ES2605654T3 - Vacuna de ADN contra el virus de la fiebre amarilla - Google Patents

Abstract

Una vacuna de ADN que es capaz de realizar la coexpresión de la proteína PreM/ME del virus de la fiebre amarilla junto con LAMP, la proteína de asociación con la membrana lisosómica, y de presentar dichas proteínas de antígeno al sistema inmunológico a través de la vía de MHC II, en la que la secuencia de PreM/ME se fusiona con el dominio C-terminal de LAMP y dicha vacuna tiene la SEQ ID NO:8 o una secuencia con más del 80% de homología con esta.

Description

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DESCRIPCION

Vacuna de ADN contra el virus de la fiebre amarilla Campo de la invencion

La presente invencion se dirige a una vacuna de ADN que es capaz de realizar la coexpresion de la protema PreM/ME del virus de la fiebre amarilla junto con LAMP, la protema de asociacion con la membrana lisosomica ("Association Protein to the Lysosomal Membrane"), y presentar dichas protemas de andgeno al sistema inmunologica a traves de la via de MHC II.

Antecedentes de la invencion

El virus de la fiebre amarilla (YFV) se considera el prototipo de la familia Flaviviridae, tambien representada por diversos otros virus de importancia medica que provocan enfermedades graves, tales como el dengue, la encefalitis japonesa y el fiebre del Nilo occidental (Barrett, 2002). Segun la Organizacion Mundial de la Salud (OMS), se producen mas de 200.000 casos anuales en el mundo de infeccion por YFV, que incluyen 30.000 muertes (90% de casos diseminados en Africa). La estrategia mas segura para la prevencion de la enfermedad sigue siendo la vacunacion, ya aun no existe un farmaco eficaz contra la infeccion por YFV. En los ultimos 70 anos, mas de 400 millones de personas en todo el mundo han sido vacunadas con el virus atenuado de YF (17DD), que se considera muy seguro y eficaz. A pesar del exito de la vacunacion en masa con 17DD, que es capaz de inducir una respuesta duradera de anticuerpos neutralizantes y una respuesta de celulas T citotoxicas (Poland, Calisher et al., 1981; Reinhardt, Jaspert et al., 1998), en la bibliograda se han indicado sistematicamente acontecimientos graves adversos (como resultado de la vacunacion) [analizado en Liu, 2003]. En algunos casos, la inmunizacion se ha asociado directamente con un aumento en la gravedad de los smtomas (Monath, Arroyo et al., 2002) e incluso puede conducir a reacciones mortales (Vasconcelos, Luna et al., 2001; Lefeuvre, Marianneau et al., 2004). En este escenario, el desarrollo de una nueva estrategia de vacunacion, tal como las vacunas de ADN que codifican secuencias vmcas espedficas (Donnelly, Ulmer et al., 1997; Lewis y Babiuk, 1999; Robinson, 1999; Schultz, Pavlovic et al., 2000) reviste una importancia fundamental para el desarrollo de estrategias de vacunas aun mas seguras.

El genoma de YFV esta dispuesto en una molecula de ARNm positiva, de aproximadamente 10,8 Kb, flanqueada por 5 estructuras de "cierre de cadena y 3a manilla" terminales no poliadeniladas. El ARN de YFV codifica tres genes estructurales (Capsida - C, Membrana - M, y Envuelta - E) y 7 genes que codifican protemas no estructurales (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5). Durante el ensamblaje del virus, el dominio carboxi-terminal de la protema C actua como una secuencia senal para la translocacion del precursor PreM/M hacia el lumen del redculo endoplasmatico (ER) de la celula hospedante, lo cual permite la maduracion apropiada de las protemas M y E. La coexpresion de las protemas PreM/M y flavivirus en celulas de mairnfero produce la formacion de pardculas pseudovmicas capaces de inducir una respuesta humoral (Raviprakash, Kochel et al., 2000; Wu, Li et al., 2006), porque la protema E es la diana principal para los anticuerpos neutralizantes.

Se ha indicado que la coexpresion de las protemas PreM/M y E, como estrategia de vacuna, es capaz de inducir la produccion de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la encefalitis japonesa y el dengue (Konishi, Yamaoka et al., 1998; Konishi, Yamaoka et al., 2000; Konishi, Ajiro et al., 2003). Sin embargo, estas vacunas no inducen una respuesta a largo plazo de anticuerpos neutralizantes con titulaciones apropiadas (Lu, et al., Raviprakash, 2003). La ineficacia de estas formulaciones probablemente este relacionada con el mecanismo de presentacion de estos andgenos al sistema inmunologico de los hospedantes. La mayoria de los andgenos producidos de modo endogeno, caracteristicos de las vacunas de ADN, son secuestrados y presentados al sistema inmunologico del hospedante por las moleculas del MHC I. Para una respuesta inmunologica satisfactoria con una alta produccion de anticuerpos neutralizantes, resulta fundamental que los andgenos sean presentados a las celulas de tipo T auxiliares CD4+ por las moleculas de MHC II. El procesamiento y la presentacion de andgenos por MHC II induce la activacion de celulas T CD4+ que resulta fundamental para la actuacion de las vacunas geneticas, como ya ha sido demostrado en estudios de delecion de MHC II (Raviprakash, Marques et al., 2001) y merma de CD4+ en ratones (Lu et al., Raviprakash, 2003). La activacion de celulas CD4+ resulta fundamental para la induccion de respuestas de CD8+, para el desarrollo de celulas de memoria (Marques, Chikhlikar et al., 2003) y para la expansion clonal de celulas B espedficas de andgeno (De Arruda, Chikhlikar et al., 2004). Para que los andgenos producidos de modo endogeno se dirijan a las moleculas de clase II, y no a las de clase I, es necesario que estas protemas se fusionen con peptidos senal que las dirijan al compartimento lisosomico de la celula.

La posibilidad de dirigir a los andgenos producidos de modo endogeno para su procesamiento a traves de MHC II ha aumentado muddsimo despues del descubrimiento de una protema transmembrana de tipo I, denominada protema de membrana asociada a liposomas ("Lysosome-Associated Membrane Protein", LAMP (Chen, Murphy et al., 1985)). LAMP es una protema que se une a la membrana externa del lisosoma a traves de su secuencia carboxi- terminal YXX0, presente en una cola citoplasmica de 11 aminoacidos (Guarnieri, Arterburn et al., 1993; Rohrer, Schweizer et al., 1996; Obermuller, Kiecke et al., 2002). El trafico intracelular de LAMP incluye a los compartimentos multilaminares especializados de celulas presentadoras de andgenos ("Antigen-Presenting Cells", APC) inmaduras, denominados MIIC y CIIV, en los que tiene lugar el procesamiento y la formacion del complejo de peptido antigenico-

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MHC II (Kleijmeer, Morkowski et al., 1997; Drake, Lewis et al., 1999; Turley, Inaba et al., 2000). El descubrimiento de la colocalizacion de las moleculas de LAMP y MHC II permite su uso como soporte de antigenos quimericos que contengan las secuencias de las dianas LAMP, con el objetivo de dirigir el procesamiento del antigeno al compartimento de MHC II. Muchos trabajos han demostrado que los antigenos fusionados con LAMP (antfgeno/LAMP) son capaces de generar una mayor actividad proliferativa de linfocitos espedficos de antigenos, unas mayores titulaciones de anticuerpos y una intensa actividad T citotoxica, con relacion a los antfgenos salvajes no fusionados con LAMP (Rowell, Ruff et al., 1995; Wu, Guarneri et al., 1995; Ruff, Guarneri et al., 1997; Raviprakash, Marques et al., 2001; Su, Vieweg et al., 2002; Donnelly, Berry et al., 2003; Anwar, Chandrasekaran et al., 2005).

La vacuna de virus atenuados 17DD esta siendo producida en el campus de Manguinhos - FIOCRUZ/RJ desde 1937, es decir, desde hace al menos 70 anos. La inmunizacion en masa con la vacuna 17DD, asf como la lucha sistematica contra el vector de transmision de la fiebre amarilla (Aedes aegypti), han sido y continuan siendo estrategias cruciales para el control de la enfermedad en el pafs. A pesar de la eficacia y la seguridad de la vacuna 17DD, esta no esta recomendada a ninos, mujeres embarazadas y personas que presentan inmunodeficiencias y que son alergicas a las protemas del huevo (el sustrato para la produccion de la vacuna 17DD). Se calcula que aproximadamente 5% de la poblacion presenta alergias y/o efectos secundarios en respuesta a la vacuna, que es posible que culminen en casos raros de muerte provocada por la vacunacion.

