ES2605254T3 - Método de diagnóstico o de pronóstico de cáncer epitelial de ovario - Google Patents

Método de diagnóstico o de pronóstico de cáncer epitelial de ovario Download PDF

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Abstract

Un resto de union que es capaz de unirse selectivamente a la proteina Sox11, o a una molecula de acido nucleico que codifica la misma, para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de diagnostico o de pronostico de cancer epitelial de ovario Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a novedosos agentes para el diagnostico, el pronostico y la obtencion de imagenes de cancer epitelial de ovario (CEV), y uso de los mismos.
Introduccion
El cancer epitelial de ovario (CEV) es la causa mas frecuente de muerte de tumor maligno ginecologico y la quinta causa mas comun de muerte relacionada con el cancer en mujeres. Se estima que en el 2008 se diagnosticaran 21.650 nuevos casos de cancer de ovario en los Estados Unidos y que 15.520 sucumbiran a la enfermedad (Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2008. CA: a cancer journal for clinicians 2008;58:71-96). La mala relacion de la supervivencia con respecto a la incidencia en CEV esta relacionada con el alto porcentaje de casos que son diagnosticados en una etapa avanzada y la falta de terapias eficaces para enfermedad avanzada resistente al tratamiento. A pesar de las mejoras en las tecnicas quirurgicas y la aparicion de agentes terapeuticos mas dirigidos tales como bevacizimab, la supervivencia de pacientes con CEV es del 45 % a los cinco anos (Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2008. CA: a cancer journal for clinicians 2008;58:71-96). Tales malas estadisticas del pronostico indican que hay una necesidad urgente de mejorar nuestro entendimiento de los mecanismos moleculares que subyacen al CEV, para desarrollar mejores ensayos de pronostico y predictivos e identificar nuevas dianas terapeuticas.
El cancer epitelial de ovario comprende tres subtipos histologicos principales; seroso, mucinoso y endometrioide. El CEV seroso incluye cistomas serosos, cistoadenomas benignos serosos, cistoadenomas serosos con actividad proliferante de las celulas epiteliales y anomalias nucleares, pero sin crecimiento destructivo infiltrativo (tumor maligno de bajo potencial o incierto) y cistoadenocarcinomas serosos. El CEV mucinoso incluye cistomas mucinosos, cistoadenomas benignos mucinosos, cistoadenomas mucinosos con actividad proliferante de las celulas epiteliales y anomalias nucleares, pero sin crecimiento destructivo infiltrativo (tumor maligno de bajo potencial o incierto) y cistoadenocarcinomas mucinosos. El CEV endometrioide incluye tumores endometrioides (similares a adenocarcinomas en el endometrio), quistes benignos endometrioides, tumores endometrioides con actividad proliferante de las celulas epiteliales y anomalias nucleares, pero sin crecimiento destructivo infiltrativo (tumor maligno de bajo potencial maligno o incierto) y adenocarcinomas endometrioides.
Tambien existen otros dos subtipos histologicos menos prevalentes, celula clara y no diferenciado.
Ademas, el CEV puede clasificarse por "etapas", que dependen de como de lejos se hayan extendido mas alla del ovario. Asi, la etapa I se define como cancer de ovario que esta confinado a uno o ambos ovarios. La etapa II se define como cancer de ovario que se ha extendido a los organos pelvicos (por ejemplo, utero, trompas de Falopio), pero que no se ha extendido a los organos abdominales. La etapa III se define como cancer de ovario que se ha extendido a los organos abdominales o el sistema linfatico (por ejemplo, ganglios linfaticos pelvicos o abdominales, en el higado, en el intestino). Finalmente, la etapa IV se define como cancer de ovario que se ha extendido a sitios remotos (por ejemplo, pulmon, dentro del higado, cerebro, ganglios linfaticos en el cuello).
Los CEVs tambien pueden clasificarse segun la aparicion de las celulas cancerosas. Bajo grado (o grado 1) significa que las celulas cancerosas se parecen a las celulas normales del ovario; normalmente crecen lentamente y es menos probable que se extiendan. Grado moderado (o grado 2) significa que las celulas parecen mas anormales que las celulas de bajo grado. Alto grado (o grado 3) significa que las celulas parecen muy anormales. Es probable que crezcan mas rapidamente y es mas probable que se extiendan.
El CEV, al igual que la mayoria de los otros canceres, es asi una enfermedad heterogenea compleja, influida y controlada por multiples alteraciones geneticas y epigeneticas que conducen a un fenotipo cada vez mas agresivo (Martin L y Schilder R. Novel approaches in advancing the treatment of epithelial ovarian cancer: the role of angiogenesis inhibition. Journal of clinical oncology 2007;25:2894-901; Naora H and Montell DJ. Ovarian cancer metastasis: integrating insights from disparate model organisms. Nature reviews 2005;5:355-66). Ahora se ha reconocido bien que las caracteristicas de un tumor individual y su evolucion vital resultan de multiples mutaciones somaticas adquiridas con el tiempo (por ejemplo, TP53, PTEN, RAS) y la evolucion continua de las respuestas del huesped a factores ambientales (por ejemplo, exposicion a estrogenos o tabaco) (West M, Ginsburg G, Huang A, and Nevins J. Embracing the complexity of genomic data for personalized medicine. Genome Res 2006;16:559-66). En ciertos casos, estas mutaciones somaticas cubren las variaciones inherentes de la linea germinal (por ejemplo, BRCA1/2) (West M, Ginsburg G, Huang A, and Nevins J. Embracing the complexity of genomic data for personalized medicine. Genome Res 2006;16:559-66; Prat J, Ribe A, and Gallardo A. Hereditary ovarian cancer. Human pathology 2005;36:861-70). Desde un punto de vista terapeutico, el CEV se considera mejor un conjunto de enfermedades inter-relacionadas complejas representadas por una inmensa heterogeneidad natural en los fenotipos de tumor, desenlaces de la enfermedad y respuesta al tratamiento. Un reto importante es, por consiguiente,
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identificar y validar minuciosamente biomarcadores de diagnostico y de pronostico que puedan describir con exactitud la heterogeneidad atribuida al CEV. Ademas, se requieren biomarcadores predictivos precisos para guiar los actuales protocolos de tratamiento, ademas de para guiar el desarrollo y la aplicacion de nuevas terapias dirigidas.
Tecnologias, tales como micromatrices de ADN, proteomica y metabolomica basada en espectrometria de masas han facilitado la investigacion traduccional durante la ultima decada, ayudando a mejorar el entendimiento de la base molecular y genetica de la oncogenesis y proporcionando una oportunidad para anadir nuevos enfoques a la practica de la oncologia clinica. La premisa fundamental de "tecnologias omicas" es que el examen completo de cambios en el genoma (ADN), transcriptoma (ARNm), proteoma (proteinas) o metaboloma (metabolitos) puede proporcionar una percepcion en la fisiologia y el mecanismo de enfermedad, por la provision de pruebas de diagnostico superiores y eficacia terapeutica a la actualmente disponible (Brennan DJ, Kelly C, Rexhepaj E, et al. Contribution of DNA and Tissue Microarray Technology to the Identification and Validation of Biomarkers and Personalised Medicine in Breast Cancer. Cancer Genomics and Proteomics 2007;4:3-16). La aplicacion de tecnologia de micromatrices de ADN a la biologia del cancer, en particular, ha conducido a una compresion cada vez mayor de la complejidad de las vias fisiopatologicas subyacentes e interacciones dentro de un tumor (Duffy MJ, Kelly ZD, Culhane AC, O'Brien S, and Gallagher WM. DNA microarray-based gene expression profiling in cancer aiding cancer diagnosis, assessing prognosis and predicting response to therapy. Current Pharmacogenomics 2005;3:289-304; Brennan DJ, O'Brien SL, Fagan A, et al. Application of DNA microarray technology in determining breast cancer prognosis and therapeutic response. Expert Opin Biol Ther 2005;5:1069-83). Los cribados transcriptomicos han acelerado la investigacion en correlaciones genotipicas-fenotipicas, con un objetivo comun de elucidar la taxonomia funcional de genes en tanto tejidos normales como estados de enfermedad, tales como cancer (Brennan D, O'Brien S, Fagan A, et al. Application of DNA microarray technology in determining breast cancer prognosis and therapeutic response. Expert Opin Biol Ther 2005;5:1069-83).
