ES2619902T3 - Composiciones y métodos que comprenden variantes de celulasa con afinidad reducida para materiales no celulósicos - Google Patents

Abstract

Una variante de celulasa aislada, donde dicha variante es una forma madura que tiene actividad de celulasa, y donde dicha variante es una variante de una celulasa original cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 97 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, consistiendo la variación en una sustitución en la posición 63 numerada por correspondencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, y donde la sustitución hace que la variante de celulasa tenga una carga neta más negativa en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Description

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secuencia de nucleótidos que codifica CBH2 que posee una utilización de codón sustancialmente diferente, mientras que la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos que codifica CBH2 tiene la secuencia de aminoácidos igual o sustancialmente igual que la de la proteína nativa. Por ejemplo, la secuencia codificadora se puede modificar para facilitar la expresión más rápida de CBH2 en un sistema concreto de expresión procariota o

5 eucariota, de conformidad con la frecuencia con la que el huésped utiliza un codón concreto (Te'o et al., FEMS Microbiology Letters, 190: 13-19, 2000, por ejemplo, describe la optimización de genes para la expresión en hongos filamentosos).

[0035] Se considera que una secuencia de ácido nucleico "puede hibridarse de forma selectiva" con una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias de forma específica se hibridan mutuamente en 10 condiciones de lavado e hibridación de astringencia moderada a elevada. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) de la sonda o del complejo de unión a ácido nucleico. Por ejemplo, la “astringencia máxima” ocurre normalmente a aproximadamente Tf-5 °C (5 °C por debajo de la Tf de la sonda); la “astringencia elevada” a aproximadamente 5 °C -10 °C por debajo de la Tf; la “astringencia moderada” o “intermedia” a aproximadamente 10 °C -20 °C por debajo de la Tf de la sonda; y la “astringencia baja” a

15 aproximadamente 20 °C -25 °C por debajo de la Tf. Funcionalmente, las condiciones de astringencia máxima se pueden utilizar para identificar secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación; mientras que las condiciones de astringencia elevada se utilizan para identificar secuencias que tienen aproximadamente 80 % o más de identidad de secuencia con la sonda.

[0036] Las condiciones de hibridación de moderada y elevada astringencia se conocen bien en la técnica (véase,

20 por ejemplo, Sambrook, et al, 1989, Capítulos 9 y 11, y en Ausubel, F.M., et al, 1993). Un ejemplo de condiciones de astringencia elevada incluye hibridación a aproximadamente 42 °C en formamida al 50 %, 5x SSC, 5 veces de solución Denhardt, SDS al 0,5 % y 100 µg/ml ADN portador desnaturalizado seguido del lavado dos veces en 2 veces SSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente y dos veces adicionales en 0,1x SSC y SDS al 0,5 % a 42 °C.

25 [0037] El término "recombinante", cuando se utiliza con referencia a, p. ej., una célula o ácido nucleico, proteína,

o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector se han modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos, o que la célula se deriva de una célula modificada de dicha forma. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se

30 expresan anormalmente de otro modo, se subexpresan o no se expresan en absoluto.

[0038] Como se utilizan en el presente documento, los términos "transformada", "establemente transformada" o "transgénica" con referencia a una célula significan que la célula tiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episomal que se mantiene a través de múltiples generaciones.

35 [0039] Como se utiliza en el presente documento, el término "expresión" se refiere al proceso por el cual se produce un polipéptido basándose en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.

[0040] El término "introducido", en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye referencia a la incorporación de una

40 secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota en la que la secuencia de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado).

[0041] Se deduce que el término “expresión de CBH2” se refiere a la transcripción y traducción del gen cbh2 o variantes del mismo, cuyos productos incluyen ARN precursor, ARNm, polipéptido, polipéptidos procesados tras 45 la traducción y derivados de los mismos, que incluyen CBH2 de especies relacionadas, tales como Trichoderma koningii, Hypocrea jecorina (también conocida como Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride) e Hypocrea schweinitzii. A modo de ejemplo, los ensayos para la expresión de CBH2 incluyen transferencia Western para proteína CBH2, análisis de transferencia Northern y ensayos de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) para ARNm de cbh2, y 50 ensayos de celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC, por sus siglas en inglés) y de ácido p-hidroxibenzoico hidrazida (PAHBAH, por sus siglas en inglés) como se describe en lo que sigue: (a) PASC: (Karlsson, J. et al. (2001), Eur. J. Biochem, 268, 6498-6507, Wood, T. (1988) en Methods in Enzymology, Vol.160. Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose (Wood, W. & Kellog, S. Eds.), pp.19-25, Academic Press, San Diego, Calif., USA) y

(b) PAHBAH: (Lever, M. (1972) Analytical Biochemistry, 47, 273, Blakeney, A.B. & Mutton, L.L. (1980) Journal of 55 Science of Food and Agriculture, 31, 889, Henry, R.J. (1984) Journal of the Institute of Brewing, 90, 37).

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[0062] El término “aislado” o “purificado” como se utiliza en el presente documento se refiere a un ácido nucleico

o aminoácido que se elimina de al menos un componente con el cual está asociado de manera natural.

[0063] De esta manera, como ilustración, un sistema de celulasas de origen natural se puede purificar en componentes sustancialmente puros mediante técnicas de separación reconocidas publicadas en la literatura, 5 incluyendo cromatografía de intercambio iónico a un pH adecuado, cromatografía de afinidad, exclusión de tamaño y similares. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio iónico (normalmente cromatografía de intercambio aniónico) es posible separar los componentes de celulasa mediante elución con un gradiente de pH,

o un gradiente de sal, o ambos, un gradiente de pH y de sal. La CBH purificada se puede añadir entonces a la solución enzimática dando lugar a una solución de CBH enriquecida. También es posible elevar la cantidad de

10 CBH producida mediante un microbio utilizando métodos de genética molecular para sobreexpresar el gen que codifica CBH, posiblemente en conjunción con la deleción de uno o más genes que codifican otras celulasas.

[0064] Las celulasas fúngicas pueden contener más de un componente CBH. Los componentes diferentes generalmente tienen puntos isoeléctricos diferentes que permiten su separación mediante cromatografía de intercambio iónico y similares. En una solución enzimática se puede emplear un único componente CBH o una

15 combinación de componentes de CBH.

[0065] Cuando se emplea en soluciones enzimáticas, el homólogo o variante de componente CBH2 se añade generalmente en una cantidad suficiente para permitir el índice más alto de liberación de azúcares solubles de la biomasa. La cantidad de homólogo o variante de componente CBH2 añadida depende del tipo de biomasa que se sacarifica, que puede determinarse fácilmente por el experto en la materia cuando se utiliza, el porcentaje en 20 peso del homólogo o la variante de componente CBH2 presente en la composición de celulasas es de preferiblemente entre 1 y 100 con ejemplos ilustrativos siendo aproximadamente 1, preferiblemente aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 15, o preferiblemente aproximadamente 20 por ciento en peso a preferiblemente aproximadamente 25, preferiblemente aproximadamente 30, preferiblemente aproximadamente 35, preferiblemente aproximadamente 40, 25 preferiblemente aproximadamente 45 o preferiblemente aproximadamente 50 por ciento en peso. Además, los intervalos preferidos pueden ser aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 por ciento en peso, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de

30 aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente

[0066] 30 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 35 aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 65 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 70 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 75 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 80 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 85 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 95 por ciento en peso. No obstante, cuando se utiliza, el porcentaje en peso del homólogo o variante de componente CBH2 en relación con cualquier componente de tipo EG presente en la composición de 45 celulasas es de preferiblemente aproximadamente 1, preferiblemente aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 15, o preferiblemente aproximadamente 20 por ciento en peso a preferiblemente aproximadamente 25, preferiblemente aproximadamente 30, preferiblemente aproximadamente 35, preferiblemente aproximadamente 40, preferiblemente aproximadamente 45 o preferiblemente aproximadamente 50 por ciento en peso. Además, los intervalos preferidos pueden ser 50 aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 por ciento en peso, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a 55 aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 35

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[0073] La mayoría de CBH y EG tiene una estructura multidominio que consiste en un dominio central separado de un dominio de unión a celulosa (CBD, por sus siglas en inglés) mediante un péptido de enlace (Suurnakki et al., 2000). El dominio central contiene el sitio activo mientras que el CBD interactúa con la celulosa uniendo la enzima al mismo (van Tilbeurgh et al., FEBS Lett. 204:223-227, 1986; Tomme et al., Eur. J. Biochem. 170:5755 581, 1988). Los CBD son particularmente importantes en la hidrólisis de la celulosa cristalina. Se ha demostrado que la capacidad de las celobiohidrolasas para degradar la celulosa cristalina disminuye claramente cuando el CBD está ausente (Linder y Teeri, J. Biotechnol. 57:15-28, 1997). No obstante, la función exacta y el mecanismo de acción de los CBD siguen siendo un tema de especulación. Se ha sugerido que el CBD mejora la actividad enzimática simplemente incrementando la concentración de enzima efectiva en la superficie de celulosa 10 (Stahlberg et al., Bio/Technol. 9:286-290, 1991), y/o aflojando cadenas de celulosa simples de la superficie de celulosa (Tormo et al., EMBO J. vol. 15, n.º 21, pp. 5739-5751, 1996). La mayoría de estudios sobre los efectos de los dominios de celulasa en sustratos diferentes se han llevado a cabo con proteínas centrales de celobiohidrolasas, puesto que sus proteínas centrales se pueden producir fácilmente mediante proteólisis limitada con papaína (Tomme et al., 1988). Se han descrito numerosas celulasas en la literatura científica, 15 ejemplos de las cuales incluyen: de Trichoderma reesei: Shoemaker, S. et al., Bio/Technology, 1:691-696, 1983, que describe CBH1; Teeri, T. et al., Gene, 51:43-52, 1987, que describe CBH2. También se han descrito celulasas de especies distintas a Trichoderma, por ejemplo, Ooi et al., Nucleic Acids Research, vol.18, n.º 19, 1990, que expone la secuencia de ADNc que codifica la endoglucanasa F1-CMC producida por Aspergillus aculeatus; Kawaguchi T et al., Gene 173(2):287-8, 1996, que expone la clonación y la secuenciación del ADNc 20 que codifica la beta-glucosidasa 1 de Aspergillus aculeatus; Sakamoto et al., Curr. Genet. 27:435-439, 1995, que expone la secuencia de ADNc que codifica la endoglucanasa CMCase-1 de Aspergillus kawachii IFO 4308; Saarilahti et al., Gene 90:9-14, 1990, que expone una endoglucanasa de Erwinia carotovara; Spilliaert R, et al., Eur J Biochem. 224(3):923-30, 1994, que expone la clonación y la secuenciación de bglA, que codifica una betaglucanasa termoestable a partir de Rhodothermus marinus; y Halldorsdottir S et al., Appl Microbiol Biotechnol.

25 49(3):277-84, 1998, que describe la clonación, la secuenciación y la sobreexpresión de un gen de Rhodothermus marinus que codifica una celulasa termoestable de la familia 12 de glicosil hidrolasa. No obstante, todavía resulta necesaria la identificación y caracterización de nuevas celulasas, con propiedades mejoradas, tales como rendimiento mejorado en condiciones de estrés térmico o en presencia de surfactantes, actividad específica aumentada, patrón de escisión de sustrato alterado, y/o alto nivel de expresión in vitro.

