ES2613662T3 - Alelos multifuncionales - Google Patents
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Abstract
Una construcción de ácido nucleico, que comprende: (a) brazos fijadores de objetivo para dirigir la construcción de ácido nucleico a un gen diana de un ácido nucleico de una célula; (b) una secuencia de accionamiento en orientación sentido con respecto a la transcripción del gen diana, y una casete de selección de fármacos (DSC) en orientación sentido o antisentido; (c) en orientación antisentido, una secuencia de nucleótidos de interés (NSI) y un COIN (elemento condicional mediante inversión); y (d) unidades recombinables, en donde las unidades recombinables comprenden dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una primera recombinasa, comprendiendo una primera unidad recombinable la secuencia de accionamiento, la DSC y la NSI, en donde la primera unidad recombinable está flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa, comprendiendo una segunda unidad recombinable la NSI, en donde la segunda unidad recombinable está flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa, dos segundos pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una segunda recombinasa, y un tercer par de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una tercera recombinasa; en donde los primeros pares, los segundos pares y los terceros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa son reconocidos por diferentes recombinasas; en donde las unidades recombinables se recombinan tras la exposición a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que carece de la secuencia de accionamiento y la DSC y contiene la NSI en orientación sentido y el COIN en orientación antisentido; y en donde el alelo condicional, cuando se expone adicionalmente a la segunda recombinasa, se recombina para formar un alelo que carece de la NSI y que tiene el COIN en orientación sentido.
Description
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DESCRIPCION
Alelos multifuncionales CAMPO DE LA INVENClON
La invencion se refiere a construcciones de acidos nucleicos para la modificacion de genomas, incluyendo construcciones inactivadas y construcciones para colocar COINs en un genoma. Se describen animales no humanos modificados geneticamente, p. ej., los ratones geneticamente modificados que tienen genes o elementos de acido nucleico dispuestos con sitios de reconocimiento de recombinasa seleccionados que permiten la delecion o inversion de los genes o elementos de acido nucleico para formar alelos nulos, alelos seleccionables, alelos informadores y/o alelos condicionales en animales no humanos, p. ej., en ratones y ratas.
ANTECEDENTES
Tfpicamente, las inactivaciones se realizan mediante la sustitucion homologa de un gen diana con otra secuencia de eleccion, habitualmente una casete informadora y una casete de seleccion, en que esta ultima esta flanqueada preferiblemente por sitios de recombinasa especffica del sitio para fortalecer la separacion de la casete de seleccion a traves de la accion de la recombinasa cognada especffica de sitio. La casete de seleccion se puede separar posteriormente, ya sea por tratamiento de las celulas con la recombinasa cognada correspondiente o por la crfa de la progenie de ratones a una cepa "supresora". Por ejemplo, en el caso de los alelos “floxed” (en que la secuencia de interes esta flanqueada por sitios loxP), la recombinasa cognada es Cre y lo que queda en el genoma es un solo sitio loxP y el informador.
Tradicionalmente se ha empleado una estrategia relacionada para generar alelos condicionales nulos. Esto implica flanquear parte del gen de interes con sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio (tales como lox para Cre y FRT para Flp) de una manera tal que tras la accion de la recombinasa cognada, la region flanqueada por los sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio se eliminan y el alelo resultante es un alelo nulo.
Aunque se han hecho intentos para incorporar una funcionalidad tanto nula como condicional en un vector fijador de objetivo y para llevar a cabo la construccion de los correspondientes alelos modificados en una sola etapa de fijacion como objetivo, los metodos que han resultado de tales intentos tienen varios inconvenientes y han tenido un exito contradictorio. Estos inconvenientes incluyen, por ejemplo, la falta de una funcionalidad verdadera (es decir, la version nula no es un nulo verdadero, el alelo condicional no es un condicional verdadero, la falta de funcion del informador, etc.) o la incapacidad de obtener un alelo de trabajo practico con las caracterfsticas deseadas.
Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica para la generacion de organismos modificados geneticamente a traves de la fijacion como objetivo, en que los loci modificados por ingenierfa genetica son loci multifuncionales, por ejemplo, un primer alelo KO verdadero y luego un alelo nulo condicional u otro alelo mutante condicional.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La FIG. 1 ilustra el uso de sitios de reconocimiento de recombinasa para eliminar simultaneamente un elemento (U) e invertir otro (D).
La FIG. 2 ilustra una realizacion de un Alelo Multifuncional (MFA), mostrado para una secuencia de nucleotidos de interes (NSI), el empleo de un aceptor de corte y empalme con la region de corte y empalme y una secuencia de accionamiento, seguido por una senal de poliadenilacion (pA), una casete de seleccion de farmacos (DSC; en una orientacion adecuada de eleccion), un COIN y cinco pares de sitios de reconocimiento de recombinasa. R1/R1', R2/R2', R3/R3', R4/R4' y R5/R5' representan pares cognatos de sitios de reconocimiento de recombinasa.
La FIG. 3 ilustra una representacion conceptual de unidades recombinables (definidas por R1/R1', R2/R2 ', R3/R3', R4/R4' y R5/R5') de una realizacion de un alelo MFA que emplea una secuencia de accionamiento (por simplicidad no se muestran el aceptor de corte y empalme y la region de corte y empalme que precede a la secuencia, y la senal poliA que sigue a la secuencia), una DSC (en una orientacion adecuada de eleccion), una NSI y un COIN.
La FIG. 4 ilustra una realizacion particular de un MFA con sitios especfficos de reconocimiento de recombinasa para fines de ilustracion (parte superior) y que genera un alelo nulo "limpiado" que comprende una secuencia de accionamiento que comprende una secuencia LacZ, y extraccion de la DSC, asf como la NSI y el elemento COIN de la realizacion inicial de la MFA utilizando una sola etapa de recombinasa. Por simplicidad, no se muestran el aceptor de corte y empalme y la region de corte y empalme que precede a la secuencia LacZ, y la senal poliA que sigue a la secuencia LacZ.
La FIG. 5 ilustra una realizacion particular de un MFA que genera un alelo condicional que contiene/incorpora un COIN de un MFA utilizando una sola recombinasa (aquf, una recombinasa Flp que actua primero sobre sitios FRT3 de la realizacion del alelo). Por simplicidad, no se muestran el aceptor de corte y empalme y la region de corte y empalme que precede a la secuencia LacZ, y la senal poliA que sigue a la secuencia LacZ.
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La FIG. 6 ilustra una realizacion de un MFA que genera un alelo nulo condicional que contiene/incorpora un COIN de un MFA utilizando una sola recombinasa (aqrn, una recombinasa Flp que actua primero sobre sitios FRT de la realizacion del alelo). Por simplicidad, no se muestran el aceptor de corte y empalme y la region de corte y empalme que precede a la secuencia LacZ, y la senal poliA que sigue a la secuencia LacZ.
La FIG. 7 ilustra una realizacion en donde, despues del tratamiento con recombinasa (exposicion de Flp tal como se muestra en la FIG. 5 o la FIG. 6), el alelo se expone a una segunda recombinasa (Cre), resultando la delecion de la NSI y la colocacion del COIN en la orientacion sentido para la transcripcion.
La FIG. 8 ilustra una realizacion en donde, despues del tratamiento con recombinasa (exposicion de Flp), el alelo se expone a una segunda recombinasa, dando como resultado la inversion del COIN y de la NSI debido a una colocacion (alternativa) de un sitio de reconocimiento de recombinasa para la segunda recombinasa en una posicion 5' de NSI.
La FIG. 9 ilustra la estructura exon-intron del gen Hprtl de raton en la region de los exones 2 a 4, adaptado del servidor del genoma de raton Ensembl (panel superior -
www.ensembl.org) y la region del exon 2 al exon 4 se expande en el navegador del ECR (
http://ecrbrowser.dcode.org) para resaltar regiones de conservacion. El exon 3 se destaca por un ovalo de puntos. La flecha vertical negra indica el punto de insercion de la secuencia de accionamiento y DSC, mientras que la flecha gris indica el punto de insercion del elemento COIN, todas utilizadas para disenar el alelo Hprt1MAF. Tengase en cuenta que ninguna de las secuencias intronicas conservadas evolutivamente que flanquean el exon 3 se interrumpen en el alelo resultante. El paralelogramo de puntos indica la region que se convertira en la NSI en el alelo Hprt1MAF.
www.ensembl.org) y la region del exon 2 al exon 4 se expande en el navegador del ECR (
http://ecrbrowser.dcode.org) para resaltar regiones de conservacion. El exon 3 se destaca por un ovalo de puntos. La flecha vertical negra indica el punto de insercion de la secuencia de accionamiento y DSC, mientras que la flecha gris indica el punto de insercion del elemento COIN, todas utilizadas para disenar el alelo Hprt1MAF. Tengase en cuenta que ninguna de las secuencias intronicas conservadas evolutivamente que flanquean el exon 3 se interrumpen en el alelo resultante. El paralelogramo de puntos indica la region que se convertira en la NSI en el alelo Hprt1MAF.
La FIG. 10 ilustra un ejemplo de un MFA, espedficamente el MFA para el gen Hprtl. El exon 3 mas secuencias intronicas conservadas evolutivamente que flanquean el exon 3 (tal como se ilustra en la FIG. 9) de Hprtl se convierten en la NSI. Tras la fijacion de objetivo, la NSI se coloca en la cadena antisentido con respecto a la direccion de la transcripcion del gen Hprtl. Una secuencia de accionamiento - SA-lacZ-poliA - y un DSC estan dispuestos aguas arriba de la NSI. La secuencia de accionamiento esta dispuesta en la orientacion sentido con respecto a la direccion de la transcripcion del gen Hprtl, actuando efectivamente como un elemento de trampa de genes, y la derogacion de la transcripcion aguas abajo de la secuencia de accionamiento. Un elemento COIN esta dispuesto aguas debajo de la NSI en la orientacion antisentido con respecto a la direccion de la transcripcion del gen Hprtl. Ni el elemento COIN ni la NSI se pueden incorporar en un ARNm de Hprtl productivo y, por lo tanto, el alelo resultante, Hprt1MFA, es un alelo nulo con un informador (LacZ). Los elementos que comprenden el alelo Hprt1MFA estan flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasa espedfica del sitio dispuestos como sigue: FRT- secuencia de accionamiento-Rox-DSC-FRT3-(LoxP)-(NSI)-(Lox2372)-(FRT)-(FRT3)-(COIN)-(Lox2372)-(LoxP)-Rox, en que el parentesis indica la colocacion en la orientacion antisentido con respecto a la direccion de la transcripcion del gen Hprt1, o en el caso de sitios de recombinasa espedfica del sitio con orientacion opuesta respecto a los pares mutuamente reconocidos.
La FIG.11 ilustra una realizacion de un MFA, que muestra determinadas unidades recombinables solapantes (A) y alelos resultantes que se generan por la accion de una primera recombinasa (B) o una segunda (C) y tercera (D) recombinasas.
La FIG. 12 ilustra una realizacion de un MFA, que muestra determinadas unidades recombinables solapantes (A) y alelos resultantes que se generan por la accion de una primera recombinasa (B) o una segunda (C) y tercera (D) recombinasas.
La FIG. 13 ilustra una realizacion de un MFA (A), que muestra alelos resultantes que resultan de la accion de una primera recombinasa que coloca la NSI en orientacion sentido (B) y una segunda recombinasa que coloca la NSI en orientacion antisentido al tiempo que coloca el COIN en orientacion sentido (C).
La FIG. 14 ilustra una realizacion de un MFA (A), que muestra alelos resultantes que resultan de la accion de una primera recombinasa que coloca la NSI en orientacion sentido (B) y una segunda recombinasa que coloca la NSI en orientacion antisentido al tiempo que coloca el COIN en orientacion sentido (C).
La FIG. 15 ilustra otra realizacion de un MFA (A), que muestra alelos resultantes que resultan de la accion de una primera recombinasa que coloca la NSI en orientacion sentido (B) y una segunda recombinasa que coloca la NSI en orientacion antisentido al tiempo que coloca el COIN en orientacion sentido (C).
La FIG. 16 ilustra un ejemplo de una realizacion de MFA, en donde el informador es un SA(adml)-gtx-lacZ-pA, la DSC es Neo, la NSI es un exon critico (ec), y el COIN es Gtx-SA-HA-myc3-TM-T2A-GFP-pA (A), la colocacion de NSI en orientacion sentido por la accion de una recombinasa al tiempo que se mantiene el COIN en orientacion antisentido (B) y, ademas, la escision de la NSI con la colocacion concomitante del COIN en orientacion sentido (C); las flechas indican cebadores utilizados para confirmar identidades y orientaciones de sitios de recombinasa en el MFA (A), y tras el tratamiento con recombinasa (B y C).
La FIG. 17 muestra los resultados de ensayos de la viabilidad y la proliferacion celular para celulas Hprt1+/Y, Hprt1MFA/Y, Hprt1C0IN/Y y Hprt1COIN'INV/Y ES, respectivamente, todas cultivadas en medio estandar de cultivo de
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celulas ES o bien sin 6-TG (sin 6-TG; paneles superiores) o complementado con un 6-TG 10 pM (6-TG, paneles inferiores).
La FIG. 18 muestra transferencias Western de preparaciones de protemas totales derivadas de celulas Hprt1+/Y (WT), Hprt1MFA/Y (MFA) - es decir, las celulas fijadas como objetivo con el MFA de la FIG. 16A, celulas Hprt1C0IN/Y (MFA + FLPo) - es decir, celulas fijadas como objetivo con el MFA de la FIG. 16A y despues tratadas con FLPo, y celulas Hprt1C°IN-NV/Y (MfA + FLPo + Cre) - es decir, celulas Hprt1COIN-INV/Y tratadas con Cre; el panel superior muestra la deteccion de la protema Hprt1, el panel central muestra la deteccion de la protema LacZ (informadora) y el panel inferior muestra la deteccion de la protema GAPDH como control de carga.
SUMARIO
Se proporcionan metodos y composiciones para hacer alelos nulos y alelos condicionales, y alelos que combinan caractensticas nulas y COIN. En diversas realizaciones se proporcionan metodos y composiciones para modificar por ingeniena genetica alelos multifuncionales en un genoma en una sola etapa de fijacion como objetivo. Se proporcionan metodos y composiciones para el analisis de complementacion de la inactivacion en animales no humanos modificados geneticamente, incluyendo los metodos que comprenden una sola etapa de fijacion como objetivo.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona una construccion de acido nucleico, que comprende:
(a) brazos fijadores de objetivo para dirigir la construccion de acido nucleico a un gen diana de un acido nucleico de una celula;
(b) una secuencia de accionamiento en orientacion sentido con respecto a la transcripcion del gen diana, y una casete de seleccion de farmacos (DSC) en orientacion sentido o antisentido;
(c) en orientacion antisentido, una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) y un COIN (elemento condicional mediante inversion); y
(d) unidades recombinables,
en donde las unidades recombinables comprenden dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una primera recombinasa, comprendiendo una primera unidad recombinable la secuencia de accionamiento, la DSC y la NSI, en donde la primera unidad recombinable esta flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa, comprendiendo una segunda unidad recombinable la NSI, en donde la segunda unidad recombinable esta flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa, dos segundos pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una segunda recombinasa, y un tercer par de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una tercera recombinasa; en donde los primeros pares, los segundos pares y los terceros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa son reconocidos por diferentes recombinasas;
en donde las unidades recombinables se recombinan tras la exposicion a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que carece de la secuencia de accionamiento y la DSC y contiene la NSI en orientacion sentido y el COIN en orientacion antisentido; y
en donde el alelo condicional, cuando se expone adicionalmente a la segunda recombinasa, se recombina para formar un alelo que carece de la NSI y que tiene el COIN en orientacion sentido.
La presente invencion proporciona, ademas, un metodo para modificar una celula no humana, que comprende:
fijar como objetivo una secuencia de nucleotidos de interes en una celula con una construccion de acido nucleico de la invencion para formar una celula fijada como objetivo, exponer la celula fijada como objetivo a la primera recombinasa para formar el alelo condicional y exponer el alelo condicional a una segunda recombinasa que escinde la NSI y coloca el COIN en orientacion sentido.
La presente invencion proporciona, ademas, una construccion de acido nucleico, que comprende:
una casete de seleccion de farmacos (DSC), un informador, un COIN, una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) y cinco pares de sitios de recombinasa dispuestos entre el informador, la DSC, el COIN y la NSI;
en donde ningun par de sitios de recombinasa es identico a cualquier otro par, y en donde unos primeros dos pares de sitios de recombinasa son reconocidos por la misma primera recombinasa, unos segundos dos pares de sitios de recombinasa son reconocidos por la misma segunda recombinasa y un quinto par de sitios de recombinasa es reconocido por una tercera recombinasa;
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en donde la primera, segunda y tercera recombinasa no son iguales, y en donde con respecto a la direccion de transcripcion, el informador se encuentra en orientacion sentido, la NSI esta en orientacion antisentido, el COIN esta en orientacion antisentido y la DSC esta en orientacion sentido o antisentido;
en donde los sitios de recombinasa estan dispuestos en unidades recombinables que comprenden (i) una primera unidad recombinable que comprende la secuencia de accionamiento, la DSC y la NSI, en donde la primera unidad recombinable esta flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa; y (ii) una segunda unidad recombinable que comprende la NSI, en donde la segunda unidad recombinable esta flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa; y
en donde los primeros dos pares y los segundos dos pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de modo que tras la exposicion a la primera recombinasa, se forma un alelo modificado, en donde los primeros dos pares de sitios de recombinasa dirigen la escision del informador, la escision de la DSC, la inversion de la NSI a orientacion sentido y el COIN se mantiene en orientacion antisentido, y (a) los segundos pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de manera que, tras la exposicion a la segunda recombinasa, la NSI se escinde y el COIN se coloca en orientacion sentido; o (b) los segundos dos pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de manera que tras la exposicion a la segunda recombinasa, la NSI se coloca en orientacion antisentido y el COIN se coloca en orientacion sentido.