Konstantinopoulos, P.A. et al., Nature Clinical Practice (2008), 5(10):577-587 publicado en linea el 22 de julio de 2008 y Spentzos, D. et al., Journal of Clinical Oncology (2004), 22(23):4700-4710 desvelan perfiles de expresion genica con significancia de pronostico en cancer epitelial de ovario.
Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de agentes y metodos mejorados para el diagnostico y pronostico de CEV.
Sumario de la invencion
La invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
Un primer aspecto de la divulgacion se refiere a un resto de union que es capaz de unirse selectivamente a la proteina Soxll, o a una molecula de acido nucleico que codifica la misma, para su uso en el diagnostico o pronostico de cancer epitelial de ovario (CEV).
Se apreciara que la divulgacion se refiere a proporcionar el uso de un resto de union que es capaz de unirse selectivamente a la proteina Sox11, o a una molecula de acido nucleico que codifica la misma, en la preparacion de un agente de diagnostico o pronostico para cancer epitelial de ovario (CEV).
Por "proteina Sox11" los presentes inventores incluyen la secuencia de aminoacidos de la proteina Sox11 humana como se muestra en la Figura 4 en el presente documento, ademas de homologos que existen de forma natural de la misma.
Asi, los presentes inventores tambien incluyen las proteinas Sox11 como se identifican en los N.° de acceso de la base de datos BAA88122, AAH25789, AAB08518, AAH25789 y P35716.
Los presentes inventores han identificado sorprendentemente Sox11 como un novedoso antigeno de diagnostico/pronostico para CEV, usando analisis de inmunohistoquimica. No solo es este el primer informe que muestra la expresion en exceso de Sox11 en celulas de CEV, sino tambien la expresion diferencial de Sox11 en cohortes de CEV de alto riesgo frente a bajo riesgo. Asi, Sox11 proporciona un valioso marcador para diagnosticar pacientes con CEV y facilita el preciso diagnostico y/o pronostico de este agresivo tumor maligno.
Por "diagnosticar" los presentes inventores incluyen el acto o proceso de identificar la existencia y/o tipo de cancer que puede estar padeciendo un individuo. Asi, en una realizacion, el diagnostico incluye la diferenciacion de un tipo de cancer particular, concretamente CEV, de uno o varios de otros canceres. En una realizacion alternativa, los restos de union de la divulgacion son para su uso en clasificar pacientes con CEV en grupos clinicamente relevantes basandose en la supervivencia global y/o supervivencia especifica de cancer.
Por "pronostico" los presentes inventores incluyen el acto o proceso de predecir la probable evolucion y desenlace de un cancer, por ejemplo, determinar la probabilidad de supervivencia y/o probabilidad de supervivencia sin recidivas (RFS, recurrence-free survival).
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Por "resto de union" se indica una molecula o entidad que es capaz de unirse a la protema Sox11 o ARNm que codifica la misma.
Se apreciara por personas expertas en la materia que los restos de union de la divulgacion pueden usarse para el diagnostico o pronostico de CEV de cualquier subtipo histologico (por ejemplo, seroso, mucinoso, endometrioide, celula clara, no diferenciado o inclasificable).
En una realizacion de la invencion, el resto de union es para su uso en el diagnostico o pronostico de CEV que pertenece a un subtipo histologico especifico. Asi, el CEV puede pertenecer a un subtipo histologico seleccionado del grupo que consiste en celula serosa, mucinosa, endometrioide o clara.
Asimismo, el resto de union puede ser para su uso en el diagnostico o pronostico de CEV asociado a celulas de un grado especifico (por ejemplo, grado alto).
Tambien se apreciara que los restos de union de la divulgacion pueden usarse in vivo o in vitro.
En una realizacion de la invencion, el resto de union de la invencion es para su uso en la deteccion de la expresion de Sox11 como biomarcador unico para cancer epitelial de ovario (CEV). Por ejemplo, la expresion de Sox11 puede usarse como biomarcador unico para la diferenciacion de CEV de uno o varios de otros canceres.
Alternativamente, el resto de union de la divulgacion puede ser para su uso en combinacion con uno o mas restos de union adicionales para detectar uno o mas biomarcadores adicionales para cancer epitelial de ovario (CEV). Asi, el resto de union puede ser para su uso en combinacion con menos de 20 restos de union adicionales, por ejemplo, menos de 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de union adicionales.
En una realizacion particular, el resto de union de la divulgacion es para detectar expresion nuclear y/o citoplasmica de Sox11.
Por "unir selectivamente" los presentes inventores incluyen restos de union que se unen mas fuertemente a Sox11 que a otros polipeptidos o acidos nucleicos; preferentemente al menos 10 veces mas fuertemente, mas preferentemente al menos 50 veces mas fuertemente e incluso mas preferentemente, al menos 100 veces mas fuertemente. Preferentemente, los restos de union se unen solo a polipeptidos o acidos nucleicos Sox11.
El termino 'polipeptido', como se usa en el presente documento, significa una pluralidad de aminoacidos que se unen juntos mediante un enlace peptidico. El termino 'peptido' puede usarse indistintamente con el termino 'polipeptido', sin embargo, un peptido puede estar compuesto de dos o mas polipeptidos.
El termino 'aminoacido', como se usa en el presente documento, incluye los veinte aminoacidos estandar geneticamente codificados y sus estereoisomeros correspondientes en la forma 'D' (en comparacion con la forma 'L' natural), omega-aminoacidos distintos de aminoacidos que existen de forma natural, aminoacidos no convencionales (por ejemplo, aminoacidos a,a-disustituidos, N-alquil-aminoacidos, etc.) y aminoacidos quimicamente derivatizados.
Cuando un aminoacido esta siendo especificamente enumerado, tal como 'alanina' o 'Ala' o 'A', el termino se refiere a tanto L-alanina como a D-alanina, a menos que se establezca explicitamente de otro modo. Otros aminoacidos no convencionales tambien pueden ser componentes adecuados para polipeptidos de la presente divulgacion, en tanto que la propiedad funcional deseada sea retenida por el polipeptido. Para los peptidos mostrados, cada resto de aminoacido codificado, cuando corresponda, se representa por la designacion de una sola letra, correspondiente al nombre comun del aminoacido convencional.
Los restos de union basados en acidos nucleicos de la divulgacion son preferentemente ADN, pero tambien pueden ser ARN o un acido nucleico artificial tal como PNA.
El segundo aspecto de la divulgacion proporciona un resto de union que es capaz de unirse selectivamente a la proteina Sox11, o a una molecula de acido nucleico que codifica la misma, para su uso en detectar celulas de cancer epitelial de ovario (CEV) en una muestra.
En una realizacion, el resto de union es para su uso en detectar CEV que pertenece a un subtipo histologico especifico (por ejemplo, celula serosa, mucinosa, endometrioide, clara y no diferenciado o inclasificable).
Asimismo, el resto de union puede ser para su uso en detectar CEV asociado a celulas de un grado especifico (por ejemplo, grado alto).
Una realizacion de la divulgacion proporciona un resto de union segun tanto el primer como el segundo aspecto que es capaz de unirse selectivamente a la proteina Sox11. Preferentemente, la proteina Sox11 es una proteina humana.
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Convenientemente, el resto de union es capaz de unirse selectivamente a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1 (vease la Figura 4) y/o una variante natural de la misma.
Por "variante natural" los presentes inventores incluyen las proteinas Sox11 que se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, variantes alelicas.
Variantes de polipeptidos incluyen polipeptidos que comprenden una secuencia con al menos el 60 % de identidad con secuencias de aminoacidos conocidas, preferentemente al menos el 70 % o 80 % o 85 % o 90 % de identidad con dichas secuencias, y mas preferentemente al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con dicha secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1.
La identidad en porcentaje puede determinarse, por ejemplo, por el programa LALIGN (Huang y Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357) en el sitio de las instalaciones de Expasy
(
http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html) usando como parametros la opcion de alineamiento global, matriz de puntuacion BLOSUM62, penalizacion por abertura de hueco -14, penalizacion por extension de hueco -4. Alternativamente, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipeptidos pueden determinarse usando programas informaticos adecuados, por ejemplo, el programa GAP del Genetic Computing Group de la Universidad de Wisconsin y se apreciara que la identidad en porcentaje se calcula en relacion con polipeptidos cuya secuencia ha sido alineada optimamente.
Preferentemente, el resto de union comprende o consiste en un polipeptido.