En fechas recientes, tras la muerte de monos en regiones con vida salvaje en las que circula el YFV, la poblacion ha empezado a tener miedo por las especulaciones de la reintroduccion de la fiebre amarilla urbana en las zonas rurales. Tomando en cuenta el riesgo de infeccion prevalente en las areas tropicales, la invasion del entorno urbano por el vector de la enfermedad, el calentamiento global y la falta de polfticas apropiadas para combatir al insecto vector, no puede descuidarse el riesgo de dispersion de la enfermedad en areas urbanas. El caos provocado por el dengue en el estado de Rfo de Janeiro, que, por cierto, es transmitido por el mismo vector que la fiebre amarilla, ilustra el riesgo de un posible brote (aunque improbable) de la fiebre amarilla urbana en las zonas rurales. Tomando en cuenta todos estos factores, el desarrollo de una estrategia de vacuna complementaria y/o alternativa contra la fiebre amarilla puede complementar/sustituir el uso de la version de la vacuna con virus atenuados.

Aunque no se ha aprobado ninguna vacuna de ADN para su uso en seres humanos, este tipo de tecnologfa cada vez se estimula mas y potencialmente sustituira a las formulaciones basadas en microorganismos vivos. Las formulaciones con una base de ADN pueden manipularse y dosificarse con facilidad, no requieren condiciones especiales de temperatura para la conservacion y la distribucion, e incluso eliminan cualquier posible riesgo de infeccion por parte de los agentes vivos/atenuados. Este tipo de tecnologfa tambien permite la manipulacion de inmunogenos capaces de estimular al sistema inmunologico con epitopos y senales biologicas espedficos, lo cual evita el uso de antfgenos/epitopos innecesarios y potencialmente perjudiciales con respecto a posibles respuestas inmunologicas cruzadas (el principal obstaculo para el desarrollo de una vacuna eficaz contra el dengue, debido a la reaccion cruzada entre sus 4 serotipos). Por ultimo, con los avances tecnologicos de las herramientas para la manipulacion de microorganismos y la purificacion de moleculas a gran escala, las vacunas de ADN podnan ser producidas a mayor escala y con un coste final menor cuando se comparan con las formulaciones atenuadas/inactivadas.

Es importante advertir que, ante los resultados significativamente esperanzadores obtenidos por el grupo de los inventores, que han empleado de una vacuna genetica basada en la secuencia vmca de la protema E fusionada con LAMP y han mejorado esta vacuna mediante la optimizacion de antfgenos para la expresion en seres humanos, los inventores creen en la posibilidad de desarrollar y aplicar una vacuna de ADN aun mas segura, capaz de conferir inmunidad contra el virus de la fiebre amarilla en seres humanos. Este tipo de tecnologfa tambien puede servir de contribucion al desarrollo de otras vacunas vmcas, en especial contra otros flavivirus, tales como el virus del dengue.

El documento WO 2004/078986 A1 describe pseudopartmulas de flavivirus para su uso como vacunas que contienen glicoprotemas prM/E ensambladas sobre partmulas centrales retrovmcas.

El documento US 2004/257307 A1 describe vacunas quimericas que comprenden una secuencia de antfgeno fusionada con un dominio para el transporte de la protema a un compartimento endosomico, por ejemplo, con un dominio del polipeptido LAMP. Estos antfgenos pueden ser protemas procedentes del virus de la fiebre amarilla.

El problema de la presente invencion es proporcionar otros antfgenos del virus de la fiebre amarilla (YFV) dirigidos al compartimento lisosomico.

Segun la presente invencion, dicho problema se resuelve fusionando el polipeptido PreM/ME de YFV al dominio C- terminal de LAMP, tal como se especifica en las reivindicaciones.

Sumario de la invencion

La presente invencion, en su aspecto mas amplio, se dirige a una vacuna de ADN optimizada basada en la region que codifica la envuelta del virus de la fiebre amarilla fusionada con la protema de asociacion con la membrana lisosomica (LAMP), que es capaz de procesar el antfgeno codificado y presentarlo al sistema inmunologico a traves de MHC, segun se define en las reivindicaciones.

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Breve descripcion de las figuras y las tablas

Figura 1: Representacion esquematica de las regiones de asociacion para la amplificacion de PreM/M-E salvaje (para YFE) y PreM/M-E fusionada con LAMP (pL/YFE). El esquema representa el genoma completo del virus de la fiebre amarilla, compuesto de 3 genes estructurales [Capsida (C), Membrana (PreM/M) y Envuelta (E)] y 7 genes no estructurales (NS1-NS5). Las flechas negras indican las regiones de asociacion de los cebadores (oligonucleotidos) empleados para la amplificacion de PreM/M-E salvaje (region carboxi-terminal de la region transmembrana X de la capsida C-terminal de la envuelta). Para la amplificacion de PreM/M-E, para la fusion con LAMP, el cebador "inverso" empleado se diseno para hibridarse antes de la region transmembrana de la envuelta (flecha blanca).

Figura 2: Producto de la PCR de PreM/M-E del virus YF. Despues de la amplificacion mediante PCR empleando cebadores disenados para la secuencia PreM/M-E salvaje (tabla 1), se obtuvo un fragmento de aproximadamente 2000 pb, tal como se esperaba. El producto de la PCR indicado migro en un gel de agarosa al 1% y se visualizo con el transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (Invitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 1650 y 2000 pares de bases.

Figura 3: Productos de la PCR de PreM/M-E de YFV para la fusion con LAMP y C-LAMP (humana). Despues de la amplificacion mediante PCR empleando cebadores disenados para las secuencias de PreM/M-E para la fusion con LaMp y C-LAMP humana (tabla 1), se obtuvo un fragmento de aproximadamente 1900 pb (PreM/M-E) y otro de 125 pb (C-LAMP), tal como se esperaba. Estos productos de la PCR migraron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con el transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (Invitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 100 y 2000 pares de bases.

Figura 4: Digestion de ADN de plasmido para confirmar la clonacion de la secuencia de PreM/M-E salvaje en el vector pGEMT-Easy. Despues de la transformacion con la conexion pGEMT-Easy + PreM/M-E salvaje, se inocularon 3 clones bacterianos blancos (seleccionados mediante IPTG/X-Gal) en medio lfquido para la posterior extraccion del ADN de plasmido. Las minipreparaciones obtenidas despues se digirieron con las enzimas Xhol y Notl para confirmar la clonacion de PreM/M-E salvaje en el vector pGEMT-Easy. Los productos de la digestion despues migraron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con un transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (Invitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 3000 y 2000 pares de bases. Solo el clon 2, asterisco, libero un fragmento del tamano esperado (2000 pb).

Figura 5: Digestion de ADN de plasmido para confirmar la clonacion de la secuencia de PreM/M-E para la fusion con LAMP en el vector pGEMT-Easy. Despues de la transformacion con la conexion pGEMT-Easy + PreM/ME para la fusion con LAMP, se inocularon 8 clones bacterianos blancos (seleccionados mediante IPTG/X-Gal) en medio lfquido para la posterior extraccion del ADN de plasmido. Las minipreparaciones obtenidas despues se digirieron con las enzimas NheI y XhoI para confirmar la clonacion de PreM/M-E para la fusion con LAMP en el vector pGEMT- Easy. Los productos de la digestion despues migraron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con el transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (Invitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 1650 y 2000 pares de bases. Los clones 3, 5 y 8 (asteriscos) liberaron fragmentos del tamano esperado (1900 pb).

Figura 6: Digestion de ADN de plasmido para confirmar la clonacion de C-LAMP en el vector pGEMT-Easy. Despues de la transformacion con la conexion pGEMT-Easy + C-LAMP, se inocularon 3 clones bacterianos en medio lfquido para la posterior extraccion del ADN de plasmido. Las minipreparaciones obtenidas despues se digirieron con las enzimas XhoI y XbaI para confirmar la clonacion de C-LAmP en el vector pGEMT-Easy. Los productos de la digestion despues migraron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con el transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (Invitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 100 y 3000 pares de bases. Del total de 3 clones, todos liberaron fragmentos del tamano esperado (125 pb, asteriscos).