30 [0074] El desarrollo de nuevas y mejoradas composiciones de celulasa que comprenden cantidades diversas de celulasas de tipo CBH, de tipo EG y de tipo BG es de interés para utilizarse: (1) en composiciones para degradar pulpa de madera u otra biomasa en azúcares (p. ej., para la producción de productos bioquímicos tal como biocombustibles); (2) en composiciones detergentes que presentan capacidad de limpieza mejorada, (3) funcionan como un agente suavizante y/o mejoran el tacto de los tejidos de algodón (p. ej., “lavado a la piedra” o

35 “biopulido”); y/o (3) en composiciones para pienso, por ejemplo.

[0075] En el presente documento también se proporcionan preparaciones de celulasa enteras que comprenden variantes de celulasa. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "preparación de celulasa entera" se refiere tanto a las composiciones que contienen celulasa de origen natural como a las de origen no natural. Una composición "de origen natural" es una producida por una fuente de origen natural y que comprende uno o 40 más componentes de tipo celobiohidrolasa, uno o más componentes de tipo endoglucanasa y uno o más componentes de tipo beta-glucosidasa, donde cada uno de estos componentes se encuentra en la proporción producida por la fuente. Una composición de origen natural es una producida por un organismo no modificado con respecto a las enzimas celulolíticas de forma que la proporción de las enzimas componentes no se altere de la producida por el organismo nativo. Una composición "de origen no natural" abarca las composiciones 45 producidas mediante: (1) la combinación de enzimas celulolíticas componentes en una proporción de origen natural o en una proporción de origen no natural, esto es, alterada; o (2) la modificación de un organismo para sobreexpresar o infraexpresar una o más enzimas celulolíticas; o (3) la modificación de un organismo de forma que se delecione al menos una enzima celulolítica. En consecuencia, en algunos modos de realización, la preparación de celulasa entera puede tener una o más de las diversas EG y/o CBH, y/o beta-glucosidasas

50 delecionadas. Por ejemplo, EG1 puede delecionarse sola o en combinación con otras EG y/o CBH.

[0076] En general, la preparación de celulasa entera incluye enzimas, incluyendo, pero sin carácter limitativo: (i) endoglucanasas (EG) o 1,4β-d-glucano-4-glucanohidrolasas (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanasas, incluyendo 1,4-β-dglucano glucanohidrolasas (también conocidas como celodextrinasas) (EC 3.2.1.74) y 1,4-β-glucanocelobiohidrolasas (exocelobiohidrolasas, CBH) (EC 3.2.1.91), y (iii) β-glucosidasa (BG) o β-glucosida

55 glucohidrolasas (EC 3.2.1.21).

[0077] En la presente exposición, la preparación de celulasa entera puede ser de cualquier microorganismo que sea útil para la hidrólisis de un material celulósico. En algunos modos de realización, la preparación de celulasa entera es una celulasa entera de hongos filamentosos. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota. En algunos modos de realización, la preparación de

celulasa entera es una celulasa entera de especies de Acremonium, Aspergillus, Emericella, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Scytalidium,Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma. En algunos modos de realización, la preparación de celulasa entera es una celulasa entera de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, o 5 Aspergillus oryzae. En otro aspecto, la preparación de celulasa entera es una celulasa entera de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otro aspecto, la 10 preparación de celulasa entera es una celulasa entera de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Scytalidium thermophilum, o Thielavia terrestris. En otro aspecto, la preparación de celulasa entera es una celulasa entera de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei p. ej., RL-P37 (Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984) pp. 46-53; Montenecourt B.S., Can., 1-20, 1987), QM9414 (ATCC n.º. 26921), NRRL

15 15709, ATCC 13631, 56764, 56466, 56767, o Trichoderma viride p. ej., ATCC 32098 y 32086. En algunos modos de realización, la preparación de celulasa entera es una celulasa entera de Trichoderma reesei RutC30, que está disponible en American Type Culture Collection como Trichoderma reesei ATCC 56765.

[0078] Entre los ejemplos de preparaciones de celulasa comerciales adecuadas para utilizarse en la presente exposición se incluyen, por ejemplo, CELLUCLAST™ (disponible en Novozymes A/S) y las enzimas LAMINEX™,

20 IndiAge™ y Primafast™ LAMINEX BG, ACCELLERASE™ 100 y ACCELLERASE™ 1500 (disponibles en Genencor Division, Danisco US. Inc.)

[0079] En la presente exposición, la preparación de celulasa entera puede ser de cualquier método de cultivo de microorganismos conocido en la técnica que dé lugar a la expresión de enzimas capaces de hidrolizar un material celulósico. La fermentación puede incluir cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña o a

25 gran escala, tales como fermentaciones continuas, por lotes, por lote alimentado, o en medio sólido en laboratorios o fermentadores industriales realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permitan que la celulasa se exprese o se aísle.

[0080] Por lo general, el microorganismo se cultiva en un medio de cultivo celular adecuado para la producción de enzimas capaces de hidrolizar un material celulósico. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado

30 que comprende fuentes de carbono y nitrógeno, así como sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. En la técnica, se conocen medios de cultivo, intervalos de temperatura y otras condiciones de crecimiento y producción de celulasa adecuados. Como ejemplo no limitativo, el intervalo de temperatura normal para la producción de celulasas a partir de Trichoderma reesei es de 24 °C a 28 °C.

[0081] Generalmente, la preparación de celulasa entera se utiliza como se produce mediante la fermentación con

35 recuperación y/o purificación mínima o inexistente. Por ejemplo, una vez que una célula secreta las celulasas en el medio de cultivo celular, puede utilizarse el medio de cultivo celular que contiene las celulasas. En algunos modos de realización, la preparación de celulasa entera comprende los contenidos no fraccionados de material de fermentación, incluyendo medio de cultivo celular, enzimas extracelulares y células. Alternativamente, la preparación de celulasa entera puede ser procesada mediante cualquier método conveniente, por ejemplo,

40 mediante precipitación, centrifugación, afinidad, filtración o cualquier otro método conocido en la técnica. En algunos modos de realización, la preparación de celulasa entera puede ser concentrada, por ejemplo, y utilizarse sin purificación adicional. En algunos modos de realización, la preparación de celulasa entera comprende agentes químicos que disminuyen la viabilidad de células o matan las células. En algunos modos de realización, las células se lisan o se permeabilizan mediante la utilización de métodos conocidos en la técnica.

45 III. Biología Molecular

[0082] En un modo de realización la presente exposición proporciona la expresión de variantes de genes cbh2 bajo el control de un promotor funcional en un hongo filamentoso. Por consiguiente, la presente exposición se basa en técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante (Véase, p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., 1989; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, 1990;

50 y Ausubel et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1994).

Métodos de mutación de secuencias de ácido nucleico de cbh2

[0083] En la presente exposición, se contempla cualquier método conocido en la técnica que pueda introducir mutaciones.

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alineadas de la figura 3.

[0103] Las búsquedas de secuencias se llevan a cabo normalmente utilizando el programa BLASTN cuando se evalúa una secuencia de ácido nucleico determinada en relación con las secuencias de ácido nucleico de las secuencias de ADN de GenBank y otras bases de datos públicas. Se prefiere el programa BLASTX para buscar

5 secuencias de ácido nucleico que se han traducido en todos los marcos de lectura con respecto a las secuencias de aminoácidos de las secuencias de proteínas de GenBank y otras bases de datos públicas. Tanto BLASTN como BLASTX funcionan utilizando parámetros por defecto de una penalización por hueco abierto de 11.0, y una penalización por hueco extendido de 1.0, y utilizan la matriz BLOSUM-62. (Véase, p. ej., Altschul, et al., 1997.)

V. Expresión de variantes de CBH2 recombinantes

10 [0104] Los métodos de la exposición se basan en la utilización de células para expresar la variante de CBH2, sin que se requiera ningún método concreto de expresión de CBH2. La variante de CBH2 se secreta preferiblemente de las células. La exposición proporciona células huésped que se han transducido, transformado o transfectado con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de CBH2. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas anteriormente para la

15 célula huésped parental antes de la transducción, transformación o transfección y resultarán evidentes para los expertos en la materia.

[0105] En un enfoque, se transfecta una célula de hongo filamentoso o una célula de levadura con un vector de expresión que tiene un promotor o un fragmento de promotor biológicamente activo o uno o varios (p. ej., una serie) de los potenciadores que funciona en la línea de la célula huésped, operativamente unidos a un segmento

20 de ADN que codifica la variante de CBH2, de manera que la variante de CBH2 se expresa en la línea celular.

A. Vectores de expresión/Constructos de ácido nucleico

[0106] Se pueden incorporar fragmentos de polinucleótidos naturales o sintéticos que codifican la variante de CBH2 (“secuencias de ácido nucleico que codifican CBH2”) en vectores o constructos de ácido nucleico heterólogos, capaces de la introducción y la replicación en una célula de levadura o de hongo filamentoso. Los 25 vectores y métodos expuestos en el presente documento son adecuados para utilizarse en células huésped para la expresión de la variante de CBH2. Se puede utilizar cualquier vector siempre que sea replicable y viable en las células en las que se introduce. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y están disponibles comercialmente. Los vectores de clonación y expresión también se describen en Sambrook et al., 1989, Ausubel F M et al., 1989, y Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast 30 Saccharomyces, 1981. Se describen vectores de expresión adecuados para hongos en van den Hondel, C. A. M.

J. J. et al. (1991) En: Bennett, J. W. y Lasure, L. L. (eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428. La secuencia de ADN adecuada se puede insertar en un plásmido o vector (denominados colectivamente en el presente documento como “vectores”) mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción adecuado(s)

35 mediante procedimientos estándar. Se considera que dichos procedimientos y los procedimientos de subclonación relacionados están dentro del alcance del conocimiento de los expertos en la materia.

[0107] Se pueden producir hongos filamentosos recombinantes que comprenden la secuencia codificadora para la variante de CBH2 introduciendo un constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende la secuencia codificadora de la variante de CBH2 en las células de una cepa seleccionada de los hongos filamentosos.

40 [0108] Una vez que se obtiene la forma deseada de una secuencia de ácido nucleico de la variante de cbh2, se puede modificar de diversas maneras. Cuando la secuencia implica regiones flanqueantes no codificadoras, las regiones flanqueantes se pueden someter a resección, mutagénesis, etc. De esta manera, se pueden realizar transiciones, transversiones, deleciones e inserciones en la secuencia de origen natural.

[0109] Puede insertarse una secuencia codificadora de la variante de cbh2 seleccionada en un vector adecuado

45 de conformidad con técnicas recombinantes conocidas y utilizarse para transformar los hongos filamentosos capaces de la expresión de CBH2. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden utilizar otras secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual o funcionalmente equivalente para clonar y expresar la variante de CBH2. Por lo tanto, se entiende que dichas sustituciones en la región codificadora están dentro de las variantes de secuencias cubiertas por la presente

50 exposición. Se pueden utilizar todas y cada una de estas variantes de secuencias de la misma manera que se describe en el presente documento para una secuencia de ácido nucleico parental que codifica CBH2.