Pueden identificarse restos de union de polipeptido por medio de un cribado. Un metodo o cribado adecuado para identificar peptidos u otras moleculas que se unen selectivamente a proteina diana o polipeptido puede comprender poner en contacto la proteina o polipeptido diana con un peptido de prueba u otra molecula en condiciones donde puede producirse la union, y entonces determinar si la molecula o peptido de prueba se ha unido a la proteina o peptido diana. Metodos de detection de la union entre dos restos son muy conocidos en la tecnica de la bioquimica. Preferentemente, se usa la tecnica conocida de presentation en fagos para identificar peptidos u otras moleculas de ligando adecuadas para su uso como restos de union. Un metodo alternativo incluye el sistema de dos hibridos de levadura.
Mas preferentemente, el resto de union comprende o consiste en un anticuerpo, o un fragmento de union al antigeno o variante del mismo.
Por "anticuerpo" los presentes inventores incluyen moleculas de anticuerpo sustancialmente intactas, ademas de anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos (en los que al menos un aminoacido esta mutado con respecto a los anticuerpos humanos que existen de forma natural), anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecificos, cadenas pesadas del anticuerpo, cadenas ligeras del anticuerpo, homodimeros y heterodimeros de cadena pesadas y/o ligeras de anticuerpo, y fragmentos de union al antigeno y derivados de los mismos.
Por "fragmento de union al antigeno" los presentes inventores indican un fragmento funcional de un anticuerpo que es capaz de unirse a la proteina Sox11.
Preferentemente, el fragmento de union al antigeno esta seleccionado del grupo que consiste en fragmentos Fv (por ejemplo, Fv monocatenario y Fv unido a disulfuro), fragmentos similares a Fab (por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos F(ab)2), dominios variables individuales (por ejemplo, dominios Vh y Vl) y anticuerpos de dominio (dAbs, que incluyen formatos individuales y dobles [es dedr, dAb-conector-dAb]).
Las ventajas de uso de los fragmentos de anticuerpos, en vez de anticuerpos completos, son multiples. El tamano mas pequeno de los fragmentos puede conducir a propiedades farmacologicas mejoradas, tales como mejor penetration de tejido solido. Ademas, los fragmentos de union al antigeno tales como los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse en y secretarse de E. coli, permitiendo asi la facil production de grandes cantidades de dichos fragmentos.
Tambien estan incluidos dentro del alcance de la divulgation versiones modificadas de anticuerpos y un fragmento de union al antigeno de los mismos, por ejemplo, modificado por la union covalente de polietilenglicol u otro polimero adecuado.
Los metodos de generation de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son muy conocidos en la tecnica. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos mediante uno cualquiera de varios metodos que emplean la induction de la produccion in vivo de moleculas de anticuerpo, cribado de bibliotecas de inmunoglobulina (Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) o generacion de moleculas de anticuerpo monoclonal por lineas celulares en cultivo. Estos incluyen, pero no se limitan a, la tecnica de hibridomas, la tecnica de hibridomas de linfocitos B humanos y la tecnica de hibridomas del virus de Epstein-Barr (EBV) (Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl.
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Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120).
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales adecuados para antigenos seleccionados por tecnicas conocidas, por ejemplo, los desvelados en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982).
Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpos usando metodos muy conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Por ejemplo, pueden prepararse fragmentos de anticuerpo segun la presente divulgacion por hidrolisis proteolitica del anticuerpo o por expresion en celulas de E. coli o de mamifero (por ejemplo, cultivo de celulas de ovario de hamster chino u otros sistemas de expresion en proteina) de ADN que codifica el fragmento. Alternativamente, pueden obtenerse fragmentos de anticuerpos por digestion con pepsina o papaina de anticuerpos completos por metodos convencionales.
Se apreciara por personas expertas en la materia que para la terapia humana o diagnosticos, se usan preferentemente anticuerpos humanizados. Formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos geneticamente manipulados o fragmentos de anticuerpos que tienen preferentemente porciones minimas derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos en los que regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo humano (anticuerpo receptor) estan sustituidas con residuos de una region determinante de la complementariedad de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata o conejo que tiene la funcionalidad deseada. En algunos casos, residuos de la region estructural Fv del anticuerpo humano estan sustituidos con residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender residuos que ni se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la region determinante de la complementariedad importada o secuencias de la region estructural. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones determinantes de la complementariedad se corresponden con aquellas de un anticuerpo no humano y todas, o sustancialmente todas, las regiones estructurales se corresponden con aquellas de una secuencia consenso humana relevante. Los anticuerpos humanizados tambien incluyen optimamente al menos una porcion de una region constante de anticuerpo, tal como una region Fc, normalmente derivada de un anticuerpo humano (vease, por ejemplo, Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596).
Metodos de humanizacion de anticuerpos no humanos son muy conocidos en la tecnica. Generalmente, el anticuerpo humanizado tiene uno o mas restos de aminoacidos introducidos en el de una fuente que es no humana. Estos restos de aminoacidos no humanos, frecuentemente denominados residuos importados, normalmente se toman de un dominio variable importado. La humanizacion puede realizarse esencialmente como se describe (vease, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-15361; documento US 4.816.567) sustituyendo regiones determinantes de la complementariedad humanas con regiones determinantes de la complementariedad de roedor correspondientes. Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quimericos, en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados pueden ser normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la region determinante de la complementariedad y posiblemente algunos residuos de la region estructural estan sustituidos con residuos de sitios analogos en anticuerpos de roedor.
Tambien pueden identificarse anticuerpos humanos usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica, que incluyen bibliotecas de presentacion en fagos (vease, por ejemplo, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581; Cole et al., 1985, en: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95).
Una vez se obtienen anticuerpos adecuados, pueden probarse para actividad, por ejemplo, por ELISA.
Otra realization de la presente divulgacion proporciona un resto de union capaz de unirse selectivamente a una molecula de acido nucleico que codifica la proteina Sox11. Preferentemente, el resto de union es capaz de unirse selectivamente a una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1 y/o variantes naturales de la misma.
Mas preferentemente, el resto de union comprende o consiste en una molecula de acido nucleico. Incluso mas preferentemente, el resto de union comprende o consiste en una molecula de ADN. Ventajosamente, el resto de union comprende o consiste en un fragmento de la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO:2 (vease la Figura 5), o la secuencia complementaria de la misma, de un fragmento o una variante de la misma. Convenientemente, la molecula de acido nucleico tiene 5 a 100 nucleotidos de longitud. Mas convenientemente, la molecula de acido nucleico tiene 15 a 35 nucleotidos de longitud.
Preferentemente, el resto de union comprende un resto detectable.
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Por un "resto detectable", los presentes inventores incluyen el significado de que el resto es uno que, cuando se localiza en el sitio diana tras la administracion del compuesto de la divulgacion en un paciente, puede detectarse, normalmente no invasivamente desde fuera del cuerpo y el sitio de la diana localizada. Asi, los compuestos de esta realizacion de la divulgacion son utiles en obtencion de imagenes y diagnostico.
Normalmente, el resto detectable es o comprende un atomo radiactivo que es util en obtencion de imagenes. Atomos radiactivos adecuados incluyen 99mTc y 123I para estudios escintigraficos. Otros restos facilmente detectables incluyen, por ejemplo, etiquetas de espin para imagen por resonancia magnetica (IRM) tales como 123I otra vez, 1311, 111In, 19F, 13C, 15N, 17O, gadolinio, manganeso o hierro. Claramente, el compuesto de la divulgacion debe tener suficiente de los isotopos atomicos apropiados con el fin de que la molecula sea facilmente detectable.
Pueden incorporarse radiomarcas u otras marcas en el compuesto de la divulgacion de formas conocidas. Por ejemplo, si el resto de union es un polipeptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por sintesis quimica de aminoacidos usando precursores de aminoacido adecuados que implican, por ejemplo, fluor-19 en lugar de hidrogeno. Marcas tales como 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh y 111In pueden unirse, por ejemplo, mediante restos de cisteina en el resto de union. Puede unirse itrio-90 mediante un resto de lisina. Puede usarse el metodo IODOGEN (Fraker et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Comm. 80:49-57) para incorporar 123I. La referencia ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) describe otros metodos en detalle.
Asi, en otra realizacion de la divulgacion, el atomo radiactivo esta seleccionado del grupo que consiste en tecnecio- 99m, yodo-123, yodo-125, yodo-131, indio-111, fluor-19, carbono-13, nitrogeno-15, ox^geno-17, fosforo-32, azufre- 35, deuterio, tritio, renio-186, renio-188 e itrio-90.