Figura 7: Digestion de ADN de plasmido para confirmar la clonacion de la secuencia de PreM/M-E salvaje en el vector p43.2. Despues de la transformacion con la conexion p43.2 + PreM/M-E salvaje, se inocularon 3 clones bacterianos en medio lfquido para la posterior extraccion del ADN de plasmido. Las minipreparaciones obtenidas despues se digirieron con las enzimas XhoI y NotI para confirmar la clonacion de PreM/M-E salvaje en el vector p43.2 (p/YFE). Los productos de la digestion despues migraron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con el transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (Invitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 2000 y 5000 pares de bases. Todos los clones liberaron fragmentos del tamano esperado (2000 pb, asteriscos).

Figura 8: Digestion de ADN de plasmido para confirmar la clonacion de la secuencia de p43.2-PreM/ME para la fusion con LAMP en el vector p43.2. Despues de la transformacion con la conexion p43.2 + PreM/M-E para la fusion con LAMP, se inocularon 8 clones bacterianos en medio lfquido para la posterior extraccion del ADN de plasmido. Las minipreparaciones obtenidas despues se digirieron con las enzimas NheI y XhoI para confirmar la clonacion de p43.2-PreM/M-E para la fusion con LAMP en el vector p43.2. Los productos de la digestion despues migraron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con el transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (Invitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 2000 y 5000

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pares de bases. Del total de 8 clones, 7 liberaron fragmentos del tamano esperado (1900 pb, asteriscos).

Figura 9: Digestion de ADN de plasmido para confirmar la clonacion de C-LAMP en el vector p43.2-PreM/ME para la fusion con LAMP. Despues de la transformacion con la conexion p43.2-PreM/ME + C-LAMP, se inocularon 7 clones bacterianos en medio lfquido para la posterior extraccion del aDn de plasmido. Las minipreparaciones obtenidas despues se digirieron con las enzimas Xhol y Xbal para confirmar la clonacion de C-LAmP en el vector p43.2- PreM/ME/LAMP (pL/YFE). Los productos de la digestion despues migraron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con el transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (Invitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 100 y 7000 pares de bases. Del total de 7 clones, todos liberaron fragmentos del tamano esperado (125 pb, asteriscos).

Figura 10: Celulas 293 transfectadas con las construcciones p/YFE a pL/YFE. La validacion de la expresion de protemas codificadas por los plasmidos p/YFE y pL/YFE, asf como su localizacion intracelular, se realizo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Se detectaron la protema E y E/LAMP empleando un anticuerpo policlonal anti- YFV. Se confirmo la distribucion esperada de la protema E vmica salvaje, generalmente asociada con la membrana reticular (A). Ademas, la protema quimerica E/lAmP (presente en celulas 293 transfectadas con pL/YFE) aparecio distribuida por la membrana reticular, mas concretamente asociada con las membranas lisosomicas (lo cual tambien se esperaba, debido a la presencia de LAMP).

Figura 11: Digestion de ADN de plasmido, en condiciones sin endotoxinas, para confirmar la identidad de los vectores (p/YFE y pL/YFE). Despues de la transformacion con las construcciones p/YFE y pL/YFE, se inocularon colonias aisladas de cada construccion en medio lfquido para la posterior extraccion del ADN de plasmido. Las gigapreparaciones obtenidas despues se digirieron. La construccion con la forma salvaje (w/YFE) se sometio a dos ensayos de digestion. El primero se realizo con las enzimas Xhol y Xbal, en el que se produjo la linearizacion de la construccion (1), y tambien con las enzimas Xhol y Notl que generaron la liberacion del fragmento codificado por p/YFE. La construccion con LAMP (pL/YFE) tambien se sometio a dos ensayos de digestion. El primero se realizo con las enzimas Xhol y Xbal, en el que se produjo la liberacion de LAMP (asterisco), y tambien con las enzimas Nhel y Xbal que generaron la liberacion del fragmento codificado por pL/YFE. Los productos de la digestion despues migraron en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron con el transiluminador de luz ultravioleta. Se empleo 1kb Plus Ladder (lnvitrogen®) como marcador de peso molecular (PM), indicado como referencia en las bandas de 1650 y 100 pares de bases.

Figura 12: Comparacion de las respuestas celulares inducidas en ratones Balb/C, empleando la vacuna 17DD y las construcciones p/YFE y pL/YFE. Se inmunizaron ratones Balb/C en los dfas 0 y 21 con: (A) 104 unidades formadoras de colonias (PFU) de la vacuna 17DD, (B) 50 ug de la vacuna pL/YFE, o (C) 50 ug de la vacuna p/YFE. De 7 a 10 dfas despues de la ultima inmunizacion, se aislaron muestras de esplenocitos de los ratones para ensayar con ELISPOT-IFN-y, empleando un banco de peptidos sinteticos, de 15 aminoacidos cada uno y con un "solapamiento" de 11 aminoacidos entre ellos, que cubren la protema E completa de YFV. Esta figura representa un promedio de 2-4 experimentos realizados con "agrupaciones" de 3-5 ratones cada una.

Figura 13: Niveles de anticuerpos neutralizantes detectados en ratones BALB/c y C57B1/6 despues de la inmunizacion con las vacunas 17DD, pL/YFE y p/YFE. Se inmunizaron ratones de ambas razas con vacunas convencionales o de ADN en los dfas 0, 30 y 45 y se obtuvo su suero inmunologico en los dfas 15, 45 y 60. Los sueros se ensayaron individualmente con neutralizacion de reduccion de placas (PRNT), y se compararon con suero de mono que contema anticuerpos neutralizantes contra YFV en una concentracion conocida. La construccion pL/YFE, aunque induce una produccion de anticuerpos neutralizantes aproximadamente 3,5 veces menor que la vacuna 17DD, es capaz de inducir unas titulaciones de anticuerpos neutralizantes al menos 7 veces mayores que las titulaciones inducidas por p/YFE.

Figura 14: Evaluacion de la proteccion contra YFV, a traves de una inyeccion intracerebral ensayada en ratones previamente inmunizados con 17DD y pL/YFE. Los ensayos de proteccion se realizaron empleando el modelo de inmunizacion/exposicion, mediante la inyeccion de 105 pFu del virus de la vacuna 17DD (por via intracerebral) en ratones previamente inmunizados con la vacuna 17DD y con la vacuna pL/YFE. Los animales se inmunizaron 3 veces (dfas 0, 30 y 45) y se expusieron 15 dfas despues de la ultima inmunizacion. Tanto la vacuna 17DD como la vacuna pL/YFE fueron capaces de proteger al 100% de los animales expuestos. La tabla 2 anade la informacion de esta figura con relacion al numero de animales expuestos, asf como la comparacion de la eficacia de las vacunas de ADN en ambas razas.

Tabla 1: Oligonucleotidos (cebadores) empleados para generar las construcciones de vacuna p/YFE y pL/YFE. Para el diseno de los nucleotidos capaces de amplificar las secuencias de PreM/M-E salvaje y PreM/M-E-LAMP se empleo el software de dominio publico Ape [desarrollado por Dr. M. Wayne Davis (
http://www.biology.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/)].

Tabla 2: Resultados del ensayo de proteccion en ratones BALB/c y C57B1/6 que compara la vacuna 17DD con la vacuna de ADN pL/YFE. Los ratones inmunizados con la vacuna 17DD y con la construccion de ADN pL/YFE se expusieron por via intracerebral a YFV 17DD. Ambas razas de ratones resultaron 100% protegidos por la vacuna convencional y por la vacuna de ADN. Como control negativo, los ratones se sometieron a los mismos programas de

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inmunizacion con el vector p43.2 vacm y PBS.

Tabla 3: Comparacion de los niveles de expresion de las protemas de la envuelta del virus de la fiebre amarilla, salvajes y optimizadas, mediante citometna de flujo. Se transfectaron celulas 293 con 1 ug de cada vacuna de ADN empleando lipofectamina, y se tineron con suero de conejo anti-envuelta del virus de la fiebre amarilla. La transfeccion de las celulas se normalizo empleando como control interno un plasmido que codifica una protema fluorescente y con relacion al nivel de expresion de la protema codificada por la construccion codificadora de la secuencia nativa de la envuelta (numero 2). El plasmido optimizado (numero 6) mostro un nivel de expresion 6,5 veces mayor que el plasmido que codifica la secuencia nativa (numero 2).