Se describe un alelo modificado, que comprende una region 3' de corte y empalme y un aceptor de corte y empalme, una secuencia de accionamiento 3' con respecto al aceptor de corte y empalme y una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) 3' con respecto a la secuencia de accionamiento, en el que la NSI esta en orientacion antisentido con respecto al gen diana (o siendo modificado el locus, o con respecto a la secuencia de accionamiento).
En un caso, la secuencia de accionamiento se selecciona de un microARN, una senal de parada de la transcripcion (tal como una region de poliadenilacion), una secuencia de nucleotidos que codifica un ADNc, o cualquiera de sus combinaciones, y puede incluir elementos reguladores tales como operadores, potenciadores y aislantes. En un caso especffico, el ADNc codifica un informador (p. ej., codifica LacZ). En un caso, la secuencia de accionamiento comprende un exon. En un caso especffico, el exon es el exon 5' mas extremo de un locus.
En un caso, la NSI comprende un exon. En un caso, la NSI comprende un exon y una secuencia intronica vecina. En un caso especffico, el exon flanqueante esta flanqueado en las posiciones 5' y 3' con una secuencia intronica. En un caso, la secuencia de nucleotidos comprende dos o mas exones, y en un caso especffico, comprende la o las secuencias intronicas. En otro caso, la NSI carece de un exon, o carece de un fragmento de un exon.
En un caso, el alelo modificado comprende un COIN. En un caso, el COIN esta en posicion 3' con respecto a la NSI; en otro caso, el COIN esta en posicion 5' con respecto a la NSI.
En un caso, el COIN se selecciona de un informador, un elemento tipo trampa de gen (elemento tipo GT) y un informador tipo trampa de gen (informador tipo GT). En un caso especffico, el elemento tipo GT se selecciona de ADNc-poliA de resistencia a farmacos SA. En un caso especffico, el informador de tipo GT se selecciona de SA- informador-poliA.
En un caso, el COIN comprende una region de corte y empalme 3'. En un caso especffico, la region de corte y empalme 3' es seguida por una secuencia seleccionada a partir de un ADNc, una secuencia de exon-intron, un microARN, un racimo de microARN, un ARN pequeno, un elemento de salto del codon, un IRES, una secuencia de poliadenilacion o cualquier combinacion de los mismos. En un caso especffico, el ARN pequeno es un mirtron. En un caso especffico, el elemento de salto del codon es T2A, E2A o F2A.
En un caso, el alelo modificado comprende una casete de seleccion de farmacos (DSC).
En un caso, el alelo modificado esta en una construccion de fijacion de objetivo que comprende un brazo de homologfa aguas arriba y un brazo de homologfa aguas abajo. En un caso, al menos un brazo de homologfa es un brazo de homologfa de raton. En un caso especffico, los dos brazos de homologfa son brazos de homologfa de raton.
En un caso, el alelo modificado comprende, de 5' a 3', un aceptor de corte y empalme, una secuencia de accionamiento, una DSC, una NSI y un COIN en donde la secuencia de nucleotidos de interes y el COIN estan ambos en orientacion antisentido con respecto a la secuencia de accionamiento, y cinco pares de sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio. En un caso, el alelo modificado, tras la exposicion a una primera recombinasa especffica del sitio que reconoce de forma independiente e invierte la secuencia entre un primer par de los sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio y suprime una secuencia entre un segundo par de sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio, resulta en un alelo que comprende la NSI en orientacion sentido para la transcripcion, que carece de la DSC, y que comprende el COIN en orientacion antisentido. En un caso, el alelo modificado comprende un tercer y cuarto sitio de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio dispuestos de manera que la exposicion adicional del alelo a una segunda recombinasa que
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reconoce independientemente el tercer y cuarto sitio de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio resulta en la supresion de la NSI y la colocacion del COIN en orientacion sentido para la transcripcion.
En un aspecto, la construccion de acido nucleico proporcionada comprende (a) un informador en orientacion sentido y una DSC en una orientacion adecuada de eleccion, y en una orientacion antisentido una NSI y un COIN; (b) cinco pares de sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio, en donde los cinco pares de sitios de reconocimiento de recombinasa son reconocidos por no mas de tres recombinasas; en donde tras el tratamiento de la construccion de acido nucleico con una primera recombinasa, se forma un alelo modificado en donde (i) la NSI esta dispuesta en orientacion sentido, (ii) el COIN permanece en orientacion antisentido, (iii) se suprimen el informador y la DSC y, (iv) el alelo modificado tras el tratamiento con una segunda recombinasa suprime la NSI y dispone el COIN en orientacion sentido.
En una realizacion, los cinco pares de sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio son los pares FRT3, Rox, FRT, loxP y lox2372.
En una realizacion, la primera recombinasa es una recombinasa Flp, y la segunda recombinasa es una recombinasa Cre.
En una realizacion, el alelo modificado tras el tratamiento con la segunda recombinasa resulta en un alelo que no se puede suprimir o invertir por la primera o la segunda recombinasa.
En una realizacion, la secuencia de nucleotidos de interes es un exon de tipo salvaje de un gen. En otra realizacion, la NSI es un exon de un gen que tiene una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos.
En una realizacion, la NSI es un exon de tipo salvaje mas el flanqueo intronico de un gen. En otra realizacion, la NSI es un exon mas la secuencia intronica vecina de un gen que tiene una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos.
En una realizacion, la NSI es un intron de tipo salvaje de un gen. En otra realizacion, la NSI es un intron de un gen que tiene una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acido nucleico.
En una realizacion, el COIN comprende un exon o exones de un gen que comprende una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos. En una realizacion especffica, el COIN comprende un exon de un mamffero. En una realizacion especffica, el mamffero es un ser humano, raton, mono o rata.
En una realizacion, el COIN comprende una region 3' de corte y empalme. En una realizacion especffica, la region 3' de corte y empalme es seguida por una secuencia seleccionada de un ADNc, una secuencia de exon-intron, un microARN, un racimo de microARN, un ARN pequeno, un elemento de salto del codon, un IRES, una secuencia de poliadenilacion y una combinacion de los mismos. En una realizacion especffica, el ARN pequeno es un mirtron. En una realizacion especffica, el elemento de salto del codon es una T2A.
En una realizacion, el COIN se selecciona de un informador, un elemento tipo trampa de gen (elemento tipo GT) y un informador tipo trampa de gen (informador tipo GT). En una realizacion especffica, el elemento tipo GT se selecciona de ADNc-poliA de resistencia a farmacos SA. En un caso especffico, el informador de tipo GT se selecciona de SA-informador-poliA.
En una realizacion, la construccion comprende, ademas, un brazo de homologfa de aguas arriba y un brazo de homologfa de aguas abajo. En una realizacion, el brazo de homologfa de aguas arriba y el brazo de homologfa de aguas abajo son brazos de homologfa de raton o de rata. En una realizacion especffica, los brazos de homologfa son brazos de homologfa de raton y la NSI comprende una secuencia humana. En una realizacion especffica, la secuencia humana comprende un exon humano que es un homologo humano de un exon de raton.
En una realizacion, el informador se selecciona de: una protefna fluorescente, una protefna luminiscente o una enzima. En una realizacion especffica, el informador se selecciona de GFP, eGFP, CFP, YFP, eYFP, BFP, eBFP, DsRed, MmGFP, luciferasa, LacZ y fosfatasa alcalina.
En una realizacion, la DSC comprende una secuencia que codifica una actividad seleccionada de neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S deaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt), nourseotricina acetiltransferasa (natl) y el virus Herpes simplex timidina quinasa (HSV-tk).
En un aspecto, la construccion de acido nucleico proporcionada comprende una secuencia de accionamiento que comprende un aceptor de corte y empalme 3', seguido de un informador en orientacion sentido, DSC en una orientacion adecuada de eleccion, una NSI en orientacion antisentido y un COIN en orientacion antisentido, en donde la secuencia de accionamiento y el informador estan flanqueados aguas arriba por un sitio de reconocimiento de recombinasa R1, un sitio de reconocimiento de recombinasa R2 esta dispuesto entre el informador y la DSC, un sitio de recombinasa R3 esta dispuesto entre la DSC y la secuencia de nucleotidos de interes, un sitio de recombinasa R4 esta dispuesto entre el sitio R3 y la NSI, un sitio de recombinasa R5 esta dispuesto entre la NSI y el
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COIN, un sitio de recombinasa R1' esta dispuesto entre el sitio R5 y el COIN, un sitio de recombinasa R3' esta dispuesto entre R1' y el COIN, un sitio de recombinacion R5' esta dispuesto aguas abajo del COIN, un sitio de recombinacion R4' esta dispuesto aguas abajo del sitio R5' y un sitio de recombinacion R2' esta dispuesto aguas abajo del sitio R4'; en donde R1 y R1' estan en orientacion opuesta, R2 y R2' estan en la misma orientacion, R3 y R3 'estan en orientacion opuesta, r4 y R4' estan en la misma orientacion y R5 y R5 'estan en la misma orientacion.
En una realizacion, el informador es seguido de una region de poliadenilacion.
En una realizacion, R1 y R1' son reconocidos por una recombinasa que reconoce R3 y R3'. En una realizacion, R4 y R4' son reconocidos por una recombinasa que reconoce R5 y R5'. En una realizacion, R2 y R2' no son reconocidos por recombinasa alguna que reconoce R1/R1', R3/R3', R4/R4' o R5/R5'. En una realizacion, R1 y R1', R3 y R3' y R2 y R2' no son reconocidos por recombinasa alguna que reconoce R4 y R4' y R5 y R5'. En una realizacion, R4 y R4 ', R5 y R5' y R2 y R2 'no son reconocidos por recombinasa alguna que reconoce R1 y R1' y R3 y R3'.
En una realizacion, el tratamiento con una sola recombinasa resulta en una construccion de acido nucleico que carece de la DSC, la NSI y el COIN. En una realizacion especffica, la construccion de acido nucleico resultante consiste esencialmente en la secuencia de accionamiento, R1, y R2 o R2'. En una realizacion especffica, R1 es un sitio FRT3 y R2 (o R2') es un sitio Rox.
En una realizacion, el tratamiento con una sola recombinasa resulta en una construccion de acido nucleico que comprende la secuencia de accionamiento en orientacion sentido, pero que carece de la DSC, carece de la NSI y carece del COIN. En una realizacion especffica, R2 y R2' son sitios Rox, y la sola recombinasa es recombinasa Dre.
En una realizacion, el tratamiento con una sola recombinasa resulta en una construccion de acido nucleico que comprende la NSI en la orientacion antisentido y el COIN en orientacion antisentido. En una realizacion, la sola recombinasa es una recombinasa Flp, R1 y R1' son una secuencia variante FRT que no reacciona de forma cruzada con R3 y R3' (que son tambien FRT o variantes de FRT), R2 y R2' son secuencias de Rox, y R4 y R4' son secuencias de loxP o secuencias variantes de lox que no reaccionan de forma cruzada con R5 y R5', en donde R5 y R5' son secuencias variantes de lox.
En una realizacion, el tratamiento con una sola recombinasa resulta en una construccion de acido nucleico que comprende la NSI en orientacion sentido y el COIN en orientacion antisentido. En una realizacion, la sola recombinasa es una recombinasa Flp, R1 y R1' son secuencias de FRT3, R2 y R2' son secuencias de Rox, R3 y R3' son secuencias de FRT, R4 y R4' son secuencias de loxP, R5 y R5' son secuencias de lox2372.
En una realizacion, la NSI es un exon de tipo salvaje de un gen. En otra realizacion, la NSI es un exon de un gen que tiene una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos.
En una realizacion, el COIN comprende un exon o exones de un gen que comprende una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos. En una realizacion especffica, el COIN comprende un exon de un mamffero. En una realizacion, el mamffero es un ser humano, raton, mono o rata.
En una realizacion, la construccion comprende, ademas, un brazo de homologfa aguas arriba de la construccion (un brazo de homologfa de aguas arriba) y un brazo de homologfa aguas abajo de la construccion (un brazo de homologfa de aguas abajo). En una realizacion, el brazo de homologfa de aguas arriba y el brazo de homologfa de aguas abajo son brazos de homologfa de raton o de rata. En una realizacion especffica, los brazos de homologfa son brazos de homologfa de raton y la NSI comprende una secuencia humana. En una realizacion especffica, la secuencia humana comprende un exon humano homologo a un exon de raton.
En una realizacion, el informador se selecciona de: una protefna fluorescente, una protefna luminiscente o una enzima. En una realizacion especffica, el informador se selecciona de GFP, eGFP, CFP, YFP, eYFP, BFP, eBFP, DsRed, MmGFP, luciferasa, LacZ y fosfatasa alcalina. En una realizacion, la DSC comprende una secuencia que codifica una actividad seleccionada de neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S deaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt), nourseotricina acetiltransferasa (natl) y el virus Herpes simplex timidina quinasa (HSV-tk).
En un aspecto, la construccion de acido nucleico proporcionada es una construccion de acido nucleico para la modificacion de un locus, que comprende una primera, segunda, tercera, cuarta y quinta unidad recombinable solapante, en donde una unidad recombinable incluye un par de sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio cognatos, y en donde (a) la primera unidad recombinable esta enmarcada por sitios de recombinasa R1 y R1' en orientacion de oposicion (que permite la inversion a traves de R1/R1'), en donde entre R1 y R1' estan dispuestas una secuencia de accionamiento en orientacion sentido con respecto a la direccion de la transcripcion del gen diana, seguida de un sitio de recombinasa R2, seguido de una DSC en una orientacion adecuada de eleccion, seguida de un sitio de recombinasa R3 seguido de un sitio de recombinasa R4, seguido de una NSI en orientacion antisentido, seguida de un sitio de recombinasa R5; (b) la segunda unidad recombinable esta enmarcada por sitios de recombinasa R2 y R2' en la misma orientacion (permitiendo la delecion a traves de R2/R2'), en donde entre R2 y R2' esta dispuesta una DSC en una orientacion adecuada de eleccion, seguida de R3, seguido de R4, seguido por la NSI en orientacion antisentido, seguido de R5 seguido de R1', seguido por el sitio de recombinasa R3' en donde R3'
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esta en la orientacion opuesta con respecto a R3 (permitiendo la inversion a traves de R3/R3'), seguido de un COIN en orientacion antisentido, seguido de R5', en donde R5' esta en la misma orientacion con respecto a R5, seguido por R4', en donde R4' esta en la misma orientacion con respecto a R4, seguido por R2', en donde R2' se encuentra en la misma orientacion con respecto a R2 (permitiendo su delecion a traves de R2/R2'); (c) la tercera unidad recombinable esta enmarcada por los sitios de recombinasa R3 y R3' en orientacion opuesta (permitiendo la inversion a traves de R3/R3'), en donde entre R3 y R3' estan dispuestos R4, la NSI en orientacion antisentido, seguido de R5, seguido de R1'; (d) la cuarta unidad recombinable enmarcada por los sitios de recombinasa R4 y R4' en la misma orientacion, en donde entre R4 y R4' estan dispuestos la NSI en orientacion antisentido, seguida de R5, seguida de R1', seguida de R3', seguida del COIN en orientacion antisentido, seguido de R5', seguido de R4'; y, (e) la quinta unidad recombinable esta enmarcada por R5 y R5' en la misma orientacion, en donde entre R5 y R5' estan dispuestos R1' seguido de R3' seguido del COIN en orientacion antisentido.
En una realizacion, R1/R1' y R3/R3' son funcionales con respecto a la misma recombinasa especffica del sitio, y dicha misma recombinasa especffica del sitio no es funcional con respecto a R4/R4' y R5/R5' y R2/R2'.
En una realizacion, R4/R4' y R5/R5' son funcionales con respecto a la misma recombinasa especffica del sitio, y dicha misma recombinasa especffica del sitio no es funcional con respecto a R1/R1' y R3/R3' y R2/R2'.
En una realizacion, R2/R2' son funcionales con una recombinasa, en donde dicha recombinasa no es funcional con respecto a cualquiera de R1/R1', R3/R3', R4/R4' y R5/R5'.
En una realizacion, R1/R1' son sitios FRT, FRT3, loxP o lox2372. En una realizacion R3/R3' son sitios FRT, FRT3, loxP o lox2372. En una realizacion R4/R4' son sitios FRT, FRT3, loxP o lox2372. En una realizacion, R5/R5' son sitios FRT, FRT3, loxP o lox2372. En una realizacion, R2/R2' son sitios Rox. En una realizacion, R2/R2' son sitios attP/attB.
En una realizacion especffica, R1/R1' y R3/R3' son funcionales con una recombinasa Flp. En otra realizacion especffica, R1/R1' y R3/R3' son funcionales con una recombinasa Cre.
En una realizacion especffica, R4/R4' y R5/R5' son funcionales con una recombinasa Cre. En otra realizacion especffica, R4/R4' y R5/R5' son funcionales con una recombinasa Flp.
En una realizacion, R2/R2' son sitios Rox que son funcionales con una recombinasa Dre. En otra realizacion, R2/R2' son sitios attP/attB que son funcionales con PhiC31 integrasa (phiC31\int).
En una realizacion, el informador se selecciona de: una protefna fluorescente, una protefna luminiscente o una enzima. En una realizacion especffica, el informador se selecciona de GFP, eGFP, cFp, YFP, eYFP, BFP, eBFP, DsRed, MmGFP, luciferasa, LacZ y fosfatasa alcalina.
En una realizacion, la DSC comprende una secuencia que codifica una actividad seleccionada de neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S deaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt), nourseotricina acetiltransferasa (natl) y el virus Herpes simplex timidina quinasa (HSV-tk).
En una realizacion, la NSI es un exon de tipo salvaje de un gen. En otra realizacion, la NSI es un exon de un gen que tiene una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos.
En una realizacion, el COIN comprende un exon de un gen que comprende una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos. En una realizacion especffica, el COIN comprende un exon de un ser humano, raton, mono o rata.