Otro aspecto de la invencion proporciona un metodo de diagnostico de cancer epitelial de ovario (CEV) en un individuo, comprendiendo el metodo:
(a) proporcionar una muestra de celulas epiteliales de ovario del individuo; y
(b) determinar la cantidad de proteina Sox11 y/o ARNm en la muestra de celulas.
en el que los niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm son indicativos del individuo que tiene cancer epitelial de ovario (CEV).
En particular, altos niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm son indicativos del individuo que tiene cancer epitelial de ovario (CEV).
En una realizacion, el metodo es para diagnosticar CEV que pertenece a un subtipo histologico especifico (por ejemplo, celula serosa, mucinosa, endometrioide y clara).
Asimismo, el metodo puede ser para diagnosticar CEV asociado a celulas de un grado especifico (por ejemplo, grado alto).
En una realizacion, el metodo comprende ademas realizar una o mas pruebas de diagnostico adicionales para CEV en las celulas epiteliales del ovario para confirmar el diagnostico
Otro aspecto de la invencion proporciona un metodo de pronostico de cancer epitelial de ovario (CEV) en un individuo, comprendiendo el metodo:
(a) proporcionar una muestra de celulas de cancer epitelial de ovario del individuo; y (b) determinar la cantidad de proteina Sox11 y/o ARNm en la muestra de celulas.
en el que los niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm son indicativos de la probabilidad de supervivencia sin recidivas del individuo.
En una realizacion, el metodo es para pronosticar CEV que pertenece a un subtipo histologico especifico (por ejemplo, celula serosa, mucinosa, endometrioide y clara).
Asimismo, el metodo puede ser para pronosticar CEV asociado a celulas de un grado especifico (por ejemplo, grado alto).
Por "probabilidad de supervivencia sin recidivas" los presentes inventores indican la probabilidad de que el individuo sobreviva durante un periodo dado, tal como un ano, dos anos, tres anos, cinco anos, diez anos o mas.
En una realizacion, altos niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm es indicativo del individuo que tiene supervivencia sin recidivas (RFS, recurrence-free survival) mejorada.
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Por "supervivencia sin recidivas mejorada" los presentes inventores indican que la probabilidad de supervivencia sin recidivas es mayor cuando se compara con una poblacion promedio de pacientes con cancer epitelial de ovario (CEV), por ejemplo, la probabilidad puede aumentarse al menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 o mas.
En una realizacion alternativa, bajos niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm es indicativo del individuo que tiene supervivencia sin recidivas (RFS) reducida.
Por "supervivencia sin recidivas reducida" los presentes inventores indican que la probabilidad de supervivencia sin recidivas es menor cuando se compara con una poblacion promedio de pacientes con cancer epitelial de ovario (CEV), por ejemplo, la probabilidad puede reducirse al menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 o mas.
Otro aspecto de la invention proporciona un metodo de detection de un cancer epitelial de ovario (CEV) en un individuo, comprendiendo el metodo:
(a) proporcionar una muestra de celulas del individuo; y
(b) determinar la cantidad de proteina Sox11 y/o ARNm en la muestra de celulas.
en el que los niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm son indicativos del individuo que tiene celulas de cancer epitelial de ovario (CEV).
En una realizacion, el metodo es para detectar celulas de un CEV que pertenecen a un subtipo histologico especifico (por ejemplo, celula serosa, mucinosa, endometrioide y clara).
Asimismo, el metodo puede ser para detectar celulas de un CEV asociado a celulas de un grado especifico (por ejemplo, grado alto).
En particular, altos niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm son indicativos del individuo que tiene cancer epitelial de ovario (CEV).
Por "altos niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm" los presentes inventores indican que la cantidad de la proteina Sox11 y/o ARNm es al menos el 10 % superior a en celulas epiteliales del ovario no cancerosas (por ejemplo, sanas), por ejemplo, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 %, 1500 %, 2000 %, 3000 %, 4000 %, 5000 %, 10000 % mayor, o mas.
Por "bajos niveles de la proteina Sox11 y/o ARNm" los presentes inventores indican que la cantidad de la proteina Sox11 y/o ARNm no es estadisticamente diferente de la de celulas epiteliales del ovario no cancerosas.
Se apreciara por los expertos que los metodos de la invencion pueden realizarse in vivo o in vitro.
En una realizacion, el metodo comprende la deteccion de la expresion de Sox11 como biomarcador unico para el diagnostico o pronostico de cancer epitelial de ovario (CEV) (como se trata anteriormente).
Alternativamente, el resto de union de la divulgation puede usarse en combination con uno o mas restos de union adicionales para detectar uno o mas biomarcadores adicionales para el diagnostico o pronostico de CEV. Asi, el resto de union puede usarse en combinacion con menos de 20 restos de union adicionales, por ejemplo, menos de 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de union adicionales.
En una realizacion, el metodo comprende detectar expresion nuclear y/o citoplasmica de Sox11.
Preferentemente, la muestra de celulas que va a probarse esta en forma de una muestra de tejido. Convenientemente, la cantidad de la proteina Sox11 y/o ARNm en la muestra se determina usando un resto de union segun el primero o segundo aspecto de la divulgacion.
Otra realizacion de los metodos de la invencion comprende comparar la cantidad de la proteina Sox11 y/o ARNm en la muestra de celulas que va a probarse con la cantidad de la proteina Sox11 y/o ARNm en una muestra de control.
Ventajosamente, la muestra de control es una muestra de control negativo que comprende o que consiste en celulas epiteliales del ovario no cancerosas.
Alternativamente, o ademas, la muestra de control es una muestra de control positivo que comprende o que consiste en celulas de cancer epitelial de ovario. Las celulas epiteliales de ovario pueden ser celulas de CEV asociadas a alta supervivencia sin recidivas (RFS) o celulas de CEV asociadas a baja supervivencia sin recidivas (RFS).
Normalmente, la etapa (b) de los metodos de la invencion se realiza usando un metodo seleccionado del grupo que
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consiste en macromatriz, micromatriz (incluyendo micromatriz de tejido), nanomatriz, PCR con transcripcion inversa, PCR en tiempo real o PCR in situ.
Otra realization del tercer o cuarto aspectos de la invention comprende determinar los niveles de proteinas biomarcadoras de CEV adicionales y/o ARNm en la muestra de celulas que va a probarse, por ejemplo, p53, receptor de estrogenos y/o receptor de progesterona.
Otro aspecto de la invencion proporciona un resto de union para su uso en un metodo de obtencion de imagenes de celulas de cancer epitelial de ovario (CEV) en el cuerpo de un individuo, comprendiendo el metodo administrar al individuo una cantidad eficaz de un resto de union segun el primer o segundo aspecto de la divulgation.
En una realizacion, el metodo es para la obtencion de imagenes de celulas de un CEV que pertenece a un subtipo histologico especifico (por ejemplo, celula serosa, mucinosa, endometrioide y clara).
Asimismo, el metodo puede ser para la obtencion de imagenes celulas de un CEV asociado a celulas de un grado especifico (por ejemplo, grado alto).
El termino 'cantidad eficaz', como se usa en el presente documento, se refiere a aquella cantidad que proporciona una senal suficientemente detectable para un regimen de administration dado. Esta es una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir una intensidad de senal deseada en asociacion con el aditivo y diluyente requeridos, es decir, un excipiente o vehiculo de administracion. Como se aprecia por aquellos expertos en la materia, la cantidad de un compuesto puede variar dependiendo de su actividad especifica. Cantidades de dosificacion adecuadas pueden contener una cantidad predeterminada de composition activa calculada para producir la intensidad de senal deseada en asociacion con el diluyente requerido. En los metodos y uso para la fabrication de composiciones de la divulgacion, se proporciona una cantidad eficaz del componente activo. Una cantidad eficaz puede ser determinada por el medico o veterinario experto habitual basandose en las caracteristicas del paciente, tales como la edad, peso, sexo, afeccion, complicaciones, otras enfermedades, etc., como es muy conocido en la tecnica.
Normalmente, el sexto aspecto de la invencion comprende la etapa de detectar la localizacion del resto de union en el individuo. Preferentemente, la proteina Sox11 y/o ARNm que codifica la misma se usan como marcador para celulas de cancer epitelial de ovario (CEV).
Un septimo aspecto de la divulgacion proporciona el uso de un resto de union como se ha definido anteriormente en la preparation de un medicamento para diagnosticar o pronosticar cancer epitelial de ovario (CEV).
La divulgacion se refiere ademas al uso de la proteina Sox11 y/o ARNm que codifica la misma como biomarcador para celulas de cancer epitelial de ovario (CEV).