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[0118] La práctica de la presente exposición empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la técnica. Dichas técnicas se explican de forma completa en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Ausubel, et al., 1993; y Coligan et al., Current Protocols in

5 Immunology, 1991.

B. Células huésped y condiciones de cultivo para la producción de CBH2

(i) Hongos filamentosos

[0119] De esta manera, la presente exposición proporciona hongos filamentosos que comprenden células que han sido modificadas, seleccionadas y cultivadas de manera efectiva para dar lugar a la producción o expresión

10 de variante de CBH2 con respecto a los correspondientes hongos parentales no transformados.

[0120] Ejemplos de especies de hongos filamentosos parentales que se pueden tratar y/o modificar para la expresión de variante de CBH2 incluyen, pero sin carácter limitativo, Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii; Penicillium sp., Humicola sp., incluyendo Humicola insolens; Aspergillus sp., Chrysosporium sp., Fusarium sp., Hypocrea sp., y Emericella sp.

15 [0121] Las células que expresan CBH2 se cultivan bajo condiciones normalmente empleadas para cultivar la línea fúngica parental. Generalmente, las células se cultivan en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes, tal como se describe en Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 y Ilmen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997). Las condiciones de cultivo también son estándar, por ejemplo, los cultivos se

20 incuban a 28 ºC en agitadores de cultivos o fermentadores hasta que se consiguen niveles de expresión de CBH2 deseados.

[0122] Las condiciones de cultivo preferidas para un hongo filamentoso determinado se pueden encontrar en la literatura científica y/o de la fuente de los hongos, tal como la American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org/). Después de establecer crecimiento fúngico, las células se exponen a condiciones efectivas para

25 causar o permitir la expresión de la variante de CBH2.

[0123] En casos en los que una secuencia que codifica CBH2 está bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor, por ejemplo, un azúcar, una sal de metal o antibióticos, se añade al medio en una concentración efectiva para inducir la expresión de CBH2.

[0124] En un modo de realización, la cepa comprende Aspergillus niger, que es una cepa útil para obtener

30 proteína sobreexpresada. Por ejemplo, se sabe que A. niger var awamori dgr246 secreta cantidades elevadas de celulasas secretadas (Goedegebuur et al., Curr. Genet (2002) 41: 89-98). Se conocen otras cepas de Aspergillus niger varawamori, tales como GCDAP3, GCDAP4 y GAP3-4 (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738743, 1993).

[0125] En otro modo de realización, la cepa comprende Trichoderma reesei, que es una cepa útil para obtener

35 proteína sobreexpresada. Por ejemplo, se sabe que RL-P37, descrita por Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53 (1984) secreta cantidades elevadas de enzimas de celulasa. Los equivalentes funcionales de RL-P37 incluyen la cepa RUT-C30 (ATCC n.º 56765) y la cepa QM9414 (ATCC n.º 26921) de Trichoderma reesei. Se contempla que estas cepas también serían útiles en la sobreexpresión de la variante de CBH2.

[0126] Cuando se desea obtener la variante de CBH2 en ausencia de actividad celulolítica nativa potencialmente

40 perjudicial, es útil obtener una cepa de célula huésped de Trichoderma en la que se hayan delecionado uno o varios genes de celulasa antes de la introducción de un constructo de ADN o plásmido que contiene el fragmento de ADN que codifica la variante de CBH2. Dichas cepas se pueden preparar mediante el método expuesto en la patente estadounidense con n.º 5,246,853 y WO 92/06209. Mediante la expresión de una variante de celulasa CBH2 en un microorganismo huésped al que le falta uno o varios genes de celulasa, se simplifican los

45 procedimientos de identificación y posterior purificación. Cualquier gen de Trichoderma sp. que se haya clonado se puede delecionar, por ejemplo, los genes cbh1, cbh2, egl1, y egl2, así como los que codifican la proteína EG III y/o EGV (véase, por ejemplo, la patente estadounidense con n.º 5,475,101 y WO 94/28117, respectivamente).

[0127] La deleción de genes se puede conseguir insertando una forma del gen que se desea delecionar o alterar en un plásmido mediante métodos conocidos en la técnica. El plásmido de deleción se corta a continuación en 50 un sitio o sitios de enzimas de restricción adecuado(s), interno a la región codificadora del gen deseado, y la secuencia codificadora del gen o parte de la misma se sustituye por un marcador seleccionable. Las secuencias

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seleccionable elegido. Por ejemplo, si se elige el marcador seleccionable de pyrG para Aspergillus sp., entonces se utiliza una cepa derivada de pyrG-específica como receptor en el procedimiento de transformación. Además, por ejemplo, si se elige el marcador seleccionable de pyr4 para una Hyprocrea sp., entonces se utiliza una cepa derivada de pyr4-específica como receptor en el procedimiento de transformación. De manera similar, se

5 pueden utilizar los marcadores seleccionables que comprenden genes de Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.) equivalentes a los genes amdS, argB, trpC, niaD de Aspergillus nidulans. Por lo tanto, la cepa receptora correspondiente debe ser una cepa derivada, tal como argB-, trpC-, niaD-, respectivamente.

[0134] A continuación, se prepara el ADN que codifica la variante de CBH2 para la inserción en un microorganismo adecuado. De acuerdo con la presente exposición, el ADN que codifica una variante de CBH2

10 comprende el ADN necesario para codificar una proteína que tiene actividad celulolítica funcional. El fragmento de ADN que codifica la variante de CBH2 puede unirse funcionalmente a una secuencia promotora fúngica, por ejemplo, el promotor del gen glaA en Aspergillus o el promotor de los genes cbh1 o egl1 en Trichoderma.

[0135] También se contempla que más de una copia de ADN que codifica una variante de CBH2 se pueda recombinar en la cepa para facilitar la sobreexpresión. El ADN que codifica la variante de CBH2 se puede 15 preparar mediante la construcción de un vector de expresión que porta el ADN que codifica la variante. El vector de expresión que porta el fragmento de ADN insertado que codifica la variante de CBH2 puede ser cualquier vector que sea capaz de replicarse de manera autónoma en un organismo huésped determinado o de integrarse en el ADN del huésped, normalmente un plásmido. En modos de realización preferidos, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de los genes. El primero contiene secuencias de ADN en las 20 que el promotor, la región codificadora del gen y la secuencia de terminación se originan todas del gen que se ha de expresar. El truncamiento del gen se puede obtener cuando se desee delecionando las secuencias de ADN no deseadas (p. ej., que codifican dominios no deseados) para dejar que el dominio se exprese bajo el control de sus propias secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción. Un marcador seleccionable también puede contenerse en el vector que permite la selección para la integración en el huésped de múltiples copias de

25 las nuevas secuencias de genes.

[0136] El segundo tipo de vector de expresión se preensambla y contiene secuencias requeridas para la transcripción a alto nivel y un marcador seleccionable. Se contempla que la región codificadora para un gen o parte del mismo se puede insertar en este vector de expresión de propósito general, de manera que está bajo el control transcripcional de las secuencias de promotor y terminador de los casetes de expresión.

30 [0137] Por ejemplo, en Aspergillus, pRAX es dicho vector de expresión de propósito general. Se pueden insertar genes o partes de los mismos en dirección 3' del promotor glaa fuerte.

[0138] Por ejemplo, en Hypocrea, pTEX es dicho vector de expresión de propósito general. Pueden insertarse genes o partes de los mismos en dirección 3' del promotor cbh1 fuerte.

[0139] En el vector, la secuencia de ADN que codifica la variante de CBH2 de la presente exposición debe estar

35 operativamente unida a las secuencias de transcripción y traducción, es decir, una secuencia promotora y una secuencia señal adecuadas en el marco de lectura al gen estructural. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad transcripcional en la célula huésped y puede derivarse de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a la célula huésped. Un péptido señal opcional proporciona la producción extracelular de la variante de CBH2. El ADN que codifica la secuencia señal es preferiblemente el que está

40 asociado de manera natural al gen que se ha de expresar, aunque se contempla la secuencia señal de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, una exocelobiohidrolasa o endoglucanasa de Trichoderma.

[0140] Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican la variante de CBH2 de la presente exposición con el promotor, y la inserción en vectores adecuados se conocen bien en la técnica.

[0141] El vector o constructo de ADN descrito anteriormente puede introducirse en la célula huésped según

45 técnicas conocidas, tales como transformación, transfección, microinyección, microporación, bombardeo biolístico y similares.

[0142] En la técnica de transformación preferida, debe tenerse en cuenta que la permeabilidad de la pared celular al ADN en Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.) es muy baja. Por consiguiente, la absorción de la secuencia de ADN deseada, el gen o el fragmento de gen es, como mucho, mínima. Existen varios métodos para aumentar

50 la permeabilidad de la pared celular de Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.) en la cepa derivada (es decir, que carece de un gen funcional correspondiente al marcador seleccionable utilizado) antes del proceso de transformación.

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glucosidasa de Trichoderma reesei (Cummings y Fowler, Curr. Genet. 29:227-233, 1996), una xilanasa de Aureobasidlium pullulans (Li y Ljungdahl, Appl. Environ. Microbiol. 62, n.º 1, pp. 209-213, 1996), una alfa amilasa de trigo (Rothstein et al., Gene 55:353-356, 1987), etc. Además, un casete del gen de celulasa que codifica la endo-[beta]-1,4-glucanasa (END1) de Butyrivibrio fibrisolvens, celobiohidrolasa (CBH1) de Phanerochaete

5 chrysosporium, la celodextrinasa (CEL1) de Ruminococcus flavefaciens y la celobiasa de Endomyces fibrilizer (Bgl1) se expresó satisfactoriamente en una cepa de laboratorio de S. cerevisiae (Van Rensburg et al., Yeast, vol. 14, pp. 67-76, 1998).

C. Introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica CBH2 en células huésped.

[0150] La exposición proporciona, además, células y composiciones celulares que han sido modificadas

10 genéticamente para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de CBH2 proporcionada de manera exógena. Se puede modificar genéticamente una célula parental o línea celular (es decir, transducirse, transformarse o transfectarse) con un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc., como se describe de manera adicional anteriormente.

15 [0151] Los métodos de transformación de la presente exposición pueden dar lugar a la integración estable de todo o parte del vector de transformación en el genoma del hongo filamentoso. No obstante, también se contempla la transformación que da lugar al mantenimiento de un vector de transformación extracromosómico autorreplicante.

[0152] Se pueden utilizar muchos métodos de transfección estándar para producir líneas celulares de

20 Trichoderma reesei que expresen grandes cantidades de la proteína heteróloga. Algunos de los métodos publicados para la introducción de constructos de ADN en cepas que producen celulasa de Trichoderma incluyen Lorito, Hayes, DiPietro y Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu y Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17:169-174; Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen y Knowles, 1987, Gene 6: 155-164, para Aspergillus Yelton, Hamer y Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, para Fusarium Bajar,

25 Podila y Kolattukudy, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212, para Streptomyces Hopwood et al., 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UK y para Bacillus Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi y Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138).

[0153] Otros métodos para introducir un constructo de ácido nucleico heterólogo (vector de expresión) en hongos filamentosos (p. ej., H. jecorina) incluyen, pero sin carácter limitativo, la utilización de una pistola de genes o de 30 partículas, permeabilización de las paredes celulares de hongos filamentosos antes del proceso de transformación (p. ej., mediante la utilización de altas concentraciones de álcali, por ejemplo, 0,05 M a 0,4 M de CaCl.sub.2 o acetato de litio), fusión de protoplastos o transformación mediada por Agrobacterium. Se describe un método de ejemplo para la transformación de hongos filamentosos mediante el tratamiento de protoplastos o esferoplastos con polietilenglicol y CaCl.sub.2 en Campbell, E.1. et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989 y Penttila, M.