Descripcion detallada de la invencion

Los presentes inventores han desarrollado y evaluado la eficacia de expresion y la capacidad para inducir una respuesta inmunologica de dos vacunas geneticas, ambas basadas en la estrategia de la coexpresion de las protemas PreM/M y E de YFV (una salvaje y la otra fusionada con LAMP). Se emplearon ambas construcciones, (p/YFE) salvaje y con LAMP (pL/YFE), para transfectar celulas humanas, y se detectaron las respectivas protemas codificadas por las construcciones mediante inmunofluorescencia. Despues los vectores p/YFE y pL/YFE se inocularon en ratones y se analizaron las respuestas inmunologicas inducidas por cada construccion, en terminos de respuestas celulares y humorales. Los resultados se consideraron excelentes, puesto que las dos construcciones son capaces de inducir respuestas de celulas T contra los mismos epitopos inducidos por la vacuna 17DD, y PL/YFE tambien fue capaz de inducir unas titulaciones elevadas de anticuerpos neutralizantes. Estos vectores tambien se inocularon en ratones que despues fueron expuestos a YFV para evaluar si estas construcciones son capaces de proteger a estos animales contra FA. A pesar de que la construccion pL/YFE es capaz de generar unas titulaciones de anticuerpos neutralizantes mas altas que la construccion salvaje p/YFE en Balb/c y en C57B1/6 inmunizados, ambas construcciones confieren 100% de proteccion a los ratones expuestos. Estos resultados se consideran excelentes.

La vacuna pL/YFE tambien se optimizo, generando la construccion pL/YFEopt, empleando el algoritmo genetico del programa LETO 1.0 (Entelechon®). Se tomaron en cuenta varios factores en el proceso de optimizacion, tales como: utilizacion de codones, estructura secundaria del ARNm, presencia de motivos de ADN repetitivos, contenido en GC, presencia/ausencia de sitios de restriccion, sitios de "corte y empalme" cnpticos, etc. Las secuencias optimizadas se introdujeron en una smtesis comercial (Geneart®) y despues se subclonaron en el vector 8L, salvaje y con LAMP. Las construcciones de vacuna optimizadas, asf como p/YFE salvaje y pL/YFE, se inocularon en ratones convencionales y transgenicos (que expresan HLA humanas) y se evaluaron para su inmunogenicidad empleando ensayos ELISPOT, neutralizacion de virus mediante reduccion de placas (PRNT) y desaffo frente a YVF.

La invencion se describira a continuacion empleando ejemplos. Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invencion y representan realizaciones preferidas; los expertos en la tecnica saben o pueden saber, empleando solo la experimentacion habitual, como emplear otros materiales y tecnicas apropiadas.

Amplificacion con PCR

Los cebadores disenados (tabla 1) para la amplificacion de PreM/M-E salvaje, PreM/M-E para la fusion con LAMP y el dominio C-terminal de LAMP, permiten obtener las respectivas secuencias con los pesos moleculares esperados. La secuencia de PreM/M-E salvaje se amplifico empleando cebadores que flanquean la region N-terminal de PreM/M (de modo mas espedfico, el nivel de la region carboxi-terminal de la capsida) y la region transmembrana C- terminal de la envuelta. Para la amplificacion de la secuencia de PreM/M-E, con el objetivo de la fusion con el dominio C-terminal de LAMP, el cebador "directo" empleado se diseno para alinearse con la misma region de la capsida. Ademas, el cebador "inverso" utilizado se diseno para alinearse mas internamente dentro de la region que codifica la envuelta. Asf, la secuencia de PreM/M-E (para la fusion con LAMP) carece del dominio transmembrana C- terminal de la envuelta, con el objetivo de su sustitucion por el dominio C-terminal de LAMP (figura 1).

El producto de la PCR de PreM/M-E para la fusion con LAMP tiene aproximadamente el mismo tamano que el producto de PreM/M-E salvaje, puesto que la region eliminada de la envuelta solo tiene 100 pares de bases (pb). Para sustituir este dominio transmembrana C-terminal de la envuelta, se disenaron cebadores capaces de amplificar la region C-terminal de LAMP-1 humana (C-LAMP). El cebador "directo" permite fusionar (en fase) PreM/M-E con CLAMP, mientras que el cebador "inverso" presenta el codon de fin de la traduccion. El producto de la PCR de la secuencia de PreM/M-E salvaje, con aproximadamente 2000 pares de bases (pb), puede observarse en la figura 2. Los productos de la PCR de PreM/ME para la fusion con LAMP (1900 pb) y C-LaMP (125 pb) pueden observarse en la figura 3.

Clonacion de los productos de la PCR obtenidos en el vector pGEMT-Easy

Tras confirmar los tamanos esperados de los productos de la PCR de PreM/ME salvaje, PreM/M-E para la fusion con LAMP y C-LAMP, estos fueron clonados en el vector pGEMT-Easy. Para facilitar la seleccion de los clones positivos, se seleccionaron los clones que conteman la insercion insertada en el fragmento lacZ del gen de la p - galactosidasa, pero solo los clones blancos de cada construccion. Se seleccionaron 3 clones de la placa que contema las bacterias transformadas con la conexion pGEMT-Easy + PreM/ME salvaje. Estos clones se inocularon

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en medio de crecimiento Ifquido para la posterior preparacion de ADN de plasmido (minipreparaciones) y la prueba de digestion para confirmar la clonacion. De los 3 clones seleccionados, solo 1 libera la insercion esperada de 2000 pb de la construccion de PreM/M-E salvaje (figura 4). Con respecto a la conexion pGEMT-Easy + PreM/ME para la fusion con LAMP, se seleccionaron 8 clones blancos. Estos clones tambien se sometieron a una extraccion del plasmido y a las pruebas de digestion. De los 8 clones seleccionados, 3 liberaron la insercion de 1900 esperada, con relacion a la construccion PreM/M-E para la fusion con LAMP (figura 5). Se seleccionaron 3 clones de la conexion pGEMT-Easy + C-LAMP, todos los cuales liberaron la insercion despues de la digestion (figura 6).

Subclonacion de los fragmentos clonados en pGEMT-Easy en el vector p43.2

Para la subclonacion de PreM/M-E en el vector p43.2, este fragmento se corto del vector pGEMT-Easy y se inserto en el vector p43.2. Para facilitar la seleccion de los clones positivos, se conectaron 3 concentraciones diferentes de insercion a una concentracion constante de vector p43.2 (se realizo una conexion en ausencia de insercion como control negativo). Asf, se selecciono la placa con el mayor numero de clones, mediante la comparacion de las placas con diferentes concentraciones de insercion con el control negativo para la seleccion de clones. Se seleccionaron 3 clones de esta placa que conteman bacterias transformadas con la conexion p43.2 + PreM/M-E salvaje. Estos clones se inocularon en medio de crecimiento lfquido para la posterior preparacion de ADN de plasmido y la prueba de digestion para confirmar la clonacion. De los 3 clones seleccionados, todos liberaron la insercion de 2000 pb esperada de la construccion de p/YFE (figura 7). Con respecto a la construccion p43.2 + PreM M-E/LAMP, fue necesario construir un vector intermedio que contema PreM/M-E para la fusion con LAMP, para la posterior fusion de LAMP. Asf, el fragmento PreM/M-E para la fusion con LAMP se corto del vector pGEMT-Easy y se subclono en el vector p43.2, generando la construccion intermedia p43.2-PreM/M-E para la fusion con LAMP. Se seleccionaron 8 clones de esta conexion, de los cuales 7 liberaron la insercion de 1900 pb esperada despues de la prueba de la digestion (figura 8). Para fusionar LAMP al fragmento p43.2-PreM/ME para la fusion con LAMP, C-LAmP fue cortado y escindido del vector pGEMT-Easy/C-LAMP y despues fue purificado. Despues, el vector p43.2-pM/ME para la fusion con LAMP se corto con las mismas enzimas, lo cual permite la insercion de LAMP en su C-terminal, generando la construccion pL/YFE. Para confirmar la insercion de LAMP en p43.2-PreM/ME para la fusion con LAMP, se digirieron 7 clones, y todos liberaron el fragmento de 125 pb esperado (figura 9).

Secuenciacion de las construcciones p/YFE y pL/YFE

Para confirmar la identidad y la calidad de las secuencias subclonadas en el vector p43.2, los respectivos vectores se secuenciaron empleando cebadores internos disenados para hibridarse a cada 400 pb de las inserciones clonadas (que significa "directo" e "inverso"). Las secuencias obtenidas se analizaron mediante los programas ApE® y Lasergene®. En la construccion p/YFE se encontraron dos mutaciones puntuales no silenciosas, es decir, con este cambio, el total de aminoacidos es de 644. Los cambios fueron de una alanina (A) a una valina (V) en la posicion 250, y de una serina (S) a un acido aspartico (D) en la posicion 349. Estas mutaciones tambien fueron las unicas encontradas en la construccion pL/YFE, lo cual indica que las mutaciones no aparecen al nivel de la PCR sino que ya estaban presentes en el molde de ADN empleado para la amplificacion. Teniendo en cuenta que la protema E presenta varios epitopos para celulas B (porque solo las protemas E y NS1 son capaces de generar anticuerpos neutralizantes), asf como para celulas T (los datos no se muestran, fueron obtenidos por empleados del grupo de los inventores), se considera que estas mutaciones son irrelevantes para este estudio de desarrollo de vacunas.