En una realizacion, el COIN comprende una region 3' de corte y empalme. En una realizacion especffica, la region 3' de corte y empalme es seguida por una secuencia seleccionada de un ADNc, una secuencia de exon-intron, un microARN, un racimo de microARN, un ARN pequeno, un elemento de salto del codon, un IRES, una secuencia de poliadenilacion y una combinacion de los mismos. En una realizacion especffica, el ARN pequeno es un mirtron. En una realizacion especffica, el elemento de salto del codon es T2A, E2A o F2A.
En una realizacion, el COIN se selecciona de un informador, un elemento tipo trampa de gen (elemento tipo GT) y un informador tipo trampa de gen (informador tipo GT). En una realizacion especffica, el elemento tipo GT se selecciona de ADNc-poliA de resistencia a farmacos SA. En un caso especffico, el informador de tipo GT se selecciona de SA-informador-poliA.
En una realizacion, la construccion comprende, ademas, un brazo de homologfa aguas arriba de la construccion (un brazo de homologfa aguas arriba) y un brazo de homologfa aguas abajo de la construccion (un brazo de homologfa aguas abajo). En una realizacion, el brazo de homologfa de aguas arriba y el brazo de homologfa de aguas abajo son brazos de homologfa de raton o de rata. En una realizacion especffica, los brazos de homologfa son brazos de homologfa de raton y la NSI comprende una secuencia humana. En una realizacion especffica, la secuencia humana comprende un exon humano que es un homologo de un exon de raton.
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Se describe un alelo multifuncional que comprende dos o mas unidades recombinables que son reconocidas por dos o mas recombinasas diferentes, estando cada una de las unidades recombinables definida por un par de sitios de reconocimiento de recombinasa compatibles que definen los lfmites de la unidad recombinable. Cada una de las unidades recombinables comprende uno o mas sitios de reconocimiento de recombinasa interna. El uno o mas sitios de reconocimiento de recombinasa interna se seleccionan de manera que, tras la recombinacion por una primera recombinasa de una unidad recombinable del alelo multifuncional, el uno o mas sitios de reconocimiento de recombinasas internas dentro de una unidad recombinable se emparejan entonces con una o mas unidades de recombinasa internas dentro de otra unidad recombinable para permitir la inversion y/o delecion por la primera recombinasa de una secuencia que se extiende a dos o mas unidades recombinables del alelo multifuncional, en donde la inversion y/o delecion es posible solo tras la inversion de los uno o mas sitios de reconocimiento de recombinasa interna.
En un caso, la inversion y/o delecion va acompanada de la inversion de un sitio de reconocimiento de recombinasa adicional del alelo multifuncional, en donde la inversion del sitio de reconocimiento de recombinasa adicional permite la inversion o delecion de un elemento del alelo multifuncional por una segunda recombinasa.
Se describe un alelo multifuncional, que comprende: (a) una primera, una segunda, una tercera, una cuarta y una quinta unidad recombinable, en donde cada una de las unidades recombinables esta limitada por sitios de reconocimiento de recombinasa compatibles y en donde la primera unidad recombinable se solapa con la segunda unidad recombinable, y en donde la tercera, cuarta y quinta unidades recombinables estan contenidos dentro de la segunda unidad recombinable; (b) una primera unidad recombinable que comprende un aceptor 3' de corte y empalme y una region de corte y empalme enlazada operativamente a una secuencia de accionamiento, una DSC, y una NSI; (c) una segunda unidad recombinable que comprende la DSC, la NSI y un COIN; (d) una tercera unidad recombinable que comprende la NSI; (e) una cuarta unidad recombinable que comprende la NSI y el COIN; (f) una quinta unidad recombinable que comprende el COIN; en donde los alelos multifuncionales comprenden un primer par de sitios de reconocimiento de recombinasa que flanquean la primera unidad recombinable aguas arriba y aguas abajo que permiten en una primera inversion de la primera unidad recombinable, en donde la primera inversion resulta en una segunda inversion de un sitio de recombinasa dentro de la segunda unidad recombinable, en donde la segunda inversion orienta el sitio recombinasa dentro de la segunda unidad recombinable con el fin de suprimir la secuencia de accionamiento y suprimir la DSC.
En un caso, una sola recombinasa reconoce el primer par de sitios de reconocimiento de recombinasa y tambien suprime la secuencia de accionamiento y la casete de seleccion de farmacos.
En un caso, la segunda inversion orienta un sitio de recombinacion de manera que despues de la inversion se forma un segundo conjunto de sitios de reconocimiento de recombinasa que permite la delecion de la NSI y/o inversion del COIN.
En un aspecto, la construccion de acido nucleico proporcionada comprende un MFA que comprende, de 5' a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, un COIN en orientacion antisentido, una NSI en orientacion antisentido, una DSC y un informador en orientacion sentido, en donde tras el tratamiento del MFA con una recombinasa seleccionada, el COIN, la NSI y la DSC se escinden y el informador permanece en orientacion sentido; y en donde tras un tratamiento alternativo con una recombinasa seleccionada diferente, el informador y la DSC se escinden, el COIN permanece en orientacion antisentido y la NSI se dispone en orientacion sentido, de manera que tras un tratamiento adicional con aun otra recombinasa seleccionada diferente, la NSI se escinde y el COIN se dispone en orientacion sentido.
En una realizacion, el MFA comprende una primera unidad recombinable, una segunda unidad recombinable y una tercera unidad recombinable, en donde la primera unidad recombinable solapa a la segunda y tercera unidad recombinable, y en donde la segunda unidad recombinable solapa a la primera y tercera unidad recombinable.
En una realizacion, la primera unidad recombinable comprende un COIN en orientacion inversa (antisentido) y una NSI en orientacion inversa, en donde la unidad recombinable esta flanqueada aguas arriba del COIN y aguas abajo de la NSI por los sitios de recombinasa compatibles R2 y R2' orientados para dirigir una delecion; la segunda unidad recombinable solapa a la primera unidad recombinable, y la segunda unidad recombinable es recombinable por la accion de una recombinasa en un sitio de recombinacion aguas arriba de la DSC y un sitio de recombinacion aguas abajo del informador, en donde los sitios de recombinacion estan orientados para dirigir una inversion, y en donde el sitio de recombinacion aguas arriba de la DSC es seguido por una secuencia que comprende la NSI. En una realizacion especffica, la MFA comprende, de 5 'a 3' con respecto a la orientacion en una cadena sentido, un primer sitio de recombinasa R1, un segundo sitio de recombinasa R2, un tercer sitio de recombinasa R3, el COIN en orientacion antisentido, un cuarto sitio de recombinasa R4, un quinto sitio de recombinasa R5, un sexto sitio de recombinasa R3' que es compatible con R3 y esta orientado para dirigir una delecion de la secuencia entre R3 y R3', la NSI en orientacion antisentido, un septimo sitio de recombinasa R2' que es compatible con R2 y esta orientado para dirigir una delecion de la secuencia entre R2 y R2', un octavo sitio de recombinasa R4', una DSC, un noveno sitio de recombinasa R1' que es compatible con R1 y esta orientado para dirigir una delecion de la secuencia entre R1 y R1', un informador en orientacion sentido y un decimo sitio de recombinasa R5' que es compatible con R5 y esta orientado para dirigir una inversion de la secuencia entre R5 y R5'.
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En una realizacion especffica, R1/R1' son sitios Rox, R2/R2' son sitios loxP, R3/R3' son sitios lox2372, R4/R4' son sitios FRT y R5/R5' son sitios FRT3. En una realizacion especffica, el MFA comprende una disposicion de sitios de recombinasa y COIN, NSI, DSC y el informador tal como se muestra en la FIG. 11, Panel A. En una realizacion especffica, tras la exposicion a una sola recombinasa que reconoce R1/R1', se forma un alelo tal como se muestra en la FIG. 11, Panel B. En una realizacion especffica, tras la exposicion a una sola recombinasa que reconoce R4/R4' y R5/R5', se forma un alelo tal como se muestra en la FIG. 11, Panel C. En una realizacion especffica, tras la exposicion del alelo de la FIG. 11, Panel C a una recombinasa adicional que reconoce R2/R2' y R3/R3', se forma un alelo tal como se muestra en la FIG. 11, Panel D.
En un aspecto, la construccion de acido nucleico proporcionada comprende un MFA que comprende, de 5' a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, una NSI en orientacion antisentido, una DSC, un informador en orientacion sentido y un COIN en orientacion antisentido; en donde tras el tratamiento del MFA con una recombinasa seleccionada, la NSI y la DSC se escinden, el informador permanece en orientacion sentido y el COIN se mantiene en orientacion antisentido; y en donde tras un tratamiento alternativo con una recombinasa seleccionada diferente, la DSC y el informador se escinden, y la NSI se dispone en orientacion sentido y el COIN esta en orientacion antisentido, y en donde despues del tratamiento alternativo con la recombinasa seleccionada diferente, el alelo se trata con aun otra recombinasa seleccionada diferente, resultando la escision de NSI y la disposicion del COIN en orientacion sentido.
En una realizacion, el MFA comprende una primera unidad recombinable, una segunda unidad recombinable y una tercera unidad recombinable, en donde la primera unidad recombinable solapa a la segunda y tercera unidad recombinable, y en donde la segunda unidad recombinable solapa a la primera y tercera unidad recombinable. En una realizacion, la primera unidad recombinable comprende una DSC y un informador en orientacion sentido, en donde la unidad recombinable esta flanqueada aguas arriba de la DSC por sitios de recombinacion R2 seguido de R3, y esta flanqueada aguas abajo del informador por sitio recombinasa R3', en donde R2/R3' estan orientados para dirigir una inversion, y en donde la DSC esta precedida por R2' orientada con respecto a R2 para dirigir una inversion; la segunda unidad recombinable esta flanqueada, aguas arriba de la NSI antisentido, por R4 y esta flanqueada, aguas abajo del COIN antisentido, por R4', en donde R4/R4' estan orientados para dirigir una escision, y en donde la segunda unidad recombinable incluye la DSC e informador; y la tercera unidad recombinable esta flanqueado aguas arriba por R1 y aguas abajo por R1', en donde R1/R1' estan orientados para dirigir una escision, en donde aguas arriba y adyacente a R1' se encuentra la DSC y en donde aguas abajo y adyacente a R1 se encuentra R2. En una realizacion especffica, el MFA comprende, de 5' a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, R1, R2, R3, R4, la NSI en orientacion antisentido, R5, R2', en donde R2/R2' estan orientados para dirigir una inversion, la DSC, R1', en donde R1/R1' estan orientados para dirigir una inversion, el gen informador, R3', en donde R3/R3' estan orientados para dirigir una inversion, el COIN en orientacion antisentido, R5', en donde R5/R5' estan orientados para dirigir una escision, y R4', en donde R4/R4' estan orientados para dirigir una escision.
En una realizacion especffica, R1/R1' son sitios Rox, R2/R2' son sitios FRT o FRT3, R3/R3' son sitios FRT o FRT3, que no son los mismos que R2/R2', R4/R4' son sitios lox2372 o sitios loxP, y R5/R5' son sitios lox2372 o sitios loxP que no son los mismos que R4/R4'.
En una realizacion especffica, el MFA comprende una disposicion de sitios de recombinasa y COIN, NSI, DSC y el informador tal como se muestra en la FIG. 12, Panel A. El tratamiento con una recombinasa seleccionada resulta en el alelo mostrado en la FIG. 12, Panel B. El tratamiento alternativo con una recombinasa seleccionada diferente resulta en el alelo mostrado en la FIG. 12, Panel C. El tratamiento del alelo de la FIG. 12, Panel C con aun otra recombinasa diferente resulta en el alelo mostrado en la FIG. 12, Panel D.
En un aspecto, la construccion de acido nucleico proporcionada comprende un MFA que comprende, de 5 'a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, un informador en orientacion sentido, una DSC, una NSI en orientacion antisentido y un COIN en orientacion antisentido; en que despues del tratamiento del MFA con una primera recombinasa seleccionada, el informador se escinde, la NSI se dispone en orientacion sentido y el COIN permanece en orientacion antisentido, y en donde el alelo comprende sitios de recombinasa que permiten una inversion de la secuencia, que tras el tratamiento con una segunda recombinasa seleccionada colocarfa al COIN en orientacion sentido y la NSI en orientacion antisentido. En una realizacion, a continuacion de la primera recombinasa seleccionada, el alelo se trata con la segunda recombinasa seleccionada. En una realizacion, el COIN senala que la NSI se ha dispuesto en orientacion antisentido despues del tratamiento con la segunda recombinasa.
En una realizacion, el MFA comprende, de 5' a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, un sitio de recombinasa R1, un informador, un segundo sitio de recombinasa R2, una DSC, un tercer sitio de recombinasa R3, una NSI en orientacion antisentido, un cuarto sitio de recombinasa R4, un quinto sitio de recombinasa R5, un sexto sitio de recombinasa R1' que es compatible con R1 y que esta orientado con respecto a R1 para dirigir una inversion, un septimo sitio de recombinasa R3' que es compatible con R3 y que esta orientado con respecto a R3 para dirigir una inversion, un COIN en orientacion antisentido, un octavo sitio de recombinasa R5' que es compatible con R5 y que esta orientado con respecto a R5 para dirigir una escision, un noveno sitio de recombinasa R4' que es compatible con R4 y que esta orientado con respecto a R4 para dirigir una escision y un decimo sitio de recombinasa R2' que es compatible con R2 y que esta orientado con respecto a R2 para dirigir una escision. En una realizacion especffica, R1/R1' son sitios FRT3 o FRT, R2/R2' son sitios Rox, R3/R3' son sitios FRT3 o FRT, que son
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diferentes de R1/R1', R4/R4' son sitios loxP o lox2372 y R5/R5' son sitios loxP o lox2372 que son diferentes de los sitios R4/R4'.
En una realizacion especffica, el MFA comprende una disposicion de sitios de recombinasa y COIN, NSI, DSC e informador tal como se muestra en la FIG. 13, Panel A. El tratamiento con una recombinasa seleccionada resulta en el alelo mostrado en la FIG. 13, Panel B. El tratamiento del alelo de la FIG.13, Panel B con una recombinasa diferente resulta en el alelo mostrado en la FIG. 13, Panel C.
En un aspecto, la construccion de acido nucleico proporcionada comprende un MFA que comprende, de 5' a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, un COIN en orientacion antisentido, una NSI en orientacion antisentido, una DSC y un informador en orientacion sentido; en que tras el tratamiento del MFA con una primera recombinasa seleccionada, el informador se escinde, la NSI se dispone en orientacion sentido, y el COIN permanece en orientacion antisentido, y en donde el alelo comprende sitios de recombinasa que permiten una inversion de la secuencia que, tras el tratamiento con una segunda recombinasa seleccionada, dispondrfa el COIN en orientacion sentido y la NSI en orientacion antisentido. En una realizacion, siguiendo a la primera recombinasa seleccionada, el alelo se trata con la segunda recombinasa seleccionada. En una realizacion, el COIN senala que la NSI se ha dispuesto en orientacion antisentido despues del tratamiento con la segunda recombinasa.
En una realizacion, el MFA comprende, de 5' a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, un sitio de recombinasa R1, un segundo sitio de recombinasa R2, un tercer sitio de recombinasa R3, un COIN en orientacion antisentido, un cuarto sitio de recombinasa R4, un quinto sitio de recombinasa R5, un sexto sitio de recombinasa R3' que es compatible con R3 y que esta orientado con respecto a R3 para dirigir una escision, un septimo sitio de recombinasa R2' que es compatible con R2 y que esta orientado con respecto a R2 para dirigir una escision, una NSI en orientacion antisentido, un octavo sitio de recombinasa R4' que es compatible con R4 y que esta orientado con respecto a R4 para dirigir una inversion, una DSC, un noveno sitio de recombinasa R1' que es compatible con R1 y que esta orientado con respecto a R1 para dirigir una escision, un informador en orientacion sentido y un decimo sitio de recombinasa R5' que es compatible con R5 y que esta orientado con respecto a R5 para dirigir una inversion. En una realizacion especffica, R1/R1' son sitios Rox, R2/R2' son sitios loxP o lox2372, R3/R3' son sitios loxP o lox2372 que son diferentes de R2/R2', R4/R4' son sitios FRT o FRT3 y R5/R5' son sitios FRT o FRT3 que son diferentes de R4/R4'.
En una realizacion especffica, el MFA comprende una disposicion de sitios de recombinasa y COIN, NSI, DSC y el informador tal como se muestra en la FIG. 14, Panel A. El tratamiento con una recombinasa seleccionada resulta en el alelo mostrado en la FIG. 14, Panel B. El tratamiento del alelo de la FIG.14, Panel B con una recombinasa diferente resulta en el alelo mostrado en la FIG. 14, Panel C.
En un aspecto, la construccion de acido nucleico proporcionada comprende un MFA que comprende, de 5' a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, una NSI en orientacion antisentido, una DSC, un informador en orientacion sentido y un COIN en orientacion antisentido; en que tras el tratamiento del MFA con una primera recombinasa seleccionada, el informador se escinde, la DSC se escinde, la NSI se dispone en orientacion sentido y el COIN se mantiene en orientacion antisentido, y en donde despues del tratamiento con la primera recombinasa seleccionada el alelo comprende sitios de recombinasa que permiten una inversion de la secuencia que tras el tratamiento con una segunda recombinasa seleccionada dispondrfa el COIN en orientacion sentido y la NSI en orientacion antisentido. En una realizacion, siguiendo con la primera recombinasa seleccionada, el alelo es tratado con la segunda recombinasa seleccionada. En una realizacion, el COIN senala que la NSI se ha dispuesto en orientacion antisentido despues del tratamiento con la segunda recombinasa.