35 et al., Gene, 63:11-22, 1988.

[0154] Se puede utilizar cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir secuencias de nucleótidos exógenas en células huésped. Estos incluyen la utilización de la transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, biolística, liposomas, microinyección, vectores plasma, vectores virales y cualquiera de los otros métodos conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro

40 material genético exógeno en una célula huésped (véase, p. ej., Sambrook et al., supra). También se utiliza el método de transfección mediada por Agrobacterium descrito en la patente estadounidense con n.º 6,255,115. Solo es necesario que el procedimiento de ingeniería genética concreto utilizado sea capaz de introducir de manera satisfactoria al menos un gen en la célula huésped capaz de expresar el gen heterólogo.

[0155] Además, los constructos de ácido nucleico heterólogos que comprenden una secuencia de ácido nucleico

45 que codifica una variante de CBH2 se pueden transcribir in vitro, y el ARN resultante se puede introducir en la célula huésped mediante los métodos conocidos, por ejemplo, mediante inyección.

[0156] La exposición incluye, además, transformantes nuevos y útiles de hongos filamentosos, tales como H. jecorina y A. niger para utilizarse en la producción de composiciones de celulasa fúngicas. La exposición incluye transformantes de hongos filamentosos, especialmente hongos que comprenden la secuencia que codifica la

50 variante de CBH2, o la deleción de la secuencia que codifica la cbh endógena.

[0157] Después de la introducción de un constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende la secuencia codificadora para una variante de cbh2, las células modificadas genéticamente se pueden cultivar en medios de nutrientes convencionales modificados según convenga para activar los promotores, seleccionar los

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la producción de bioetanol), y/o en composiciones para pienso. El aislamiento y caracterización de la celulasa de cada tipo proporciona la capacidad para controlar los aspectos de tales composiciones.

[0166] En un enfoque, la celulasa de la exposición es útil en composiciones detergentes o en el tratamiento de tejidos para mejorar el tacto y la apariencia.

5 [0167] Puesto que la velocidad de hidrólisis de los productos celulósicos se puede aumentar mediante la utilización de un transformante que tenga al menos una copia adicional del gen cbh insertado en el genoma, los productos que contienen celulosa o heteroglicanos se pueden degradar a un ritmo más rápido y en mayor medida. Los productos fabricados con celulosa, tales como papel, algodón, pañales de celulosa, y similares se pueden degradar de manera más eficiente en un vertedero. De esta manera, el producto de la fermentación

10 obtenible de los transformantes o los transformantes solos se puede utilizar en composiciones para ayudar a degradar mediante licuefacción una variedad de productos de celulosa que se añaden a los vertederos llenos.

[0168] La sacarificación y fermentación por separado es un proceso por el que la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, rastrojos de maíz, se convierte en glucosa y, posteriormente, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. La sacarificación y fermentación simultánea es un proceso por el que la celulosa

15 presente en la biomasa, por ejemplo, rastrojos de maíz, se convierte en glucosa y, al mismo tiempo y en el mismo reactor, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. De esta manera, en otro enfoque, la variante de celulasa de tipo CBH de la exposición resulta útil en la degradación de la biomasa en etanol. La producción de etanol a partir de fuentes de celulosa fácilmente disponibles proporciona una fuente de combustible renovable estable.

20 [0169] Las materias primas basadas en celulosa están compuestas por residuos agrícolas, pastos y maderas y otra biomasa de bajo valor, tal como residuos municipales (p. ej., papel reciclado, hierba cortada, etc.). El etanol se puede producir a partir de la fermentación de cualquiera de estas materias primas celulósicas. No obstante, la celulosa debe convertirse primero en azúcares antes de que pueda haber una conversión en etanol.

[0170] Se pueden utilizar una gran variedad de materias primas con la variante de CBH inventiva y la

25 seleccionada para su uso puede depender de la región en la que se realiza la conversión. Por ejemplo, en el medio oeste de Estados Unidos pueden predominar residuos agrícolas tales como paja de trigo, rastrojo de maíz y bagazo, mientras que en California puede predominar la paja de arroz. No obstante, debe entenderse que se puede utilizar cualquier biomasa celulósica disponible en cualquier región.

[0171] Los métodos de la presente exposición pueden utilizarse en la producción de monosacáridos, disacáridos

30 y polisacáridos como materias primas químicas o de fermentación para microorganismos para la producción de productos orgánicos, químicos y combustibles, plásticos y otros productos terminados o intermedios. En concreto, puede aumentar el valor de la transformación de residuos (residuos desecados de destilería, residuos desecados de cervecería, bagazo de caña de azúcar, etc.) mediante solubilización completa o parcial de la celulosa o hemicelulosa. Además del etanol, algunos productos químicos que pueden producirse a partir de la

35 celulosa y la hemicelulosa incluyen: acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgánicos (p. ej., ácido láctico), 1,3propanodiol, butanodiol, glicerol, etilenglicol, furfural, polihidroxialcanoatos, ácido cis, cis-mucónico, piensos animales y xilosa.

[0172] Una composición de celulasas que contiene una cantidad mejorada de celobiohidrolasa resulta útil en la producción de etanol. El etanol de este proceso también se puede utilizar como un potenciador de octanaje o

40 directamente como combustible en lugar de gasolina, lo cual es ventajoso puesto que el etanol como fuente de combustible es más ecológico que los productos derivados del petróleo. Se sabe que la utilización de etanol mejorará la calidad del aire y posiblemente reducirá los niveles locales de ozono y esmog. Además, la utilización de etanol en lugar de gasolina puede ser de importancia estratégica en la amortiguación del impacto de los cambios repentinos en la energía no renovable y los suministros petroquímicos.

45 [0173] El etanol se puede producir a través de procesos de sacarificación y fermentación a partir de biomasa celulósica, tales como árboles, plantas herbáceas, residuos sólidos municipales y residuos agrícolas y forestales. No obstante, la proporción de enzimas de celulasa individuales en una mezcla de celulasas de origen natural producida mediante un microbio puede no ser la más eficaz para la conversión rápida de la celulosa de la biomasa en glucosa. Se sabe que las endoglucanasas actúan para producir nuevos extremos en la cadena de

50 celulosa que por sí mismos son sustratos para la acción de celobiohidrolasas y mejoran, de esta manera, la eficacia de la hidrólisis del sistema de celulasas entero. Por lo tanto, la utilización de actividad de celobiohidrolasa aumentada u optimizada puede mejorar en gran medida la producción de etanol.

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NanoDrop™ (Thermo), en duplicados tras una dilución de muestra 1:10 para determinar la concentración total de proteínas de las muestras.

Determinaciones del potencial zeta

[0186] Este ejemplo describe la determinación del potencial zeta de una enzima y un sustrato. La presencia de

5 una carga en la superficie de una partícula influye en la distribución de los iones en la región interfacial circundante. El resultado es una concentración de iones contrarios incrementada de carga opuesta a la de la partícula situada cerca de la superficie de la partícula. A medida que uno se aleja de la superficie de la partícula, la distribución heterogénea de iones será, finalmente, homogénea. La distancia a la que se obtiene una distribución homogénea se denomina longitud de Debye (1/κ) o distancia de cribado, y depende de la fuerza

10 iónica, como se muestra en la expresión que sigue, donde ε0 es la permitividad de espacio libre (8.854 x 10-12 F m-1), εr es la permitividad del líquido, k es la constante de Boltzmann (1.38 x 10-23 J K-1), T es la temperatura en Kelvin, e es la carga electrónica (1.6022 x 10-19 C), I es la fuerza iónica molar, y NA es la constante de Avogadro

(6.022 x 1023 mol-1).

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15 La fuerza iónica molar puede calcularse a partir de la siguiente ecuación, donde Ci es la concentración de especies iónicas y Zi es la valencia.

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Para agua a 298 K, la expresión de longitud de Debye se reduce a la forma siguiente.

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20 La capa líquida alrededor de la partícula tiene dos partes; una región interior (capa de Stem) donde los iones están fuertemente unidos y una región exterior (difusa) donde están asociados con menos firmeza. En la capa difusa, existe un límite en el interior del cual los iones y las partículas forman una entidad estable. Cuando se mueve una partícula, los iones que se encuentran en este límite se mueven con ella. Los iones que se encuentran más allá del límite no se desplazan con la partícula. El potencial eléctrico en este límite, también

25 denominado superficie de cizalla hidrodinámica, se define como potencial zeta.

[0187] En la dispersión de luz electroforética, el potencial zeta z se calcula a partir de la movilidad electroforética medida u mediante la utilización de la ecuación de Henry que se muestra a continuación, donde ε es la constante dieléctrica, h es la viscosidad de la solución, k es la longitud de Debye inversa, a es el radio de la partícula y f(ka) es la función de Henry.

30

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[0188] Las unidades de k son longitud recíproca, siendo 1/k el "grosor" de la doble capa eléctrica (longitud de Debye). El parámetro a se refiere al radio de la partícula y, por consiguiente, ka es la proporción del radio de la partícula en relación con el grosor de la doble capa eléctrica. La función de Henry, f(ka) depende de la forma de la partícula, pero se conoce para una esfera. En la expresión anterior, varía entre f(0) = 1 (límite de Hückel) y f(¥)

35 = 1.5 (límite de Smoluchowski). Para las partículas pequeñas como las proteínas en un medio dieléctrico bajo (o fuerza iónica baja), el límite de Hückel de f(ka) = 1 es el modelo más adecuado.

[0189] Los potenciales zeta de las proteínas se midieron con el Zetasizer NS (Malvern Instruments, Reino Unido) según el principio descrito anteriormente. Los potenciales zeta de tejidos teñidos con bismaleimida se midieron con el SurPass (Anton-Paar, Austria) utilizando la implementación del potencial de flujo del principio anterior. A

40 partir de la definición de carga superficial, normalmente expresada en Culombios:

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También puede expresarse como una carga neta z multiplicada por la carga elemental e 1.6*10-19C:

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Por consiguiente, el cambio esperado en el potencial zeta debido a un incremento de la carga neta es proporcionado por:

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5 También es posible medir los potenciales zeta con una técnica de gel nativo (Sparks et al., Journal of Lipid Research, 33:123-130, 1992) como se describe en el ejemplo 1. La movilidad electroforética medida con geles nativos es normalmente menor que en solución debido al retardo provocado por la matriz de gel. Los potenciales zeta calculados de esta manera son normalmente más bajos en comparación con los métodos basados en soluciones. Por lo tanto, nos referimos a ellos como potenciales zeta aparentes cuando se obtienen a través de

10 la técnica con gel nativo.

