ES2611944T3 - Procedimiento, composición y artículo de fabricación para proporcionar alfa-1-antitripsina - Google Patents

Abstract

Alfa-1 antitripsina (a1-AT) para su utilización en un procedimiento de tratamiento o prevención de un trastorno o enfermedad asociada con la deficiencia de a1-AT en un sujeto mediante administración subcutánea, en la que la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de la administración subcutánea de a1-AT es, como mínimo, de aproximadamente el 120% de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de a1-AT administrada por vía intravenosa, en la que la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de α1-AT es suficiente para mantener en el sujeto un nivel valle de α1-AT en sangre, como mínimo, de aproximadamente 80 mg/dl, en la que la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de α1-AT es de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 300 mg de α1-AT por kg de peso corporal del sujeto.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento, composicion y articulo de fabricacion para proporcionar alfa-1 -antitripsina SECTOR DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a alfa-1-antitripsina (a1-AT) para su utilizacion en un procedimiento de tratamiento o prevencion de un trastorno por via subcutanea.

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCION

La deficiencia de a1-AT es un trastorno genetico relativamente frecuente que predispone a los individuos afectados a una enfermedad hepatica y/o enfisema pulmonar. El tipo mas frecuente de deficiencia de a1-AT denominado inhibidor de la proteasa de tipo Z (PiZ), se transmite como un rasgo autosomico recesivo y afecta a aproximadamente 1 de cada 1700 nacidos vivos en la mayoria de las poblaciones del norte de Europa y de America del norte. La mutacion PiZ es una sustitucion de un solo nucleotido que da como resultado una sustitucion de un solo aminoacido (glutamato 342 a lisina).

Se cree que la principal funcion fisiologica de la a1-AT es la inhibicion de la elastasa de los neutrofilos, la catepsina G y la proteinasa 3. La a1-AT producida en los individuos con deficiencia PiZ de a1-AT es funcionalmente activa, aunque puede haber una disminucion en su capacidad especifica de inhibicion de la elastasa. El sitio predominante de sintesis de a1-AT es el higado, sin embargo, tambien se sintetiza en tipos de celulas extrahepaticas, incluyendo macrofagos, celulas epiteliales intestinales y celulas intestinales de Paneth.

La semivida en el plasma de la a1-AT de tipo M (a1-ATM) (PiM es el alotipo normal) es de aproximadamente cinco dias. La semivida de la proteina mutante PiZ (a1-ATZ) es ligeramente inferior, pero esta diferencia no es suficiente para justificar los niveles plasmaticos bajos de a1-AT en los individuos PiZ homocigotos.

La patogenia de la lesion pulmonar en la deficiencia de a1-AT es atribuible a la marcada reduccion de la actividad de a1-AT disponible. Se ha descubierto que la a1-AT constituye mas del 90% de la actividad inhibidora de elastasa de los neutrofilos en el liquido de lavado alveolar pulmonar. Por lo tanto, parece que la enfermedad pulmonar destructiva que se observa en muchos individuos con deficiencia de a1-AT se debe a una perturbacion en el equilibrio neto entre la elastasa y la a1-AT dentro de los pulmones. La actividad no inhibida de la elastasa, catepsina G, y proteinasa 3 de neutrofilos, a su vez, da como resultado la destruccion lenta de la integridad del tejido conectivo de los pulmones. Esta destruccion de tejido conectivo conduce a una sobredistension y una reduccion de la fuerza de retraccion de los pulmones, que se traduce en una disminucion del flujo de aire espiratorio. El tabaquismo agrava el problema al provocar la inactivacion oxidativa de la a1-AT que esta presente.

En la actualidad, las opciones de tratamiento para individuos con patologias asociadas con la deficiencia de la a1 -AT son limitadas. Liver disease associated with a1-AT deficiency is treated by orthotopic liver transplantation. Perlmutter, Ann. Med. 28:385-94, 1996. Se ha tratado la terapia genica somatica para reemplazar el gen defectuoso de a1-AT, pero aun no se ha utilizado con exito. Los pacientes con enfisema relacionado con la deficiencia de a1-AT han sido tratados con a1-AT plasmatica purificada administrada por via intravenosa o mediante administracion de aerosol intratraqueal. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.093.316. La eficacia de este regimen de tratamiento, sin embargo, aun no se ha establecido.

La terapia de suplemento de a1-AT se ha utilizado en individuos deficientes en forma de administraciones intravenosas repetidas de forma cronica. Este modo de administracion puede asociarse con problemas incluyendo, por ejemplo, el requisito de un trabajador de la salud para la administracion, un acceso venoso malo, reaccion de hipersensibilidad inmediata, el alto coste del procedimiento y las amplias fluctuaciones de los niveles plasmaticos de a1-AT.

El documento WO 2005/014648 da a conocer la administracion intravenosa de a1-AT.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de un procedimiento para proporcionar a1-AT que sea, como minimo, facil de administrar, sea adecuado para la administracion a largo plazo y alcance niveles de biodisponibilidad en plasma de a1-AT deseables.

CARACTERl'STICAS DE LA INVENCION

La presente invencion da a conocer:

Realizaciones de la presente invencion son:

1. Alfa-1 antitripsina (a1-AT) para su utilizacion en un procedimiento de tratamiento o prevencion de un trastorno o

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enfermedad asociada con la deficiencia de a1-AT en un sujeto mediante administracion subcutanea, en la que la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de la administracion subcutanea de a1-AT es, como minimo, de aproximadamente el 120% de una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT administrada por via intravenosa, en la que la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT es suficiente para mantener en el sujeto un nivel valle de a1-AT en sangre, como minimo, de aproximadamente 80 mg/dl, en la que la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT es de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 300 mg de a1 -AT por kg de peso corporal del sujeto.

2. a1-AT para su utilizacion, segun la realizacion 1, en la que la formulacion es una formulacion liofilizada para reconstituir antes de la administracion.

3. a1-AT para su utilizacion, segun cualquiera de las realizaciones 1 o 2, en la que la formulacion comprende ademas una hidrolasa.

4. a1-AT para su utilizacion, segun cualquiera de las realizaciones 1 o 2, en la que la formulacion comprende ademas una hialuronidasa.

En una realizacion, la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT es suficiente para mantener un nivel valle de a1-AT en sangre, como minimo, de aproximadamente 80 mg/dl.

La a1-AT se proporciona para administracion subcutanea. En una realizacion, la formulacion es una formulacion liofilizada, en la que antes de la administracion, la formulacion liofilizada se puede reconstituir con una solucion acuosa adecuada, por ejemplo una solucion acuosa que comprende agua. La liofilizacion y reconstitucion de formulaciones liofilizadas son, generalmente, conocidas en la tecnica.