En una realizacion, el MFA comprende, de 5' a 3' con respecto a la direccion de la transcripcion, un sitio de recombinasa R1, un segundo sitio de recombinasa R2, un tercer sitio de recombinasa R3, un NSI en orientacion antisentido, un cuarto sitio de recombinasa R4, un quinto sitio de recombinasa R5, un sexto sitio de recombinasa R2' que es compatible con R2 y que esta orientado con respecto a R2 para dirigir una inversion, una DSC, un septimo sitio de recombinasa R1' que es compatible con R1 y que esta orientado con respecto a R1 para dirigir una escision, un informador en orientacion sentido, un octavo sitio de recombinasa R3' que es compatible con R3 y que esta orientado con respecto a R3 para dirigir una inversion, un COIN en orientacion inversa, un noveno sitio de recombinasa R5' que es compatible con R5 y que esta orientado con respecto a R5 para dirigir una escision y un decimo sitio de recombinasa R4' que es compatible con R4 y que esta orientado con respecto a R4 para dirigir una escision. En una realizacion especffica, R1/R1' son sitios Rox, R2/R2' son sitios FRT o fRT3, R3/R3' son sitios FRT o FRT3 que son diferentes de R2/R2', R4/R4' son sitios loxP o lox2372 y R5/R5' son sitios loxP o lox2372 que son diferentes de R4/R4'.
En una realizacion especffica, el MFA comprende una disposicion de sitios de recombinasa y COIN, NSI, DSC y el informador tal como se muestra en la FIG. 15, Panel A. El tratamiento con una recombinasa seleccionada resulta en el alelo mostrado en la FIG. 15, Panel B. El tratamiento del alelo de la FIG.15, Panel B con una recombinasa diferente resulta en el alelo mostrado en la FIG. 15, Panel C.
Se describe un alelo multifuncional, que comprende una DSC, un informador, un COIN, una NSI y cinco pares de sitios de recombinasa dispuestos entre el informador, la DSC, el COIN y la NSI, en donde ningun par de sitios de
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recombinasa es identico a cualquier otro par, y en donde unos primeros dos pares de sitios de recombinasa son reconocidos por la misma primera recombinasa, unos segundos dos pares de sitios de recombinasa son reconocidos por la misma segunda recombinasa y el quinto par de sitios de recombinasa son reconocidos por una tercera recombinasa, en donde la primera, segunda y tercera recombinasa no son identicas, y en donde, con respecto a la direccion de la transcripcion, el MFA comprende (de 5' a 3'): (a) una secuencia de accionamiento (p. ej., con informador) en orientacion sentido, la DSC en orientacion sentido o antisentido, la NSI en orientacion antisentido, el COIN en orientacion antisentido; (b) el COIN en orientacion antisentido, la NSI en orientacion antisentido, la DSC en orientacion sentido o antisentido, el informador en orientacion sentido; (c) la NSI en orientacion antisentido, la DSC en orientacion sentido o antisentido, el informador en orientacion sentido, el COIN en orientacion antisentido; (d) el informador en orientacion sentido, la DSC en orientacion sentido o antisentido, la NSI en orientacion antisentido, el COIN en orientacion antisentido; (e) el COIN esta en orientacion antisentido, la NSI esta en orientacion antisentido, la DSC esta en orientacion sentido o antisentido, el informador esta en orientacion sentido; o (f) la NSI en orientacion antisentido, la DSC en orientacion sentido o antisentido, el informador en orientacion sentido, el COIN en orientacion antisentido.
En un caso, la disposicion es como en (a), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de manera que tras la exposicion a la tercera recombinasa, el quinto par de sitios de recombinasa dirige una escision de la DSC, la NSI y el COIN, en donde el informador se mantiene en orientacion sentido.
En un caso, la disposicion es como en (a), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de manera que tras la exposicion a la primera recombinasa, se forma un MFA modificado, en donde los dos primeros pares de sitios de recombinasa dirigen la escision del informador y la escision de la DSC y la inversion de la NSI a una orientacion sentido, en donde el COIN se mantiene en orientacion antisentido. En un caso adicional, el MFA modificado comprende los segundos dos pares de sitios de recombinasa que, tras la exposicion a la segunda recombinasa, resultan en un alelo en donde la NSI se escinde y el COIN se dispone en la orientacion sentido.
En un caso, la disposicion es como en (b), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la tercera recombinasa, el quinto par de sitios de recombinasa dirige una escision del COIN, la NSI y la DSC, en donde el informador se mantiene en orientacion sentido.
En un caso, la disposicion es como en (b), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la primera recombinasa, se forma un MFA modificado en donde los dos primeros pares de sitios de recombinasa dirigen la escision de la DSC y el informador y la inversion directa de la NSI a la orientacion sentido, en donde el COIN se mantiene en orientacion antisentido. En un caso adicional, el MFA modificado comprende los segundos dos pares de sitios de recombinasa que, tras la exposicion a la segunda recombinasa, dan lugar a un alelo en donde la NSI se escinde y el COIN se coloca en la orientacion sentido.
En un caso, la disposicion es como en (c), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la quinta recombinasa, la NSI y la DSC se escinden y el informador y el COIN se mantienen en orientacion antisentido.
En un caso, la disposicion es como en (c), y los pares o los sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la primera recombinasa, se forma un MFA modificado en donde la DSC y el informador se escinden, y la NSI se dispone en orientacion sentido, en donde el COIN se mantiene en orientacion antisentido. En un caso adicional, el MFA modificado comprende los segundos dos pares de sitios de recombinasa que, tras la exposicion a la segunda recombinasa, resultan en un alelo en donde la NSI se escinde y el COIN se dispone en orientacion sentido.
En un caso, la disposicion es como en (d), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la quinta recombinasa, la DSC, la NSI y el COIN se escinden y el informador se mantiene en orientacion sentido.
En un caso, la disposicion es como en (d), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la primera recombinasa, se forma un MFA modificado en donde el informador y la DSC se escinden, y la NSI se dispone en orientacion sentido, en donde el COIN se mantiene en orientacion antisentido. En un caso adicional, el MFA modificado comprende los segundos dos pares de sitios de recombinasa que, tras la exposicion a la segunda recombinasa, resultan en un alelo en donde el COIN se dispone en orientacion sentido y la NSI se dispone en orientacion antisentido.
En un caso, la disposicion es como en (e), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la quinta recombinasa, el COIN, la NSI y la DSC se escinden y el informador se mantiene en orientacion sentido.
En un caso, la disposicion es como en (e), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la primera recombinasa, se forma un MFA modificado en donde la DSC y el informador se escinden, la NSI se dispone en orientacion sentido y el COIN se mantiene en orientacion antisentido. En un caso adicional, el MFA modificado comprende los segundos dos pares de sitios de recombinasa dispuestos de tal manera
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que, tras la exposicion a la segunda recombinasa, la NSI se coloca en orientacion antisentido y el COIN se coloca en la orientacion sentido.
En un caso, la disposicion es como en (f), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la quinta recombinasa, la NSI y la DSC se escinden, el informador se mantiene en orientacion sentido y el COIN se mantiene en orientacion antisentido.
En un caso, la disposicion es como en (f), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la quinta recombinasa, la NSI y la DSC se escinden y el informador se mantiene en orientacion sentido y la COIN se mantiene en orientacion antisentido.
En un caso, la disposicion es como en (f), y los pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion a la primera recombinasa, se forma un MFA modificado en donde la DSC y el informador se escinden y la NSI se dispone en orientacion sentido y el COIN se mantiene en orientacion antisentido. En un caso adicional, el MFA modificado comprende los segundos dos pares de sitios de recombinasa dispuestos de tal manera que, tras la exposicion a la segunda recombinasa, la NSI se dispone en orientacion antisentido y el COIN se dispone en orientacion sentido.
Se describe un metodo para producir una celula que comprende una construccion que tiene una secuencia de nucleotidos de interes en orientacion antisentido y un COIN en orientacion antisentido, que comprende la etapa de introducir en un genoma de una celula un MFA tal como se describe en esta memoria, identificar la celula que comprende el MFA, seguido de una etapa de exponer el genoma a una primera recombinasa, en el que la accion de la primera recombinasa sobre la construccion en el genoma resulta en la secuencia de nucleotidos de interes que se coloca en la orientacion sentido.
En un caso, la celula es una celula pluripotente, una celula pluripotente inducida, una celula totipotente o una celula ES. En un caso especffico, la celula ES es una celula ES de raton o de rata.
En un caso, la construccion se introduce en la celula por recombinacion homologa. En otro caso, la construccion se integra aleatoriamente en un acido nucleico de la celula. En una realizacion, el acido nucleico de la celula es el genoma de la celula.
En un caso, la NSI comprende un exon. En un caso, la NSI comprende un exon y una secuencia flanqueante intronica. En un caso especffico, el exon flanqueante esta flanqueado en las posiciones 5' y 3' con la secuencia intronica. En un caso, la secuencia de nucleotidos comprende dos o mas exones, y en un caso especffico comprende la o las secuencias intronicas. En otro caso, la NSI carece de un exon, o carece de un fragmento de un exon.
En un caso, la NSI es un exon de tipo salvaje o exones de un gen. En otro caso, la NSI es un exon o exones de un gen que tiene una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos.
En un caso, el COIN comprende un exon de un gen que comprende una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de acidos nucleicos. En un caso especffico, el COIN comprende un exon de un gen de ser humano, raton, mono o rata.
En un caso, el COIN comprende una region 3' de corte y empalme. En una realizacion especffica, la region 3' de corte y empalme es seguida por una secuencia seleccionada de un ADNc, una secuencia de exon-intron, un microARN, un racimo de microARN, un ARN pequeno, un elemento de salto del codon, un IRES, una secuencia de poliadenilacion y una combinacion de los mismos. En un caso especffico, el ARN pequeno es un mirtron. En un caso especffico, el elemento de salto del codon es T2A, E2A o F2A.
En un caso, el COIN se selecciona de un informador, un elemento tipo trampa de gen (elemento tipo GT) y un informador tipo trampa de gen (informador tipo GT). En una realizacion especffica, el elemento tipo GT se selecciona de ADNc-poliA de resistencia a farmacos SA. En una realizacion especffica, el informador de tipo GT se selecciona de SA-informador-poliA.
Se describe un metodo para disponer un alelo multifuncional en un genoma de celulas de raton, que comprende una etapa de introducir en un locus en una celula de raton una construccion de fijacion de objetivo, que comprende una primera unidad recombinable que comprende (a) una secuencia de accionamiento (p. ej., una secuencia de nucleotidos y/o un informador); (b) una DSC; (c) una NSI en orientacion antisentido con respecto al locus; (d) un COIN en orientacion antisentido con respecto al locus; y (e) sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio dispuestos en unidades recombinables para suprimir el informador y la DSC, para invertir la NSI de nuevo a la orientacion sentido, y para invertir el COIN y suprimir o volver a invertir la NSI.
En un caso, los sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio estan dispuestos en unidades recombinables de modo que la NSI se volvera a invertir a la cadena antisentido y el COIN se invertira a la cadena sentido. En otro caso, los sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio estan dispuestos en unidades recombinables de modo que la NSI se suprimira y el COIN sera invertido a la cadena sentido.
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En un caso, las unidades recombinables estan dispuestos de tal manera que tras la exposicion del locus diana modificado con MFA a una primera recombinasa, una primera unidad recombinable que comprende el informador y DSC se suprimen y la NSI se dispone en la orientacion sentido con respecto al locus y el COIN se mantiene en la orientacion antisentido, formando una segunda unidad recombinable.
En un caso, la secuencia de nucleotidos de interes en la orientacion antisentido es un exon en la orientacion antisentido, o un exon flanqueado por la secuencia intronica, en donde el exon y la secuencia intronica estan cada uno en orientacion antisentido. En un caso especffico, el exon que se dispone en la orientacion antisentido es identico al exon que esta siendo reemplazado por la construccion de fijacion de objetivo. En un caso especffico, la NSI en orientacion antisentido es un exon y la secuencia que rodea el exon. En un caso especffico, la NSI es dos o mas exones. En una realizacion especffica, la NSI es una secuencia no exonica.
En un caso, la segunda unidad recombinable generada por la accion de la primera recombinasa se expone a una segunda recombinasa, en donde la segunda recombinasa suprime la NSI y dispone el COIN en la orientacion sentido.
En un caso, la segunda unidad recombinable generada por la accion de la primera recombinasa se expone a una segunda recombinasa, en donde la segunda recombinasa dispone la NSI en orientacion antisentido y dispone el COIN en orientacion sentido.
Se describe tambien un metodo para la complementacion de una inactivacion, que comprende introducir en un animal no humano un MFA tal como se describe en esta memoria, en donde la construccion de acido nucleico comprende una secuencia de acido nucleico de tipo salvaje en orientacion antisentido y un COIN en la orientacion antisentido, en el que tras la exposicion de la construccion de acido nucleico a una primera recombinasa la secuencia de acido nucleico de tipo salvaje se invierte para detectar la orientacion y se transcribe, pero el COIN permanece en la orientacion antisentido; y en donde tras la exposicion a una segunda recombinasa se escinde la secuencia de acido nucleico de tipo natural, o se invierte de nuevo a la cadena antisentido, y el COIN se invierte para detectar la orientacion.
En un caso, el animal no humano es un raton.
En un caso, el COIN es un elemento informador. En una realizacion, el elemento informador se selecciona a partir de una protefna fluorescente, una protefna luminiscente o una enzima. En un caso especffico, el informador se selecciona de GFP, eGFP, CFP, YFP, eYFP, BFP, eBFP, DsRed, MmGFP, luciferasa, LacZ, y fosfatasa alcalina.
Tambien se describe una celula de mamffero que comprende un alelo multifuncional de acuerdo con la invencion.
En un caso, la celula de mamffero se selecciona de una celula de raton y una celula de rata. En un caso, la celula se selecciona de una celula madre, una celula madre embrionaria (ES), una celula pluripotente inducida, una celula pluripotente y una celula totipotente.
Tambien se describe un embrion no humano o animal no humano que comprende un alelo multifuncional de acuerdo con la invencion.
En un caso, el embrion no humano o animal no humano comprende un alelo multifuncional que ha sido expuesto a una o mas recombinasas especfficas del sitio. En un caso especffico, el alelo multifuncional ha sido expuesto a una o mas recombinasas especfficas del sitio como resultado de una etapa de cultivo en donde un animal no humano que comprende un alelo multifuncional se ha acoplado a un animal no humano que comprende una o mas recombinasas especfficas del sitio, y el embrion no humano o el animal no humano es una progenie de la etapa de crfa.
Tambien se describe una celula que comprende un MFA tal como se describe en esta memoria, en donde la celula es una celula de mamffero, p. ej., una celula ES o una celula pluripotente o pluripotente inducida. En un caso especffico, la celula es una celula de raton o de rata.
Tambien se describe un animal no humano, que comprende un MFA tal como se describe en esta memoria, o un MFA que ha sido expuesto a uno o mas recombinasas tal como se describe en esta memoria.
Tambien se describe un embrion no humano, que comprende un MFA tal como se describe en esta memoria, o un MFA que ha sido expuesto a una o mas recombinasas tal como se describe en esta memoria.
Tambien se describe una celula, un embrion no humano o un animal no humano producido utilizando un MFA tal como se describe en esta memoria.
Tambien se describe una celula, un embrion no humano o un animal no humano producido utilizando un MFA tal como se describe en esta memoria.
Cualquier aspecto o realizacion se puede utilizar en relacion con cualquier otro aspecto o realizacion, segun sea apropiado, p. ej., cualquier informador o DSC resenado en relacion con cualquier realizacion particular de MFA se
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puede utilizar con cualquier realizacion de MFA descrita en esta memoria, y cualquier recombinasa o sitio de recombinasa particular mencionado en relacion con cualquier realizacion particular de MFA se puede utilizar con cualquier realizacion de MFA descrita en esta memoria.
Se describen otras realizaciones y resultaran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de una revision de la siguiente descripcion detallada.
DESCRIPCION DETALLADA
La invencion no se limita a metodos particulares, y las condiciones experimentales descritas, ya que tales metodos y condiciones pueden variar. La terminologfa utilizada en esta memoria es con el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invencion estara limitado unicamente por las reivindicaciones.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos y expresiones tecnicas y cientfficas utilizadas en esta memoria tienen el mismo significado que el comunmente entendido por aquellos expertos en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria se pueden utilizar en la practica o ensayo de la presente invencion, se describen ahora metodos y materiales particulares.
La frase "orientacion sentido," o "sentido" se refiere a la direccion de codificacion o cadena sentido de una secuencia de acido nucleico transcribible en el contexto local del genoma, p. ej., cuando una secuencia se dispone en "orientacion sentido" en o cerca de una secuencia transcribible en un genoma, la orientacion de la secuencia es compatible con la transcripcion y, para genes que codifican protefnas, tambien la traduccion de la secuencia en la region o locus o gen en el que se dispone la secuencia. La frase "orientacion antisentido" o "antisentido" se refiere a la colocacion de una secuencia en una region o locus o gen en el que la secuencia esta en la cadena opuesta (o antisentido) a lo que es compatible con la transcripcion. Asf, en un ejemplo especffico, si una secuencia se dispone en orientacion "sentido" en un gen, puede generalmente ser transcrito. Si una secuencia se dispone en orientacion "antisentido", por lo general no se transcribira. Para loci en donde la transferencia entre las cadenas sentido y antisentido podrfa resultar en la transcripcion de cualquiera de las hebras, la secuencia puede ser seleccionada o tratada mediante ingenierfa genetica de tal manera que la transferencia de sentido a antisentido o de antisentido a sentido resultana en la transcripcion de una cadena, pero no cualquiera de las dos.
El termino "COIN" incluye la referencia a un elemento condicional. Un elemento condicional comprende una secuencia de nucleotidos, cuya expresion (o el fracaso de expresar) esta condicionada por la ocurrencia de un evento independiente. Por ejemplo, una region codificadora que en una orientacion sentido codificarfa una protefna o fragmento de la misma o un ARN no codificante (ARNnc) se dispone en la orientacion antisentido, flanqueada por ambos lados por sitios de recombinacion especfficos del sitio en la orientacion opuesta. En ausencia de una recombinasa especffica del sitio que reconoce los sitios flanqueantes, la region codificadora no se transcribe, ya que se dispone en la cadena antisentido con respecto al gen diana. Tras el tratamiento con la recombinasa especffica del sitio cognato, la secuencia COIN se invierte y, como resultado de ello, se incorpora en el mensaje transcrito, resultando la expresion de la protefna o fragmento de la misma o en la del ARNnc.