[0190] La carga efectiva en una formulación determinada se enumera como su potencial zeta. La utilización del potencial zeta como una escala de carga común posibilita la comparación de variantes de enzimas que tienen distintos pliegues (p. ej., serina proteasas, metaloproteasas, etc.), así como interacciones con distintos sustratos

(p. ej., micromuestra de bismaleimida) en las condiciones de interés (p. ej., detergente American Association of

15 Textile Chemists and Colorists [AATCC] HDL). Si bien se prefiere el potencial zeta para comparar distintos pliegues proteicos, las movilidades electroforéticas o las cargas medidas también proporcionan una escala absoluta y son adecuadas para las comparaciones. El rendimiento de la bismaleimida como una función del potencial zeta de las enzimas se describe mediante una distribución normal estándar, indicada por la línea sólida, con una media µ igual a -9,68 mV, desviación típica σ de 11,39 mV y valor pico de 0,4056 [A600-fondo]. Esta

20 distribución se indica en coordinadas reducidas estándar por la actividad de la bismaleimida divididas por el valor pico en el eje Y derecho como una función de la puntuación Z en el eje X superior. La puntuación Z se define, como es habitual, como (X-µ)/σ, donde X es, en este caso, el potencial zeta.

Tabla 1-1 Actividad en la micromuestra de bismaleimida de las proteasas

Nivel de rendimiento

Puntuación Z Potencial Z ζ Ventana* para la actividad de micromuestra de bismaleimida

90 %

± 0,46 -14,92 < ζ < -4,44

80 %

± 0,65 -17,08 < ζ < -2,28

70 %

± 0,84 -19,25 < ζ < -0,11

60 %

± 1,00 -21,07 < ζ < +1,71

50 %

± 1,18 -23,12 < ζ < +3,76

*Media µ = -9,68 mV, desviación típica σ = 11,39 mV, potencial zeta ζ = Z* σ+µ Tampón de referencia: HEPES 5mM, pH 8.0, 2,5mM NaCl

[0191] La distribución normal es única para cada tintado de sustrato en condiciones de reacción determinadas

25 (pH, conductividad, tipo de sal, quelantes detergentes, etc.). Distintas ventajas o resultados favorables siguen a una distribución normal con una propiedad física que se mantiene en las enzimas de diversos pliegues, como por ejemplo, el caso de niveles de expresión y potenciales zeta para variantes de carga en escalera ASP y NprE. En una distribución normal el valor pico se da en la media. La comparación de cargas de enzima y de sustrato en una escala de potencial zeta común revela que el rendimiento de la bismaleimida óptimo se da cuando el

30 potencial zeta de enzima medio, en este caso -9,68 mV, básicamente se empareja con el potencial zeta del tintado de sustrato, en este caso -8,97 mV, medido en las mismas condiciones.

[0192] Los niveles de rendimiento de las distribuciones normales estándar se describen convenientemente por lo que respecta a sus puntuaciones z como se indica en la tabla 1-1 (Véase, Abramowitz y Stegun, Handbook of Mathematical Functions with Formulas, Graphs, and Mathematical Tables, Dover, New York, 9th Ed., 1964). La 35 conversión a potenciales zeta es conocimiento claro proporcionado de la media y la desviación típica definiendo la distribución para una aplicación determinada. En este ejemplo, el rendimiento de limpieza medido para un pliegue proteico se limita a valores de potencial zeta entre -40 mV y + 20 mV. Las variantes con un rendimiento de limpieza por encima de un 80 % de su pliegue óptimo (esto es z = ± 0,65), se limitan a valores de potencial zeta entre -17,08 mV y -2,28 mV. Las variantes con un rendimiento de limpieza por encima de un 90 % de su

40 pliegue óptimo (esto es z = ± 0,46), se limitan a valores de potencial zeta entre -14,92 mV y -4,44 mV.

[0193] Distintas manchas de sustrato (p. ej., hierba, manchas derivadas del cuerpo, tomate) tienen distintos potenciales zeta en la misma formulación y la misma mancha de sustrato tiene distintos potenciales zeta en

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[0199] Los siguientes ensayos se utilizaron en los ejemplos descritos a continuación. Cualquier desviación de los protocolos proporcionados a continuación se indica en los ejemplos. En estos experimentos, se utilizó un espectrofotómetro para medir la absorbancia de los productos formados al término de las reacciones.

5 Ensayo con hexoquinasa para la medición de glucosa residual

[0200] Se midió la glucosa residual de sobrenadantes de cultivos de H. jecorina que expresan variantes de CBH2 mediante la utilización de un ensayo con hexoquinasa. Se añadió un volumen de 5 µl de sobrenadante al ensayo con hexoquinasa glucosa de 195 µl (Instrumentation Laboratory, Breda, Países Bajos) en un una placa de microtitulación de 96 pocillos (Costar Flat Bottom PS). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante

10 15 min. A continuación de la incubación, se midió la absorbancia a 340 nm DO. Se excluyeron los sobrenadantes de cultivos que expresan glucosa residual del agrupamiento para estudios adicionales.

Ensayo HPLC para la determinación del contenido de proteína

[0201] La concentración de proteínas de variante de CBH2 de sobrenadantes de cultivos combinados se determinó mediante la utilización de un HPLC Agilent 1100 (Hewlet Packard) equipada con una columna Proswift 15 RP 2H (Dionex). Se inyectaron diez microlitros de muestra, mezclados con 50 µl de 10 % de acetonitrilo en agua desmineralizada filtrada tras el equilibrio de la columna de HPLC con 10 % de acetonitrilo que contiene 0,01 % de ácido trifluoroacético. Se eluyeron los compuestos mediante la utilización de un gradiente de 10 % a 30 % de acetonitrilo desde 0,3 min hasta 1 min, seguido de un gradiente de 30 % a 65 % desde 1 min hasta 4 mins. Las concentraciones de proteína de las variantes de CBH2 se determinaron a partir de una curva de calibración

20 generada utilizando CBH2 de tipo salvaje purificada (6,25; 12,5; 25; 50 µg/ml). Para calcular el índice de rendimiento (IR), se promedió la relación de la proteína total (media) producida por una variante y la proteína total (media) producida por el tipo salvaje en la misma dosis.

Determinación de la actividad específica mediante ensayo de hidrólisis de celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC, por sus siglas en inglés)

25 [0202] Hidrólisis de celulosa: La celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC) se preparó a partir de Avicel, según un método publicado (Walseth, Tappi 35:228, 1971; y Wood, Biochem J, 121:353-362, 1971). Este material se diluyó con tampón y agua para conseguir una mezcla de 1 % p/v de forma que la concentración final de acetato de sodio fuera 50mM, pH 5.0. Se dispersaron cien microlitros de una suspensión de PASC 1 % en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5.0) en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Costar Flat Bottom

30 PS). Se añadieron diez microlitros de un sobrenadante de cultivo de 5 mg/ml de una cepa delecionada de CBH2 a la PASC, y a esto se le añadieron 5, 10, 15 o 20 µl de sobrenadantes de cultivo combinados de células de H. Jecorina que expresan CBH2 de tipo salvaje o variantes de CBH2. La deleción del gen CBH2 de Hypocrea jecorina (también denominada Trichoderma reesei) se describe en la patente estadounidense con n.º 5,861,271 y 5,650,322. Se añadieron volúmenes compensatorios de tampón de acetato para compensar las diferencias en el

35 volumen total. La placa de microtitulación se selló y se incubó en una incubadora termostatizada a 50 ºC en agitación constante a 900 rpm. Tras dos horas, la reacción de hidrólisis se detuvo mediante la adición de tampón de glicina de 100 µl, pH 10 a cada pocillo. Los productos de la reacción de hidrólisis se analizaron con el ensayo PAHBAH.

[0203] Ensayo PAHBAH: Se añadieron alícuotas de 150 µl de reactivo de azúcar reductor PAHBAH (5 % p/v de

40 ácido p-hidroxibenzoico hidrazida (PAHBAH, Sigma # H9882, disuelto en 0,5 N HCl), (Lever, Anal Biochem, 47:273-279, 1972) a todos los pocillos de una placa de microtitulación vacía. Se añadieron diez microlitros de los sobrenadantes de reacción de hidrólisis a la placa de reacción PABAH. Todas las placas se sellaron y se incubaron a 69 ºC en agitación constante a 900 rpm. Después de una hora, se pusieron las placas en hielo durante cinco minutos y se centrifugaron a 720 x g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se

45 transfirieron muestras de 80 µL de las mezclas de reacción PAHBAH desarrolladas a una nueva placa (de lectura) y se midió la absorbancia a 410 nm en un espectrofotómetro. Se incluyó un estándar de celobiosa como control. Se generó una curva de respuesta a la dosis para la proteína de tipo salvaje CBH2. Para calcular el índice de rendimiento (IR), se promedió la relación del azúcar total (medio) producido por una variante y el azúcar total (medio) producido por el tipo salvaje en la misma dosis.

50 Determinación de la actividad específica mediante hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado (PCS) con ácido diluido

[0204] Rastrojo de maíz pretratado (PCS): Se pretrató el rastrojo de maíz con un 2 % de H2SO4 p/p, como se describe (Schell et al., J Appl Biochem Biotechnol, 105:69-86, 2003) y, a continuación, se lavó varias veces con agua desionizada para obtener una pasta que tiene un pH de 4.5. A continuación, se añadió tampón de acetato

de sodio (pH 5.0) a una concentración final de 50mM de acetato de sodio y, cuando fuera preciso, se tituló esta mezcla a pH 5.0 utilizando 1 N de NaOH. La concentración de celulosa en la mezcla de reacción era aproximadamente 7 %. Se añadieron sesenta y cinco microlitros de esta suspensión de celulosa por pocillo a una placa de microtitulación de 96 pocillos (Nunc Flat Bottom PS). Se añadieron diez microlitros de un sobrenadante 5 de cultivo de 5 mg/ml de una cepa delecionada de CBH2 al PCS, y a esto se le añadieron 5, 10, 15 o 20 µl de sobrenadantes de cultivo combinados de células de H. jecorina que expresan CBH2 de tipo salvaje o variantes de CBH2. Se añadieron volúmenes compensatorios de tampón de acetato para compensar las diferencias en el volumen total. Tras sellar la placa, se colocaron las placas en una incubadora termostatizada a 50 ºC en agitación constante a 1300 rpm durante cinco minutos. A continuación, se incubaron las placas a 50 ºC mientras

10 se agitaban a 220 rpm con un 80 % de humedad para evitar el secado. Tras siete días, se pusieron las placas en hielo durante cinco minutos y la reacción de hidrólisis se detuvo mediante la adición de tampón de glicina de 100 µl, pH 10 a cada pocillo. Los productos de la reacción de hidrólisis se analizaron con el ensayo PAHBAH.

[0205] Ensayo PAHBAH: Se añadieron alícuotas de 150 µl de reactivo de azúcar reductor PAHBAH (5 % p/v de ácido p-hidroxibenzoico hidrazida (PAHBAH, Sigma # H9882, disuelto en 0,5 N HCl), (Lever, Anal Biochem, 15 47:273-279, 1972) a todos los pocillos de una placa de microtitulación vacía. Se añadieron diez microlitros de los sobrenadantes de reacción de hidrólisis a la placa de reacción PABAH. Todas las placas se sellaron y se incubaron a 69 ºC en agitación constante a 900 rpm. Después de una hora, se pusieron las placas en hielo durante cinco minutos y se centrifugaron a 720 x g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se transfirieron muestras de 80 µL de las mezclas de reacción PAHBAH desarrolladas a una nueva placa (de

20 lectura) y se midió la absorbancia a 410 nm en un espectrofotómetro. Se incluyó un estándar de celobiosa como control. Se generó una curva de respuesta a la dosis para la proteína de tipo salvaje CBH2. Para calcular el índice de rendimiento (IR), se promedió la relación del azúcar total (medio) producido por una variante y el azúcar total (medio) producido por el tipo salvaje en la misma dosis.