En algunos aspectos, la a1-AT se puede administrar por via subcutanea para diversas aplicaciones, incluyendo terapias humanas y veterinarias, sola o en combinacion con uno o mas reactivos, por ejemplo, un reactivo capaz de mejorar la farmacocinetica y/o la farmacodinamica de la a1 -AT administrada por via subcutanea.

En otro aspecto, la presente memoria ilustra una composicion farmaceutica que comprende a1-AT y una hialuronidasa, en la que la composicion es adecuada para la administracion por via subcutanea a un sujeto.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS

La figura 1 es un grafico de la concentracion en plasma de alfa-1 antitripsina (a1-AT) como una funcion del tiempo despues de la administracion por via intravenosa (IV) o subcutanea (SC-1 y SC-2).

La figura 2 es un grafico de la concentracion en plasma de alfa-1 antitripsina (a1-AT) como una funcion del tiempo despues de la administracion por via subcutanea repetida (SC-3, SC-4 y SC-5).

La figura 3 es (A) una representacion tipica de secciones de H y E de la piel y el tejido subyacente de conejos de control no tratados (diapositiva 1), tratados con vehiculo (diapositivas 2 y 3: 1 hora y 72 horas despues de la dosis, respectivamente) y tratados con h-AT (diapositivas 4 y 5: a1-AT 1 hora y 72 horas despues de la dosis, respectivamente); y (B) una representacion tipica de secciones de inmunohistologia de pulmones tenidos con anticuerpo monoclonal primario frente a h-AT seguido de un anticuerpo monoclonal secundario frente al complejo de hAT-anticuerpo y acoplado a un cromoforo diaminobenzedina y sometidos a contratincion con hematoxilina (diapositivas 1 y 2: vehiculo 1 hora despues de la dosis; diapositivas 3 y 4: a1-AT 1 hora y 72 horas despues de la dosis, respectivamente).

La figura 4 es un grafico que muestra alfa-1 antitripsina en plasma tras la administracion IV y SC (± hialuronidasa) en conejos. DESCRIPCION DETALLADA

Segun la presente invencion, se ha descubierto sorprendentemente que la administracion subcutanea de a1-AT es un procedimiento intrinsecamente sencillo y novedoso de proporcionar a1-AT a un sujeto (por ejemplo, un ser humano o un animal). Un regimen de dosificacion que comprende la administracion subcutanea de a1-AT es, sorprendentemente, muy adecuado para proporcionar al sujeto una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT. La administracion subcutanea (por ejemplo, inyeccion subcutanea utilizando una aguja) no requiere profesionales de la salud capacitados para administrar el farmaco. Opcionalmente se puede administrar una unidad de dosis a partir de un dispositivo preenvasado que perfora la piel en la medida correcta y libera la dosis. Ademas, la administracion subcutanea es la causa de menos molestias para el sujeto con respecto a lo que resulta habitual con las inyecciones intramusculares e intravenosas, asi como con los supositorios rectales. En resumen, la administracion subcutanea de a1-AT, tal como se describe en el presente documento, proporciona una mejora para el tratamiento o la prevencion de trastornos o enfermedades asociadas con la deficiencia de a1-AT.

Se pretende que el termino "a1-AT," tal como se utiliza en el presente documento, sea amplio, a menos que se indique especificamente lo contrario. El termino se refiere a todos los polimorfos de origen natural de la a1-AT. El termino tambien incluye fragmentos funcionales de a1-AT, proteinas quimericas que comprenden a1-AT o fragmentos funcionales de las mismas, homologos obtenidos por sustitucion analoga de uno o mas aminoacidos de a1-AT, y los homologos de especie. El termino tambien se refiere a todos los polipeptidos de a1-AT que son un

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producto de la tecnologia de ADN recombinante que incluye una a1-AT que es un producto de la tecnologia transgenica. Por ejemplo, el gen que codifica la a1-AT se puede insertar en un gen de mamifero que codifica una proteina del suero de la leche de tal manera que la secuencia de ADN se expresa en la glandula mamaria, tal como se describe en la patente de Estados Unidos No. 5.322.775. El termino tambien se refiere a todas las proteinas de a1-AT sintetizadas quimicamente por medios bien conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, sintesis de peptidos en fase solida. El termino se refiere tambien a a1-AT preparada a partir de plasma. El termino se refiere tambien a a1-AT que esta disponible comercialmente. Por ejemplo, se preparan Prolastin® (Talecris Therapeutics, Inc., Research Triangle Park, NC), Aralast® (Baxter International, Inc., Deerfield, IL) y Zemaira® (CSL Behring, Kankakee, IL) a partir de combinados de plasma humano. La a1-AT de plasma humano tambien esta disponible comercialmente en la firma Sigma-Aldrich Chemical Co. como los productos A9024, A6150 y 10814 (Sigma-Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). La a1-AT tambien esta disponible en la firma PPL Therapeutics, East Mains, Ormiston, East Lovian, EH35 5NG, Escocia. La patente de Estados Unidos No. 6.974.792 describe un procedimiento de preparacion de a1 -AT.

El termino "subcutaneo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a por debajo de la piel (por ejemplo, en el tejido conectivo subyacente a la dermis y por encima de la fascia del tejido muscular).

Una "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico deseado, tal como, por ejemplo, la reduccion o inhibicion del enfisema asociado con la deficiencia congenita de a1-AT. Una cantidad terapeuticamente eficaz de a1-AT puede variar segun factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y la capacidad de la a1-AT para provocar una respuesta deseada en el sujeto. Los regimenes de dosificacion se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una con la que cualquier efecto toxico o perjudicial de la a1-AT es superado por los efectos terapeuticamente beneficiosos.

Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado, tal como, por ejemplo, la prevencion o la inhibicion del enfisema asociado con la deficiencia congenita de a1-AT. Una cantidad profilacticamente eficaz puede determinarse, tal como se ha descrito anteriormente para la cantidad terapeuticamente eficaz.

Un experto en la tecnica puede adaptar facilmente la dosis y frecuencia de la administracion subcutanea para proporcionar un regimen de dosificacion que es terapeuticamente o profilacticamente eficaz.

Por tanto, la administracion subcutanea se refiere a la liberacion de una dosis deseada de la a1 -AT por debajo de la piel a traves de un dispositivo de administracion de medicamentos. El dispositivo de administracion de medicamentos puede penetrar en la epidermis del individuo que se va a tratar y da como resultado la introduccion de la dosis deseada de a1-AT en los tejidos del individuo. El dispositivo de administracion de la presente invencion puede incluir, pero sin limitaciones a los mismos, cualquier inyector tradicional de aguja hipodermica, inyector sin aguja de accionamiento neumatico, inyector de chorro o inyector sin aguja de gas a presion (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.730.723, 5.891.086, 5.957.886 y 5.851.198).