El termino "incompatible", cuando se utiliza para describir dos o mas sitios de reconocimiento de recombinasa, se refiere a la calidad que dos o mas sitios de reconocimiento de recombinasa no pueden recombinarse entre sf (pero los dos o mas sitios de reconocimiento de recombinasa se pueden recombinar con otros sitios de reconocimiento de recombinasa (p. ej., identicos) cognatos.
Inactivaciones y Alelos Condicionales
El estudio de la funcion del gen por metodos geneticos se ha basado en el descubrimiento de variantes que se producen de forma natural o alelos mutantes, o en la generacion deliberada de tales variantes y alelos mutantes. Este ultimo ha procedido ya sea por la mutagenesis aleatoria seguida de rastreos basados en el fenotipo y luego elucidacion de la mutacion causal - un proceso al que se alude como "genetica directa" o mediante la metodologfa de la ingenierfa genetica mediante la cual las mutaciones se realizan en genes o loci "diana" especfficos - un enfoque al que se ha aludido como "genetica inversa".
En el raton - el organismo modelo de mamffero mas utilizado - la capacidad de tratar mediante ingenierfa genetica mutaciones especfficas, molecularmente extremadamente bien definidas a traves de fijacion como objetivo de genes ha dominado el campo de la genetica inversa. Sin embargo, la mayorfa de las variantes realizadas hasta la fecha han sido alelos nulos relativamente simples, conocidos comunmente como "alelos inactivados" o simplemente "inactivaciones", y habitualmente abarcan una delecion de la region exon-intron de un gen o parte del mismo, y en anos mas recientes con la sustitucion concomitante de esa region con un ADNc informador, tal como LacZ. La adaptacion de recombinasa especffica del sitio y sus sitios de reconocimiento cognatos (tales como Cre/lox, Dre/Rox, PhiC31\int/attP-attB, Flp/FRT), derivados de bacteriofagos o levadura y modificados para su uso en celulas de mamfferos, es un desarrollo mas reciente que no solo ha hecho posible la escision posterior a la fijacion como objetivo de la DSC (en la medida en que este flanqueada por sitios de reconocimiento de recombinasas especfficas del sitio), sino tambien ha permitido el tratamiento por ingenierfa genetica de alelos nulos condicional. Se han
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desarrollado alelos nulos condicionales en los que la region de exon-intron del gen diana - o con mas frecuencia una parte del mismo- esta flanqueada por sitios de reconocimiento de recombinasa, haciendo que los alelos modificados sean susceptibles de conversion al estado nulo por la accion de la recombinasa cognata. La ventaja de este metodo sobre inactivaciones regulares es que la conversion del gen modificado en una inactivacion puede ser controlada espacio-temporalmente mediante el control del lugar (organo, tejido o tipo de celula), el tiempo y, a veces, tambien la duracion que la recombinasa cognata estara activa.
Tradicionalmente, los alelos condicionales nulos han sido tratados por ingenierfa genetica como un seguimiento de los correspondientes alelos inactivados simples, sobre todo en los casos en los que este ultimo sea letal embrionario y/o muestre una pluralidad de fenotipos, por lo tanto, haciendo imposible el estudio de la funcion del gen diana en un entorno adulto (en el caso de letalidad embrionaria), o diffcil de interpretar en un tipo de celula o proceso biologico especffico (en el caso en que el gen muestra una pluralidad de fenotipos). Dada la cantidad de esfuerzo, tiempo y dinero que se necesitan para generar ratones modificados geneticamente a traves de la fijacion como objetivo del gen, se ha considerado onerosa esta manera escalonada de generar primero una inactivacion, a continuacion descifrar su fenotipo y luego tratar mediante ingenierfa genetica un nulo condicional por un numero creciente de investigadores. Ademas, para un pequeno numero de genes, los alelos inactivados regulares no pueden pasar a traves de la lfnea germinal, ya que son fruto de la letalidad embrionaria incluso en el estado heterocigoto nulo. Por lo tanto, el deseo de ser capaces de tratar mediante ingenierfa genetica alelos duales (nulos y condicionales) o incluso de multiples modalidades en una sola etapa de fijacion como objetivo del gen ha sido un objetivo persistente de los implicados en la tecnica, asf como la comunidad de usuarios finales. De hecho, dos metodos han tratado de abordar esta necesidad: FlEx e Inactivacion-primero (KO-primero).
El metodo FlEx se ha utilizado tanto para la fijacion como objetivo como en calidad de una trampa de genes (GT), pero los principios basicos de diseno son los mismos con independencia de la aplicacion final. Un diseno basico de un FlEx se muestra en la FIG. 1, representando U, p. ej., una DSC y representando D un informador. El resultado de la accion de recombinasa en la construccion FlEx es la supresion permanente del elemento U (p. ej., la DSC) y la inversion (y expresion) del elemento D (p. ej., el informador).
En su realizacion y aplicacion originales, FlEx fue desarrollado como un metodo para tratar mediante ingenierfa genetica alelos condicionales. FlEx se utilizo por primera vez para generar un alelo "nulo condicional” para Rarg, mediante la insercion de la casete FlEx en este gen, de manera que un cuplete loxP/lox511 se inserto aguas arriba del exon 8 de Rarg, y el resto de la casete FlEx - compuesto 5' a 3' de SA-lacZ-SV40poliA (un elemento de tipo GT) en la orientacion antisentido con respecto a Rarg, y luego otro cuplete loxP/lox511 en la orientacion antisentido con respecto al primer cuplete loxP/lox511, y que contiene un mini-gen de neomicina fosfotransferasa (neo) en la orientacion sentido dentro del intron-8 en de Rarg. Este diseno refuerza la inversion mediada por Cre del elemento de tipo GT SA-lacZ-SV40poliA de modo que se introduce en la cadena sentido y actua como una trampa de genes; simultaneamente, el exon 8 de Rarg se coloca en la orientacion antisentido (garantizando de manera eficaz que, incluso en el caso en que la transcripcion no termina en el extremo del elemento de tipo GT SA-lacZ-SV40poliA, el exon 8 no se incorporara en el mensaje de lectura), mientras que neo se elimina simultaneamente, y resulta con ello en un alelo nulo de Rarg en el que la expresion de Rarg se sustituye por la de lacZ.
Sin embargo, a pesar del exito de este metodo en la generacion de un alelo nulo (por la exposicion a Cre), el alelo (pre-Cre) FlEx no reordenado de Rarg no era un nulo condicional verdadero tal como fue disenado originalmente, sino un alelo hipomorfico severo, en donde la expresion de RargFLEx se redujo significativamente en comparacion con Rarg. Como resultado, ratones RargLEx/FLEx muestran un fenotipo que se asemejaba a una forma menos severa de los ratones inactivados Rarg, y revelando la incapacidad de esta realizacion inicial de FlEx de generar un alelo nulo condicional verdadero.
El metodo FlEx se ha adaptado tambien para su uso en el atrapamiento de genes. En esa variacion del metodo, un elemento GT (SA pgeo-poliA, en que pgeo es una fusion en marco de lacZ con marcos de lectura abiertos neo, por lo tanto, la combinacion de la capacidad de informar a traves de LacZ y seleccionar a traves de Neo) estaba flanqueado por dos series de tipo FlEx, una serie externa compuesta de un cuplete FRT/FRT3 y una serie interna compuesta de un cuplete loxP/lox511, tanto en la configuracion de imagen especular con respecto a la otra. De esta manera, la incorporacion con exito del vector GT resultante en genes transcritos activamente resultana en la expresion de pgeo y, por lo tanto, permitirfa la seleccion de estos eventos mediante la seleccion de G418 y, dependiendo del sitio de incorporacion del elemento de GT teoricamente tambien resultana en la generacion de alelos nulos funcionales para los genes correspondientes. Una vez que un gen ha sido atrapado para generar el correspondiente alelo FlEx, el alelo resultante puede ser un alelo inactivado o un alelo hipomorfico, es decir, uno en el que esta regulada a la baja la expresion del gen atrapado. El tratamiento de estos alelos FlEx con FLP recombinasa deberfa, en principio, invertir el elemento de GT a la cadena anti-sentido, aliviando de ese modo la terminacion de la transcripcion dentro del elemento de trampa y, por lo tanto, convertirfa el gen modificado en GT condicional. Este GT condicional, ahora "oculto" en la hebra antisentido, puede ser reactivado por la exposicion a Cre, que volvera a invertirlo actuando sobre los cupletes loxP/lox511 de la serie FlEx.
Esta aplicacion de la tecnologfa FlEx se basa en un elemento GT para generar alelos nulos. Por lo tanto, esta sujeta a las limitaciones de la tecnologfa de atrapamiento de genes, lo cual no garantiza que se genere una verdadera inactivacion y se asume el riesgo adicional de inactivar elementos reguladores (por inactivacion insercional
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aleatoria). Tanto la disposicion del elemento GT, como el grado de que es eficaz en la terminacion de la transcripcion pueden afectar si cualquier alelo dado sera un alelo nulo. Un problema adicional es que para la mayorfa de genes que no tienen una funcion ya establecida, y mas aun uno que enlaza el gen a un fenotipo determinado mediante el estudio de un alelo nulo definitivo, es muy diffcil demostrar de manera concluyente que un alelo GT es verdaderamente un alelo nulo. De hecho, por estos y otros motivos, en su mayorfa tecnicos, despues de 4 anos de adopcion y el uso de un consorcio de mutagenesis de ratones a gran escala - EUCOMM- el metodo de atrapamiento de genes basado en FIEX ha sido abandonado en favor de la fijacion como objetivo de genes utilizando el metodo KO-primera.
De manera similar al metodo FlEx, los actuales alelos KO-primera tfpicos se basan, al menos en parte, en un elemento tipo GT (ya sea SA-lacZ-poliA o SA pgeo-poliA) para generar un alelo inactivado similar. Sin embargo, en el reconocimiento de las limitaciones que se han asociado con ese enfoque (aprendiendo efectivamente de la experiencia adquirida con los GTs, asf como consideraciones teoricas), la KO-primera tambien requiere que el exon crftico flanqueado por sitios loxP aguas abajo del elemento de tipo GT debe ser suprimido (utilizando Cre) con el fin de generar un alelo nulo verdadero. Por lo tanto, en la practica, este metodo requiere primero la colocacion de una casete de informador/tipo GT flanqueada por FRT mas un mini-gen de farmaco en un intron del gen diana en algun lugar aguas arriba del exon a ser suprimido, mientras que flanqueando por sitios loxP simultaneamente el exon programado para ser suprimido. A este exon se le ha aludido como el "exon crftico", y con independencia de los criterios que se utilizan para definir el "exon crftico", el metodo de KO-primera requiere claramente su separacion con el fin de hacer que el alelo resultante sea un nulo verdadero. Por lo tanto, despues de la fijacion como objetivo, el alelo resultante no es ni un alelo nulo verdadero ni un alelo nulo condicional. Las razones por las que el alelo resultante no es un nulo verdadero se han atribuido al hecho de que, sin la separacion del exon crftico (que esta flanqueado por sitios loxP) por Cre, sigue existiendo la posibilidad de la transcripcion revisada y el corte y empalme alrededor de la casete de tipo GT, asf como la transcripcion del mensaje del gen aguas abajo de la casete de tipo GT debido a la presencia del mini-gen de farmacos. La razon de que el alelo resultante no sea un alelo nulo condicional reside en el hecho de que sin la separacion tanto de la casete informador/tipo GT como del mini-gen de farmacos, no puede tener lugar la generacion del mensaje normal (composicion normal, asf como el nivel y los sitios de expresion).
Por lo tanto, dependiendo del uso, los alelos - nulo o nulo condicionado KO-primera deben someterse a una segunda etapa de posfijacion como objetivo. En el caso de que se desee un nulo verdadero, el alelo de KO-primera debe ser tratado con recombinasa Cre para suprimir el exon crftico (que esta flanqueado por sitios loxP).
Por el contrario, un alelo condicional se puede generar despues de una separacion mediada por Flp de la casete informador/tipo GT y el mini-gen de farmacos, que estan juntos flanqueado por sitios FRT. De esta manera, las unicas modificaciones que quedan son un sitio FRT y el exon "crftico" flanqueado por sitios loxP. Este alelo, a su vez, se puede convertir en nulo por separacion mediada por Cre del exon flanqueado por sitios loxP.
Aunque el metodo KO-primera aborda algunas de las limitaciones del FlEx, sigue siendo obstaculizado por tres inconvenientes principales que limitan su utilidad: en primer lugar, a pesar de que rectifica la falta de fiabilidad de elementos tipo Gt para generar una KO-primera verdadera, fracasa en proporcionar una KO-primera verdadera, sin una etapa de posfijacion como objetivo adicional; en segundo lugar, debido a los criterios utilizados para definir "exones crfticos", la KO-primera se limita a genes codificadores de protefnas, efectivamente colocando fuera del alcance de todos los genes codificadores no proteicos (es decir, los que codifican ARNs 'no codificantes', una clase de las biomoleculas muy importantes). Ademas de ello, de los genes codificantes de protefnas solo aquellos para los que se puede definir un "exon crftico" son susceptibles de un diseno de KO-primera. Los criterios para definir un exon crftico son que su delecion resulte en un desplazamiento de marco entre la parte del marco de lectura abierto (ORF) que lo precede y la parte del ORF que le sigue. Esto se debe a que la induccion de este desplazamiento de marco es obligatoria para que el metodo de KO-primera proporcione una inactivacion definitiva. Por lo tanto, incluso ciertas clases de genes que codifican protefnas no son susceptibles de un diseno de KO-primera. Estos incluyen genes en que el ORF esta contenido dentro de un exon, y genes en que todos o la mayorfa de los exones en tandem quedan fuera en el mismo marco. En tercer lugar, una vez que el alelo de KO-primera se ha convertido en un alelo nulo condicional (por la accion de Flp), el alelo resultante no proporciona mecanismo alguno para el informe afirmativo de nulidad despues de la conversion del alelo condicional al estado nulo. Tfpicamente, los alelos inactivados primero separan el informador (p. ej., lacZ) junto con la DSC utilizando (una etapa conseguida utilizando Flp recombinado, tal como SA-lacZ-poliA y DSC utilizada en KO-primera son FRTed) dejando tras de sf solo el exon flanqueado por sitios loxP (mas un sitio FRT aguas arriba del mismo). Por lo tanto, no hay opcion de enfoques de inactivacion-primera convencionales para una funcion del informador para informar del logro de un alelo nulo.
Alelos Multifunciones
Se proporciona un enfoque de un alelo multifuncional (MFA) que permite la separacion o inactivacion de una secuencia de nucleotidos en un genoma por la introduccion de un conjunto de elementos funcionales que comprenden una secuencia de accionamiento (que confirma la separacion o inactivacion), resultando una inactivacion verdadera, y que tambien contienen uno o mas elementos condicionales cuya expresion en el alelo es condicional (es decir, depende de determinados eventos moleculares o senales) y resenable.
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El enfoque de MFA proporciona opciones de fijacion de objetivo para generar verdaderos alelos de inactivacion- primera que no requieren una segunda etapa de posfijacion de objetivo para convertir los alelos fijados como objetivo en estado nulo, proporcionando asf una ventaja y avance conceptual frente a alelos de inactivacion-primera tfpicos actuales que requieren una etapa de posfijacion de objetivo para convertir alelos fijados como objetivo en alelos nulos. El enfoque de MFA tampoco se limita al uso con "exones crfticos” y no se limita a inactivaciones por desplazamiento del marco, sino que es generalmente aplicable para modificar cualquier secuencia de nucleotidos de interes. Los MFAs proporcionan una versatilidad reforzada y una multiplicidad de opciones de alelos despues de una sola etapa de fijacion de objetivo.
El enfoque de MFA proporciona un alelo de KO-primera verdadero que proporciona la oportunidad de crear un segundo estado en el genoma del receptor tras la inversion de cualquier secuencia seleccionada ligada a una secuencia de accionamiento, y en donde se puede resenar tras la transcripcion por inversion de la secuencia seleccionada. La secuencia seleccionada puede ser, p. ej., un COIN, que, sin limitacion, puede por si mismo comprender una secuencia de accionamiento que, p. ej., comprende un represor para controlar la transcripcion de otro gen o secuencia reguladora. En un ejemplo, una sola etapa de fijacion de objetivo colocando un MFA en un locus puede permitir la modificacion de un locus de tipo salvaje a un estado particular, el Estado A (p. ej., una inactivacion de un gen endogeno). El MFA esta disenado para permitir un cambio de un estado a otro estado particular, el Estado B (p. ej., el restablecimiento de un fenotipo de tipo salvaje) a traves de la accion de una primera recombinasa. El estado B se puede convertir en el Estado C (p. ej., restablecimiento de la inactivacion y la expresion de un COIN) por una segunda recombinasa, y asf sucesivamente. Por lo tanto, se pueden alcanzar diferentes estados en un locus seleccionado a partir de un unico alelo inicial cuando se emplean MFAs.
El enfoque del MFA se puede utilizar para disponer un MFA como una trampa de genes, de manera que el transgen que comprende el MFA obtiene la expresion de elementos del MFA empleando un promotor transcripcionalmente activo endogeno.
El enfoque del MFA puede ser utilizado en aplicaciones de transgenesis tradicionales en donde la secuencia de accionamiento comprende un promotor, exon o exones e intrones y, opcionalmente, elementos de control de la transcripcion y seguido por una DSC (opcional, ya que no es necesario para una transgenesis basada en una inyeccion pronuclear tradicional), una NSI (que puede ser una segunda secuencia de accionamiento) en la orientacion antisentido con respecto a la primera secuencia de accionamiento, y un COIN (que puede ser una tercera secuencia de accionamiento) tambien dispuesto en la orientacion antisentido con respecto a la primera secuencia de accionamiento.