En una realizacion, la proteina Sox11 y/o ARNm que codifica la misma es para su uso como biomarcador para CEV que pertenece a un subtipo histologico especifico (por ejemplo, celula serosa, mucinosa, endometrioide, clara y no diferenciado o inclasificable).
Asimismo, la proteina Sox11 y/o ARNm que codifica la misma puede ser para su uso como un biomarcador para CEV que pertenece a un grado especifico (por ejemplo, grado alto).
Se apreciara que Sox11 puede usarse como biomarcador unico para cancer epitelial de ovario (CEV).
Alternativamente, Sox11 puede usarse en combination con uno o mas biomarcadores adicionales. Preferentemente, sin embargo, Sox11 se usa en combinacion con menos de 20 biomarcadores adicionales se usan en el metodo, por ejemplo, menos de 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 biomarcadores adicionales.
Un noveno aspecto de la divulgacion se refiere ademas a un metodo de selection de una molecula con eficacia en el diagnostico y/o pronostico de cancer epitelial de ovario (CEV), comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) poner en contacto una molecula que va a probarse con la proteina Sox11 y/o ARNm que codifica la misma (o con un fragmento de dicha proteina o ARNm); y
(b) detectar la presencia de un complejo que contiene la proteina y/o ARNm (o fragmento de la misma) y la molecula que va a probarse.
En una realizacion, el metodo es para seleccionar una molecula con eficacia en el diagnostico y/o pronostico de CEV que pertenece a un subtipo histologico especifico (por ejemplo, seroso, mucinoso, endometrioide).
Asimismo, el metodo puede ser para seleccionar una molecula con eficacia en el diagnostico y/o pronostico de CEV asociado a celulas de un grado especifico (por ejemplo, grado alto). Metodos de detection y/o medicion de la
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concentracion de proteina y/o acido nucleico son muy conocidos para aquellos expertos en la materia, vease, por ejemplo, Sambrook y Russell (arriba).
Metodos preferidos para la deteccion y/o medicion de proteina incluyen transferencia Western, transferencia Northern, ensayos inmunosorbentes (ELISA), micromatriz de anticuerpos, micromatriz de tejidos (TMA), inmunoprecipitacion, hibridacion in situ y otras tecnicas inmunohistoqmmicas, radioinmunoensayo (RIA), ensayos inmunorradiometricos (IRMA) y ensayos inmunoenzimaticos (IEMA), que incluyen ensayos de sandwich usando anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Ensayos de sandwich a modo de ejemplo se describen por David et al., en las patentes de EE.UU. N.° 4.376.110 y 4.486.530, incorporadas por este documento por referencia. Puede usarse tincion de anticuerpos de celulas sobre portaobjetos en metodos muy conocidos en las pruebas de diagnostico de laboratorios de citologia, como es muy conocido para aquellos expertos en la materia.
Normalmente, ELISA implica el uso de enzimas que dan un producto de reaccion coloreado, normalmente en ensayos en fase solida. Se han empleado ampliamente enzimas tales como peroxidasa de rabano picante y fosfatasa. Una forma de amplificar la reaccion de fosfatasa es usar NADP como sustrato para generar NAD que ahora actua de coenzima para un segundo sistema de enzima. La pirofosfatasa de Escherichia coli proporciona un buen conjugado debido a que la enzima no esta presente en tejidos, es estable y da un buen color de reaccion. Tambien pueden usarse sistemas quimioluminiscentes basados en enzimas tales como luciferasa.
Frecuentemente se usa conjugation con la vitamina biotina, ya que esta puede ser facilmente detectada por su reaccion con avidina o estreptavidina unida a enzima a la que se une con gran especificidad y afinidad.
Metodos preferidos para la deteccion y/o medicion de acido nucleico (por ejemplo, ARNm) incluyen transferencia Southern, transferencia Northern, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT- PCR), PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), nanomatriz, macromatriz, autorradiografia e hibridacion in situ.
En una realization tipica, la presencia de celulas de cancer epitelial de ovario (CEV) se detecta por deteccion de la proteina Sox11 y/o acido nucleico en nucleos de celulas y/o citoplasma. Preferentemente, los nucleos/citoplasma de celulas de linfoma expresan la proteina Sox11 y/o acido nucleico en una cantidad relativamente alta, como se indica, por ejemplo, por tincion brillante de los nucleos durante el analisis de hibridacion in situ.
Ejemplos no limitantes preferidos que incorporan ciertos aspectos de la invention se describiran ahora, con referencia a las siguientes figuras:
Figura 1. Expresion de proteinas Sox11 en cancer de ovario.
Tincion inmunohistoquimica de Sox 11 que muestra precisamente la expresion citoplasmica (A) y la expresion citoplasmica y nuclear (B). Imagen de marcas correspondiente del algoritmo de deconvolucion que muestra estroma en azul, tincion citoplasmica en amarillo y naranja y expresion nuclear en rojo.
Figura 2. Expresion de proteinas Sox11 y supervivencia en cancer de ovario.
Expresion de Sox11 clasificada en baja, media y alta basada en el histograma (A). Estimation de Kaplan Meier de RFS basada en the tres grupos de Sox11 (B). Estimacion de Kaplan Meier de RFS basada en comparacion de niveles altos y medios de Sox11 con niveles bajos de Sox11 (C).
Figura 3. Secuencia de aminoacidos de la proteina Sox11 de Homo sapiens.
Figura 4. Secuencia de acidos nucleicos de ARNm de SOX11 de Homo sapiens.
Figura 5. Supervivencia global (25 anos) en cancer de ovario endometroide
Se compara la supervivencia global a los 25 anos de pacientes con mas o menos del 10 % de celulas tumorales positivas para Sox11. Cuando se censura un paciente (se saca del estudio por otro motivo distinto a muerte) esto se indica con una marca de verification en la iinea.
Figura 6. Supervivencia global (5 anos) en cancer de ovario endometroide
Se compara la supervivencia global a los 5 anos de pacientes con mas o menos del 10 % de celulas tumorales positivas para Sox11. Cuando se censura un paciente (se saca del estudio por otro motivo distinto a muerte) esto se indica con una marca de verificacion en la linea.
Figura 7. Supervivencia especfica de cancer (5 anos) en cancer de ovario endometroide
Se compara la supervivencia especifica de cancer a los 5 anos de pacientes con mas o menos del 10 % de celulas tumorales positivas para Sox11. Cuando se censura un paciente (se saca del estudio por otro motivo distinto a muerte) esto se indica con una marca de verificacion en la linea.
Figura 8. Supervivencia global (25 anos) para CEV de grado alto
Se compara la supervivencia global a los 25 anos de pacientes de grado alto con mas o menos del 10 % de celulas tumorales positivas para Sox11. Cuando se censura un paciente (se saca del estudio por otro motivo
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distinto a muerte) esto se indica con una marca de verificacion en la lmea.
Figura 9. Supervivencia especifica de cancer (25 anos) para CEV de grado alto
Se compara la supervivencia especifica de cancer a los 25 anos de pacientes de grado alto con mas o menos del
10 % de celulas tumorales positivas para Sox11. Cuando se censura un paciente (se saca del estudio por otro
motivo distinto a muerte) esto se indica con una marca de verificacion en la linea.
EJEMPLOA Introduccion
El factor de transcripcion Sox11 es un miembro de la familia de los genes Sox y se ha mapeado con el cromosoma 2p25.3 (Azuma T, Ao S, Saito Y, et al. Human SOX11, an upregulated gene during the neural differentiation, has a long 3' untranslated region. DNA research 1999;6:357-60). Se identifican proteinas Sox como proteinas que contienen un dominio de grupo de alta movilidad de union a ADN (HMG) con fuerte homologia de aminoacidos (normalmente >50 %) con el dominio HMG del gen de determinacion del sexo masculino, Sry (Wegner M. From head to toes: the multiple facets of Sox proteins. Nucleic acids research 1999;27:1409-20). Se han identificado mas de 20 genes Sox ortologos en los genomas humano y de raton, y los miembros de la familia se dividen en ocho subgrupos segun el grado de homologia dentro y fuera del dominio HMG (Schepers GE, Teasdale RD, and Koopman P. Twenty pairs of sox: extent, homology, and nomenclature of the mouse and human sox transcription factor gene families. Developmental cell 2002;3:167-70). Las proteinas Sox actuan de factores de transcripcion uniendose al surco menor de ADN e introduciendo una flexion aguda de ADN que les permite desempenar una funcion arquitectonica clave en el ensamblaje de complejos potenciadores transcripcionales (Dy P, Penzo-Mendez A, Wang H, et al. The three SoxC proteins Sox4, Sox11 and Sox12 exhibit overlapping expression patterns and molecular properties. Nucleic acids research 2008;36:3101-17; van de Wetering M and Clevers H. Sequence-specific interaction of the HMG box proteins TCF-1 and SRY occurs within the minor groove of a Watson-Crick double helix. The EMBO journal 1992;11:3039-44). Ademas de interacciones proteina-ADN, las proteinas Sox tambien interaccionan con diversos otros factores de transcripcion para aumentar su eficiencia y especificidad de accion (Dy P, Penzo-Mendez A, Wang H, et al. The three SoxC proteins Sox4, Sox11 and Sox12 exhibit overlapping expression patterns and molecular properties. Nucleic acids research 2008;36:3101-17).