En una realizacion, el sujeto es un ser humano, en el que el sitio de la administracion subcutanea incluye, pero sin limitaciones a los mismos, supraescapular, parte superior del pecho, parte superior del muslo, y combinaciones de los mismos.

Entre los ejemplos de trastornos y enfermedades asociados con o causados por niveles por debajo de lo normal de a1-AT en plasma y para los que las presentes realizaciones dirigidas a la administracion subcutanea pueden ser especialmente utiles se incluyen, sin limitaciones a los mismos, enfermedad pulmonar, tal como enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) (por ejemplo, enfisema), enfermedad hepatica, enfermedad vascular (por ejemplo, aneurismas intracraneales, displasia fibromuscular arterial, trastornos hemorragicos graves e hipertension), paniculitis, enfermedades oculares (por ejemplo, uveitis anterior), vasculitis necrotizante sistemica y granulomatosis de Wegener.

Un factor que puede considerarse cuando se determina una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1 -AT para la administracion subcutanea es la concentracion de la a1-AT funcionalmente activa expresada en un compartimento biologico del sujeto, tal como, por ejemplo, en el tracto respiratorio inferior o el fluido de revestimiento epitelial (ELF) del sujeto. Otro factor que tambien puede considerarse a la hora de determinar una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT para la administracion subcutanea es la farmacologia (por ejemplo, la farmacocinetica) de la a1 -AT.

La farmacocinetica de la a1-AT se refiere a la concentracion o los niveles de a1-AT en la sangre del sujeto. Los parametros o medidas farmacocineticos de los niveles de a1-AT en la sangre incluyen el area bajo la curva (AUC), Cmin (es decir, valle) y la Cmax. La AUC es la exposicion total de a1-AT en la sangre del sujeto durante un periodo de dosificacion fijo (por ejemplo, 8, 12 y 24 horas). La Cmin (es decir, el nivel valle) es el nivel sanguineo mas bajo de la

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a1-AT durante un periodo de dosificacion fijo. La Cmax es el nivel mas alto o pico alcanzado por la a1-AT en la sangre del sujeto durante un periodo de dosificacion fijo.

Cabe destacar que los valores de las dosis pueden variar con la gravedad de la afeccion que se va a aliviar. Debe entenderse ademas que, para cualquier sujeto concreto, los regimenes de dosificacion especificos pueden ajustarse en el tiempo segun la necesidad individual y el juicio profesional del cuidador y los intervalos de dosificacion indicados en la presente memoria descriptiva son unicamente ejemplos y no estan destinados a limitar el alcance o la practica de la presente invencion.

Los regimenes de dosificacion por via subcutanea se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapeutica o profilactica optima. Por ejemplo, se puede administrar un unico bolo subcutaneo, varias dosis divididas se pueden administrar por via subcutanea en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente tal como indican las exigencias de la situacion terapeutica o profilactica. Ademas, una o mas dosis subcutaneas se pueden administrar como parte de un regimen que comprende otros modos de administracion de a1 -AT, incluyendo, pero sin limitaciones, la administracion intravenosa.

En un aspecto, la a1-AT es para su utilizacion en un procedimiento para tratar o prevenir un trastorno o enfermedad asociado con la deficiencia de a1-AT en un sujeto.

La a1-AT se va a proporcionar por via subcutanea en una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz.

Por ejemplo, la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz que se va a administrar por via subcutanea puede ser suficiente para lograr o mantener un nivel valle en sangre de a1-AT (por ejemplo, nivel plasmatico) por encima de un nivel umbral objetivo. En una realizacion, el nivel umbral objetivo es, como minimo, de aproximadamente 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, y 200 mg/dl.

En otra realizacion, en la que el sujeto es un ser humano, la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz es suficiente para lograr o mantener un nivel valle en sangre de a1-AT, como minimo, de aproximadamente 50 mg/dl. En otras realizaciones, la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT es suficiente para mantener un nivel valle de a1-AT en sangre, como minimo, de aproximadamente 80 mg/dl. En una realizacion, la etapa de administracion comprende una pluralidad de inyecciones subcutaneas de una composicion que comprende una concentracion de a1-AT.

La dosis y la frecuencia de la administracion subcutanea de a1-AT pueden adaptarse a cada sujeto individual. Por consiguiente, tanto la dosis como la frecuencia pueden variar.

En una realizacion, la dosis que se va a administrar por via subcutanea es, como minimo, de aproximadamente 70 mg a aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 250 mg, de aproximadamente 90 mg a aproximadamente 200 mg, y de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 150 mg por kg de peso corporal del sujeto por administracion. La dosis es de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 300 mg por kg de peso corporal del sujeto.

Las dosis se puede administrar por via subcutanea a dichas frecuencias y durante el tiempo que se considere necesario y seguro, segun el cuidador determina facilmente mediante pruebas estandar (por ejemplo, medico o veterinario) dependiendo del trastorno o enfermedad especifica que se va a tratar.

En una realizacion, la dosis se administra por via subcutanea, como minimo, una vez por una unidad de tiempo, de manera ilustrativa, como minimo, una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, y asi sucesivamente por una unidad de tiempo. En otra realizacion, la unidad de tiempo es una hora, un dia, una semana, cada dos semanas, cada tres semanas, un mes, cada 1,2, 3, 4, 5, y 6 meses, etc.

En su caso, las dosis y frecuencias de administracion subcutanea se pueden ajustar hacia arriba o hacia abajo. En otras realizaciones, la administracion subcutanea se puede realizar antes, simultaneamente o despues de otros modos de administracion de a1-AT, tales como, por ejemplo, administracion intramuscular o intravenosa.

En una realizacion, la presente invencion da a conocer un procedimiento para tratar o prevenir un trastorno o una enfermedad asociada con la deficiencia de a1-AT en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento o prevencion. El procedimiento comprende proporcionar, por via subcutanea, una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT al sujeto. En una realizacion, la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT es, como minimo, aproximadamente 72 mg/kg de peso corporal por semana. En otra realizacion, la etapa de administracion comprende una o mas inyecciones subcutaneas del sujeto, en la que las una o mas inyecciones comprenden cada una un volumen de una composicion que comprende una concentracion de a1-AT, en la que cada una de la una o mas inyecciones se administra por via subcutanea durante una duracion de la administracion. En algunas realizaciones, se proporciona la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT a traves de una pluralidad

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de inyecciones subcutaneas que se repiten semanalmente. La pluralidad de inyecciones subcutaneas se puede administrar el mismo dfa o, como mmimo, en dos dfas diferentes de cada semana.