El enfoque de MFA ofrece una multiplicidad de opciones para la creacion de loci que contienen alelos nulos, alelos nulos condicionales, COINs, secuencias de accionamiento (que puede incluir informadores) y DSCs, y otros elementos, en una sola etapa de fijacion de objetivo. Manipulaciones posfijacion de objetivo del locus proporcionan opciones a traves del uso de unidades recombinables introducidas en el locus que contiene MFA, con la construccion MFA en la etapa de fijacion de objetivo unica. El numero de diferentes recombinasas requeridas para ejercer las diversas opciones manipulables en el locus posfijacion de objetivo se reduce mediante el empleo de diferentes pares de sitios de reconocimiento de recombinasas especfficas del sitio cognatas que son incompatibles (p. ej., un par de sitios FRT y un par de sitios FRT3, un par de sitios loxP y un par de sitios lox2372, etc.). Por lo tanto, la exposicion de un locus que contiene MFA a una sola recombinasa puede actuar independientemente sobre al menos dos unidades recombinables diferentes, para recombinar una unidad de tal manera que la unidad dispone elementos de interes (p. ej., informadores, DSCs, exones, COINs, etc.) en orientaciones deseadas, asf como para re-orientar lugares de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio dentro de la unidad recombinable para formar nuevas unidades recombinables.
El enfoque de MFA proporciona una opcion para un COIN que puede contener cualquier secuencia deseada, incluyendo pero no limitado a un informador, o un ADNc que codifica una forma mutante o variante del gen diana o parte del gen diana, o parientes y homologos del gen diana, o incluso secuencias codificadoras no proteicas tales como microARNs o racimos de microARNs, o cualesquiera combinaciones de estos elementos (ya que pueden ser acomodados por la colocacion de sitios de entrada al ribosoma interno o peptidos de "auto-escision"- dependiendo de la eleccion de los elementos-entre los diferentes elementos).
El enfoque de MFA proporciona una opcion en donde la inactivacion se consigue mediante la fijacion de objetivo, se emplea una primera recombinasa para restablecer el elemento inactivado de nuevo en un estado de (tipo salvaje) activo, y se emplea una segunda recombinasa para restablecer la inactivacion, en donde un COIN se dispone en orientacion sentido concomitante con el restablecimiento o la inactivacion del elemento inactivado, resenando asf el restablecimiento de la inactivacion en las celulas en que la segunda recombinasa ha sido activado.
Aunque los enfoques actuales de inactivacion-primera carecen de un mecanismo para informar la nulidad tras la conversion de un alelo condicional a nulo, el enfoque de MFA proporciona una opcion para un elemento de informacion (p. ej., un COIN, veanse la FIG. 5 y la FIG. 6, en la parte inferior; detectable por genotipado y/o por visualizacion u otra determinacion cualitativa o cuantitativa, opcionalmente a nivel de celula) que, tras la accion de una segunda recombinasa invierte o invierte y escinde una secuencia de nucleotidos de interes (p. ej., un exon y la secuencia circundante, NSI en la FIG. 5 y la FIG. 6) y dispone el elemento informador en orientacion sentido,
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resenando de manera efectiva la inversion y/o escision de la NSI. En esta realizacion, un alelo nulo despues de una sola etapa de fijacion de objetivo se convierte, por una primera recombinasa, en un alelo restaurado (en esta realizacion, NSI de la FIG. 5 y la FIG. 6 es un exon y que rodea la secuencia o el gen o parte del mismo reemplazado por el vector de orientacion), y por una segunda recombinasa en un alelo nulo que informa de su presencia mediante la disposicion del COIN en la orientacion sentido.
Por lo tanto, el enfoque de MFA proporciona una opcion para la evaluacion de un efecto fenotfpico de una inactivacion (despues de la etapa de fijacion de objetivo), a continuacion, exposicion a una primera recombinasa para restablecer el exon inactivado o gen o region del mismo, evaluando el efecto fenotfpico del restablecimiento - es decir, la conversion de nuevo al tipo salvaje (una etapa equivalente a un ensayo de complementacion, pero desprovisto del requisito de generar una nueva lfnea de ratones transgenicos, un requisito que ha acompanado tradicionalmente el analisis de complementacion), luego exponiendo opcionalmente a la segunda recombinasa para restablecer la inactivacion y evaluando el efecto fenotfpico de restablecer el alelo nulo. Por lo tanto, el alelo de MFA combina un enfoque de inactivacion-primera verdadera con la versatilidad de elementos adicionales (condicionales), y la capacidad de realizar un analisis del tipo de complementacion verdadero en un animal geneticamente modificado, en un protocolo que comprende una unica etapa de fijacion de objetivo.
En una aplicacion del MFA, se describe un metodo para un ensayo de complementacion, que comprende fijar como objetivo un alelo endogeno de una celula con un MFA de acuerdo con la invencion, a continuacion, en una etapa posfijacion de objetivo, generar un alelo condicional nulo a partir del MFA (por exposicion a una primera recombinasa), en donde la secuencia de nucleotidos de interes en el MFA comprende un exon o un exon mas secuencia circundante, u otra region de interes (asociada, por ejemplo, con un fenotipo) en la orientacion sentido, y evaluar el efecto fenotfpico del alelo condicional nulo (que deberfa ser de tipo salvaje). En una realizacion adicional, el MFA se expone, ademas, a una segunda recombinasa que restablece la nulidad y, opcionalmente, se mide de nuevo un efecto fenotfpico. En una realizacion especffica, la segunda recombinasa tambien dispone un informador condicional (p. ej., un COIN) en la orientacion sentido, en donde el informador condicional informa de la conversion del alelo condicional nulo en un alelo nulo o, en su caso, informa del restablecimiento de nulidad.
En una realizacion, la NSI comprende un exon y una secuencia intronica vecina, o una region de exon-intron de un gen diana. En otra realizacion, la NSI comprende una region que codifica un ARNnc, microARN, racimo de microARN u otro(s) ARnc pequenos.
Los MFAs son alelos que se pueden disponer de forma aleatoria o fijar como objetivo a un lugar de eleccion en un genoma. El MFA esta tratado por ingenierfa genetica para producir alelos nulos, condicionales o una combinacion de alelos condicionales/nulos, mediante una disposicion juiciosa de las secuencias entre una serie de pares de sitios de reconocimiento de recombinasas especfficas del sitio cognatas. Los alelos resultantes, producidos por la disposicion de construcciones en un genoma son manipulables por parte de recombinasas seleccionadas, que pueden ser introducidas en la construccion en el genoma de forma transitoria o a traves de crfa de un animal que comprende la construccion en su genoma con un animal que comprende un gen para una recombinasa seleccionada (p. ej., una cepa que expresa Cre, Flp o PhiC31\int).
En diversas realizaciones, se proporcionan metodos y composiciones para generar un alelo de inactivacion-primera verdadero, en que la nulidad no depende de la realizacion de una segunda etapa tal como, p. ej., la separacion de un "exon crftico" o una "region crftica", por la accion de una recombinasa. De acuerdo con ello, se proporcionan realizaciones para generar en una unica etapa de fijacion de objetivo un alelo que es multifuncional, ya que es un alelo de inactivacion-primera verdadero con un informador, logrado en una sola etapa de recombinacion y de fijacion de objetivo.
Los metodos y composiciones para generar alelos inactivados por el enfoque de MFA no estan limitados por un requisito de generar un desplazamiento de marco a traves de la delecion de la inversion de un exon crftico para generar un alelo nulo, tal como se requiere por algunos tipos de alelos inactivados (p. ej., KO-primera o algunas realizaciones de FIEx). En su lugar, el metodo de MFA se basa en su capacidad de separar la NSI de la unidad de transcripcion del gen diana en el momento de la fijacion de objetivo, al tiempo que simultaneamente reemplaza la expresion de la NSI con la de una secuencia de accionamiento. La secuencia de accionamiento puede comprender un elemento tipo GT (p. ej., un informador tal como SA-lacZ-poliA), un ADNc, un exon o exones, elementos reguladores (p. ej., potenciadores, aisladores, operadores). Dado que la secuencia de accionamiento esta definida por el experimentador, los alelos que no sean nulos se pueden hacer igualmente bien. Por ejemplo, la secuencia de accionamiento puede codificar un gen negativo dominante o un gen constitutivamente activo o una forma activada de un gen.
En diversas realizaciones, el MFA comprende una secuencia de nucleotidos de interes y un COIN que estan cada uno en orientacion antisentido en el alelo resultante, y que comprenden, ademas, una secuencia de accionamiento y/o una DSC tanto en orientacion sentido en el alelo (o en orientaciones sentido y antisentido, o cada uno de forma independiente en orientacion sentido o antisentido), con lo cual tras la exposicion a una primera recombinasa se suprimen la secuencia de accionamiento y/o la DSC, la secuencia de nucleotidos de interes se invierte a una orientacion sentido y el COIN se mantiene en la orientacion antisentido. El alelo comprende, ademas, sitios de recombinacion situados con el fin de permitir la inversion simultanea posterior por una segunda recombinasa de la
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secuencia de nucleotidos de interes y el COIN, de manera que tras la accion de la segunda recombinasa, la secuencia de nucleotidos de interes se dispone en orientacion antisentido y el COIN se dispone en orientacion sentido. En una realizacion adicional, el nucleotido de interes se suprime tras el tratamiento con la segunda recombinasa, dejando al COIN en la orientacion sentido. En una realizacion especffica, el COIN es un informador o una DSC. En otra realizacion especffica, el nucleotido de interes es un exon o region de interes de un gen de una especie (p. ej., exon de raton, rata, primate no humano o ser humano) y el COIN es un exon de un gen de otra especie (p. ej., exon de raton, rata, primate no humano o ser humano).
El enfoque de MFA tambien permite un enfoque de atrapamiento de genes. En esta realizacion del enfoque de MFA, un MFA se inserta en un locus transcripcionalmente activo. Esto puede conseguirse por recombinacion aleatoria, o por "atrapamiento fijado como objetivo" (vease, p. ej., la patente de EE. UU. N° 7.473.557). Una secuencia de accionamiento precedida por un aceptor de corte y empalme y una region de corte y empalme y seguida por una senal de poliA proporciona una inactivacion o "derribo" de cualquier secuencia genomica transcrita existente. La inclusion de una DSC sin promotor, es decir, una cuya expresion depende de la insercion dentro de la cadena sentido de un locus transcripcionalmente activo, asegura la seleccion positiva de celulas que contienen el MFA. La inclusion de una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) en orientacion antisentido, junto con un COIN en orientacion antisentido, en union con una disposicion recomendada de sitios de reconocimiento de recombinasas especfficas del sitio, proporciona la capacidad de expresar condicionalmente la NSI (a partir del promotor del locus atrapado), tras la exposicion a una primera recombinasa. Despues, tras la exposicion a una segunda recombinasa, la expresion de la NSI se puede desactivar y al mismo tiempo reemplazar por la del COIN. La DSC sin promotor asegurara que cualquier celula seleccionada tenga la capacidad de expresar la NSI sin promotor y el COIN sin promotor, y que la expresion se hara de acuerdo con el patron de expresion endogena del locus transcripcionalmente activo.
Ciertos enfoques ventajosos utilizando MFAs se describen convenientemente en relacion con realizaciones particulares (es decir, con referencia a alelos que comprenden sitios especfficos denominados recombinasa y secuencias de nucleotidos tal como se muestra en las figuras) para conveniencia y no a modo de limitacion, es decir, recombinasas y sitios de reconocimiento de recombinasa, secuencias de accionamiento, informadores, DSCs y secuencias de nucleotidos de interes adecuados pueden ser rutinariamente elegidos basandose en la descripcion en esta memoria. La "secuencia de nucleotidos de interes" o "NSI" puede ser cualquier secuencia de nucleotidos de interes, p. ej., un exon, un exon mas secuencia(s) flanqueante(s), dos o mas exones, un fragmento de una secuencia codificadora, una secuencia codificadora completa, un elemento regulador o secuencia, una secuencia codificadora no proteica, un intron, o cualesquiera de sus combinaciones, etc. Los COINs pueden comprender ADNcs, asf como secuencias codificadoras que no son protefnas y pueden incorporar elementos tales como senales y sitios de poliadenilacion, microARNs u otros ARNs codificadores no proteicos, IRES, peptidos de salto del codon, y cualquier combinacion de los mismos. Determinados COINs y algunos sistemas para utilizar los mismos puede encontrarse, p. ej., en la patente de EE. UU. N° 7.205.148.
Se proporcionan metodos y composiciones para producir y utilizar MFAs en cualquier celula, incluyendo celulas animales no humanas y en animales no humanos. Los metodos y las composiciones se pueden emplear utilizando la recombinacion homologa (o integracion aleatoria) para disponer alelos utiles en cualquier sitio seleccionado (o sitio aleatorio) en el genoma de una celula. Los metodos y las composiciones se pueden utilizar en celulas pluripotentes, pluripotentes inducidas y totipotentes. Celulas adecuadas para su uso con los metodos y las composiciones incluyen celulas ES, p. ej., de raton, o celulas ES de rata. En diversos casos, se describen alelos de KO-primera verdaderos que otorgan una opcion para una funcionalidad condicional con una funcion de informador integrada.
En la FIG. 2 se ilustra un ejemplo de como se puede disenar una disposicion de elementos y sitios de reconocimiento de recombinasa para crear una construccion que eliminaran la funcion del gen diana (es decir, crearan un alelo nulo), o para alterar la funcion del gen diana (p. ej., convirtiendolo en un alelo dominante negativo, constitutivamente activo o hipomorfico), mientras que al mismo tiempo integran todos los elementos aguas abajo que permitiran (a) la generacion de un alelo condicional, y (b) su inversion a un nulo con un informador.
La FIG. 2 muestra una realizacion de un MFA que se puede disponer en un genoma (p. ej., se muestran utilizando brazos de homologfa a la izquierda y derecha de la MFA). La posfijacion de objetivo, el alelo resultante se puede convertir en un alelo condicional, lo cual se logra mediante la eliminacion de una primera secuencia seleccionada y la inversion de una segunda secuencia seleccionada. La delecion y la inversion se pueden conseguir por la misma recombinasa o una recombinasa diferente. Por ejemplo, se pueden utilizar dos pares de sitios de reconocimiento Flp incompatibles - uno para dirigir la delecion y el otro para dirigir la inversion. Un ejemplo de dos de tales sitios Flp son sitios FRT y sitios FRT3. En otro ejemplo, se pueden utilizar dos pares de sitios Cre incompatibles, p. ej., loxP y lox2372- uno para dirigir la delecion y el otro para dirigir la inversion. Ademas, se pueden utilizar dos recombinasas diferentes (p. ej., un par de sitios loxP con Cre y un par de sitios FRT con Flp). Para esta realizacion se pueden elegir cualesquiera sitios adecuados, siempre que los sitios puedan dirigir la delecion e inversion de pares de sitios de recombinasa del MFA mostrado en la FIG. 2 (realizaciones especfficas que se muestran en la FIG. 5 y la FIG. 6).
Aunque el diseno de construccion de la FIG. 2 se puede utilizar con cualquiera de las secuencias de interes (es decir, NSI es cualquier secuencia de interes), el diseno de la construccion puede ser particularmente util para reemplazar un exon de interes por un exon modificado.
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En una realizacion, la NSI es un exon (o exones) que se produce de forma natural, y el COIN es un exon modificado (p. ej., un exon que comprende una mutacion). El MFA se dispone en un genoma de, p. ej., una celula ES de raton mediante, p. ej., la recombinacion homologa (utilizando brazos de homologfa de raton adecuados) y la celula ES se emplea para producir un raton geneticamente modificado que comprende la construccion en la lfnea germinal del raton. En una realizacion, el cambio de estado del exon que se produce de forma natural al exon modificado se consigue por la accion de una recombinasa en el MFA.
En una realizacion, la construccion se dispone en un genoma de, p. ej., un raton, y el raton comprende, ademas, una recombinasa (p. ej., Cre) cuya actividad se puede regular. Una recombinasa puede ser regulada, p. ej., empleando una protefna de fusion que dispone la recombinasa bajo el control de un efector o metabolito (p. ej., CreER, cuya actividad esta controlada positivamente por tamoxifeno), disponiendo la recombinasa bajo el control de un promotor especffico para el tejido, o disponiendo la recombinasa bajo el control de un promotor (u otro elemento regulador) que es activo en una fase particular del desarrollo (p. ej., un promotor Nanog), o un promotor inducible (p. ej., uno cuya actividad esta controlada por doxiciclina y TetR o variantes de TetR ), o combinaciones de estas tecnologfas.
La realizacion de MFA mostrada en la FIG. 2 porta elementos que comprenden una secuencia que codifica una secuencia de accionamiento, una DSC, una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) y un COIN, en donde los elementos estan dispuestos entre una serie de sitios de reconocimiento de recombinasa que se seleccionan con el fin de proporcionar una funcionalidad deseada al MFA.
La parte superior de la FIG. 2 ilustra una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) en un genoma de eleccion (p. ej., una NSI en un genoma de raton). Un MFA tal como el mostrado se introduce en el genoma, p. ej., mediante recombinacion homologa para reemplazar la NSI. La NSI es reemplazada por el MFA mostrado, en que la NSI del MFA se invierte tal como se muestra y, por lo tanto, ya no se incorpora en la transcripcion del gen diana. La presencia del MFA puede ser convenientemente confirmada si la secuencia de accionamiento contiene un informador (p. ej., un lacZ). Una DSC esta presente tambien, para ayudar en la seleccion de celulas modificadas (p. ej., celulas ES de raton modificadas con el MFA).
El MFA de la realizacion de la FIG. 2 comprende cinco unidades distintas de la secuencia, que se definen por cinco conjuntos de sitios de reconocimiento de recombinasa. La FIG. 3 contiene una representacion conceptual de las cinco unidades de secuencia distintas flanqueadas por sitios de reconocimiento de recombinasas compatibles.