Estabilidad de las variantes de CBH2 en presencia de etanol

25 [0206] Se sometió a ensayo la estabilidad de las CBH2 de tipo salvaje y de las variantes de CBH2 en presencia de 4,5 % de etanol (EtOH) a 49 ºC. Se añadieron sobrenadantes de cultivo combinados (80 µL) de células de H. jecorina que expresan variantes de CBH2 a una placa de 96 pocillos (Greiner V-bottom PS) que contiene 10 µl de 40,5 % de EtOH por pocillo. Las placas se sellaron y se incubaron en una incubadora termostatizada a 49 ºC durante 16 horas en agitación a 900 rpm. A continuación de la incubación, se pusieron las placas en hielo

30 durante 5 minutos. Se determinó la actividad de CBH2 residual utilizando el ensayo de hidrólisis con celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC) como se describe anteriormente.

[0207] Para calcular la actividad residual, se dividió el valor del producto formado por la adición de 5, 10, 15 y 20 µl de CBH2 incubado con EtOH al ensayo PASC de actividad residual por el valor del producto formado por la adición de 5, 10, 15 y 20 µl de CBH2 sin EtOH al ensayo PASC. A continuación, los valores individuales de estas

35 cuatro proporciones se promediaron para proporcionar la actividad residual media. Para determinar el valor IR para la variante, se dividió entonces el valor de la actividad residual media para las variantes por la media de los valores de actividad residual de los controles de CBH2 de tipo salvaje.

Termoestabilidad de variantes de CBH2

[0208] Se sometió a ensayo la termoestabilidad de las CBH2 de tipo salvaje y de las variantes de CBH2 a 53 ºC.

40 Se añadió sobrenadante de cultivo combinado (80 µL) de células de H. jecorina que expresan variantes de CBH2 a una placa de 96 pocillos (Greiner V-bottom PS). Las placas se sellaron y se incubaron en una incubadora termostatizada a 53 ºC durante 16 horas en agitación a 900 rpm. A continuación de la incubación, se pusieron las placas en hielo durante 5 minutos. Se determinó la actividad de CBH2 residual utilizando el ensayo de hidrólisis con celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC) como se describe anteriormente.

45 [0209] Para calcular la actividad residual, se dividió el valor del producto formado por la adición de 5, 10, 15 y 20 µl de CBH2 tratado térmicamente al ensayo PASC de actividad residual por el valor del producto formado por la adición de 5, 10, 15 y 20 µl de CBH2 sin tratar térmicamente al ensayo PASC. A continuación, los valores individuales de estas cuatro proporciones se promediaron para proporcionar la actividad residual media. Para determinar el valor IR para la variante, se dividió entonces el valor de la actividad residual media para las

50 variantes por la media de los valores de actividad residual de los controles de CBH2 de tipo salvaje.

EJEMPLO 2

Evaluación de la unión de lignina

[0210] La lignina, un biopolímero complejo de fenilpropanoide, es el constituyente principal diferente a los carbohidratos de madera que se une a las fibras de celulosa para endurecer y fortalecer las paredes celulares de las plantas. Al estar reticulado a otros componentes de pared celular, la lignina minimiza la accesibilidad de la celulosa y la hemicelulosa a las enzimas de degradación de celulosa. Por lo tanto, generalmente se asocia la

5 lignina con digestibilidad reducida de toda la biomasa vegetal. En concreto, la unión de celulasas a la lignina reduce la degradación de celulosa mediante celulasas. La lignina es hidrofóbica y, al parecer, tiene carga negativa. En consecuencia, se contempla la adición de cargas negativas a las celulasas para reducir su unión a la lignina.

[0211] Como se describe en el presente documento, se creó una reacción para medir el efecto de la modificación

10 química sobre la capacidad de una preparación de celulasa Trichoderma sp. para unir un componente de polímeros vegetales, concretamente la lignina. Se recuperó la lignina mediante la digestión amplia de bagazo de caña de azúcar pretratado con ácido con celulasas (100 mg Laminex BG/ g de celulosa) seguido de la hidrólisis de las celulasas mediante serina proteasa no específica, como se describe precisamente en Berlin et al. (Applied Biochemistry and Biotechnology, 121:163-170, 2005), salvo que la sonicación, el secado, la molienda y el cribado

15 no se realizaron y se añadió al procedimiento un lavado con ácido (0,1 N HCl) para eliminar la proteasa seguido de lavados constantes con tampón de acetato (50 mM acetato de sodio, pH 5) para devolver la muestra a un de pH 5. Brevemente, se combinó 50 µL de lignina 1,16 % (recuperada a partir de la sacarificación completa de bagazo) preparada en tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 5, con µl de una preparación de celulasa Trichoderma sp. desalinizada modificada o sin modificar. Se incubaron tubos para microcentrifugadora que

20 contenían la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante una hora y, a continuación, se centrifugaron a alta velocidad para separar los materiales solubles de los insolubles. Se recogieron diez µl del sobrenadante de cada tubo. Se volvieron a mezclar los tubos de reacción y se incubaron durante dos horas adicionales y, a continuación, se recogieron unas segundas alícuotas de 10 µl del sobrenadante de cada tubo. Se analizaron las muestras de sobrenadante mediante SDS-PAGE. La reducción de la intensidad de banda en las preparaciones

25 de celulasa Trichoderma sp. modificadas era indicativa de una reducción en la unión de lignina.

EJEMPLO 3

Evaluación de la unión de bagazo

[0212] El bagazo es la biomasa que permanece después de que se haya machacado la caña de azúcar para extraer su jugo. Se preparó una solución que contiene 2 % de celulosa de bagazo (tratada con ácido, 28 %

30 sólido, 57 % glicano) en acetato de sodio 50 mM a pH 5. Se diluyeron muestras de preparaciones de celulasa Trichoderma sp. sin modificar o modificadas químicamente diez veces en el mismo tampón de acetato de sodio. Se mezclaron alícuotas de las enzimas diluidas con solución de bagazo o tampón únicamente y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Se recogió el sobrenadante y se sometió a ensayo la actividad de un componente de celulasa, concretamente beta-glucosidasa.

35 [0213] Se midió la actividad de beta-glucosidasa utilizando el ensayo de cloro-nitro-fenil-beta-D-glucósido (CNPG). El ensayo CNPG es un ensayo cinético en el que la β-glucosidasa convierte CNPG en el producto coloreado 2-cloro-4-nitrofenol (CNP). La DO se mide a 405 nm durante un periodo de 10 minutos a 37 ºC. Los índices se obtienen como Vmax mediante el empleo del software SpectraMax y, a continuación, se convierten en actividad específica (µM CNP/s/mg de Proteína). Brevemente, se añadieron 200 µl de tampón de acetato de

40 sodio 50 mM, pH 5.0 a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Se cubrió la placa y se colocó en un Eppendorf Thermomixer a 37 ºC durante 15 minutos para permitir que se equilibrara a la temperatura. Se añadieron cinco µl de las muestras de enzima, diluidas en serie en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5.0 a cada pocillo después del equilibrio. Se diluyó una solución madre de CNPG 10 mM 1:5 utilizando tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5.0, y a continuación, se añadieron 20 µl de la solución de CNPG diluida (2 mM) a

45 cada pocillo que contenía muestras de enzima. Se transfirió la placa de microtitulación a un espectrofotómetro (SpectraMAX, tipo 340; Molecular Devices) a 37 ºC y se leyó la DO a 405 nm durante 0-15 min, con una lectura a intervalos de ≥ 9 s.

[0214] La cantidad de actividad de beta-glucosidasa de las muestras de enzimas de celulasa que no se unió al sustrato de bagazo era considerablemente mayor en el caso de la preparación de celulasa Trichoderma sp. 50 modificada químicamente. En concreto, como determina el ensayo CNPG, menos del 50 % de la betaglucosidasa sin modificar no se unió (p. ej., 50 % unido) al sustrato de bagazo, mientras que aproximadamente el 80 % de la beta-glucosidasa modificada no se unió (p. ej., 20 % unido) al sustrato de bagazo. Tomados conjuntamente, los datos de unión de celulasa modificada indican que la reducción de las cargas positivas en la celulasa conlleva la reducción de la unión a un sustrato de polímero vegetal con carga más negativa. En este 55 caso, el sustrato de polímero vegetal era lignina que permanecía en biomasa tratada con ácido. Se demostró que la biomasa tratada con ácido a partir de rastrojo de maíz, un biopolímero vegetal de composición química similar,

imagen26

todas las concentraciones de proteínas con un espectrofotómetro (Thermo) NanoDrop™. Se creó una reacción de sacarificación en placa de microtitulación, en cada pocillo de una placa de microtitulación, se prepararon 150 uL de BPA (7 % de glucano preparado como se describe anteriormente para PCS) en tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 5, se añadieron 20 µl de mezcla de enzima de 21 µg de proteína total de modo que la 5 proporción final de proteína y celulosa en cada pocillo fuera de 20 mg/g. Se elaboraron seis mezclas de enzimas mediante la adición de beta-glucosidasa, variante de CBH2, EG1 o EG2 purificadas modificadas o sin modificar a un fondo de T.reesei en el que los genes que codifican celobiohidrolasa I (CBHI, Cel7a), celobiohidrolasa II (CBHII, Cel6a), endoglucanasa I (EGI, Cel7b) y endoglucanasa II (EGII, Cel5a) se han inactivado (Véase, US 2007/0128690). En cada mezcla, se añadió 72,5 % del fondo de T. reesei, 2,5 % de beta-glucosidasa, 15 % de 10 variante de CBH2, 5 % de EG1, 5 % de EG2; las primeras cuatro mezclas tienen una proteína que no está modificada, la quinta mezcla tiene todas las proteínas sin modificar y la sexta mezcla tiene todas las proteínas modificadas. Se incubó la placa a 50 ºC durante 72 horas. Se terminó la reacción mediante la adición de 100 µl de glicina 100 mM pH 10 a cada pocillo. Después de la mezcla exhaustiva, el contenido de los pocillos de placa de microtitulación se filtró a través de una placa de filtrado de 96 pocillos Millipore (0,45 µm, PES). Se diluyó el 15 filtrado en una placa que contenía 100 µl de glicina 10 mM pH 10 y se midió la cantidad de azúcares solubles (DP1 hasta DP7) producidos mediante HPLC. La serie Agilent 1100 HPLC se equipó con una columna de descalcinación/precolumna (Catálogo Biorad n.º 125-0118) y una columna de carbohidratos Aminex a base de plomo (Catálogo Aminex n.º HPX-87P). La fase móvil utilizada era agua con un caudal de 0,6 ml/min. Se diluyeron todos los estándares de azúcares solubles (DP1-DP7) obtenidos de Sigma en agua Milli-Q a 100

20 mg/mL y se utilizaron para convertir el área de pico para los azúcares individuales en concentraciones de azúcares reales. El porcentaje de conversión se calculó dividiendo los azúcares medidos mediante HPLC entre el 100 % de la conversión de celulosa en glucosa.