Deteccion de las protemas E y E/LAMP mediante inmunofluorescencia

Para evaluar la expresion de las protemas E y E/LAMP codificadas por las construcciones p/YFE y pL/ YFE, respectivamente, se transfectaron celulas 293 humanas con estas vacunas de ADN. A pesar de la baja eficacia de expresion (aproximadamente 40%), ambas protemas fueron detectadas en el compartimento celular apropiado. Tal como se esperaba, se confirmo la distribucion reticular caractenstica del antfgeno salvaje E (figura 10A), asf como la distribucion lisosomica caractenstica de la protema E-LAMP (figura 10B).

Evaluacion de la respuesta inmunologica inducida en ratones inmunizados con las vacunas p/YFE y pL/YFE

Para los ensayos de inmunizacion, las vacunas de ADN p/YFE y pL/YFE se prepararon inicialmente a gran escala sin endotoxinas. Las preparaciones obtenidas se sometieron a pruebas de digestion con enzimas espedficas para asegurar la calidad/identidad de los vectores. El vector p/YFE se digirio con las enzimas Xhol y Xbal y las enzimas Xhol y Notl, mientras que el vector pL/YFE se digirio con las enzimas Xhol y Xbal y las enzimas Nhel y Xbal. Todas las digestiones liberaron fragmentos de ADN con el tamano esperado (figura 11). Despues, las construcciones p/YFE y pL/YFE se emplearon para ensayos experimentales de inmunizacion en ratones.

Los plasmidos p/YFE y pL/YFE, sin endotoxinas, se inocularon en ratones BALB/c y C57B1/6, y se empleo como control positivo la vacuna 17DD y como controles negativos disolucion salina y el vector p43.2 vado. Las respuestas inmunologicas inducidas por cada construccion se analizaron en terminos de respuesta celular (mediante el ensayo "Enzyme-Linked Immunosorbent SPOT” (ELISPOT), SPOT inmunoadsorbente ligado a enzimas) y respuesta humoral (mediante ensayos de neutralizacion de virus, PRNT). Los resultados obtenidos se consideraron excelentes, porque las dos construcciones son capaces de inducir una respuesta de celulas T contra los mismos epitopos inducidos por la vacuna de virus atenuados convencional (figura 12), y la construccion pL/YFE aun fue

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capaz de inducir anticuerpos neutralizantes a una concentracion considerada bastante satisfactoria. La construccion pL/YFE, aunque induce una produccion de anticuerpos neutralizantes aproximadamente 3,5 veces menor que la vacuna 17DD, es capaz de inducir unas titulaciones de anticuerpos neutralizantes al menos siete veces mayores que p/YFE (figura 13).

El vector pL/YFE despues se inoculo 3 veces (50 |ig/inmunizacion) en ratones BALB/c y C57BL/6. De nuevo, se empleo la vacuna 17DD como control positivo, y se emplearon el vector p43.2 vado y disolucion salina (1X PBS) como controles negativos. Dos semanas despues de la ultima inmunizacion, los animales se expusieron a una inoculacion contra YFV por medio del inoculo de 105 unidades formadoras de placa (PFU) de la vacuna 17DD (por via intracerebral). La vacuna 17DD y la vacuna de ADN pL/YFE (E-LAMP) confirieron una proteccion del 100% a los ratones expuestos (figura 14 y tabla 2).

Optimizacion de la vacuna pL/YFE que genera las construcciones pL/YFEoptl y pL/YFEopt2

Para mejorar la eficacia de la expresion del antigeno E en celulas eucariotas, con el objetivo de experimentar en primates, se optimizo la secuencia de ADN que codifica la protema E. Esta secuencia se analizo/optimizo con respecto a caractensticas tales como la "utilizacion de codones", estructura secundaria del ARN mensajero (ARNm), distribucion del contenido en GC, motivos de ADN repetitivos, sitios de restriccion, sitios de "corte y empalme" cnpticos, etc. El proceso de optimizacion toma en cuenta los diversos parametros mencionados anteriormente, y busca un equilibrio entre todos.

Se generaron dos versiones optimizadas de la vacuna pL/YFE, denominadas pL/YFEopt1 y pL/YFEopt2. Las construcciones optimizadas despues se emplearon para transfectar celulas 293 humanas, con el objetivo de evaluar la eficacia de expresion del antfgeno E-LAMp optimizado (E-LAMPopti-2) con respecto al antfgeno E-LAMP salvaje. Mediante un ensayo de inmunofluorescencia, se considero que la expresion de E-LAMP es al menos 20 veces mayor (los datos no se muestran). Aunque no se han realizado ensayos cuantitativos de transferencia Western para evaluar con mas precision el numero de veces que E-LAMPOPT1 se expresa mas con relacion a E-LAMP salvaje, se puede decir que la expresion de estos antfgenos de E-LAMPOPT1 es significativamente mayor que la expresion del antfgeno salvaje.

Considerando la mayor eficacia de la expresion de p43.2/E-LAMPopti-2 con relacion a p43.2/E-LAMP salvaje, se cree que probablemente la vacuna de ADN optimizada sera aun mas eficaz que la vacuna salvaje previamente ensayada. Es posible que la mayor eficacia de expresion venga acompanada de una mayor titulacion de anticuerpos neutralizantes, aumentando asf el potencial de la vacuna optimizada con respecto al numero de dosis y concentracion de ADN en cada dosis. Aunque el vector p43.2 ha sido optimizado para la expresion en celulas eucariotas (mediante la combinacion de promotores espedficos, factores de transcripcion, secuencias senal para la poliadenilacion, marcadores de resistencia, etc.), algunas secuencias de ADN contenidas en este (tal como, por ejemplo, la secuencia que codifica el marcador de resistencia a la ampicilina) no estan permitidas por the Food and Drug Administration (FDA) para su uso en seres humanos. Por otra parte, otros vectores de expresion, tales como el vector 8L, por ejemplo, no presentan estas secuencias no deseadas y, por tanto, no estan prohibidos por la FDA. Asf, los antigenos E-LAMPopti-2 pudieron clonarse en el vector 8L y generaron las construcciones p8L/E-LAMPopti-2 que inicialmente se evaluaran en ratones y despues en monos.

Ejemplo 1: Construccion de los vectores de transfeccion p43.2-PreM/M-E (p/YFE) y p43.2-PreM/M-E-LAMP (pL/YFE)

1.1 - Amplificacion y purificacion de los productos de la PCR

La secuencia de PreM/M-E de VFA, que incluye la secuencia carboxi-terminal de la capsida (responsable de la translocacion de PreM/M al retfculo endoplasmico) se amplifico mediante PCR, a partir de un plasmido que contema el genoma completo de VFA [el clon infeccioso fue suministrado amablemente por Dr. Ricardo Galler (Biomanguinhos-IOC/FIOCRUZ)]. El PreM/M- E fue amplificado con dos parejas distintas de cebadores para obtener la secuencia salvaje (que se extiende desde el nucleotido 392 hasta el nucleotido 2452 del genoma del virus de la fiebre amarilla, basandose en la secuencia con n.° de registro NC 002031 de Genbank - NCBI), asf como a partir de una secuencia de fusion que incorpora LAMP en la region carboxi-terminal (que se extiende desde el nucleotido 392 al nucleotido 2323 del genoma del virus de la fiebre amarilla, basandose en la secuencia con n.° de registro NC 002031 de Genbank - NCBI). La secuencia C-terminal de LAMP se amplifico a partir de un plasmido que contema las regiones N-terminal y C-terminal de LAMP-1 humana, p43.2 hLAMP/GAG [suministrado amablemente por Dr. Ernesto Marques (LaViTE- CPqAM/FIOCRUZ)]. Se emplearon cebadores espedficos que permiten la incorporacion de sitios de restriccion espedficos, del codon ATG de inicio de la traduccion (en contexto con la secuencia Kozak) y del codon de fin de la traduccion (vease la tabla 1). Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 50 |il que contema: 1X tampon Tgo (Roche®); dNTP 0,2 mM (Invitrogen®); 0,6 uM de cada cebador; 1 unidad de la enzima ADN polimerasa Tgo (Roche®); 10 ng del ADN molde. Las muestras se amplificaron en un termociclador de gradiente Mastercycler (Eppendorf®) programado como sigue: 1- 94 °C durante 2 min (desnaturalizacion); 2 - [94 °C durante 1 minuto (desnaturalizacion); 55 °C durante 30 segundos (hibridacion); 68 °C durante 75 segundos (extension) - 30 ciclos (amplificacion)]; 3 - 68 °C durante 10 minutos (extension y relleno de los fragmentos incompletos). Los productos de la PCR migraron en un gel de agarosa para la posterior purificacion empleando el kit

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comercial QIAEX II (Qiagen®), segun las recomendaciones del fabricante.