La primera unidad recombinable distinta comprende sitios R1/R1' (p. ej., sitios FRT3) en orientacion opuesta (es decir, dirigiendo una inversion), en donde entre los sitios R1/R1' esta dispuesto lo siguiente: una secuencia de accionamiento (una region 3' de corte y empalme y aceptor 5' con respecto a la secuencia de accionamiento, y una senal poliA 3' con respecto a la secuencia de accionamiento, no se muestran en la FIG. 3 en aras de la simplicidad), un sitio R2 (p. ej., un sitio Rox), una DSC, un sitio R3 (p. ej., un sitio FRT) en la misma orientacion que el sitio R1, un sitio de R4 (p. ej., un sitio loxP) y una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) en orientacion antisentido con respecto a la direccion de la transcripcion (es decir, codificada por la cadena antisentido) del gen diana, y un sitio R5 (p. ej., un sitio lox2372) en la misma orientacion que el sitio r4. En los casos en los que un sitio R3' (en orientacion opuesta del sitio R3 mostrado en la FIG. 3A) se incluye adicionalmente aguas abajo del sitio 3' R1', la unidad en presencia de una recombinasa que reconoce R1/R1' invertira la NSI a una posicion para la transcripcion y suprimira la secuencia de accionamiento y la DSC. En una realizacion, una secuencia adicional incluye un COIN dispuesto en la cadena antisentido y es seguida por un sitio R4' (p. ej., un sitio loxP) que esta en orientacion opuesta con respecto al sitio R4 de la unidad, de manera que tras la exposicion a una recombinasa que reconoce R4/R4' (p. ej., Cre), el COIN se invierte de manera que la secuencia codificadora del COIN esta ahora en posicion para la transcripcion aguas abajo de la NSI.
La segunda unidad recombinable distinta (FIG. 3B) comprende sitios R2/R2' (p. ej., sitios Rox) en la misma orientacion (es decir, dirigiendo una delecion), que comprende las siguientes secuencias dispuestas entre los sitios R2/R2': una DSC, un primer sitio R3 (p. ej., un primer sitio FRT) en la misma orientacion que el sitio R1 de la primera unidad recombinable distinta, un primer sitio R4 (p. ej., un primer sitio loxP), un NSI en orientacion invertida (es decir, antisentido) con respecto al gen diana, un primer sitio R5 (p. ej., un primer sitio lox2372) en la misma orientacion con respecto al sitio R4, un sitio R1' (p. ej., un segundo sitio FRT3) y un sitio R3' (por ejemplo, un segundo sitio FRT), ambos en orientacion opuesta al sitio R3, un COIN (en orientacion antisentido con respecto a la transcripcion del gen diana), un sitio R5' (p. ej., un segundo sitio lox2372) en la misma orientacion que el sitio R5, y un sitio R4' (p. ej., un segundo sitio loxP) en la misma orientacion que R4. Esta segunda unidad recombinable distinta es escindible por una recombinasa que reconoce R2/R2'. Cuando se incluye en el MFA, esta unidad puede ser escindida para dejar atras una secuencia de accionamiento (p. ej., en algunas realizaciones un informador, p. ej., una secuencia que codifica lacZ), flanqueada por un sitio R1 y un sitio R2 o R2'.
La tercera unidad recombinable distinta (FIG. 3C) comprende sitios R3/R3' (p. ej., sitios FRT) en orientacion opuesta (es decir, dirigiendo una inversion), que comprende las siguientes secuencias dispuestas entre los sitios R3/R3': un sitio R4 (p. ej., un sitio loxP), una NSI en orientacion invertida (es decir, antisentido) con respecto a la transcripcion del gen diana, un sitio R5 (p. ej., un sitio lox2372) en la misma orientacion que el sitio R4 de la unidad (es decir, de la FIG. 3C) y un sitio R1' (p. ej., un sitio FRT) en la orientacion opuesta al sitio R3. Esta unidad puede ser invertida por
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la accion de una recombinasa que reconoce R3/R3' (p. ej., una recombinasa Flp, en que los sitios R3/R3' son sitios FRT), lo que resulta en la disposicion de la NSI en la orientacion apropiada para la transcripcion y la traduccion.
La cuarta unidad recombinable distinta (FIG. 3D) comprende sitios R4/R4' (p. ej., dos sitios loxP) en la misma orientacion (es decir, dirigiendo una delecion), que comprende las siguientes secuencias dispuestas entre los sitios R4/R4': una NSI en orientacion invertida (es decir, antisentido), un sitio R5 (p. ej., un primer sitio lox2372) y un sitio R1' (p. ej., un sitio FRT3) y un sitio R3' (p. ej., un sitio FRT) cada uno en la misma orientacion con respecto al sitio R4, un COIN (en orientacion antisentido) y un sitio R5' (p. ej., un segundo sitio lox2372) en la misma orientacion que el sitio R5. En presencia de una recombinasa que reconoce R4/R4' (p. ej., Cre si R4/R4' son sitios loxP, p. ej.), esta unidad es escindible. Si se dispone dentro del MFA y se expone a la recombinasa R4/R4' (en ausencia de exposicion a una recombinasa que reconoce R1/R1', R3/R3'), esta unidad se suprimira y dejara la secuencia de accionamiento (p. ej., en algunas realizaciones un informador, p. ej., una secuencia que codifica lacZ) y la DSC. Por lo tanto, esta unidad permite una realizacion en la que el MFA, cuando se reemplaza una secuencia en un genoma (p. ej., reemplazando un exon), puede actuar en presencia de una recombinasa que reconoce R4/R4' como un alelo nulo que comprende una secuencia de accionamiento y una DSC. La DSC del MFA se puede separar, si se desea, tras la accion de una recombinasa que reconoce R2/R2' (p. ej., una recombinasa Dre en que R2/R2' son sitios Rox) debido a que la DSC esta flanqueado aguas arriba y aguas abajo por sitios R2/R2' en la misma orientacion.
La quinta unidad recombinable distinta (FIG. 3E) comprende sitios R5/R5' (p. ej., dos sitios lox2372) en la misma orientacion (es decir, dirigiendo una delecion), asf como en la misma orientacion de los sitios R4/R4' de la cuarta unidad recombinable distinta, que comprende las siguientes secuencias dispuestas entre los sitios R5 y R5': un sitio R1' (p. ej., un sitio FRT3) y un sitio R3' (p. ej., un sitio FRT) en la misma orientacion uno con respecto al otro, pero en orientacion opuesta al sitio R1 de la primera unidad recombinable distinta, y un COIN (en orientacion antisentido) con respecto a la transcripcion del gen diana.
Como reconoceran los expertos en la tecnica, las unidades recombinables solapantes estan descritas de esta forma para transmitir la estructura del MFA, en lugar de limitar los posibles elementos recombinables en el MFA. Por ejemplo, los expertos en la tecnica reconoceran que cada una de las unidades recombinables comprende sitios de recombinacion especfficos del sitio dentro de la unidad recombinable, y que la accion de una recombinasa en los sitios (a traves de unidades recombinables) alcanza manipulaciones deseadas y descritas del MFA que logran funciones previstas del MFA. Por ejemplo, con referencia a la FIG. 3, la accion de una recombinasa que reconoce R1/R1' y R3/R3' funciona para manipular porciones de todas las cinco unidades recombinables tal como se muestra conceptualmente en la FIG. 3.
Una vez que un MFA se dispone en un lugar deseado en un genoma, puede ser tratado mediante ingenierfa genetica de tal manera que proporciona un alelo nulo con una funcion informadora, en donde el alelo nulo se puede volver a modificar (en la etapa de posfijacion de objetivo, etapa mediada por recombinasa) de modo que carezca de todas las secuencias flanqueadas con sitios de reconocimiento de recombinasa orientadas en la misma direccion. Un ejemplo de esta realizacion se muestra en la FIG. 4, que muestra ejemplos de sitios de reconocimiento de recombinasa adecuados, en donde todos los elementos distintos de la secuencia de accionamiento (aquf, que codifica lacZ) estan flanqueados aguas arriba y aguas abajo por sitios Rox. Tras la exposicion a la recombinasa Dre, solo la secuencia de accionamiento esta presente. La escision de las secuencias con sitios Rox puede ser confirmada por la perdida de la DSC (aquf, conteniendo neor), y/o la perdida del COIN y/o la perdida de la NSI. El resultado es un alelo nulo verdadero que carece de DSC, NSI y COIN.
Se puede utilizar un MFA tal como se ilustra en la FIG. 2 y como se ejemplifica en la parte superior de la FIG. 3 para crear un alelo condicional. Un alelo condicional se puede generar mediante la seleccion de la recombinasa apropiada con la cual se expone el alelo en primera instancia. La recombinasa apropiada en esta realizacion es una recombinasa que invierte la NSI de nuevo a la cadena sentido y abandona el COIN en la orientacion antisentido. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la exposicion del MFA a una recombinasa que reconoce R1/R1' y tambien R3/R3' (p. ej., una recombinasa Flp, en donde R1/R1' y R3/R3' se seleccionan de sitios FRTy FRT3; vease la Fig. 5 para una realizacion particular). En pocas palabras, una vez que un MFA se dispone en un lugar deseado en un genoma, se puede utilizar para generar un alelo condicional, en donde la NSI invertida de la FIG. 2 y la parte superior de la FIG. 3 estan dispuestas en una orientacion para la transcripcion del gen diana, mientras que deja el COIN en orientacion antisentido y se suprime la secuencia de accionamiento y la DSC. Un ejemplo de esta realizacion se muestra en la FIG. 5, en que una secuencia de accionamiento que contiene un lacZ y una DSC que contiene neor se separan exponiendo primero el alelo a la recombinasa Flp, provocando una inversion de elementos dirigida por sitios FRT3, seguido por la delecion mediada por Flp dirigida por sitios FRT. El alelo resultante presenta la NSI en una orientacion para la transcripcion, pero deja el COIN en la orientacion antisentido.
Tal como se muestra en la FIG. 6, se puede lograr el mismo alelo condicional si la inversion mediada por Flp se produce primero a traves de sitios FRT (como en la FIG. 5) o sitios FRT3 (como en la FIG. 6).
En la realizacion que genera un alelo condicional, sitios de recombinasa que permanecen en el alelo se seleccionan de manera que el tratamiento con una o mas recombinasas adecuadas resulta en la posterior delecion de la NSI (o re-inversion de la NSI) y la inversion del COIN, de manera que el alelo resulta en un alelo nulo con respecto a la NSI, pero tambien coloca al COIN en la orientacion para la transcripcion. Un ejemplo de esto se muestra utilizando sitios
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loxP y lox2372, cada uno de los cuales dirige de forma independiente la recombinacion mediada por Cre. Aunque se utilizan los sitios Cre-reactivos, pueden utilizarse cualesquiera sitios adecuados en lugar de los sitios Cre.
Tal como se muestra en la FIG. 7, la NSI en orientacion sentido (es decir, en la posicion para la transcripcion y la traduccion) esta dispuesta 3' con respecto a un primer sitio lox2372. Despues de la NSI, se encuentra un primer sitio loxP en la misma orientacion que el primer sitio lox2372, y un COIN invertido (es decir, antisentido) esta dispuesto aguas abajo del primer sitio loxP, y el COIN invertido dispuesto aguas arriba de un segundo sitio lox2372 en orientacion opuesta con respecto al primer sitio lox2372. Dispuesto aguas abajo del segundo sitio lox2372 se encuentra un segundo sitio loxP dispuesto en una orientacion opuesta con respecto al primer sitio loxP. Esta disposicion permite, tras el tratamiento con Cre, la inversion a traves de cualquiera de los sitios lox seguido de su delecion a traves de cualquiera de los sitios lox (vease la FIG. 7). El alelo resultante contiene un COIN en orientacion sentido, es decir, en la posicion para la transcripcion y la traduccion.
En una disposicion alternativa (vease la FIG. 8), un sitio loxP esta dispuesto 5' con respecto a la NSI (en lugar de dispuesto entre la NSI y el COIN), de manera que la exposicion a Cre resulta en la inversion de la NSI a la orientacion antisentido y el COIN a la orientacion sentido.
El enfoque del MFA proporciona opciones para muchas realizaciones. En una realizacion especffica, tras la exposicion a la primera recombinasa, la disposicion de elementos y sitios de recombinasa son como se muestra en la construccion de la parte inferior de la FIG. 5 o la FIG. 6, en donde el sitio FRT3 tal como se muestra es el sitio R1 que no tiene un sitio cognato en el alelo resultante, el sitio FRT tal como se muestra es un sitio R3 de recombinasa que no tiene un sitio cognato en el alelo resultante, el sitio lox2372 mas a la izquierda es el sitio R5 que se empareja con un sitio R5' de recombinasa cognato que ocupa el sitio lox2372 mas a la derecha tal como se muestra, el sitio loxP mas a la izquierda tal como se muestra es el sitio R4 que se empareja con un sitio R4' de recombinasa cognato proporcionado por el sitio loxP mas a la derecha tal como se muestra, y el sitio Rox tal como se muestra es el sitio R2 que no tiene un sitio de recombinasa cognato en el alelo resultante.
En una realizacion especffica, tras la exposicion a la segunda recombinasa, la disposicion de elementos y sitios de recombinasa del alelo resultante es como se muestra en la construccion de la parte inferior de la FIG. 7, en donde el sitio FRT3 mostrado es el sitio R1 que no tiene un sitio cognato en el alelo resultante, el sitio lox2372 es el sitio R5 que no esta emparejado con un sitio de recombinasa cognato en el alelo resultante, el sitio FRT mostrado es el sitio R3 que no esta emparejado con un sitio de recombinasa cognato en el alelo resultante, el sitio loxP tal como se muestra es el sitio R4 que no esta emparejado con un sitio recombinasa cognato en el alelo resultante, y el sitio Rox tal como se muestra es el sitio R2' que no esta emparejado con un sitio de recombinasa cognato en el alelo resultante.
En una realizacion especffica, el alelo resultante permite la expresion del COIN tras la exposicion a la segunda recombinasa. En una realizacion especffica, el COIN es un informador o una DSC.
Se describe un MFA que comprende un COIN, una NSI, una DSC, un informador y sitios de recombinasa que estan dispuestos de manera que la accion por una recombinasa escindira el COIN, la NSI y la DSC, pero no el informador (FIG. 11 B), mientras que la accion con una recombinasa diferente generara un alelo que carece de la DSC, pero que dispone la NSI en orientacion sentido, al tiempo que mantiene el COIN en orientacion antisentido (FIG. 11C). Este alelo resultante tiene sitios de recombinasa dispuestos de modo que la accion tal por una recombinasa adicional escindira la NSI y dispondra el COIN en orientacion sentido (FIG. 11D). Por lo tanto, en las realizaciones comentadas, este MFA permitira la seleccion de una inactivacion verdadera con una funcion de informador y la separacion de la DSC, o la colocacion de una NSI, en donde la posterior separacion de la NSI se confirma por la disposicion concomitante de un COIN en orientacion sentido. Un diagrama esquematico de algunas unidades de recombinasa solapantes se muestra en la FIG. 11A para un alelo de este tipo, con las unidades de recombinasa representadas por formas de trazos discontinuos.
Se describe un MFA que comprende un COIN, una NSI, una DSC, un informador y sitios de recombinasa que estan dispuestos de modo que la accion por una recombinasa escindira la NSI y la DSC, pero mantendra la orientacion del informador y el COIN (Fig. 12B), mientras que la accion con una recombinasa diferente generara un alelo que carece de la DSC y el informador, pero que dispone la NSI en la orientacion sentido, mientras mantiene el COIN en orientacion antisentido (Fig. 12C). Este alelo resultante tiene sitios de recombinasa dispuestos de modo que la accion por una recombinasa adicional escindira la NSI y dispondra el COIN en orientacion sentido (FIG. 12D). Por lo tanto, en las realizaciones comentadas, este MFA permitira la seleccion de una inactivacion verdadera con una funcion de informador y la separacion de la DSC; o la disposicion de una NSI, en donde la posterior separacion de la NSI se confirma por la disposicion concomitante de un COIN en orientacion sentido. Un diagrama esquematico de algunas unidades de recombinasa solapantes se muestra en la FIG. 12A para un alelo de este tipo, con las unidades de recombinasa representadas por formas de trazos discontinuos.
Se describe un MFA que comprende un COIN, una NSI, una DSC, un informador y sitios de recombinasa que estan dispuestos de manera que la accion por una recombinasa escindira el informador y la DSC y dispondra la NSI en orientacion sentido (FIG. 13B). Este alelo resultante tiene sitios de recombinasa dispuestos de modo que la accion por una recombinasa adicional dispondra la NSI en orientacion antisentido, al tiempo que dispondra el COIN en
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orientacion sentido (FIG. 13C). Por lo tanto, en las realizaciones comentadas, este MFA permitira la creacion de un alelo condicional a partir de un MFA.
Se describe un MFA que comprende un COIN, una NSI, una DSC, un informador y una serie diferente de sitios de recombinasa que estan dispuestos de manera que la accion por una recombinasa seleccionada escindira el informador y la DSC y dispondra la NSI en orientacion sentido (FIG. 14B). Este alelo resultante tiene sitios de recombinasa dispuestos de modo que la accion por una recombinasa adicional dispondra la NSI en orientacion antisentido, al tiempo que dispondra el COIN en orientacion sentido (FIG. 14C). Por lo tanto, este MFA permitira la creacion de un alelo condicional a partir de un MFA.