Se pueden utilizar diversas formulaciones diferentes que contienen a1-AT segun la presente invencion. El ingrediente activo en tales formulaciones es a1-AT, que puede ser a1-AT humana o no humana recombinante pero, como se ha indicado anteriormente, tambien puede incluir a1-AT extrafda de fuentes de plasma. Aunque la a1-AT esta generalmente presente por sf sola como el unico ingrediente activo, la a1-AT puede estar presente con uno o mas ingrediente activos adicionales.

Independientemente del ingrediente activo, puede haber diferentes tipos de formulaciones de a1-AT que pueden utilizarse en relacion con la presente invencion. Todas las formulaciones incluyen a1-AT y, opcionalmente, un vehfculo farmaceuticamente aceptable adecuado para la administracion subcutanea. En una realizacion, la formulacion es una composicion de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que comprende una concentracion de a1-AT. En otra realizacion, la concentracion es, como mmimo, de aproximadamente 50 mg/ml.

Por lo tanto, cualquier formulacion que hace que sea posible administrar por vfa subcutanea a1-AT a un sujeto puede utilizarse en relacion con la presente invencion, incluyendo formulaciones que se pueden administrar tambien por vfa intravenosa. La informacion especffica con respecto a las formulaciones que se pueden utilizar en relacion con la administracion subcutanea se describen en “Ciencias farmaceuticas de Remington” (“Remington's Pharmaceutical Sciences”), A. R. Gennaro editor (ultima edicion) Mack Publishing Company. En cuanto a las formulaciones de insulina, tambien es util tener en cuenta Sciarra y otros [Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 65, No. 4, 1976].

La a1-AT se puede liofilizar en el recipiente en el que la reconstitucion de la protema a1-AT se debe llevar a cabo con el fin de evitar una etapa de transferencia. Generalmente, la liofilizacion se traducira en una formulacion liofilizada en la que el contenido de humedad de la misma es menor que aproximadamente el 5%, y preferentemente menor que aproximadamente el 3%. Y, tfpicamente, cuando es el momento de administrar por vfa subcutanea la a1-AT al sujeto, la formulacion liofilizada se puede reconstituir con un diluyente adecuado para conseguir la concentracion de a1-AT deseada.

La reconstitucion tiene lugar, generalmente, a una temperatura de aproximadamente 25°C para asegurar la completa hidratacion, aunque se pueden utilizar otras temperaturas segun se desee. El tiempo requerido para la reconstitucion dependera, por ejemplo, del tipo de diluyente, la cantidad de excipiente o excipientes y de protema. Entre los ejemplos de diluyentes se incluyen, pero sin limitaciones, agua esteril, agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI), una solucion tamponada de pH (por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato), solucion salina esteril, y solucion de Ringer o solucion de dextrosa. El diluyente contiene, opcionalmente, un conservante. La cantidad de conservante utilizado se determina evaluando para diferentes concentraciones de conservantes la compatibilidad con la protema y el ensayo de la eficacia del conservante.

La formulacion reconstituida debe administrarse al sujeto, tal como, por ejemplo, un ser humano, segun procedimientos conocidos, mediante administracion subcutanea (es decir, bajo la piel). Para tales fines, la formulacion se puede inyectar utilizando una jeringa. Sin embargo, se dispone de otros dispositivos para la administracion de la formulacion, tales como dispositivos de inyeccion (por ejemplo, los dispositivos Inject-case® y Genject®); plumas inyectoras (tales como, GenPen®); dispositivos sin aguja (por ejemplo, MediJector® y BioJector®); y sistemas de administracion de parches subcutaneos. La protema puede administrarse como el unico tratamiento o junto con otros farmacos o terapias. La colocacion subcutanea de un equipo de infusion con alas, por ejemplo, se puede utilizar para minimizar las inyecciones repetidas con la aguja.

En una realizacion, la concentracion de a1-AT en la formulacion para administracion subcutanea es, como mmimo, de aproximadamente 0,1 mg/ml, de manera ilustrativa, como mmimo, de aproximadamente 0,1, 1, 10, 100, 1.000 mg/ml. Ademas, la actividad especffica de la a1-AT en la formulacion para administracion subcutanea puede variar. En una realizacion, la actividad especffica es, como mmimo, de aproximadamente 0,05 mg de a1-AT activa por mg de protema total, de manera ilustrativa, como mmimo, de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, o mas de a1-AT activa por mg de protema total.

En general, una administracion subcutanea individual de a1-AT comprende un volumen de una formulacion de a1-AT, en la que el volumen se administra durante una duracion de administracion. El volumen dependera, por supuesto, en parte de la concentracion de a1-AT en la formulacion que se va a administrar. Ademas, la duracion de la administracion puede depender de uno o mas factores incluyendo, pero sin limitaciones, el volumen que se administra y el nivel de incomodidad del sujeto. Por ejemplo, una dosis que tiene un volumen relativamente grande se puede proporcionar como volumenes mas pequenos separados que se pueden administrar al mimo tiempo o en un momento diferente en el mismo sitio subcutaneo o en uno diferente (por ejemplo, administracion simultanea de dos volumenes mas pequenos en dos sitios subcutaneos diferentes).

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En una realizacion, el volumen que se administra en un sitio subcutaneo es menor de aproximadamente 3 ml. Preferentemente, la duracion de la administracion del volumen es, como mmimo, de aproximadamente 0,5 segundos (s), de manera ilustrativa, como mmimo, de aproximadamente 0,5 s, 1 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 50 s, 1 minuto (min), 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min y 1 hora.

En otros aspectos, la a1-AT se puede administrar por vfa subcutanea para diversas aplicaciones, incluyendo terapias humanas y veterinarias, sola o en combinacion con uno o mas reactivos, por ejemplo, un reactivo capaz de mejorar la farmacocinetica y/o la farmacodinamica de la a1-AT administrada por vfa subcutanea. Por ejemplo, en una realizacion, el uno o mas reactivos se deben administrar a un sujeto de forma simultanea con a1-AT, por ejemplo por medio de una unica composicion farmaceutica esteril que comprende a1-AT y el uno o mas reactivos. En otras realizaciones, el uno o mas reactivos se administran a la vez antes de o despues de la administracion de a1 -AT.

El uno o mas reactivos se pueden administrar mediante inyeccion, por ejemplo, inyeccion parenteral, incluyendo, pero sin limitacion a las mismas, inyeccion subcutanea, intramuscular, intraorbital, intracapsular e intravenosa. La vfa de administracion y la cantidad de los uno o mas reactivos administrada puede variar en funcion de diversas variables del sujeto, incluyendo el tamano, el peso, la edad, la gravedad de la enfermedad y la capacidad de respuesta a la terapia. Los procedimientos para determinar la vfa de administracion y la dosificacion adecuadas de los uno o mas reactivos generalmente se pueden determinar caso por caso. Dichas determinaciones son rutinarias para un experto ordinario en la tecnica (vease, por ejemplo, “Principios de Harrison de medicina interna” (“Harrison's Principles of Internal Medicine”), 11s Ed., 1987).