[0219] La figura 2A muestra que la sexta mezcla de enzimas (EG2, EG1, variante de CBH2 y beta-glucosidasa modificadas) con todas las proteínas modificadas, tiene la conversión de celulosa más elevada, y la quinta

25 mezcla de enzimas, con todas las proteínas sin modificar, tiene la conversión más baja. Si se comparan las primeras cuatro mezclas de enzimas, la segunda mezcla de enzimas con la CBH2 sin modificar proporcionó la siguiente conversión más baja. La figura 2B muestra las ventajas de las proteínas modificadas sobre las proteínas sin modificar en la conversión de celulosa.

EJEMPLO 6

30 Preparación de variantes de carga en escalera de CBH2 de T.reesei

[0220] Como se determina durante el desarrollo de la presente exposición, la succinilación de los residuos de lisina superficiales de CBH2 mejoró el rendimiento sobre BPA y sobre rastrojo de maíz pretratado. La carga de la variante de CBH2 modificada era de aproximadamente -17 en comparación con la variante de CBH2 sin modificar. Teniendo esto en cuenta, se designó una carga en escalera de CBH2 para la determinación de la

35 carga superficial óptima en aplicaciones de rendimiento de celulasa.

SEQ ID NO:1 expone la secuencia de ADN que codifica CBH2 de Hypocrea jecorina de referencia:

imagen27

Pub. estadounidense con n.º 2006/0205042). Los residuos superficiales que eran extremadamente variables en

el alineamiento de secuencia de aminoácidos de CBH2 eran candidatos para mutagénesis. Sin embargo, se evitó

la acumulación de sustituciones muy cerca entre sí. Se sustituyó la arginina por glutamina (carga -1), y se

sustituyó la glutamina y la asparagina por las variantes carboxílicas respectivas (carga -1). Además, se

5 seleccionaron residuos de aspartato y glutamato para la sustitución de los respectivos residuos de amino para la

terminación de la carga en escalera (carga +1). En la tabla 6-1, se muestran sustituciones de CBH2 específicas,

con todas las posiciones mostradas excepto R63 y R77, ubicadas en el dominio catalítico de CBH2. Puede

crearse una carga positiva neta mediante la eliminación de un residuo cargado negativamente o mediante la

introducción de un residuo cargado positivamente. De la misma manera, puede crearse una carga negativa neta 10 mediante la eliminación de un residuo cargado positivamente o mediante la introducción de un residuo cargado

negativamente.

Tabla 6-1. Sustituciones de CBH2

Introducción de carga negativa y eliminación de carga positiva

Eliminación de carga positiva Introducción de carga negativa Introducción de carga negativa Eliminación de carga negativa Eliminación de carga negativa

Lisina

Arginina Asparagina Glutamina Aspartato Glutamato

K157E

R153Q N382D Q204E D189N E208Q

K129E

R294Q N344D Q147E D211N E244Q

K288E

R203Q N237D Q239E D405N E146Q

K194E

R378Q N339D Q281E D277N

K356E

R63Q N289D D151N

K327E

R77Q N161D

N285D

N197D

N254D

N247D

[0222] Para la preparación de una carga en escalera de CBH2, se designaron diez variantes de carga de CBH2 (C-1 a C-10) abarcando un intervalo de carga de +8 a -32, en comparación con la CBH2 de tipo salvaje en 15 tramos de 4, como se muestra en la tabla 6-2.

Tabla 6-2. Carga en escalera de CBH2

C-1

C-2 CBH2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10

8

4 0 -4 -8 -12 -16 -20 -24 -28 -32

D189 N

D189 N

WT K157 E K157 E K157 E K157 E K157 E K157 E K157 E K157 E

E208 Q

E208 Q

K129 E K129 E K129 E K129 E K129 E K129 E K129 E K129 E

D211 N

D211 N

K288 E K288 E K288 E K288 E K288 E K288 E K288 E

D405 N

D405 N

K194 E K194 E K194 E K194 E K194 E K194 E K194 E

E244 Q

K356 E K356 E K356 E K356 E K356 E K356 E

D277 N

K327 E K327 E K327 E K327 E K327 E K327 E

D151 N

R153 Q R153 Q R153 Q R153 Q R153 Q

E146 Q

R294 Q R294 Q R294 Q R294 Q R294 Q

R203 Q

R203 Q

R203 Q

R203 Q

R203 Q

R378 Q

R378 Q

R378 Q

R378 Q

R378 Q

N382 D

N382 D

N382 D

N382 D

imagen28

KH2PO4; 1,0 g/L MgSO4·7H2O; 33,0 g/L PIPPS; p.H. 5.5) con adición posestéril de ∼2 % de mezcla de glucosa y soforosa como fuente de carbono, 10 ml/L de 100g/L de CaCl2, 2,5 ml/L de oligoelementos de T. reesei (400X): 175g/L de ácido cítrico anhidro; 200g/L FeSO4·7H2O; 16g/L ZnSO4·7H2O; 3,2 g/L CuSO4·5H2O; 1,4 g/L MnSO4·H2O; 0,8 g/L H3BO3. Los transformantes se cultivaron en cultivo líquido durante 5 días en una cámara

5 rica en O2 alojada en una incubadora a 28 ºC. Las muestras de sobrenadante de la placa de microtitulación de filtrado se obtuvieron mediante la utilización de un colector de vacío. Se pusieron las muestras en geles NuPAGE 4-12 % (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se tiñó el gel con tintura Simply Blue stain (Invitrogen). La expresión de variantes de carga superficial de CBH2 adicionales puede obtenerse utilizando este método.

EJEMPLO 7

10 Generación de variantes de carga de CBH2 en T. reesei

[0226] Se envió el plásmido pTTTpyr-cbh2 que contiene la secuencia codificadora de proteína de CBH2 de Hypocrea jecorina (SEQ ID NO:1) a BASEClear (Leiden, Países Bajos), GeneArt AG (Regensburg, Alemania) y Sloning BioTechnology GmbH (Puchheim, Alemania) para la generación de bibliotecas de evaluación de sitio (SEL, por sus siglas en inglés). El mapa de plásmido de pTTTpyr-cbh2 se muestra en la figura 5. Se realizó una

15 petición a los proveedores para la generación de bibliotecas posicionales en cada uno de los sitios en la proteína madura de CBH2 de Hypocrea jecorina (SEQ ID NO:3). La secuencia de aminoácidos de proteína de longitud completa de CBH2 se muestra en SEQ ID NO:2.

SEQ ID NO:1 expone la secuencia de ADN que codifica CBH2 de Hypocrea jecorina de referencia:

imagen29

SEQ ID NO:2 expone la secuencia de proteína de longitud completa de CBH2 de Hypocrea jecorina:

imagen30

0,05; las mutaciones combinables son aquellas mutaciones para las cuales la variante tiene valores de índice de rendimiento ≤ 0,5 para al menos una propiedad. Las mutaciones combinables son mutaciones que pueden combinarse para suministrar proteínas con índices de rendimiento adecuados para una o más propiedades deseadas. Las posiciones en las que se dan las mutaciones se clasifican de la manera siguiente: Las posiciones

5 no restrictivas tienen ≤ 20 % de mutaciones neutras para al menos una propiedad; y las posiciones restrictivas tienen < 20 % de mutaciones neutras para la actividad y la estabilidad. Las posiciones completamente restrictivas no tienen mutaciones neutras para la actividad o la estabilidad.

[0229] Estos datos pueden utilizarse para modificar cualquier CBH2. Aunque la CBH2 que se ha de modificar tenga un aminoácido diferente al de la CBH2 de Hypocrea jecorina en una posición concreta, estos datos pueden

10 utilizarse para encontrar una sustitución que altere las propiedades deseadas mediante la identificación de la mejor sustitución, incluyendo la sustitución del aminoácido de tipo salvaje de CBH2 de Hypocrea jecorina.

[0230] La tabla 8-11 muestra valores de índice de rendimiento (IR) para las variantes de CBH2 de Hypocrea jecorina. Los índices de rendimiento menores o iguales que 0,05 se establecieron en 0,05 y se indican en cursiva y negrita en la tabla.