Sox11 pertenece al subgrupo C, junto con Sox4 y Sox12 (Schepers GE, Teasdale RD, and Koopman P. Twenty pairs of sox: extent, homology, and nomenclature of the mouse and human sox transcription factor gene families. Developmental cell 2002;3:167-70), y las tres proteinas demuestran un alto grado de homologia dentro de tanto el dominio de transactivacion del extremo C como el dominio HMG (Dy P, Penzo-Mendez A, Wang H, et al. The three SoxC proteins Sox4, Sox11 and Sox12 exhibit overlapping expression patterns and molecular properties. Nucleic acids research 2008;36:3101-17; Jay P, Goze C, Marsollier C, et al. The human SOX11 gene: cloning, chromosomal assignment and tissue expression. Genomics 1995;29:541-5). Sox11 y Sox 4 desempenan funciones importantes en procesos cardiacos, neuronales y otros procesos embrionarios importantes, aunque se sabe menos de Sox12 (Dy P, Penzo-Mendez A, Wang H, et al. The three SoxC proteins Sox4, Sox11 and Sox12 exhibit overlapping expression patterns and molecular properties. Nucleic acids research 2008;36:3101-17).
Los presentes inventores han demostrado recientemente que Sox11 nuclear esta especificamente regulado por incremento en linfoma de celulas del manto (MCL) y distingue MCL de otros linfomas de linfocitos B (Ek S, Dictor M, Jerkeman M, Jirstrom K, and Borrebaeck CA. Nuclear expression of the non B cell lineage Sox11 transcription factor identifies mantle cell lymphoma. Blood 2008;111:800-5). Sox4 es un factor de transcripcion importante en linfocitos de tanto el linaje de linfocitos B como T (Wegner M. From head to toes: the multiple facets of Sox proteins. Nucleic acids research 1999;27:1409-20; van de Wetering M, Oosterwegel M, van Norren K, and Clevers H. Sox-4, an Sry- like HMG box protein, is a transcriptional activator in lymphocytes. The EMBO journal 1993;12:3847-54) y es crucial para la linfopoyesis B (Smith E and Sigvardsson M. The roles of transcription factors in B lymphocyte commitment, development, and transformation. Journal of leukocyte biology 2004;75:973-81), mientras que Sox11 no tiene funcion linfopoyetica conocida y no se expresa en linfocitos B (Ek S, Dictor M, Jerkeman M, Jirstrom K, and Borrebaeck CA. Nuclear expression of the non B-cell lineage Sox11 transcription factor identifies mantle cell lymphoma. Blood 2008;111:800-5). Tanto Sox4 como Sox11 se expresan en meduloblastoma (Lee CJ, Appleby VJ, Orme AT, Chan WI, and Scotting PJ. Differential expression of SOX4 and SOX11 in medulloblastoma. Journal of neuro-oncology 2002;57:201-14) y Sox11 tambien se expresa en exceso en glioma maligno (Weigle B, Ebner R, Temme A, et al. Highly specific overexpression of the transcription factor SOX11 in human malignant gliomas. Oncology reports 2005;13:139-44). Adicionalmente, Sox4 se expresa en cancer de vejiga con elevados niveles de expresion asociados a desenlace del paciente mejorado (Aaboe M, Birkenkamp-Demtroder K, Wiuf C, et al. SOX4 expression in bladder carcinoma: clinical aspects and in vitro functional characterization. Cancer research 2006;66:3434-42).
Este estudio resume la expresion de ARNm de Sox11 a traves de un gran numero de tejidos normales y tumores, y revela que el ARNm de Sox11 va a expresarse en exceso en un gran numero de tejidos malignos. Ademas, los presentes inventores examinaron especificamente la expresion de Sox11 de proteinas en CEV y demostraron que los elevados niveles de la proteina Sox11, como se ha determinado por analisis de imagenes, se asociaron a una supervivencia libre de recidivas (RFS) mejorada.
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Materiales y metodos
Perfil transcripcional
Se recuperaron niveles de expresion de ARNm del gen SOX11 a traves de un gran numero de tejidos humanos de la base de datos In Silico Transcriptomics (IST), que contiene datos de un metanalisis de 14.095 muestras analizadas usando micromatrices de expresion genica de Affymetrix.
Pacientes y muestras de tumores
La TMA, usada en este estudio, se construyo a partir de una cohorte consecutiva de 76 pacientes diagnosticados con cancer epitelial de ovario invasivo primario en el Hospital Nacional de Maternidad, Dublin, con una mediana del seguimiento de 4,3 anos. La cohorte de pacientes se resume en la Tabla 1. El enfoque quirurgico estandar fue una histerectomia abdominal total, salpingo-ooforectomia bilateral y omentectomia con evaluacion citologica de liquido del peritoneo o lavados. La enfermedad residual se resecciono a menos de 2 cm cuando fue posible. Se registro el estado y volumen de la enfermedad residual (enfermedad no residual, enfermedad residual mayor o inferior a 2 cm) en todos los casos. La quimioterapia adyuvante consistio en cisplatino o carboplatino antes de 1992 y combinada con paclitaxel desde 1992 hasta 2002. Ningun paciente recibio quimioterapia neo-adyuvante. Se excluyeron del estudio canceres de ovario benigno o incierto, cancer no epitelial de ovario y casos con caracteristicas histologicas tipicas de cancer de ovario secundario. Los especimenes de diagnostico se fijaron todos en formalina y se incorporaron en parafina en el Departamento de Patologia en el Hospital Nacional de Maternidad, Dublin, Irlanda. Todos los bloques de tejido se almacenaron en este departamento antes de la construccion del TMA. Se obtuvo autorizacion etica completa del comite etico del Hospital Nacional de Maternidad, Dublin.
Micromatrices de tejido e inmunohistoauimica
Se usaron setenta y seis especimenes de tumor incorporados en parafina para la construccion de la micromatriz de tejido (TMA). Se marcaron areas representativas de cancer invasivo sobre portaobjetos tenidos con hematoxilina y eosina y se construyo la TMA, usando un robot para la fabrication de micromatrices de tejido manual (MTA-1, Beecher Inc, WI). La matriz consistio en cuatro nucleos por paciente. Se extrajeron dos nucleos de 1,0 mm de cada bloque de donante y se ensamblaron en un bloque de receptor. Los bloques de receptor se limitaron a aproximadamente 100 nucleos cada uno. En general, se tomaron nucleos de la parte periferica del tumor en los casos en los que el tumor tenia limites bien definidos. En tumores de crecimiento mas difuso, las areas con la mayor densidad de celulas tumoral fueron principalmente elegidas como diana. Se evito tejido necrotico.
Se secaron secciones de TMA (4 |jm), se desparafinaron, se rehidrataron y se pusieron a traves de concentraciones descendentes de etanol. Se realizo la recuperation de antigeno mediada por calor en un BORGdecloaker (Biocare, Concord, CA, EE.UU.) a pH 9,0 y entonces las secciones se tineron con el anticuerpo anti-Sox11 humana de conejo primario (1:100) a temperatura ambiente durante 25 minutos. Este anticuerpo especifico se produjo, como se describe previamente (Ek S, Dictor M, Jerkeman M, Jirstrom K, and Borrebaeck CA. Nuclear expression of the non B-cell lineage Sox11 transcription factor identifies mantle cell lymphoma. Blood 2008; 111:800-5) y se eligieron como dianas las siguientes secuencias de proteinas:
FMVWSKIERRKIMEQSPDMHNAEISKRLGKRWKMLKDSEKIPRREAERLRLKHMADYP
DYKYRPRKKPKMDPSAKPSASQSPEKSAAGGGGGSAGGGAGGAKTSKGSSKK
[SEQ ID NO:3]
La senal se detecto, usando el sistema de detection Dako REAL, que contiene el anticuerpo anti-conejo/raton de cabra biotinilado secundario, el complejo de estreptavidina/peroxidasa de rabano picante y 3,3-diaminobencidina, segun el protocolo del fabricante. Los portaobjetos se contratineron con hematoxilina de Mayers (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
Adquisicion de imagenes, tratamiento y analisis automatizado
Se uso el sistema Aperio ScanScope XT Slide Scanner (Aperio Technologies, Vista, CA) para capturar imagenes digitales de portaobjetos completos con un objetivo 20X. Se des-matrizaron los portaobjetos para visualizar nucleos individuales, usando TMA Lab (Aperio). Se uso un algoritmo de deconvolution del color (Aperio) para desarrollar un modelo de puntuacion cuantitativa para la expresion de Sox11.