En una realizacion, el uno o mas reactivos es una hidrolasa tal como, por ejemplo, una glicosidasa. Entre los ejemplos ilustrativos no limitantes de una glicosidasa se incluyen hialuronidasa, a-amilasa, p-amilasa, queratanasa, dextranasa, endoglicoceramidasa II, quitosanasa, quitinasa, tioglucosidasa, pectinasa, pectoliasa, lisozima, neuraminidasa, a-glucosidasa, p-glucosidasa, a- galactosidasa, p-galactosidasa, a-manosidasa, invertasa, trehalasa, amiloglucosidasa, p-glucuronidasa, hialuronidasa, celulasa, hesperidinasa, pululanasa,

a-N-acetilgalactosaminidasa, a-L-fucosidasa, p-N-acetilglucosaminidasa, p-N-acetilhexosaminidasa, p-glucanasa, laminarinasa, isoamilasa, inulinasa, xilanasa, agarasa, endoglicosidasa H, endoglicosidasa F2, endoglicosidasa F3, endoglicosidasa H, endoglicosidasa F1, O-glucosidasa, protema Fpg, ADNasa, diastasa, y xilanasa.

En algunas realizaciones, la glicosidasa es una hialuronidasa. Por ejemplo, la hialuronidasa puede ser una enzima que es capaz de escindir los enlaces glicosfdicos p-N-acetilhexosamina-(1-4) en acido hialuronico, condroitina, y/o sulfatos de condroitina. Por ejemplo, la hialuronidasa se puede administrar como adyuvante para aumentar la absorcion de a1-AT mejorando de este modo su farmacocinetica y/o farmacodinamia. Sin desear quedar ligado a teorfa particular alguna, se cree que la hialuronidasa puede actuar como una sustancia de diseminacion o difusion que modifica la permeabilidad del tejido conectivo a traves de la hidrolisis del acido hialuronico, un polisacarido que se encuentra en la sustancia fundamental intercelular del tejido conectivo y de determinados tejidos especializados, tales como el cordon umbilical y el humor vftreo. La hialuronidasa, como mmimo, puede hidrolizar el acido hialuronico mediante la division del enlace glucosamirndico entre el C1 de fraccion de glucosamina y el C4 de acido glucuronico. Se cree que esto puede disminuir temporalmente la viscosidad del cemento celular y promover la difusion de los fluidos inyectados o de los trasudados o exudados localizados, lo que facilita su absorcion. La velocidad de difusion puede ser proporcional a la cantidad de enzima, y la medida puede ser proporcional al volumen de la solucion. El conocimiento de los mecanismos implicados en la desaparicion de la hialuronidasa inyectado es limitado, sin embargo, se cree que la sangre de una serie de especies de mamfferos provoca la inactivacion de la hialuronidasa.

La dosificacion especffica apropiada para la administracion puede determinarla facilmente un experto en la tecnica y/o segun los factores tratados en el presente documento. Ademas, un experto ordinario en la tecnica reconocera que las estimaciones para dosificaciones apropiadas en seres humanos pueden extrapolarse a partir de determinaciones del nivel de actividad enzimatica de la enzima in vitro y/o las dosis eficaces en estudios con animales. Por ejemplo, en los casos en los que X unidades (U) de hialuronidasa pueden ser eficaces en la mejora de la farmacocinetica y/o la farmacodinamia de un regimen de a1 -AT administrada por vfa subcutanea en un conejo con un peso de aproximadamente 3 kg y, dada esta informacion, las dosis de hialuronidasa correspondientes en un ser humano con un peso aproximado de 75 kg pueden ser aproximadamente 25 veces (por ejemplo, aproximadamente 25 veces X unidades) la dosis eficaz en los conejos.

Se conocen una serie de inyecciones de hialuronidasa, tales como, por ejemplo, formulaciones comercializadas como Amphadase® (150 unidades/ml de solucion inyectable), Hydase® (150 unidades/ml de solucion inyectable), Hylenex® (150 unidades/ml de solucion inyectable), Vitrase® (200 unidades/ml de solucion inyectable) y Vitrase® (6.200 unidades de inyeccion). Por ejemplo, segun un fabricante, Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals, Inc., Rancho Cucamonga, Ca) es una preparacion de hialuronidasa testicular bovina purificada suministrada como una solucion esteril e incolora lista para utilizar y la absorcion y la dispersion de otros farmacos inyectados puede mejorarse mediante la adicion de 50 a 300 unidades de Amphadase®, a la solucion inyectable. Cada vial de Amphadase® contiene 150 unidades USP de hialuronidasa por ml con 8,5 mg de cloruro sodico, 1 mg de edetato

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disodico, 0,4 mg de cloruro de calcio, tampon de fosfato de sodio monobasico y no mas de 0,1 mg de timerosal (derivado de mercurio). La solucion lista para utilizar es transparente e incolora con un pH aproximado de 6,8 y una osmolalidad de 295 a 355 mOsm.

La a1-AT se puede administrar por via subcutanea a un sujeto en una composicion que comprende a1-AT en combinacion con una cantidad eficaz de una hialuronidasa, en el que la cantidad eficaz es suficiente para aumentar la absorcion, dispersion, o ambas cosas, de a1-AT. En una realizacion, la hialuronidasa se administra simultaneamente con a1-AT. En otra realizacion, la hialuronidasa se administra simultaneamente con a1-AT, en la que la composicion comprende ademas la hialuronidasa. En algunas realizaciones, la hialuronidasa se administra simultaneamente con a1-AT, en la que la composicion que comprende a1-AT se administra en un sitio diferente del sitio de administracion de la hialuronidasa.

En otras realizaciones, la presente memoria descriptiva ilustra una composicion farmaceutica que comprende a1-AT y una hialuronidasa y un vehiculo farmaceuticamente aceptable, en la que la composicion es adecuada para la administracion por via subcutanea a un sujeto. En una realizacion, el sujeto es un ser humano. La composicion farmaceutica puede estar en forma de una formulacion liofilizada.