1.2 - Clonacion de los productos de la PCR en un vector de replicacion

Los productos de la PCR purificados despues se sometieron a un tratamiento con la enzima ADN polimerasa Taq (Invitrogen®) para anadir adeninas libres a sus extremos. Esta reaccion se realizo en un volumen final de 10 |il que contema: 1X de tampon de polimerasa Taq (Invitrogen®); MgCh 1,5 mM; dATP 2 mM (Invitrogen®); 5 unidades de ADN polimerasa Taq (Invitrogen®); 5 |il del producto de la PCR purificado. Las muestras se incubaron a 72 °C durante 20 minutos en un termociclador de gradiente Mastercycler (Eppendorf®). Despues del tratamiento con la ADN polimerasa Taq (Invitrogen®), los productos de la PCR adenilados se emplearon para la clonacion en el vector pGEMT-Easy (Promega®). Las reacciones de conexion se realizaron empleando el kit I del sistema del vector pGEMT-Easy (Promega®) en un volumen final de 10 |il que contema : 1X tampon "Rapid Ligation"; 50 ng del vector pGEMT-Easy; 0,4 unidades de ADN ligasa T4; 2 |il de los productos de la PCR tratados. La reaccion de conexion se realizo a 4 °C durante aproximadamente 15 horas. Despues las conexiones se emplearon para transformar celulas competentes para confirmar la clonacion. Las transformaciones se realizaron en un volumen final de 80 |il que contema: 50 |il de celulas competentes (Escherichia coli TG1); 25 ul de tampon de transformacion (MgCh 5 mM; Tris-HCl 5 mM, pH 7,4); 5 |il de cada producto de la conexion. Las reacciones de transformacion se incubaron durante 30 minutos sobre hielo y despues se sometieron a un choque termico (37 °C - 5 minutos) y se volvieron a enfriar en hielo. Las celulas se sembraron en placas con medio de cultivo solido Luria-Bertani (LB), que contema ampicilina en una concentracion de 50 |ig/ml e IPTG/X-Gal (IPTG 10 mM; 0,1 mg de X-Gal). Las placas se incubaron durante aproximadamente 15 horas a 37 °C, y despues se incubaron a 4 °C durante 1 hora para facilitar la discriminacion entre los clones vados (azul) y los clones que conteman la insercion (blancos).

1.3 - Preparacion del ADN del plasmido

Para confirmar la clonacion se seleccionaron las colonias blancas de cada conexion para preparar el ADN del plasmido y la prueba de digestion. Las colonias se inocularon en 2 ml de medio LB lfquido que contema ampicilina (50 |ig/ml), y se cultivaron durante aproximadamente 15 horas a 37 °C. Despues se centrifugaron 1,5 ml de cada cultivo (13.200 rpm - 5 minutos) para obtener un sedimento bacteriano. La extraccion del ADN del plasmido se realizo a partir de estos "sedimentos" empleando el kit de minipreparaciones de centrifugacion QIAprep (Qiagen®), segun las recomendaciones del fabricante. Despues se emplearon los ADN del plasmido, 50 |il cada uno, para la confirmacion de la clonacion mediante ensayos de digestion. Las reacciones de digestion se realizaron en un volumen final de 10 |il que contema: 1X tampon de digestion; 1,5 |il de ADN del plasmido. Todas las digestiones se realizaron a 37 °C durante aproximadamente 4 horas. El vector pGEMT-Easy que contema el fragmento PreM/M-E se digirio con 0,01 unidades de la enzima XhoI y 0,01 unidades de la enzima NotI. El vector pGEMT-Easy, que contema la misma secuencia pero con sitios de restriccion diferentes que permiten la insercion posterior de LaMp, se digirio con 0,005 unidades de la enzima NheI y 0,01 unidades de la enzima XhoI. Asf, el vector pGEMT-Easy que contiene el fragmento C-LAMP fue digerido con 0,01 unidades de la enzima XhoI y 0,01 unidades de la enzima XbaI. A partir de los resultados de la digestion, verificados sobre gel de agarosa, se digirieron los clones positivos de cada construccion a mayor escala para la posterior purificacion de los fragmentos. Las reacciones de digestion a gran escala se realizaron en un volumen final de 50 |il que contema: 1X tampon de digestion; 15 |il de ADN del plasmido. Todas las digestiones se realizaron a 37 °C durante aproximadamente 4 horas. El vector pGEMT-Easy que contiene el fragmento PreM/M-E se digirio con 0,1 unidades de la enzima XhoI y 0,05 unidades de la enzima NotI. El vector pGEMT-Easy que contiene el fragmento PreM/M-E para la fusion con LAMP se digirio con 0,05 unidades de la enzima NheI y 0,1 unidades de la enzima XhoI, y el vector pGEMT-Easy que contiene el fragmento C-LAMP se digirio con 0,1 unidades de la enzima XhoI y 0,1 unidades de la enzima XbaI. Despues, cada fragmento se purifico mediante extraccion en un gel de agarosa, empleando el kit de extraccion en gel QIAEX kit II (Qiagen®).

1.4 - Subclonacion de PreM/M-E salvaje y PreM/M-E-LAMP en el vector p43.2

El vector p43.2 se sometio a reacciones de digestion para crear sitios de restriccion compatibles con los sitios de los fragmentos de PreM/M-E salvaje y PreM/M-E para la fusion con LAMP. Las reacciones de digestion se realizaron en dos etapas, primero con una enzima y despues con otra. Para la clonacion de PreM/M-E salvaje (p/YFE), la primera reaccion de digestion se realizo en un volumen final de 50 |il que contema: 1X tampon de digestion; 15 |il de la muestra del vector, y 0,05 U de la enzima NotI (Biolabs®). La digestion se realizo a 37 °C durante aproximadamente 4 horas. Despues de la digestion se verifico si se habfa producido la linearizacion del vector comparando el tamano entre la muestra digerida y el vector intacto, migrando ambos bajo las mismas condiciones en un gel de agarosa. Tras haber verificado la linearizacion, la muestra se precipito con etanol y se resuspendio en un volumen final de 40 |il. La segunda reaccion de digestion se realizo en un volumen final de 50 |il que contema: 1X tampon de digestion; 40 |il de la muestra del vector, y 0,1 unidades de la enzima XhoI. Al igual que la clonacion de PreM/ME para la fusion con LAMP, el vector p43.2 se sometio a una esquema de digestion muy similar al empleado para la clonacion del fragmento salvaje, y empleando las enzimas NheI y XhoI. Las digestiones se realizaron a 37 °C durante aproximadamente 6 horas. Las reacciones de conexion de ambos fragmentos al vector p43.2 se realizaron en un volumen final de 10 |il que contema: 1X tampon de ADN ligasa T4 (New England Biolabs®); 100 ng del vector p43.2 (roto con XhoI/NotI o NheI/XhoI); 0,4 unidades de ADN ligasa T4 (New England Biolabs®); 3 |il de cada fragmento purificado. Las reacciones de conexion se realizaron a 16 °C durante aproximadamente 20 horas. Despues las

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conexiones se emplearon para transformar celulas competentes para confirmar la clonacion. Los procedimientos de transformacion, preparacion y digestion del ADN del plasmido fueron los mismos que los descritos anteriormente. Por ultimo, para la insercion del fragmento C-terminal de LAMP (C-LAMP) en el vector p43.2-PreM/M-E para la fusion con LAMP, tanto el vector como el fragmento C-LAMP fueron digeridos con las enzimas Xhol y Xbal (para obtener la construccion pL/YFE).