Analisis estadistico
Se uso la correlation de la rho de Spearman para estimar la relation entre nucleos de tumores individuales. Se evaluaron diferencias en la distribution de datos clinicos y caracteristicas tumorales entre muestras con una expresion alta y baja de Sox11 (descrita a continuation) usando la prueba de x2. Se usaron analisis de Kaplan-Meier
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y la prueba de rangos logaritmicos para ilustrar diferencias entre RFS. Se usaron modelos de riesgo proporcional de la regresion de Cox para estimar la relacion con RFS y Sox11, etapa y grado. Todos los calculos se realizaron usando SPSS version 11.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Un valor de p < 0,05 se considero estadisticamente significativo.
Resultados
Expresion de ARNm de Sox11 en tejidos normales y tumorales
Se realizo un metanalisis de los niveles de expresion de ARNm de Sox11 en 14.095 muestras analizadas usando las micromatrices de expresion genica Affymetrix.
Fueron evidentes elevados niveles de expresion de ARNm de Sox11 en muestras de carcinoma epitelial de ovario (datos no mostrados).
Expresion de proteinas Sox11 en cancer de ovario
Habiendo identificado Sox11 como un gen que se expreso en exceso en celulas de carcinoma epitelial de ovario, se examino la expresion de la proteina Sox11 usando IHC en CEV como se ilustra en la Figura 1. La expresion de Sox11 se observo exclusivamente en epitelio de tumor y la senal de IHC fue evidente en tanto el nucleo como el citoplasma. Solo estuvo presente expresion nuclear de Sox11 cuando se acompano de senal citoplasmica, mientras que una proporcion (49 %) de tumores demostraron expresion citoplasmica en ausencia de senal nuclear (Fig. 1).
Determinacion cuantitativa de la expresion de Sox11 como se ha determinado por analisis de imagenes
Entonces se determino la determinacion cuantitativa de la expresion de Sox11, usando un enfoque de analisis de imagenes, en particular mediante el uso de un algoritmo de deconvolucion de color comercial (Aperio). Se genera una imagen de "marcas" en pseudo-color como resultado del algoritmo, permitiendo asi la confirmacion de que el algoritmo estaba identificando con exactitud pixeles epiteliales y de estroma (Fig. 1). Recientemente se publico una descripcion completa del algoritmo (Brennan DJ, Rexhepaj E, O'Brien SL, et al. Altered Cytoplasmic-to-Nuclear Ratio of Survivin Is a Prognostic Indicator in Breast Cancer. Clinical cancer research 2008;14:2681-9).
El algoritmo se uso para calcular una intensidad total (TI) para Sox11 para cada nucleo. Hubo una fuerte correlacion entre nucleos por cuadruplicado de tumores individuales para TI (rho de Spearman = 0,858, p < 0,001), que indica que Sox11 tiene un patron de expresion homogeneo en cancer de ovario y es adecuado para el analisis basado en TMA. Como los tumores se dispusieron en matriz por cuadruplicado, la mediana del valor para cada tumor se uso para analisis adicionales. El algoritmo distinguio con exactitud entre tincion nuclear y citoplasmica en todos los nucleos, como se ha confirmado por un histopatologo.
Se muestra un histograma de datos del analisis de imagenes de Sox11 para la cohorte entera en la Figura 2a. Usando este histograma, los tumores se dispusieron en tres categorias - nivel alto, medio y bajo de la expresion de Sox11, como se ha determinado por analisis de imagenes. Basandose en la clasificacion del analisis de imagenes, se clasifico que el 20 % (n = 17) de los tumores tenian niveles altos, el 43 % (n = 35) niveles medios y el 29 % (n = 24) niveles bajos / negativos de la expresion de Sox11, como se ha determinado por analisis de imagenes. Los tumores en el grupo de expresion alta mostraron todos expresion de Sox11 nuclear y citoplasmica, mientras que aquellos en el grupo medio generalmente presentaron solo Sox11 citoplasmica. No se encontro asociacion entre la expresion de Sox11 y la edad, grado o etapa de la enfermedad.
Asociaciones entre la expresion de Sox11 como se ha determinado por analisis de imagenes automatico y supervivencia
El analisis de Kaplan Meier de la RFS basada en la expresion de Sox11 revelo una disminucion escalonada en la RFS entre los grupos alto, medio y bajo (p = 0,033) (Fig. 2b). Analisis de subconjuntos adicionales revelaron una RFS marcadamente reducida en pacientes con bajos niveles de expresion de Sox11, como se ha determinado por el analisis de imagenes en comparacion con los expresores de Sox11 altos y medios (p = 0,02) (Fig. 2c). Los presentes inventores continuaron realizando un analisis de regresion de Cox multifactorial de RFS, que revelo que la expresion de Sox11 era un factor pronostico independiente de RFS cuando se compara con la etapa y el grado (HR = 0,56, IC del 95 % = 0,319 - 0,997, p = 0,049).
Discusion
En este estudio, los presentes inventores combinaron un metanalisis de datos transcriptomicos, TMAs y analisis de imagenes automaticos para identificar y validar Sox11 como biomarcador de pronostico en carcinoma epitelial de ovario (CEV).Este estudio es el primero en describir la relacion entre la expresion de Sox11 y el pronostico en CEV. Habiendo identificado previamente Sox11 como un nuevo marcador de diagnostico en MCL (Ek S, Dictor M, Jerkeman M, Jirstrom K, and Borrebaeck CA. Nuclear expression of the non B-cell lineage Sox11 transcription factor identifies mantle cell lymphoma. Blood 2008;111:800-5), los presentes inventores continuaron usando la base de
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datos 1ST que contema datos de un metanalisis de 14.095 muestras analizadas, usando las micromatrices de expresion genica Affymetrix para describir la expresion de ARNm de Sox11 en celulas CEV.
Los presentes inventores continuaron entonces usando TMAs y un analisis automatico cuantitativo de IHC para evaluar la expresion de Sox11 de proteinas en CEV en relacion con la supervivencia sin recidivas. Esto revelo la expresion de Sox11 espedfica del epitelio en tanto compartimentos nucleares como citoplasmicos. Los elevados niveles de Sox11, particularmente Sox11 nuclear, se asociaron a un aumento de RFS y los analisis multifactoriales de la regresion de Cox revelaron que Sox11 era un factor pronostico independiente de RFS cuando se controla para el grado y la etapa (vease la Tabla 2).