Tabla 8-1: Índices de rendimiento de variantes de carga de CBH2

Variante

HPLC Act. esp. PASC Act. esp. PCS Res. EtOH Res. Calor

R63A

1,21 1,03 0,94 0,97 1,00

R63C

1,47 1,02 1,05 0,96 1,06

R63D

0,12 0,11 0,19 0,05 1,02

R63E

0,88 0,94 0,98 0,96 1,05

R63F

0,91 0,95 0,85 0,94 1,09

R63G

0,71 0,96 0,95 1,08 1,20

R63I

0,81 0,93 1,11 1,03 1,09

R63L

0,94 0,96 0,91 1,06 1,29

R63M

1,22 0,99 1,10 1,05 1,09

R63N

1,23 1,02 1,11 1,03 1,07

R63P

0,96 0,99 1,17 1,04 1,09

R63Q

0,87 0,99 1,01 0,99 1,13

R63S

0,59 0,92 1,09 1,00 0,94

R63T

0,43 0,87 0,94 0,91 0,84

R63V

1,00 0,99 0,89 1,03 1,06

R63W

0,98 0,97 0,91 1,08 1,10

R63Y

1,29 1,03 0,99 1,06 1,07

R77F

0,25 0,81 0,58 0,92 0,81

R77G

0,41 1,02 0,75 1,00 0,93

R77L

0,14 0,53 0,36 0,94 0,79

R77N

0,83 0,99 0,87 1,00 1,02

K129A

0,23 1,03 0,81 0,74 0,57

K129L

0,80 0,94 0,80 0,82 0,71

K129N

0,15 0,93 0,65 0,73 0,61

K129Q

0,41 1,30 0,89 1,01 0,99

K129S

0,37 1,05 0,92 0,84 0,84

K129T

0,16 0,87 0,37 0,81 0,69

K129V

0,17 0,93 0,91 0,63 0,45

K129Y

0,35 0,95 0,82 0,68 0,46

Q147E

0,86 1,00 0,88 1,07 1,05

R153A

0,23 0,50 0,72 0,63 0,64

R153C

0,26 0,51 0,86 0,94 0,88

R153D

0,35 0,35 0,54 0,75 0,72

R153E

0,27 0,69 0,75 0,79 0,80

R153F

0,21 0,38 0,69 0,68 0,58

Tabla 8-1: Índices de rendimiento de variantes de carga de CBH2

Variante

HPLC Act. esp. PASC Act. esp. PCS Res. EtOH Res. Calor

R153G

0,21 0,31 0,59 0,62 0,92

R153I

0,22 0,28 0,37 0,63 1,09

R153L

0,19 0,30 0,40 0,94 0,44

R153M

0,31 0,70 0,86 0,92 1,05

R153N

0,22 0,20 0,42 1,12 1,23

R153P

0,23 0,14 0,10 0,39 2,17

R153Q

0,24 0,52 0,99 0,77 1,05

R153S

0,41 0,78 0,99 0,93 0,93

R153T

0,31 0,63 0,74 0,84 0,94

R153V

0,23 0,28 0,59 0,63 0,81

R153W

0,42 0,77 1,07 0,90 0,87

R153Y

0,32 0,60 0,73 0,84 0,90

K157A

0,68 1,04 0,93 1,01 0,91

K157D

0,69 0,96 1,01 1,12 0,90

K157E

0,10 0,92 0,75 1,03 0,73

K157F

0,40 1,01 0,94 1,07 0,95

K157G

0,50 0,98 0,76 1,04 0,93

K157I

0,71 1,00 0,81 1,05 0,94

K157L

0,18 0,88 0,60 1,04 0,75

K157M

0,33 0,99 0,77 0,99 0,88

K157P

0,11 0,57 0,63 3,04 1,86

K157Q

0,50 1,00 0,70 1,00 0,88

K157T

0,14 0,79 0,47 1,02 0,83

K157V

0,46 0,99 0,86 0,99 0,91

K157W

1,06 0,95 0,84 1,04 0,93

K157Y

0,77 0,98 0,92 1,00 0,84

N161E

0,76 1,03 1,07 1,12 1,12

D189A

0,29 0,77 0,73 0,79 0,69

D189C

0,38 0,89 0,82 0,90 0,76

D189E

0,44 0,98 0,84 0,94 0,89

D189F

0,39 0,82 0,64 0,94 0,99

D189G

0,27 0,87 0,86 0,88 0,71

D189H

0,39 0,91 0,52 0,91 0,83

D189I

0,16 0,52 0,39 0,63 0,61

D189K

0,37 0,96 0,78 0,89 0,73

D189L

0,33 1,04 0,82 0,89 0,85

D189N

0,55 0,95 1,05 1,00 0,96

D189P

0,12 0,30 0,22 0,72 0,76

D189Q

0,73 0,98 0,72 0,93 0,86

D189R

0,38 0,96 0,82 0,94 0,88

D189S

0,14 0,60 0,32 0,86 1,22

D189T

0,21 0,84 0,84 0,85 0,76

D189V

0,36 1,03 0,99 1,03 0,91

D189W

0,13 0,18 0,34 0,45 1,06

D189Y

0,32 0,52 0,46 1,30 1,34

K194A

0,30 0,67 0,86 0,95 1,00

K194C

0,22 1,08 1,72 0,88 0,88

K194D

0,61 0,98 1,07 1,00 1,03

K194E

0,44 1,00 1,14 1,02 1,14

K194F

0,67 1,03 0,94 1,04 1,13

Tabla 8-1: Índices de rendimiento de variantes de carga de CBH2

Variante

HPLC Act. esp. PASC Act. esp. PCS Res. EtOH Res. Calor

K194G

0,43 0,92 0,65 0,92 0,96

K194I

0,24 0,38 0,49 0,50 0,59

K194L

0,61 0,98 0,90 1,01 1,22

K194M

0,61 1,02 0,86 1,03 1,17

K194N

0,54 0,99 1,02 1,04 1,17

K194P

0,32 0,39 0,55 0,46 0,38

K194Q

0,64 1,00 1,00 1,03 1,17

K194S

0,66 1,00 0,83 1,12 1,03

K194T

0,08 0,11 1,09 1,17 9,80

K194V

0,23 0,30 0,71 0,55 0,62

K194W

0,43 0,93 0,98 0,98 1,01

K194Y

0,08 0,11 0,36 0,60 2,65

N197D

1,50 1,12 1,08 1,06 1,07

R203A

0,71 0,93 0,75 0,69 0,88

R203F

0,85 0,92 0,99 0,67 0,87

R203G

0,60 1,07 1,13 0,66 1,39

R203I

0,39 0,70 0,64 1,46 3,02

R203L

0,46 1,14 0,54 1,08 1,24

R203M

0,58 0,88 0,91 0,99 1,25

R203N

0,36 1,08 0,82 1,06 1,20

R203P

0,29 0,49 0,28 2,85 4,58

R203Q

0,80 0,99 0,78 0,84 0,86

R203S

0,54 1,19 0,53 1,99 1,96

R203T

0,66 1,04 0,82 0,99 0,91

R203V

0,85 0,94 0,89 0,73 0,78

R203W

0,39 1,10 0,63 2,28 2,42

R203Y

0,57 1,09 1,03 1,03 1,18

Q204D

1,23 1,04 0,73 1,00 1,00

Q204E

1,08 1,12 1,05 0,93 1,04

Q239D

0,59 0,98 0,91 0,92 0,92

Q239E

0,70 1,10 1,16 1,00 1,04

N247D

1,18 0,76 0,67 0,58 0,96

N254E

0,20 0,84 0,56 0,76 0,91

Q281D

1,10 0,60 0,43 1,33 0,95

Q281E

2,50 0,89 0,85 1,10 0,63

N285D

0,35 0,70 0,59 1,99 2,24

K288A

0,41 0,61 0,68 1,52 2,84

K288C

0,41 0,95 0,63 0,72 1,49

K288D

0,23 0,23 0,05 5,77 5,10

K288E

0,38 0,89 0,81 0,65 1,60

K288F

0,36 0,75 0,29 1,53 2,74

K288G

0,23 0,40 0,12 2,22 4,09

K288H

0,32 0,90 0,48 1,09 1,54

K288I

0,40 0,75 0,37 1,51 2,48

K288L

0,80 0,96 0,81 0,60 0,82

K288N

0,71 0,98 0,84 1,08 1,68

K288P

0,26 0,34 0,05 5,00 5,39

K288Q

0,23 0,80 0,18 1,23 2,51

K288S

0,19 0,71 0,21 2,02 2,72

K288T

0,25 0,71 0,35 1,27 2,96

Tabla 8-1: Índices de rendimiento de variantes de carga de CBH2

Variante

HPLC Act. esp. PASC Act. esp. PCS Res. EtOH Res. Calor

K288V

0,31 0,84 0,38 1,67 1,87

N289D

0,84 0,96 0,87 0,93 0,92

N289E

0,13 0,26 0,63 1,03 1,48

R294A

0,97 1,06 0,89 0,92 0,77

R294C

0,70 1,15 0,74 1,01 1,16

R294D

0,75 0,94 0,85 0,94 1,09

R294E

0,73 0,82 0,66 1,02 1,20

R294F

0,37 0,52 0,54 0,90 1,56

R294G

1,25 0,93 0,84 0,71 0,87

R294I

0,77 0,84 0,72 0,98 1,01

R294L

0,54 1,06 1,03 1,05 1,22

R294M

0,34 0,76 0,78 0,81 1,78

R294N

0,50 0,80 0,64 1,30 1,06

R294P

0,48 0,86 0,74 0,74 0,99

R294Q

0,50 0,79 0,75 1,23 1,30

R294S

0,64 1,00 0,57 1,32 1,47

R294T

1,12 1,03 0,97 1,02 1,10

R294V

0,83 0,96 0,83 0,82 1,03

R294W

1,08 1,01 0,57 0,56 0,58

R294Y

0,26 0,43 0,31 2,39 3,19

K327A

0,86 1,03 0,98 0,76 0,76

K327C

0,42 0,93 1,25 1,28 1,02

K327D

0,31 0,73 0,76 1,13 1,81

K327E

0,73 0,84 0,85 1,05 0,87

K327F

0,24 0,61 0,44 1,91 2,14

K327G

0,24 0,83 0,16 1,65 1,30

K327I

0,31 0,74 0,23 1,44 1,37

K327L

0,26 0,94 0,60 0,89 1,30

K327M

0,41 0,90 0,90 0,87 1,44

K327N

0,41 0,90 1,04 0,74 1,33

K327P

0,21 0,58 0,05 1,65 2,77

K327Q

1,32 1,06 1,42 1,15 0,77

K327S

0,20 0,63 0,58 2,39 2,92

K327T

0,21 0,29 0,09 3,69 7,57

K327V

0,28 0,86 0,58 0,66 1,26

K327W

0,28 1,05 0,74 0,93 1,57

K327Y

0,93 1,04 1,08 0,49 0,60

N339D

0,92 1,04 1,05 1,04 1,10

N339E

0,94 1,03 0,83 1,08 1,13

N344D

0,29 0,85 1,10 1,43 1,31

K356A

1,22 1,03 0,88 0,23 0,25

K356C

0,62 0,92 0,98 0,29 0,45

K356D

0,42 0,87 0,57 0,22 0,42

K356E

0,43 0,98 0,71 0,28 0,43

K356F

0,69 0,99 0,45 0,15 0,39

K356G

0,97 0,98 0,20 0,20 0,40

K356I

0,76 0,96 0,60 0,26 0,46

K356L

0,67 1,00 0,68 0,45 0,39

K356M

0,68 0,99 0,88 0,54 0,53

K356N

0,98 1,04 0,72 0,19 0,37

Tabla 8-1: Índices de rendimiento de variantes de carga de CBH2

Variante

HPLC Act. esp. PASC Act. esp. PCS Res. EtOH Res. Calor

K356P

0,23 0,52 0,33 1,09 0,99

K356Q

0,77 0,99 0,77 0,41 0,43

K356S

0,58 0,88 0,48 0,22 0,41

K356T

0,63 1,00 0,49 0,28 0,43

K356V

0,91 0,90 0,75 0,35 0,31

K356W

0,39 0,90 0,42 0,24 0,47

K356Y

0,52 0,96 0,47 0,20 0,51

R378A

0,21 0,76 0,79 0,25 0,54

R378C

0,25 0,34 0,42 0,74 1,01

R378D

0,19 0,23 0,33 0,49 0,58

R378E

0,17 0,18 0,30 0,92 0,94

R378F

0,13 0,39 1,34 0,12 0,38

R378G

0,08 0,22 1,48 0,19 0,82

R378I

0,19 0,42 0,33 0,38 0,69

R378L

0,21 0,75 0,79 0,33 0,53

R378M

0,14 0,52 0,77 0,37 0,47

R378N

0,12 0,19 0,48 0,38 0,81

R378P

0,17 0,65 0,54 0,48 0,62

R378Q

0,20 0,82 0,94 0,56 0,59

R378S

0,18 0,65 0,47 0,45 0,64

R378T

0,18 0,52 1,03 0,25 0,43

R378V

0,36 1,01 0,98 1,06 1,19

R378W

0,09 0,10 0,64 0,34 0,30

R378Y

0,24 0,60 0,62 0,23 0,53

N382D

0,71 0,81 N.H. 1,17 1,15

N382E

2,21 0,16 N.H. 6,19 5,56

D405A

1,75 0,82 0,33 0,32 0,60

D405C

0,45 0,63 0,57 0,72 0,97

D405E

0,85 0,81 0,63 0,50 0,65

D405F

0,79 0,95 0,24 0,56 0,82

D405G

0,77 0,87 0,16 0,56 0,86

D405H

0,27 0,38 0,25 3,35 3,59

D405I

0,62 1,04 0,49 0,83 1,02

D405K

0,63 0,65 0,24 0,43 0,72

D405L

0,41 0,95 0,76 0,38 0,43

D405M

0,52 1,31 0,58 0,59 0,69

D405N

0,74 1,04 0,78 1,34 1,32

D405P

0,77 0,80 0,19 0,99 1,02

D405Q

0,71 1,12 0,39 1,10 1,21

D405R

0,93 1,20 0,36 0,56 0,61

D405S

0,95 1,24 0,40 0,75 0,96

D405T

0,74 1,17 0,32 0,64 0,83

D405V

0,39 1,05 0,60 1,32 1,24

D405W

1,12 1,17 0,40 0,42 0,48

D405Y

1,56 1,07 0,39 0,31 0,07

EJEMPLO 9 Efecto de cambio de carga en la actividad de variantes de CBH2

45

imagen31

Claims (1)

1. imagen1