1.5 - Secuenciacion del ADN

Las construcciones p/YFE y pL/YFE se sometieron a una secuenciacion automatica para la certificacion de la identidad/calidad de las secuencias clonadas. La reaccion de secuenciacion se realizo en un volumen final de 10 |il que contema: 1X tampon "Save money" (Tris-HCl 200 mM/pH 9,0, MgCh 5 mM ); 0,32 |iM de cada cebador (un total de seis cebadores internos); 0,5 |il de disolucion "Bigdye" (Applied Biosystems®); 200 ng de ADN. Las muestras se incubaron a 95 °C durante 5 minutos en un termociclador Gene AMP PCR System 9700 (Applied Biosystems®) para la desnaturalizacion. Despues estas muestras se sometieron a los siguientes ciclos de PCR para la secuenciacion: 1- 94 °C durante 2 min (desnaturalizacion inicial); 2 - [94 °C durante 15 segundos (desnaturalizacion); 50 °C durante 10 segundos (hibridacion); 60 °C durante 4 minutos (extension) - 45 ciclos]. Las muestras se precipitaron en isopropanol al 65%, se lavaron con etanol al 60% y se resuspendieron en 15 |il de formamida (Applied Biosystems®). Las muestras se secuenciaron en Integrated Core Technology (NIT) del CPqAM, empleando el secuenciador automatico de ADN ABI Prism 3100 (Applied Biosystems®) segun las convenciones previamente establecidas de esta unidad.

Ejemplo 2: Cultivo, infeccion y transfeccion de celulas eucariotas

Se cultivaron celulas 293 eucariotas en medio DMEM (Invitrogen®) suplementado con: suero bovino fetal al 10% (Gibco®); penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco®); L-glutamina al 1% (Sigma®). Estas celulas se emplearon para ambos ensayos de infeccion vmca y para los experimentos de transfeccion. Despues de alcanzar una confluencia de aproximadamente 90%, las celulas se infectaron con un extracto vmco de YFV a la concentracion de 0,36 x 106 unidades formadoras de placa (PFU), suministrado amablemente por Dr. Marli Tenorio (CPqAM/LaViTE). Para la infeccion, las celulas se incubaron inicialmente con el extracto de YFV puro (1 hora/37 °C/5% de CO2) y despues se anadio medio DMEM completo para el mantenimiento celular. Las celulas infectadas permanecieron en las mismas condiciones de incubacion (37 °C/5% de CO2) durante 48 horas, hasta que presentan los efectos citopatologicos provocados por los virus. Para los ensayos de transfeccion, las celulas 293 se cultivaron bajo las mismas condiciones anteriores. Despues fueron incubadas con 0,8 |ig de cada ADN (p/YFE y pL/YFE), empleando como control negativo el vector p43.2 vacfo y como control positivo el gen indicador de la p-galactosidasa. Las reacciones de transfeccion se realizaron empleando el kit Lipofectamine 2000 (Invitrogen®), segun las recomendaciones del fabricante. Las celulas transfectadas se incubaron (48 horas/37 °C/5% de CO2) y se procesaron para la evaluacion de la eficacia de transfeccion mediante la actividad de la expresion del gen indicador. Para la reaccion de coloracion de p-gal, las celulas primero se lavaron en 1X PBS y se fijaron en disolucion de glutaraldelmdo al 0,2%/PBS. Despues las celulas fijadas se incubaron en un volumen final de 1 ml de una disolucion que contema: 20 mg de X- Gal; 0,005 M de ferriciamida de potasio; 0,005 M de ferriciamida de potasio; 0,002 M de MgCh en 1X PBS, para revelar la coloracion de la actividad p-gal.

Ejemplo 3: Transfeccion y analisis de la expresion mediante inmunofluorescencia

Se cultivaron celulas 293 en cubreobjetos y se transfectaron con las construcciones de vacuna obtenidas empleando el kit Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies®). Se empleo el vector p43.2 vacfo como control negativo. Las transfecciones se realizaron en placas de cultivo de 24 pocillos con 2,5 |ig de cada plasmido y 10 |il de lipofectamina, segun las instrucciones del fabricante. Las celulas se incubaron durante 48 horas y despues se fijaron en metanol al 100% a -20 °C durante 5 minutos, se bloquearon en disolucion de BSA al 1%/PBS durante 30 minutos, y se incubaron con un anticuerpo policlonal anti-virus de la fiebre amarilla (producido en ratones en el terrario de CPqAM) a una dilucion de 1:200. Se empleo un anticuerpo secundario anti-IgG de raton conjugado con el fluorocromo Alexa 488, producido en cabras, a una dilucion de 1:500 (Molecular Probes, Seattle, EEUU). Despues, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos empleando el "Prolong gold" normal (Molecular Probes, Seattle, EEUU) y se visualizaron mediante microscopfa confocal. Las imagenes se obtuvieron mediante el microscopio confocal Leica SPII-AOBS (Leica Microsystems, Hm®) utilizando el objetivo de lente 63 x NA 3.1 sumergido en aceite de inmersion. El fluorocromo Alexa 488 se excita empleando el laser Arkr a una longitud de onda de 488 nm y las imagenes digitales se capturaron empleando el software Leica, en el formato RGB de 24 bits, en un area de 1024 x 1024 pfxeles. Los campos de captura se seleccionaron segun la dispersion y morfologfa de las celulas.

Ejemplo 4: Evaluacion de la respuesta inmunologica inducida en ratones inmunizados con las vacunas p/YFE y pL/YFE

4.1 - Adquisicion de vectores de vacuna a gran escala

Las construcciones que codifican las protemas E vmcas de tipo salvaje (p/YFE) y la protema E fusionada con la protema de membrana asociada a lisosomas (LAMP) (pL/YFE) se sometieron a la preparacion de ADN de plasmido a mayor escala. Se emplearon partes almuotas de cada ADN para transformar celulas competentes (E. coli TG1).

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Despues se eligio una unica colonia de cada placa para ser inoculada en 12 ml de medio LB Ifquido que contema ampicilina (50 |ig/ml), y se cultivaron durante aproximadamente 8 horas a 37 °C bajo agitacion vigorosa. Despues de esto, cada cultivo se inoculo en 2,5 litros de medio LB/ampicilina y se cultivo a 37 °C durante 16 horas bajo agitacion vigorosa. Despues el cultivo se centrifugo (8.000 RPM - 15 minutos) para obtener el sedimento bacteriano. A partir de este "sedimento" se realizo la extraccion del ADN del plasmido (condiciones sin endotoxinas) empleando el kit comercial Endofree Plasmid Giga Kit (Qiagen®), segun las recomendaciones del fabricante. Los ADN de plasmido se sometieron a ensayos de digestion en un volumen final de 10 |il que contema: 1X tampon de digestion, 1 |il de cada ADN de plasmido y enzima de restriccion espedfica. Las digestiones se realizaron a 37 °C durante aproximadamente 4 horas.

4.2 - Animales y protocolos de inmunizacion

Para los ensayos de neutralizacion y proteccion se inmunizaron ratones BALB/c y C57B1/6 hembra de 3 semanas de edad en los dfas 0, 30 y 45. Un dfa antes de cada inmunizacion se recolectaron muestras de suero de cada animal. Los ratones se inmunizaron en la base de la cola con la vacuna de virus atenuados 17DD a 104 PFU/50 |il (control positivo), vacunas de ADN p/YFE y pL/YFE (ambas a una concentracion de 50 |ig/50 |il), asf como con el vector vado y PBS (controles negativos). Todos los procedimientos se realizaron segun los requisitos de the Ethics Committee on Animal Use (CEUA), segun el protocolo P-0259-05 aprobado por este comite.

4.3 - Ensayos de neutralizacion de placas

Para el analisis de las titulaciones de anticuerpos neutralizantes inducidos por las vacunaciones con 17DD y con las construcciones p/YFE y pL/YFE, se realizaron ensayos para la neutralizacion de virus mediante reduccion de placas (PRNT). Estos ensayos se realizaron empleando muestras de suero de ratones Balb/c y C57BL/6 recogidas antes y despues de la vacunacion. Los ensayos de neutralizacion se evaluaron mediante la reduccion de la formacion de placas del virus de la fiebre amarilla cultivados en celulas Vero. Despues de la inactivacion del suero (30 min/56 °C), se incubaron diluciones en serie con 50-100 PFU de virus durante 30 min a 37 °C, y se anadieron a placas de 6 pocillos que conteman celulas Vero. Despues de una hora de incubacion se retiro el inoculo y se anadio medio semisolido que contema agarosa. Despues de 8 dfas de incubacion, las placas se fijaron y se detecto la formacion de placas vmcas mediante un ensayo inmunologico de peroxidasa. El ensayo de neutralizacion por reduccion de placas se define mediante la dilucion a la cual el numero de placas se reduce en 50%, PRNT50, cuando se compara con el control.