Se puede proporcionar un articulo de fabricacion que contiene composiciones o formulaciones liofilizadas de la presente invencion y proporciona instrucciones para su reconstitucion y/o utilizacion. El articulo de fabricacion comprende un recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales (por ejemplo, viales de doble camara), jeringuillas (tales como jeringuillas de doble camara) y tubos de ensayo. El recipiente puede estar formado por diversos materiales, tales como vidrio o plastico. El recipiente contiene las composiciones o formulaciones liofilizadas y la etiqueta en el recipiente o asociada con el mismo puede indicar las instrucciones para la reconstitucion y/o utilizacion. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulacion liofilizada se reconstituye a las concentraciones de proteina como se ha descrito anteriormente. La etiqueta puede indicar, ademas, que la formulacion es util o esta destinada a la administracion subcutanea. El recipiente que contiene la formulacion puede ser un vial multiusos, que permite administraciones repetidas (por ejemplo, de 2-6 administraciones) de la formulacion reconstituida. El articulo de fabricacion puede incluir ademas un segundo recipiente que comprende un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI). El articulo de fabricacion puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, cargas, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones de utilizacion.

Ejemplos

Ejemplo 1 Biodisponibilidad en plasma de a1-AT humana administrada por via subcutanea

Para determinar la biodisponibilidad en plasma de la a1-AT tras la administracion subcutanea (SC) (y, para compararlo con la inyeccion intravenosa de a1-AT), se examino la administracion unica de dos niveles de dosis subcutaneas y en comparacion con una unica administracion intravenosa de a1-AT.

Los conejos blancos New Zealand (~ 3 kg de peso corporal) se aclimataron durante, como minimo, 1 semana antes de su utilizacion. Se proporciono alimento y agua a demanda. Se monitorizo a los conejos diariamente para determinar su bienestar.

Los conejos se asignaron a los Grupos A, B o C (N = 5 cada uno) de peso corporal similar. Se trato a los conejos con acepromazina (1,0 mg/kg de peso corporal) mediante inyeccion SC para facilitar la vasodilatacion en las orejas. En la oreja se aplico Nair® u otro depilatorio para facilitar la eliminacion del pelo y exponer los vasos sanguineos. De cinco a diez minutos despues, se retiro la crema Nair® y el pelo frotando con esponjas de gasa humedas hasta retirar toda la crema. Se secaron las orejas se secaron y se aplico la crema anestesica local, lidocaina (1%). Despues de 15 minutos, la oreja se limpio con un hisopo con alcohol y para el grupo intravenoso (grupo IV), se administro a1-AT (50 mg/ml) (200 mg/ kg de peso corporal) a traves de la vena de la oreja.

Para los grupos de administracion subcutanea (grupos SC-1 y SC-2), se afeito el pelo en dos secciones (2" x 2") en el lado dorsal. Se administro a1-AT (200 mg/kg de peso corporal (grupo SC-1); 240 mg/kg de peso corporal (grupo SC-2)) por via subcutanea en los dos sitios utilizando una aguja Monoject de calibre 25 unida a una jeringa. Antes de la infusion, se retiro el piston de la jeringa para asegurarse de que la punta de la aguja no esta en un vaso sanguineo. Despues de la infusion, se realizo observacion visual para garantizar la falta de permeabilidad.

Se extrajo sangre al tiempo cero (antes de la dosis), 5 minutos, 3 horas, 6 horas, 9 horas, 1, 2, 3, 4, 6, 8, y 10 dias. Se extrajo una muestra de sangre de 1,5 ml del cateter arterial utilizando una jeringa cargada con 150 ul de citrato de sodio al 3,8% y se transfirieron a un tubo de microcentrifuga.

Despues de la extraccion de sangre inicial, se devolvio a los animales a sus jaulas de retencion. En cada tiempo de extraccion posterior, se devolvio a los animales a sus jaulas de restriccion, la muestra de sangre se tomo como se ha descrito anteriormente y se devolvio a los animales a sus jaulas de retencion. Antes de las extracciones de

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sangre sucesivas, se sedo a los conejos con 1 mg/ml de acepromazina y la muestra de sangre de 1,5 ml se recogio directamente de la arteria de la oreja con una aguja de calibre 22 g y una jeringa de 3 ml cargada con citrato de sodio al 3,8%. Se sacrifico a los conejos al final del estudio mediante infusion intravenosa de pentobarbital. Se sacrifico a todos los conejos segun las politicas del Servicio de Salud Publica sobre el cuidado humano de animales de laboratorio. Todos los efectos adversos en los conejos se abordaron en estricta conformidad con los protocolos veterinarios aprobados en la Universidad Estatal de Carolina del Norte, Facultad de Medicina Veterinaria.

Las muestras de sangre se centrifugaron despues de la recogida a 3.000 rpm en una centrifuga de mesa, las muestras de plasma se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80 °C. Las muestras de plasma se analizaron para detectar los valores de h-AT mediante inmunonefelometria.

Como se muestra en la figura 1, el perfil de eliminacion plasmatica de la a1 -AT administrada por via intravenosa (es decir, el grupo IV) sigue un patron bifasico con una fase alfa inicial rapida y una fase beta lenta con una semivida de eliminacion terminal (T1/2) de 53 horas. La a1-AT administrada por via subcutanea (es decir, SC-1 y SC-2) alcanzo la Cmax en aproximadamente 48 horas. La disponibilidad fraccional (F) derivada del area bajo la curva de concentracion (AUC) de los grupos SC-1 (es decir, 100% de la dosis IV) y SC-2 (es decir, el 120% de la dosis IV) fue, respectivamente, un 27% menor (P <0,05) y un 8% menor (no estadisticamente significativo) en comparacion con el grupo IV Los resultados se resumen en la tabla 1.

Tabla 1: Perfil plasmatico

Grupo

AUC (hmg/ml) Media ± SD Media F ± SD

IV

179,0 ± 11,2 1,00 ± 0,06

SC1

131,4 ± 13,1* 0,73 ± 0,07*

SC2

164,6 ± 21,0 0,92 ± 0,12

‘Estadisticamente significativa del grupo IV de P <0,05

Ejemplo 2

Biodisponibilidad en plasma tras administraciones subcutaneas repetidas de a1-AT humana

Se estudio la biodisponibilidad plasmatica de a1-AT tras tres administraciones subcutaneas (SC) repetidas.

Los conejos se prepararon como se ha indicado anteriormente y fueron asignados a tres grupos y se les administro la dosis los dias 0, 2, 4 y 6. A los conejos del grupo 1 (es decir, SC-3) se administraron dosis de 50 mg/kg, a los conejos del grupo 2 (es decir, SC-4) se administraron dosis de 60 mg/kg, y a los conejos del grupo 3 (es decir, SC-5) se administraron dosis de 70 mg/kg. Las muestras de sangre se recogieron 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, y 12 dias despues de la dosificacion y se procesaron como se ha indicado anteriormente para el analisis.