Se describe un MFA que comprende una NSI, una DSC, un informador, un COIN y sitios de recombinasa que estan dispuestos de manera que la accion por una recombinasa seleccionada escindira el informador y la DSC y dispondra la NSI en orientacion sentido, al tiempo que mantendra el COIN en orientacion antisentido (FIG. 15B). Este alelo resultante tiene sitios de recombinasa dispuestos de modo que la accion por una recombinasa adicional dispondra la NSI en orientacion antisentido, al tiempo que dispondra el COIN en orientacion sentido (FIG. 15C). Por lo tanto, este MFA permitira tambien la creacion de un alelo condicional a partir de un MFA.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: MFA Hprtl
Hprtl es un gen que esta ligado a X en ratones, y celulas ES Hprtl-nulo son resistentes al analogo de nucleobase 6- tioguanina (6-TG). Esta propiedad proporciona un test fenotfpico facil y robusto, ya que las celulas que son de tipo salvaje para Hprtl mueren en presencia de 6-TG, mientras que las celulas que son nulas para Hprtl sobreviven. Adicionalmente, si se fijan como objetivo celulas ES que se derivan de blastocistos masculinos (como es tfpicamente el caso, y es tambien el caso para la mayorfa de las lfneas celulares ES actualmente en uso para la fijacion de objetivo), se necesita entonces una sola ronda de fijacion de objetivo para generar celulas ES HPRT1MFA/Y. Con el fin de generar celulas ES HPRT1MFA/Y, un MFA en un vector de fijacion de objetivo de acuerdo con el alelo mostrado en la FIG. 5 (parte superior), se prepara mediante la metodologfa de ingenierfa genetica estandar y recombinacion homologa bacteriana de acuerdo con el metodo VELOCIGENE® descrito en la Patente de EE. UU. N° 6.586.251 y en Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. El alelo Hprt1MFA esta disenado en torno al exon 3, que define el exon 3 y la secuencia conservada intronica directamente 5' y 3' de la misma como la NSI (FIG. 9). La razon de esta eleccion radica en que el exon 3 comienza en marco 2 (f2) y termina en el marco 0 (Z0); por extension, el exon precedente (es decir, el exon 2) termina en el marco 2 (f2) y el siguiente exon (es decir, el exon 4) comienza en el marco 0 (f0). Esto significa que si esta NSI se invierte en la orientacion antisentido, entonces el exon 2 se desplaza fuera del marco con respecto al exon 4, porque el exon 2 termina en f2 y el exon 4 comienza en f0. De esta manera, si en el alelo Hprt1MFA existe alguna transcripcion mas alla de la secuencia de accionamiento - SA-lacZ-poliA (FIG. 10) - y tambien existe un corte y empalme que separa la secuencia de accionamiento del ARNm final, ese ARNm no comprendera el exon 3 y codificara una secuencia sin sentido, dando lugar efectivamente a un ARNm y fenotipo Hprt1-nulo. Por el contrario, para el alelo Hprt1C0IN-INV (generado por el tratamiento de Hprt1MFA con FLP o variantes de FLP para generar primero el alelo Hprt1C0IN, a continuacion, mediante el tratamiento con Cre, para generar Hprt1Ca -INV) si existe una transcripcion despues de SA-eGFP-poliA del elemento COIN (FIG. 10), y existe tambien un corte y empalme que separa la secuencia SA-eGFP-poliA del ARNm final, ese ARNm no comprendera el exon 3 y, por lo tanto, codificara una secuencia sin sentido, dando efectivamente lugar a un ARNm y fenotipo Hprt1-nulo.
La NSI orientada antisentido es el exon 3 y rodea a la secuencia intronica conservada evolutivamente de Hprt1 (FIG. 9), y el COIN orientado antisentido es un SA-eGFP-poliA. El vector de fijacion de objetivo tiene un brazo de homologfa de raton aguas arriba del primer sitio FRT3 y aguas abajo del segundo sitio Rox que dirigen la fijacion de objetivo en el locus Hprt1 de modo que es reemplazado por su version MFA, por lo que (a) un elemento SA-LacZ- poliA en la orientacion sentido con respecto a la direccion de la transcripcion de Hprt1, seguido de una DSC en la orientacion antisentido con respecto a la direccion de la transcripcion de Hprt1, tanto el exon 3 de Hprt1 precedente, (b) el exon 3 se dispone en la orientacion antisentido con respecto a la direccion de la transcripcion de Hprt1, y (c) un elemento COIN se dispone en la orientacion antisentido con respecto a la direccion de la transcripcion de Hprt1 aguas abajo del exon 3, y en que estos diferentes elementos estan flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasa especffica del sitio, dispuestos juntos en unidades recombinables tal como se detalla en la FIG. 3 y la FIG. 10, siendo SA-lacZ-poliA la secuencia de accionamiento, y siendo la NSI el exon 3 mas secuencias intronicas flanqueantes de Hprt1.
El vector de fijacion de objetivo se prepara y se electropora en celulas ES de acuerdo con el metodo VELOCIGENE® descrito en la Patente de EE. UU. N° 6.586.251 y en Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Las celulas ES resultantes portan el alelo MFA de Hprt1 en lugar de la version de tipo salvaje de Hprt1. Antes de cualquier modificacion adicional las celulas ES Hprt1MFA/Y son resistentes al tratamiento con 6-TG (porque son efectivamente nulas para Hprt1), demostrando la utilidad del metodo de MFA para generar un alelo de inactivacion- primera verdadero. Despues del tratamiento con Dre, esta propiedad se conserva, mientras que el genotipo de las celulas se convierte en Hprt1SA~LacZ~poliA/Y. A pesar de que para el locus Hprt1 esta modificacion no puede alterar ni el
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nivel de expresion del informador (LacZ) ni tiene consecuencias fenotfpicas algunas (altera la resistencia a 6-TG), esto puede no ser el caso para otros loci. Despues del tratamiento con FLP o variantes de FLP, en una etapa que es efectivamente equivalente a un ensayo de complementacion, las celulas ES Hprt1MFA/Y se convierten en celulas ES Hprt1COIN/Y que son efectivamente de tipo salvaje y, por lo tanto, sensibles a 6-TG. Ademas, esta operacion restablece la expresion del mensaje Hprtl de nuevo a su identidad de tipo salvaje. Despues del tratamiento con Cre, las celulas ES Hprt1COIN/Y se convierten en celulas ES Hprt1COIN-NV/Y que son efectivamente nulas para Hprtl y, por lo tanto, resistentes a 6-TG. Ademas, esta operacion resulta en la abrogacion de la expresion del mensaje de tipo salvaje del mensaje de Hprt1, y su reemplazo concomitante por un mensaje hfbrido compuesto por el primer exon de Hprt1 y eGFP (codificada por el elemento COIN), generando de este modo un alelo que expresa eGFP en lugar de Hprt1. Esta nueva propiedad, la expresion de eGFP, se puede utilizar opcionalmente para puntuar la inversion del elemento COIN a la cadena con sentido y tiene, ademas, utilidad para permitir el aislamiento de celulas en las que este evento ha tenido lugar a partir de una poblacion de celulas, en donde existen ambos tipos de celulas (celulas ES Hprt1COIN/Y y celulas ES Hprt1COIN-INV/Y). Por lo tanto, no solo el alelo COIN se convierte en nulo, sino que el evento tambien esta marcado por un nuevo evento, facilmente medible y util.
Ejemplo 2: Resultados del MFA Hprtl
Se construyo un MFA que tiene un informador lacZ (SA(adml)-gtx-lacZ-pA) en orientacion sentido, una DSC de neomicina (Neo), una NSI en orientacion antisentido que abarca un exon crftico (ec) para Hprtl (exon 3) y secuencias intronicas flanqueantes conservadas evolutivamente, y un COIN (Gtx-SA-HA-myc3-TM-T2A-GFP-pA) con una disposicion de sitios de recombinasa tal como se muestra en la FIG. 16A. El MFA se electroporalizo en celulas ES FlH4 y se seleccionaron para resistencia a G418. Posteriormente, se genotiparon colonias resistentes a G418 para determinar la fijacion de objetivo. Se obtuvieron cinco clones fijados como objetivo (Hprt1MFA/Y) de un total de 96 colonias rastreadas. Se encontro que los cinco de estos clones sobrevivieron y se propagaron cuando se cultivan en un medio estandar de celulas ES complementado con 6-TG 10 pM (que es el ensayo estandar de supervivencia de 6-TG utilizado), como era de esperar para las celulas que son Hprf1-nulas (Doetschman, T. et al. (1987) Targeted correction of mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells, Nature 330:576-578). Por el contrario, la lfnea celular parental, F1H4, asf como cualquiera de los clones no fijados como objetivo que se testaron, no lograron crecer en presencia de 6-TG. Estos resultados estan de acuerdo con lo que se ha informado anteriormente (Doetschman et al. (1987)).
Tras el tratamiento con recombinasa FLPo (Raymond, C.S .y Soriano, P. (2007) High-efficiency FLP and PhiC31 site-specific recombination in mammalian cells, PLoS ONE 2:e162), el alelo Hprt1MFA se convierte en el alelo Hprt1C0IN (FIG. 16B), dando lugar a celulas ES Hprt1MFA/Y. Esta operacion da como resultado la separacion del informador LacZ, la DSC, asf como el restablecimiento de la re-inversion de la NSI en la cadena sentido. Por lo tanto, el alelo resultante (Hprt1C0IN) es funcionalmente de tipo salvaje, dado que el ARNm de Hprt1 de tipo salvaje es codificado y expresado.
Tras tratamiento adicional con recombinasa Cre (Sauer, B. y Henderson, N. (1988) Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5166 -5170), el alelo Hprt1COIN se convierte en el alelo Hprt1CONI-NV (FIG. 16C), dando lugar a celulas ES Hprt1C0IN-INV/Y. Este alelo (Hprt1C0IN'INV) es funcionalmente nulo, ya que el ARNm de Hprt1 esta reemplazado por uno que codifica eGFP (y tambien carece de la NSI- es decir, el exon 3 de Hprt1 y las secuencias intronicas flanqueantes tal como se define en la fase de diseno).
Celulas que portan el MFA (Hprt1MFA/Y) se sometieron a ensayo para determinar la resistencia al analogo de nucleotido 6-Tg, y se compararon con celulas de tipo salvaje (FIG. 17). Las celulas ES Hprt1MFA/Y sobrevivieron, mientras que las celulas Es Hprt1+/Y murieron, lo que indica que Hprt1MFA/Y son funcionalmente Hprt1-nulas. Celulas ES Hprt1MFA/Y fueron tratadas luego con FLPo, para probar si el alelo Hprt1MFA se convierte en el alelo Hprt1C0IN. Se espera que las celulas ES Hprt1COIN/Y resultantes sean fenotfpicamente de tipo salvaje, dado que se restablece la expresion de Hprt1. Esto ha demostrado ser de hecho el caso, ya que celulas ES Hprt1COIN/Y mueren cuando se cultivan en presencia de 6-TG, al igual que sus homologos de tipo salvaje (Hprt1+/Y). Por ultimo, las celulas ES Hprt1COIN/Y fueron tratadas con Cre para generar celulas ES Hprt1COIN-INV/Y que se predice que seran nulas para Hprt1 dado que el modulo de COIN es activado al tiempo que se suprime simultaneamente el exon 3 de Hprt1 (FIG. 16, Panel C). Cuando se cultivan en presencia de 6-Tg, las celulas ES Hprt1COIN-INV/Y sobrevivieron y proliferaron, confirmando que son funcionalmente nulas para Hprt1, segun lo pretendido por el diseno y la aplicacion del MFA.
Los resultados fenotfpicos obtenidos anteriormente fueron confirmados adicionalmente al nivel de protefnas, mediante la realizacion de transferencias Western de preparaciones de protefnas de celulas ES que pertenecen a cada una de las clases genotfpicas: (Hprt1+/Y ) de tipo salvaje, Hprt1MFA/Y (MFA), Hprt1C0IN/Y (MFA + FLPo) y Hprt1C0IN~INV/Y (MFA + FLPo + Cre). Estas preparaciones de protefnas se examinaron en cuanto al informador y la expresion de NSI (es decir, Hprt1). Celulas Es Hprt1MFA/Ycarecen de la protefna Hprt1, pero expresan el informador (LacZ). En celulas ES Hprt1C0IN/Y, la expresion de Hprt1 es restablecida a niveles de tipo salvaje, lo que refleja la disposicion de la NSI (exon 3 de Hprt1) de nuevo en la orientacion sentido, y no mostro protefna informadora (LacZ), lo que confirma la escision del informador por parte de FLPo. Esto establecio que el alelo Hprt1MFA es de hecho nulo, y se puede convertir en un alelo de tipo salvaje funcional despues de la separacion del informador y la DSC, y la re-
inversion concomitante de la NSI en la cadena sentido (una operacion experimentalmente realizada por FLPo). El hecho de que en el nivel de la expresion de la protema Hprt1 el alelo Hprt1COIN sea identico a la de tipo salvaje (Hprt1+), demuestra adicionalmente la robustez de este metodo para generar un condicional nulo verdadero y realizar el equivalente de un ensayo de complementacion en una etapa posfijacion de objetivo mediada por 5 recombinasa. Por ultimo, las celulas ES Hprt1CO N~INV/Y carecen de la protema Hprtl, lo que confirma efectivamente las observaciones fenotfpicas realizadas utilizando el ensayo de resistencia de 6-TG. Esto confirma, ademas, que el alelo condicional nulo basado en COIN (Hprt1C0IN) funciona segun lo previsto.
Claims (14)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Una construccion de acido nucleico, que comprende:(a) brazos fijadores de objetivo para dirigir la construccion de acido nucleico a un gen diana de un acido nucleico de una celula;(b) una secuencia de accionamiento en orientacion sentido con respecto a la transcripcion del gen diana, y una casete de seleccion de farmacos (DSC) en orientacion sentido o antisentido;(c) en orientacion antisentido, una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) y un COIN (elemento condicional mediante inversion); y(d) unidades recombinables,en donde las unidades recombinables comprenden dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una primera recombinasa, comprendiendo una primera unidad recombinable la secuencia de accionamiento, la DSC y la NSI, en donde la primera unidad recombinable esta flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa, comprendiendo una segunda unidad recombinable la NSI, en donde la segunda unidad recombinable esta flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa, dos segundos pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una segunda recombinasa, y un tercer par de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por una tercera recombinasa; en donde los primeros pares, los segundos pares y los terceros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa son reconocidos por diferentes recombinasas;en donde las unidades recombinables se recombinan tras la exposicion a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que carece de la secuencia de accionamiento y la DSC y contiene la NSI en orientacion sentido y el COIN en orientacion antisentido; yen donde el alelo condicional, cuando se expone adicionalmente a la segunda recombinasa, se recombina para formar un alelo que carece de la NSI y que tiene el COIN en orientacion sentido.
- 2. Un metodo para modificar una celula no humana, que comprende:fijar como objetivo una secuencia de nucleotidos de interes en una celula con una construccion de acido nucleico de la reivindicacion 1 para formar una celula fijada como objetivo, exponer la celula fijada como objetivo a la primera recombinasa para formar el alelo condicional y exponer el alelo condicional a una segunda recombinasa que escinde la NSI y coloca el COIN en orientacion sentido.
- 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la NSI en la celula es un exon o una secuencia de nucleotidos que esta asociada con un fenotipo.
- 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la secuencia de nucleotidos de interes en la celula se reemplaza por la construccion de acido nucleico de la reivindicacion 1.
- 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el fenotipo se determina una primera vez despues de formar la celula fijada como objetivo, pero antes de la exposicion a la primera recombinasa.
- 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el fenotipo se determina una segunda vez despues de la exposicion a la primera recombinasa.
- 7. Una construccion de acido nucleico, que comprende:una casete de seleccion de farmacos (DSC), un informador, un COIN, una secuencia de nucleotidos de interes (NSI) y cinco pares de sitios de recombinasa dispuestos entre el informador, la DSC, el COIN y la NSI;en donde ningun par de sitios de recombinasa es identico a cualquier otro par, y en donde unos primeros dos pares de sitios de recombinasa son reconocidos por la misma primera recombinasa, unos segundos dos pares de sitios de recombinasa son reconocidos por la misma segunda recombinasa y un quinto par de sitios de recombinasa es reconocido por una tercera recombinasa;en donde la primera, segunda y tercera recombinasa no son iguales, y en donde con respecto a la direccion de transcripcion, el informador se encuentra en orientacion sentido, la NSI esta en orientacion antisentido, el COIN esta en orientacion antisentido y la DSC esta en orientacion sentido o antisentido;en donde los sitios de recombinasa estan dispuestos en unidades recombinables que comprenden (i) una primera unidad recombinable que comprende la secuencia de accionamiento, la DSC y la NSI, en donde la primera unidad recombinable esta flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa51015202530cognatos reconocidos por la primera recombinasa; y (ii) una segunda unidad recombinable que comprende la NSI, en donde la segunda unidad recombinable esta flanqueada por un par de los dos primeros pares de sitios de reconocimiento de recombinasa cognatos reconocidos por la primera recombinasa; yen donde los primeros dos pares y los segundos dos pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de modo que tras la exposicion a la primera recombinasa, se forma un alelo modificado, en donde los primeros dos pares de sitios de recombinasa dirigen la escision del informador, la escision de la DSC, la inversion de la NSI a orientacion sentido y el COIN se mantiene en orientacion antisentido, y (a) los segundos dos pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de manera que, tras la exposicion a la segunda recombinasa, la NSI se escinde y el COIN se coloca en orientacion sentido; o (b) los segundos dos pares de sitios de recombinasa estan dispuestos de manera que tras la exposicion a la segunda recombinasa, la NSI se coloca en orientacion antisentido y el COIN se coloca en orientacion sentido.
- 8. Una construccion de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el quinto par de sitios de recombinasa estan dispuestos de manera que, tras la exposicion a la tercera recombinasa y en ausencia de exposicion a la primera o segunda recombinasa, la quinta recombinasa escinde el COIN, la NSI y la DSC, y mantiene al informador en la orientacion sentido.
- 9. Una construccion de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde la construccion de acido nucleico esta insertada en un gen, y con respecto a la direccion de transcripcion del gen, de 5' a 3', la construccion comprende un informador en orientacion sentido, una DSC en orientacion sentido o antisentido, una NSI en orientacion antisentido y un COIN en orientacion antisentido.
- 10. Una construccion de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde la DSC esta en orientacion sentido.
- 11. Una construccion de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde la construccion de acido nucleico esta insertada en un gen, y con respecto a la direccion de transcripcion del gen, de 5' a 3', la construccion comprende un COIN en orientacion antisentido, una NSI en orientacion antisentido, una DSC en orientacion sentido o antisentido, y un informador en orientacion sentido.
- 12. Una construccion de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde la DSC esta en orientacion sentido.
- 13. Una construccion de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde la construccion de acido nucleico esta insertada en un gen, y con respecto a la direccion de transcripcion del gen, de 5' a 3', la construccion comprende una NSI en orientacion antisentido, una DSC en orientacion sentido o antisentido, un informador en orientacion sentido y un COIN en orientacion antisentido.
- 14. Una construccion de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la DSC esta en orientacion sentido.
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