4.4 - Ensayos de evaluacion de la seguridad

En los ensayos de proteccion se emplearon ratones Balb/c y C57BL/6 inmunizados 3 veces con la vacuna 17DD o las vacunas de ADN. Los animales se expusieron por medio de un inoculo intracerebral que contema 10.000 PFU de virus 17DD, 15 dfas despues de la ultima inmunizacion. Los animales se controlaron durante 21 dfas para evaluar los smtomas de neurovirulencia y mortalidad. Los animales moribundos se sacrificaron mediante exposicion a CO2.

Ejemplo 5: Optimizacion del vector pL/YFE a traves del algoritmo genetico

Para mejorar la eficacia de la expresion del antfgeno codificado por la vacuna pL/YFE en celulas eucariotas, con el objetivo de futuros experimentos en modelos de primates, se optimizo la secuencia de ADN que codifica la protema PreM/M-Env empleando el algoritmo genetico. Esta secuencia se analizo/optimizo con respecto a caractensticas tales como la "utilizacion de codones", estructura secundaria del ARN mensajero (ARNm), distribucion del contenido en GC, motivos de ADN repetitivos, sitios de restriccion, sitios de "corte y empalme" cnticos, etc. La secuencia optimizada se subclono en el vector 8L, generando la construccion p8L/YFEopt.

Secuencia diana

Cebadores utilizados (directo X inverso)

PreM/M-E salvaje

5’ ACCGC7CGAGGCCACCATGGGAGGATTGTCCTCAAGGAAACG 3’ (Xhol) (Met)

5’ ACCGGCGGCCGCTCAGTTCAAGCCGCCAAATAGCCCC 3’ (Notl) (Fin)

PreM/M-E para LAMP

5’ ACCGGC 7AGCGCCACCATGGGAGGATTGTCCTCAAGGAAACG 3 ’ (Nhel) (Met)

5’ ACCGC7CGAGGTTCAAGCCGCCAAATAGCCCC 3’ (Xhol)

LAMP (C-terminal)

5 ’ACCGC7CGAGACGCTGATCCCCATCGCTGTGG 3’ (Xhol)

5’ ACCG7C7AGACTAGATAGTCTGGTAGCCTGCGTGACTCC 3’ (Xbal) (Fin)

5

10

15

20

25

30

Tabla 2 - Resultados del ensayo de proteccion en ratones BALB/c y C57B1/6 que compara la vacuna 17DD con la vacuna de ADN pL/YFE

Inmunizacion/Exposicion (105 PFU/vacuna 17DD)

Mortalidad de BALB/c (Muertos/Inoculados) Mortalidad de C57B1/6 (Muertos/Inoculados)

Vacuna 17DD

0/10 0/10

pL/YFE

0/10 0/10

p43.2/vado o PBS

8/10 10/10

Tabla 3 - Comparacion de los niveles de expresion de las protemas de la envuelta del virus de la fiebre amarilla, salvajes y optimizadas, mediante citometna de flujo

Plasmido

Expresion normalizada por el salvaje 2. (%)

1. p43.2/vado

0,03

2. p43..2/ENV/c-LAMP/salvaje

100

3. p43.2/ENV/c-LAMP/OPT-GA

450

4. p43.2/ENV/c-LAMP/OPT-LT

465

5. p8L/LAMP/vado

0,00

6. p8L/ENV/c-LAMP/OPT-GA

625

7. p8L/ENV/c-LAMP/OPT-LT

350

La vacuna de virus atenuados 17DD es la unica formulacion disponible para proteger a los seres humanos frente a la infeccion provocada por el virus de la fiebre amarilla (YFV), la principal fuente de morbilidad y mortalidad en las areas tropicales del mundo. A pesar del exito de la vacunacion en masa con la vacuna 17DD, que es capaz de inducir una respuesta duradera de anticuerpos neutralizantes y una respuesta de celulas T citotoxicas, en la bibliograffa se han indicado sistematicamente acontecimientos graves adversos como consecuencia de la vacunacion contra la fiebre amarilla. En algunos casos, la vacunacion se ha asociado directamente con un aumento en la gravedad de los smtomas e incluso puede conducir a reacciones mortales. En este escenario, el desarrollo de una nueva estrategia de vacunacion, tal como las vacunas de ADN que codifican secuencias vmcas espedficas, reviste una importancia fundamental para el desarrollo de estrategias de vacunas aun mas seguras.

La vacuna de ADN contra la fiebre amarilla, tal como se describe en la presente, se basa en la secuencia que codifica la protema de la envuelta de YFV (p/YFE). Ademas de la construccion salvaje p/YFE, la secuencia de E tambien se fusiono con la secuencia que codifica la protema de membrana asociada a lisosomas humana (h-LAMP) para generar una construccion (pL/YFE). La fusion con LAMP intenta dirigir el antfgeno a la via de presentacion/degradacion de antfgenos MHCII, puesto que varios trabajos han demostrado que los antfgenos fusionados con LAMP (antigeno/LAMP) son capaces de generar una mayor actividad proliferativa de linfocitos espedficos de antfgenos, unas mayores titulaciones de anticuerpos y una intensa actividad T citotoxica, con relacion a los antfgenos salvajes no fusionados con LAMP.

Esta invencion se dirige a optimizar la vacuna de ADN contra YFV, p8L/YFEopt, para que sea capaz de proteger a los seres humanos frente a una infeccion provocada por YFV. El desarrollo de este tipo de tecnologfa se dirige a generar una vacuna aun mas segura que la vacuna 17DD, que podna revolucionar la estrategia de vacunacion contra el YFV en Brasil y en todo el mundo. Por ultimo, las estrategias utilizadas para la construccion de esta vacuna de ADN tambien podnan servir de contribucion al desarrollo de otras vacunas vmcas, en especial contra otros flavivirus, tales como la encefalitis japonesa, la fiebre del Nilo occidental y el virus del dengue.

Claims (6)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. - Una vacuna de ADN que es capaz de realizar la coexpresion de la protema PreM/ME del virus de la fiebre amarilla junto con LAMP, la protema de asociacion con la membrana lisosomica, y de presentar dichas protemas de antfgeno al sistema inmunologico a traves de la via de MHC II, en la que la secuencia de PreM/ME se fusiona con el dominio C-terminal de LAMP y dicha vacuna tiene la SEQ ID NO:8 o una secuencia con mas del 80% de homologfa con esta.
2. 2. - Una vacuna de ADN que es capaz de realizar la coexpresion de la protema PreM/ME del virus de la fiebre amarilla junto con LAMP, la protema de asociacion con la membrana lisosomica, y de presentar dichas protemas de antfgeno al sistema inmunologico a traves de la via de MHC II, en la que la secuencia de PreM/ME se fusiona con el dominio C-terminal de LAMP y dicha vacuna tiene la SEQ ID NO:9 o una secuencia con mas del 80% de homologfa con esta.
3. 3. - Una vacuna de ADN que es capaz de realizar la coexpresion de la protema PreM/ME del virus de la fiebre amarilla junto con LAMP, la protema de asociacion con la membrana lisosomica, y de presentar dichas protemas de antfgeno al sistema inmunologico a traves de la via de MHC II, en la que la secuencia de PreM/ME se fusiona con el dominio C-terminal de LAMP y dicha vacuna tiene la SEQ ID NO:10 o una secuencia con mas del 80% de homologfa con esta.
4. 4. - Una vacuna de ADN que es capaz de realizar la coexpresion de la protema PreM/ME del virus de la fiebre amarilla junto con LAMP, la protema de asociacion con la membrana lisosomica, y de presentar dichas protemas de antfgeno al sistema inmunologico a traves de la via de MHC II, en la que la secuencia de PreM/ME se fusiona con el dominio C-terminal de LAMP y dicha vacuna tiene la SEQ ID NO:11 o una secuencia con mas del 80% de homologfa con esta.
5. 5. - Una vacuna de ADN que es capaz de realizar la coexpresion de la protema PreM/ME del virus de la fiebre amarilla junto con LAMP, la protema de asociacion con la membrana lisosomica, y de presentar dichas protemas de antfgeno al sistema inmunologico a traves de la via de MHC II, en la que la secuencia de PreM/ME se fusiona con el dominio C-terminal de LAMP y dicha vacuna tiene la SEQ ID NO:12 o una secuencia con mas del 80% de homologfa con esta.
6. 6. - Antfgenos de vacuna obtenidos mediante la expresion de una o mas de las secuencias geneticas segun una de las reivindicaciones 1 a 5.