superficie) para evitar danar las estructuras fuera del area diana. La aguja se 40 inserta desde varios puntos y en direcciones y planos variables para lograr una distribucion uniforme y de
aspecto natural del injerto.
Cuando se usan estrictamente para la mejora de la calidad del tejido, las ASC disueltas se inyectan en la dermis y debajo de la dermis con una aguja puntiaguda fina y se distribuyen de manera uniforme en el area diana. Los sitios 45 de incision e inyeccion se suturan y se aplican prendas de compresion postoperatorias en los sitios donantes y en algunos casos tambien en los sitios receptores.
Beneficios clinicos y novedad de la invention
50 Los injertos de grasa enriquecida con ASC (expandidas ex vivo) o las ASC en solitario no se han usado nunca a nivel clfnico para la inyeccion en los senos o en la cara y no se han descrito nunca en la bibliograffa ni el inventor ha compartido la idea de estas aplicaciones clfnicas con terceros antes de la presentacion de la patente US 61/839.578. La idea de enriquecer injertos de grasa con ASC expandidas ex vivo con el fin de mejorar la supervivencia y la calidad de los injertos de grasa se ha mostrado en un modelo murino 3 y en un estudio de prueba de conceptos 55 reciente en seres humanos 4, aunque, como se ha mencionado anteriormente, las aplicaciones clfnicas de esta invencion nunca se han demostrado (es decir, el relleno mamario cosmetico y el relleno facial). Se debe enfatizar que esta invencion (es decir, al aplicacion de ASC expandidas ex vivo para los propositos del relleno/rejuvenecimiento facial y el rellano/aumento mamario cosmetico) es significativamente diferente del uso de la SVF recien aislada, incluyendo una pequena fraccion de ASC no expandidas, para el llamado "liporrelleno asistido
por celulas" convencional. Este metodo se ha descrito en la bibliograffa y se ha aplicado en seres humanos con resultados clfnicos impredecibles, no significativamente mejores que los del liporrelleno convencional 8 La logica para usar ASC expandidas ex vivo para el relleno facial se sustenta en los estudios mencionados anteriormente, donde queda demostrado que las celulas madre sobreviven despues de la inyeccion al contrario de lo que sucede 5 con las celulas de grasa. Ademas, las ASC son muy resistentes a la hipoxia y a exposiciones ffsicas 9-11. Mediante el uso de celulas madre en solitario como material de relleno, se puede lograr un volumen/aumento residual fiable.
Existen muchos beneficios clfnicos a partir de la fabricacion de un relleno mamario y facial sostenible biocompatible, incluyendo su aspecto natural, la no inmunogenicidad, evitar los efectos secundarios del material artificial y el 10 procedimiento puede ser autologo. La mayorfa de los pacientes tiene reservas de grasa naturales en el abdomen, los muslos, los brazos y las nalgas que se pueden usar. De esta manera, los pacientes obtienen una remodelacion corporal deseada y personalizada. El tejido adiposo autologo puede trasplantarse facilmente mediante una simple liposuccion e inyeccion posterior, con muy poca incomodidad para los pacientes y con muy poco riesgo de efectos secundarios.
15
EJEMPLOS
Resultados de la investigation - Prueba de estudio de conceptos (analogo al diseno de estudio descrito, por ejemplo, en Kolle SF, Fischer-Nielsen A, Mathiasen AB, et al. Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo 20 expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial. Lancet 2013; 382: 1113-20):
Objetivo del estudio:
25 Se comparan injertos de grasa enriquecidos con una dosis alta de celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) expandidas ex vivo autologas con injertos de grasa no enriquecidos (injertos de grasa convencionales).
Diseno del estudio:
30 Se preparan injertos de grasa purificada, uno con y otro sin enriquecimiento de ASC (control) para cada participante. Los injertos de grasa se inyectan por via subcutanea.
Se elige una concentracion de 20 x 106 ASC por ml de injerto de grasa enriquecido - aproximadamente 2.000 veces el nivel fisiologico.
35
Los volumenes de los injertos de grasa inyectados se miden mediante imagenes de resonancia magnetica (IRM) inmediatamente despues de la inyeccion y despues de 121 dfas y se comparan con las IRM iniciales.
Resultado:
40
En comparacion con los injertos de control, los injertos de grasa enriquecida con ASC tienen volumenes residuales significativamente mayores. No se han observado hechos adversos serios graves.
Bibliograffa
45
1. Leuchter I, Schweizer V, Hohlfeld J, Pasche P. Treatment of velopharyngeal insufficiency by autologous fat injection. Eur Arch Otorhinolaryngol 2010; 267: 977-83.
2. Coleman SR. Structural fat grafts: the ideal filler? Clin Plast Surg 2001; 28: 111-9.
3. Lu F, Li J, Gao J, et al. Improvement of the survival of human autologous fat transplantation by using VEGF- 50 transfected adipose-derived stem cells. Plast Reconstr Surg 2009; 124: 1437-46.
4. Kolle SF, Fischer-Nielsen A, Mathiasen AB, et al. Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial. Lancet 2013; 382: 1113-20.
5. Yoshimura K, Sato K, Aoi N, Kurita M, Hirohi T, Harii K. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plast Surg 2008; 32: 48-55.
55 6. Matsumoto D, Sato K, Gonda K, et al. Cell-assisted lipotransfer: supportive use of human adipose-derived cells for soft tissue augmentation with lipoinjection. Tissue Eng 2006; 12: 3375-82.
7. Schallmoser K, Bartmann C, Rohde E, et al. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion 2007; 47: 1436-46.
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lipofilling of the breast: a prospective comparative study. J Plast Reconstr Aesthet Surg 2013; 66: 1494-503.