Como se muestra en la figura 2, los niveles plasmaticos de la a1-AT administrada por via subcutanea en los tres grupos (es decir, SC-3, SC-4, y SC-5) siguieron aumentando con la administracion repetida hasta el dia 7 y, a partir de entonces, los niveles disminuyeron gradualmente hacia el valor basal el dia 12. La AUC de los grupos de SC-3, SC-4, y SC-5 fueron 127 ± 11, 159 ± 8, y 162 ± 12, respectivamente. La disponibilidad fraccional (F), que se determino mediante la comparacion de la aUc con el grupo de dosis unica IV a partir del experimento descrito en el ejemplo 1 anterior, fue de 0,71 ± 0,03, 0,89 ± 0,04, 0,91 ± 0,07 para SC-3, SC-4, y SC-5, respectivamente. El valor F para SC-3 fue menor que el de SC-4 y SC-5 en aproximadamente un 20% (P <0,05). Los resultados se resumen en la tabla 2.

Tabla 2. Area bajo la curva y disponibilidad fraccional (F)

Grupo

AUC (hmg/ml) Media ± SD Media F ± SD

1: SC-3

127 ±11* 0,71 ± 0,03*

2: SC-4

159 ± 8 0,89 ± 0,04

3: SC-5

162 ± 12 0,91 ± 0,07

*P < 0,05 en comparacion con la dosis unica IV a 200 mg/kg descrita en el ejemplo1.

Ejemplo 3

Histopatologia en el sitio de la inyeccion de a1-AT humana administrada SC

Para determinar la histopatologia en el sitio de la inyeccion y la presencia de a1-AT humana en el tejido pulmonar, se realizo inmunohistoquimica despues de la administracion subcutanea repetida de alfa-1 antitripsina (h-AT) humana en conejos.

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Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comite institucional para el cuidado y uso de animales de laboratorio (IACUC) de la Universidad Estatal de Carolina del Norte. Se aclimato a los conejos blancos New Zealand macho, despues de su llegada a las instalaciones de animales, durante, como minimo, 1 semana antes de su utilizacion. Durante este periodo de aclimatacion, cada animal se introdujo en un inmovilizador, tres veces/semana durante un minimo de 15 minutos para aclimatar los animales al inmovilizador. Se proporciono alimento y agua a demanda. Se monitorizo a los conejos diariamente para determinar su bienestar.

Se peso a los animales y se asignaron a grupos (n = 3) de peso corporal aproximadamente igual, tal como se muestra en la tabla 3.

Tabla 3: Diseno del estudio

Grupos

N Tratamientos Volumen total (ml) Tiempo de obtencion de tejido

Grupo 1-A

3 Administracion SC diaria de alfa-1-antitripsina durante 3 dias 10 ml 1 hora despues de la ultima dosis

Grupo 1-B

3 Administracion SC diaria de alfa-1-antitripsina durante 3 dias 10 ml 3 dias despues de la ultima dosis

Grupo 2-A

3 Administracion SC diaria de vehiculo (PBS) durante 3 dias 10 ml 1 hora despues de la ultima dosis

Grupo 2-B

3 Administracion SC diaria de vehiculo (PBS) durante 3 dias 10 ml 3 dias despues de la ultima dosis

Grupo 3-A

1 Sin tratamiento 10 ml Al mismo tiempo que el grupo A

El dia antes del inicio del estudio, un area en el costado izquierdo de los animales se recorto de la linea media dorsal extendiendose 4 cm en direccion ventral y desde la punta de la ultima costilla al ala del ileon. El dia del estudio, se sedo a los animales con la inyeccion SC de acepromazina (1 mg/kg) y 15 minutos mas tarde, se administraron los articulos de ensayo (10 ml de h-AT-56 mg/ml - n.° de lote T06AU02) o vehiculo (solucion salina tamponada con fosfato) mediante inyeccion SC por un cateter de mariposa de calibre 23. Se inmovilizo la piel del animal mediante traccion suave y se inserto la aguja de tipo mariposa desde el cateter en el espacio entre la piel y el tejido subcutaneo subyacente para asegurar que hay un minimo movimiento de la aguja para evitar lesiones de los tejidos.

Los articulos de ensayo se administraron SC en el mismo sitio para cada conejo y los bordes del lugar de inyeccion y la distorsion tisular se marcaron con un rotulador. Las inyecciones como se ha indicado anteriormente se repitieron cada dia durante tres dias consecutivos.

Los tiempos de obtencion de tejido se resumen en la tabla 3 anterior. Se anestesio a los animales con ketamina (50 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal) por via intramuscular (IM) y se les sacrifico con pentobarbital (120 mg/kg o 7ml por conejo de 3 kg) administrado por via intravenosa (IV).

Para el analisis de tejido pulmonar, se abrio la cavidad toracica y se extrajeron los pulmones. Se cateterizo la traquea y se inflaron los pulmones con 50-100 ml de formaldehido tamponado a pH 7,4. Despues del inflado, se introdujeron los pulmones en formaldehido y se procesaron mediante inmunohistoquimica en un plazo de 72 horas. Se realizo tincion especifica de h-AT con un anticuerpo monoclonal primario seguido de un anticuerpo monoclonal secundario frente al complejo h-AT y se acoplo a un cromoforo de diaminobenzedina y se realizo contratincion con hematoxilina.

Para el analisis de los tejidos de la piel, se recogio todo el costado izquierdo y se obtuvo una seccion de 3"x 3" de la piel y se realizo una incision en el musculo subyacente de la pared, se clavo en espuma de poliestireno y se coloco en formaldehido. El tejido se marco dorsal, ventral, craneal y caudal con un rotulador. La esquina dorso-craneal de la seccion cuadrada de tejido se corto para proporcionar adicionalmente orientacion para seccionar y la histopatologia.

Los resultados de la histologia del sitio de inyeccion de la piel y los tejidos subyacentes y la inmunohistoquimica de pulmon se muestran en la figura 3. La figura 3A, diapositivas 1-5, muestra que no habia indicios de inflamacion o signos de lesiones en los conejos tratados con h-AT o vehiculo en comparacion con el control sin tratar, lo que sugiere que la administracion SC repetida de h-AT no altero la piel y la histologia del tejido subyacente. Como se muestra en la figura 3B, los pulmones de los conejos tratados con vehiculo (diapositivas 1 y 2) no mostraron tincion oscura, lo que indica la falta de h-AT, sin embargo, los conejos tratados con h-AT (diapositivas 3 y 4) mostraron tincion oscura, lo que indica la presencia de h-AT en todo el tejido pulmonar, incluyendo celulas epiteliales, endoteliales, y el espacio intersticial. Estos resultados sugieren que la administracion sC de h-AT esta facilmente disponible en el tejido pulmonar, el organo diana en el tratamiento de la deficiencia de h-AT.