Sox11 desempena una funcion importante en la embriogenesis y el remodelado de tejido, y por consiguiente esta presente durante la gastrulacion y el desarrollo temprano post-gastrulacion en todo el embrion (Hargrave M, Wright E, Kun J, et al. Expression of the Sox11 gene in mouse embryos suggests roles in neuronal maturation and epithelio- mesenchymal induction. Developmental dynamics 1997;210:79-86; Sock E, Rettig SD, Enderich J, et al. Gene targeting reveals a widespread role for the high-mobility-group transcription factor Sox11 in tissue remodeling. Molecular and cellular biology 2004;24:6635-44). Despues durante el desarrollo, Sox11 se expresa prominentemente en el sistema nervioso en desarrollo y en muchos sitios en todo el embrion donde se producen las interacciones epitelial-mesenquimatosa (Hargrave M, Wright E, Kun J, et al. Expression of the Sox11 gene in mouse embryos suggests roles in neuronal maturation and epithelio-mesenchymal induction. Developmental dynamics 1997;210:79- 86). En los sitios de tales interacciones epitelial-mesenquimatosa, Sox11 puede encontrarse en el compartimento mesenquimatoso o epitelial, y se ha propuesto que participa en el remodelado inductivo (Hargrave M, et al., 1997, arriba). La expresion de Sox11 en la mayoria de los tejidos es transitoria y, como consecuencia, se ha encontrado poca expresion de Sox11 en tejidos adultos terminalmente diferenciados, a diferencia de su amplia expresion durante la embriogenesis (Sock E, Rettig SD, Enderich J, et al. Gene targeting reveals a widespread role for the high-mobility-group transcription factor Sox11 in tissue remodeling. Molecular and cellular biology 2004;24:6635-44). Los hallazgos de los inventores complementan estos datos, por lo que la expresion de Sox11 estuvo ausente en tejido normal. Queda por esclarecer completamente la funcion desempenada por Sox11 en la tumorigenesis. Como se ha mencionado previamente, fue evidente una marcada regulacion por incremento de ARNm de Sox11 en celulas de CEV. La funcion funcional exacta de Sox11 en tejidos adultos no se ha entendido completamente, aunque parece que las proteinas Sox desempenan una funcion doble (i) union a ADN y (ii) seleccion de componente transcripcional, que puede permitir el reclutamiento selectivo de proteinas Sox individuales para genes especificos (Ek S, Dictor M, Jerkeman M, Jirstrom K, and Borrebaeck CA. Nuclear expression of the non B-cell lineage Sox11 transcription factor identifies mantle cell lymphoma. Blood 2008;111:800-5). Mientras que varios estudios han descrito la expresion de Sox11 en gliomas (Weigle B, Ebner R, Temme A, et al. Highly specific overexpression of the transcription factor SOX11 in human malignant gliomas. Oncology reports 2005;13:139-44), neuroblastomas (Lee CJ, Appleby VJ, Orme AT, Chan WI, and Scotting PJ. Differential expression of SOX4 and SOX11 in medulloblastoma. Journal of neurooncology 2002;57:201-14) y MCL (Ek S, Dictor M, Jerkeman M, Jirstrom K, and Borrebaeck CA. Nuclear expression of the non B-cell lineage Sox11 transcription factor identifies mantle cell lymphoma. Blood 2008;111:800-5), su funcion funcional en estos tumores no se ha entendido completamente.
En resumen, esta es la primera descripcion de la expresion diferencial de Sox11 en CEV. Los hallazgos de los inventores demuestran que Sox11 es un factor pronostico independiente de RFS mejorado en CEV.
Tabla 1. Caracteristicas de pacientes y tumores
Edad
Mediana (intervalo) 52 (31-77)
Histologia
Seroso
50
Mucinoso
4
Endometroide
17
Celula clara
1
Otro
4
Grado
Bien diferenciado
12
Moderadamente diferenciado
29
Mal diferenciado
35
Etapa
1
0
2
21
3
54
4
1
Tabla 2. Analisis multifactorial* de la regresion de Cox de RFS
HR IC del 95 % Valor de p
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Sox11
(alto / medio frente a bajo)
0,56 0,319 - 0,997 0,049
Etapa
(continua)
1,92 0,971 - 3,800 0,061
Grado
(Bien y moderadamente diferente a mal diferenciado)
1,08 0,740 - 1,562 0,702
*Ajustado para todas las otras variables en la tabla
Abreviaturas: HR = razones de riesgo, 1C del 95 % = intervalos de confianza del 95 %
EJEMPLO B Introduccion
El cancer epitelial de ovario (CEV) comprende tres subtipos histologicos principales (seroso, mucinoso y endometrioide) y tambien puede clasificarse en subgrupos basandose en el estado y grado. Los tumores endometrioides constituyen aproximadamente del 2 al 4 por ciento de todos los tumores de ovario y la mayoria de ellos (aproximadamente el 80 por ciento) son malignos, representando del 10 al 20 por ciento de todos los carcinomas de ovario.
Material y metodos
Se tineron secciones de CEV de grado alto y de CEV endometrioide para Sox11 y se analizaron como se describe previamente (Brennan et al., 2009, European Journal of Cancer, 45(8):1510-1517).
Resultados y discusion
Como se muestra en las Figuras 5, 6 y 7, la supervivencia global y especifica de cancer puede predecirse usando Sox11 para CEVs endometrioides. Por tanto, como se muestra en las Figuras 8 y 9, la supervivencia global y especifica de cancer puede predecirse usando Sox11 para CEVs de alto grado.
Cuando se calcula la probabilidad de supervivencia especifica de cancer, solo se usan los datos de muertes relacionadas con el cancer, a diferencia de cuando se calcula la supervivencia global.
Estos datos indican que Sox11 puede usarse en tanto CEV de grado alto como cancer de ovario endometrioide para estratificar pacientes en grupos clinicamente relevantes basandose en la supervivencia global y especifica de cancer.
En conclusion, Sox11 no es solo un biomarcador util para CEV como grupo, sino que puede usarse para subgrupos de pacientes con diferentes caracteristicas clinicas y/o histologicas.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un resto de union que es capaz de unirse selectivamente a la protema Sox11, o a una molecula de acido nucleico que codifica la misma, para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo.
  2. 2. El uso de un resto de union que es capaz de unirse selectivamente a la proteina Sox11, o a una molecula de acido nucleico que codifica la misma, para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro.
  3. 3. Un resto de union para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo segun la reivindicacion 1 o un uso para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro segun la reivindicacion 2, en donde el CEV pertenece a un subtipo histologico seleccionado del grupo que consiste en celulas serosa, mucinosa, endometrioide y clara.
  4. 4. Un resto de union para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo segun las reivindicaciones 1 o 3, o un uso para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro segun las reivindicaciones 2 o 3 en la deteccion de la expresion de Sox11 como biomarcador unico para diagnosticar o pronosticar cancer epitelial de ovario (CEV).
  5. 5. Un resto de union para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo segun las reivindicaciones 1, 3 o 4, o un uso para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro segun las reivindicaciones 2, 3 o 4, en donde el resto de union es capaz de unirse selectivamente a la proteina Sox11.
  6. 6. Un resto de union para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo segun las reivindicaciones 1, 3, 4 o 5 o un uso para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro segun las reivindicaciones 2, 3, 4 o 5, en donde el resto de union es capaz de unirse selectivamente a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
  7. 7. Un resto de union para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 6, o un uso para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el resto de union comprende o consiste en un anticuerpo o un fragmento de union al antigeno del mismo.
  8. 8. Un resto de union para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo segun las reivindicaciones 1, 3 o 4, o un uso para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el resto de union es capaz de unirse selectivamente a una molecula de acido nucleico que codifica la proteina Sox11.
  9. 9. Un resto de union para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 u 8, o un uso para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 u 8, en donde el resto de union es capaz de unirse selectivamente a una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
  10. 10. Un resto de union para su uso en el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 9, o un uso para el diagnostico, el pronostico y/o la deteccion de cancer epitelial de ovario (CEV) in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en donde el resto de union comprende un resto detectable.
  11. 11. Un metodo in vitro de diagnostico de cancer epitelial de ovario (CEV) en un individuo, comprendiendo el metodo:
    (a) proporcionar una muestra de celulas epiteliales del ovario del individuo; y
    (b) determinar la cantidad de proteina Sox11 y/o de ARNm en la muestra de celulas.
    en el que los niveles de proteina Sox11 y/o de ARNm son indicativos del individuo que tiene cancer epitelial de ovario (CEV).
  12. 12. Un metodo in vitro de pronostico de cancer epitelial de ovario (CEV) en un individuo, comprendiendo el metodo:
    (a) proporcionar una muestra de celulas de cancer epitelial de ovario del individuo; y
    (b) determinar la cantidad de proteina Sox11 y/o de ARNm en la muestra de celulas.
    en el que los niveles de proteina Sox11 y/o de ARNm son indicativos del individuo que tiene una mayor supervivencia sin recidivas (RfS).
    10
  13. 13. Un metodo in vitro de deteccion de celulas de cancer epitelial de ovario (CEV) en un individuo, comprendiendo el metodo:
    (a) proporcionar una muestra de celulas epiteliales del ovario del individuo; y
    (b) determinar la cantidad de proteina Sox11 y/o de ARNm en la muestra de celulas.
    en el que los niveles de proteina Sox11 y/o de ARNm son indicativos del individuo que tiene celulas de cancer epitelial de ovario (CEV).
  14. 14. Un resto de union como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 10 para su uso en un metodo de obtencion de imagenes de celulas de cancer epitelial de ovario (CEV) en el cuerpo de un individuo, comprendiendo el metodo administrar al individuo una cantidad eficaz de dicho resto de union.
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