9. Rehman J, Traktuev D, Li J, et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation 2004; 109: 1292-8.
10 Rasmussen JG, Frobert O, Pilgaard L, et al. Prolonged hypoxic culture and trypsinization increase the pro- 5 angiogenic potential of human adipose tissue-derived stem cells. Cytotherapy 2010.
11 Thangarajah H, Vial IN, Chang E, et al. IFATS collection: adipose stromal cells adopt a proangiogenic phenotype under the influence of hypoxia. Stem Cells 2009; 27: 266-74.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para fabricar una composicion que comprende celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario (P0) expandidas ex vivo mezcladas con tejido de grasa recogido; comprendiendo el
    5 metodo
    - expandir ex vivo las ASC de una fraccion vascular estromal (SVF) aislada en un medio de crecimiento que consiste en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio esencial mmimo alfa (a-MEM), penicilina-estreptomicina al 1-5 %, 1-5 lU/ml de heparina libre de conservantes y lisado de plaquetas
    10 humanas agrupadas (pHPL) al 2-20 %,
    - cosechar dichas ASC en el pase primario (P0), y
    - mezclar dichas ASC con tejido de grasa recogido a una relacion de 20 x 106 - 20 x 107 ASC/ml de grasa.
  2. 2. Una composicion que comprende celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario 15 (P0) expandidas ex vivo mezcladas con tejido de grasa recogido a una relacion de al menos 20 x 106 - 20 x
    107 ASC/ml de grasa, donde dichas celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario (P0) expandidas ex vivo se han cultivo en un medio de crecimiento que consiste en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio esencial mmimo alfa (a-MEM), penicilina-estreptomicina al 1-5 %, 1-5 lU/ml de heparina libre de conservantes y lisado de plaquetas humanas agrupadas (pHPL) al 2-20 %, y se han cosechado en el primer 20 pase (P0).
  3. 3. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 2 para su uso como un agente de relleno mamario, un agente de relleno facial, para relleno mamario cosmetico, o para relleno facial cosmetico.
    25 4. Metodo cosmetico de relleno mamario, donde las celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de
    cultivo primario (P0) expandidas ex vivo se mezclan con tejido de grasa recogido a una relacion de al menos 20 x 106 - 20 x 107 ASC/ml de grasa, donde dichas celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario (P0) se han cultivado en un medio de crecimiento que consiste en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio esencial mmimo alfa (a-MEM), penicilina-estreptomicina al 1-5 %, 1-5 lU/ml de heparina libre de 30 conservantes y lisado de plaquetas humanas agrupadas (pHPL) al 2-20 %, y se han cosechado en el pase primario (P0), y donde la grasa se inyecta como alfcuotas o cadenas con una aguja larga en horizontal (en paralelo al cuerpo) insertando la aguja desde varios puntos alrededor del margen de la areola y en varios puntos en el pliegue inflamatorio en direcciones y planos variables para lograr una distribucion uniforme y de aspecto natural del injerto.
    35 5. Metodo cosmetico de relleno facial, donde las celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de
    cultivo primario (P0) expandidas ex vivo se mezclan con tejido de grasa cosechado a una relacion de al menos 20 x 106 - 20 x 107 ASC/ml de grasa, donde dichas celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario (P0) se han cultivado en un medio de crecimiento que consiste en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio esencial mmimo alfa (a-MEM), penicilina-estreptomicina al 1-5 %, 1-5 lU/ml de heparina libre de 40 conservantes y lisado de plaquetas humanas agrupadas (pHPL) al 2-20 %, y se han cosechado en el pase primario (P0), y donde los injertos de grasa se inyectan como alfcuotas o como cadenas con una aguja larga en horizontal (en paralelo a la superficie) para evitar danar las estructuras fuera del area diana, y la aguja se inserta desde varios puntos y en direcciones y planos variables para lograr una distribucion uniforme y de aspecto natural del injerto.
    45 6. Metodo cosmetico de relleno facial, donde las celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de
    cultivo primario (P0) expandidas ex vivo se mezclan con tejido de grasa recogido a una relacion de al menos 20 x 106 - 20 x 107 ASC/ml de grasa, donde dichas celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario (P0) se han cultivado en un medio de crecimiento que consiste en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio esencial mmimo alfa (a-MEM), penicilina-estreptomicina al 1-5 %, 1-5 lU/ml de heparina libre de 50 conservantes y lisado de plaquetas humanas agrupadas (pHPL) al 2-20 % y se han cosechado en el pase primario (P0), y donde las ASC se inyectan en la dermis con una aguja puntiaguda fina y se distribuyen uniformemente en el area diana, y la incision y los sitios de incision se suturan y se aplican prendas de compresion postoperatorias en los sitios donantes y en algunos casos tambien en los sitios receptores.
    55 7. Metodo cosmetico para introducir un agente en la piel, donde el agente comprende celulas madre
    derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario (P0) expandidas ex vivo mezcladas con tejido de grasa recogido a una relacion de al menos 20 x 106 - 20 x 107 ASC/ml de grasa, donde dichas celulas madre derivadas de tejido adiposo (ASC) de cultivo primario (P0) expandidas ex vivo se han cultivado en un medio de crecimiento que consiste en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio esencial mmimo alfa (a-MEM), penicilina-
    estreptomicina al 1-5 %, 1-5 lU/ml de heparina libre de conservantes y lisado de plaquetas humanas agrupadas (pHPL) al 2-20 %, y se han cosechado en el pase primario (P0).
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