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Ejemplo 4

Efecto de la hialuronidasa sobre la farmacocinetica de la alfa-1-antitripsina humana administrada por via subcutanea

Para determinar el efecto de la enzima hialuronidasa sobre la farmacocinetica de la a1-AT administrada por via subcutanea, se administro a los conejos a1-AT con o sin hialuronidasa.

Se peso a los conejos y se les asigno al Grupo A, B o C (n = 5) y se correspondio con el peso corporal promedio de cada grupo. Se aclimato a los conejos durante, como minimo, 1 semana antes del estudio. Durante este periodo de aclimatacion, cada animal se introdujo en un inmovilizador, tres veces a la semana durante un minimo de 15 minutos para aclimatar a los animales al inmovilizador. Se proporciono comida y agua a demanda y se monitorizo a los conejos al dia para determinar su bienestar. Se coloco a cada conejo en un inmovilizador y se administraron los farmacos del siguiente modo:

1. h-AT - por via intravenosa: Se trato a los conejos con acepromacina (1,0 mg/kg de peso corporal) mediante inyeccion Sc para provocar vasodilatacion de las arterias y venas en las orejas. Se administro h-AT (No. de lote T06Au02-56 mg/ml - Talecris Biotherapeutics) [200 mg/kg de peso corporal, 10,7] como un bolo en la vena de la oreja a traves de una aguja de tipo mariposa unida a la jeringa.

2. Administracion subcutanea: Se trato a los conejos con acepromacina (1,0 mg/kg de peso corporal) mediante inyeccion SC para provocar vasodilatacion de las arterias y venas en las orejas. Se afeito el pelo en la cara dorsal (2" por 2") se afeito y se administro h-AT (No. de lote T06Au02- 56 mg/ml-Talecris Biotherapeutics) [h-AT: 200 mg/kg10,7; h-AT + hialuronidasa: 200 mg/kg (10,7 ml/conejo de 3 kg) de h-AT + 3.000 U de hialuronidasa ( H-6254 - Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)] por via subcutanea a traves de una aguja de tipo mariposa unida a una jeringuilla. Antes de la infusion, se tiro del embolo de la jeringa para observar si habia sangre. Despues de la infusion, se realizo observacion visual para garantizar la falta de permeabilidad.

Se extrajo sangre al tiempo cero (antes de la dosis), 5 minutos, 4 horas y 1, 2, 3, 4, 6, 8, y 10 dias. Se extrajo una muestra de sangre de 1,5 ml de la arteria medial de la oreja utilizando una jeringa cargada con 150 ul de citrato de sodio al 3,8% y se transfirio a un tubo de microcentrifuga. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3.000 rpm en una centrifuga de mesa, se congelaron alicuotas de plasma en hielo seco y se guardaron a -80 °C.

Se analizaron las muestras para determinar la AT humana mediante inmunonefelometria. Los datos se analizaron mediante Microsoft Excel (Microsoft, Seattle, WA) y se determinaron los parametros farmacocineticos, tales como el area bajo la curva (AUC), la disponibilidad fraccional (F), la semivida (T1/2), la concentracion plasmatica maxima (Cmax) y el tiempo maximo para la concentracion plasmatica maxima (Tmax), etc. utilizando WinNonlin 5.2 (vista Pharsight Corp., Mountain CA). Los graficos se representaron utilizando Sigma Plot 8.0 (Systat Software, Inc, San Jose, CA). Los datos se sometieron a un analisis estadistico utilizando JMP 7.0 (SAS, Cary, NC).

Los niveles de h-AT en plasma de conejo despues de la administracion IV y SC se muestran en la figura 4. En el grupo de IV, el nivel de h-AT fue maximo en el primer punto de obtencion de muestras (5 minutos) y despues, los niveles disminuyeron rapidamente con el tiempo hasta el dia 10. El Tmax (el tiempo hasta los niveles maximos) de h-AT en los grupos que recibieron h-AT SC sola o con hialuronidasa fue 48 horas y 24 horas, respectivamente. Estos resultados muestran que la hialuronidasa redujo el tiempo hasta la concentracion plasmatica maxima de h-AT en comparacion con el grupo que recibio h-AT sola. Como se muestra en la tabla 4, la AUC en plasma de h-AT administrada por via intravenosa fue de 164,1 ± 14,3 h*mg/ml (media ± SD) y la de los grupos que recibieron h-AT por via SC con y sin hialuronidasa fueron 131,3 ± 26,4 y 126,9 ± 7,7 h*mg/ml, respectivamente.

Tabla 4. Area bajo la curva (AUC)

Grupo

AUC (h mg/ml) Media ± SD

Alfa-1 AT: IV

164,1 ± 14,3

Alfa-1 AT: SC

131,3 ± 26,4*

Alfa-1 AT: SC (mas hialuronidasa)

126,9 ± 7,7*

*P < 0,05 en comparacion con el grupo IV

Consistente con los resultados en el ejemplo 1 anterior, los resultados tambien muestran que las dosis iguales de h-AT administrada por via IV y SC dan lugar a una AUC mas baja (20%) para la administracion SC en comparacion con la AUC IV Ademas, la coadministracion de hialuronidasa y h-AT dio lugar a una reduccion del 23% de la AUC en comparacion con el grupo IV y una reduccion casi similar en la AUC como la del grupo al que se ha administrado h-AT SC sola. Esto sugiere que la hialuronidasa no afecto significativamente a la AUC en comparacion con el grupo al que se habia administrado SC h-AT sola. Se puede concluir a partir de los resultados de este estudio que la hialuronidasa solo afecta al Tmax pero no la AUC de la h-AT administrada SC en conejos.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Alfa-1 antitripsina (a1-AT) para su utilizacion en un procedimiento de tratamiento o prevencion de un trastorno o enfermedad asociada con la deficiencia de a1-AT en un sujeto mediante administracion subcutanea, en la que la

   5 cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de la administracion subcutanea de a1-AT es, como minimo, de aproximadamente el 120% de una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT administrada por via intravenosa, en la que la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT es suficiente para mantener en el sujeto un nivel valle de a1-AT en sangre, como minimo, de aproximadamente 80 mg/dl, en la que la cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de a1-AT es de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 300 mg de 10 a1 -AT por kg de peso corporal del sujeto.
2. 2. a1-AT para su utilizacion, segun la reivindicacion 1, en la que la formulacion es una formulacion liofilizada para reconstituir antes de la administracion.

   15 3. a1-AT para su utilizacion, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la formulacion comprende

   adicionalmente una hidrolasa.
3. 4. a1-AT para su utilizacion, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la formulacion comprende adicionalmente una hialuronidasa.

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