ES2601003T3

ES2601003T3 - Procedimiento y sistema para el diagnóstico de enfermedades mediante la detección simultánea de anticuerpos unidos a sustratos sintéticos y celulares

Info

Publication number: ES2601003T3
Application number: ES11708424.4T
Authority: ES
Inventors: Ilka KNÜTTER; Boris Radau; Dirk Roggenbuck
Original assignee: Medipan GmbH
Current assignee: Medipan GmbH
Priority date: 2010-02-22
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2017-02-13
Anticipated expiration: 2031-02-22
Also published as: EP2539713A1; AU2011217190B2; EP2362222A1; JP5707421B2; EP2362222B1; US20120308996A1; AU2011217190A1; HK1174972A1; EP2539713B1; CN102667483A; US9772331B2; CN102667483B; WO2011101487A1; JP2013520664A; ES2425540T3

Abstract

Un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades que comprende la detección simultánea de anticuerpos unidos a uno o más sustratos celulares y uno o más sustratos sintéticos, caracterizado por: a) proporcionar una mezcla de sustratos celulares y sintéticos, donde el sustrato sintético es una micropartícula o perla revestida con antígeno al que es capaz de unirse un anticuerpo a detectar, y donde el sustrato celular es una célula de mamífero, múltiples células de mamífero y/o tejido orgánico, b) incubación de dicha mezcla de sustratos con una muestra obtenida de un paciente que contiene el anticuerpo a detectar, c) detección y/o identificación de sustratos celulares y sintéticos y anticuerpos unidos a dichos sustratos usando microscopía de fluorescencia, y d) evaluación de datos de imágenes de inmunofluorescencia.

Description

DESCRIPCION

Procedimiento y sistema para el diagnostico de enfermedades mediante la deteccion simultanea de anticuerpos unidos a sustratos sinteticos y celulares.

La invencion se refiere a un procedimiento y a un sistema para el diagnostico de enfermedades que detecta simultaneamente anticuerpos unidos a sustratos celulares y/o tisulares y anticuerpos unidos a sustratos sinteticos, tales como micropartfculas o perlas revestidas con antfgenos especfficos, proporcionando de esta manera un procedimiento en “una etapa” para la deteccion y caracterizacion simultaneas de anticuerpos asociados con 10 enfermedades tanto a baja especificidad (celular y/o tisular) como a alta especificidad (antigenica).

Antecedentes de la invencion

En diagnosticos rutinarios se ha establecido la deteccion de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFI) 15 empleando diferentes sustratos celulares y tisulares como fuentes de antfgeno multiples. Los ensayos de inmunofluorescencia basados en celulas, tales como la deteccion de anticuerpos antinucleares (AAN) usando celulas HEp-2, se usan ampliamente en diagnosticos clfnicos y en investigacion como referencia en el sector (Tan EM, Adv. Immunology 1982; 33: 167-240, Costes SV, y col., Radiat Res. 2006; 165(5): 505-15, Sack U, y col., Ann N Y Acad Sci 2009; 1173: 166-73, Conrad K, y col., Ann N Y Acad Sci 2009; 1173: 180-185). Los procedimientos para 20 diagnosticar enfermedades autoinmunitarias que usan estrategias basadas en inmunofluorescencia indirecta se conocen en la tecnica. El documento WO 97/06440 describe un procedimiento mediante el cual se diagnostica artritis reumatoide mediante la presencia de anticuerpos que estan dirigidos contra centros organizadores de microtubulos, o microtubulos que se extienden desde estos, en una muestra de lfquido corporal de un paciente. La lfnea celular usada como sustrato es, preferentemente, una lfnea celular de macrofago IT-1, que se usa como 25 sustrato al que se unen los autoanticuerpos presentes en la muestra del paciente.

La demanda creciente de lectura e interpretacion de patrones de fluorescencia automatizadas, que den como resultado una mejor normalizacion y rentabilidad, ha sido posible gracias a un sofisticado software de reconocimiento de patrones y a lectores totalmente automaticos que ya estan disponibles en la actualidad (Hou YN, y col., Radiat 30 Res. 2009; 171(3): 360-7, Hiemann R, y col., Ann N Y Acad Sci 2007; 1109: 358-71, Bocker W, y col., Radiat Res. 2006; 165(1): 113-24. Hiemann R, y col., Autoimmun Rev. 2009; 9: 17-22). La inmunofluorescencia indirecta se ha aplicado adicionalmente en enfoques cuantitativos y semicuantitativos para determinar el valor cuantitativo de anticuerpos, por ejemplo en el diagnostico de enfermedades caracterizadas por la presencia y/o cantidad de autoanticuerpos (documento WO 2009/062479 A2).

35

Sin embargo, avances realizados en el desarrollo de ensayos y la tecnologfa recombinante han preparado el camino para la deteccion de especificidades de autoanticuerpos contra dianas antigenicas individuales mejorando de esta manera el poder de diagnostico de los ensayos con anticuerpos. La creciente variedad de anticuerpos descubiertos en diferentes trastornos, tales como enfermedades infecciosas y reumaticas, ha generado la necesidad de tecnicas 40 innovadoras, que superen los inconvenientes de la deteccion de anticuerpos unicos y que disminuyan el coste y el tiempo de presentacion de resultados. Por consiguiente, recientemente se han desarrollado plataformas multiples para atender la demanda de determinaciones simultaneas de diversas especificidades de anticuerpos en una muestra. Ensayos multiples basados en citometrfa de flujo basada en perlas fluorescentes y los sistemas de micromatrices han demostrado ser herramientas poderosas que dan soporte a analisis de mayor rendimiento y a 45 ensayos mas exhaustivos de las muestras de pacientes (Avaniss-Aghajani E, y col., Clin Vaccine Immunol. 2007; 14: 505-9, Lal G, y col., J Immunol Methods 2005; 296: 135-47). Tambien se ha usado reconocimiento de patrones asistido por ordenador para analizar matrices de antfgenos, de modo que los anticuerpos que se unen a un panel de antfgenos asociados a una enfermedad puedan ser detectados y correlacionados con el diagnostico de una enfermedad particular (Binder SR y col, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, diciembre de 2005, 135350 1357). Ademas, para la evaluacion de anticuerpos especfficos de enfermedades reumaticas, puede usarse deteccion multiple mediante microperlas codificadas por fluorescencia inmovilizadas, usando fluorescencia multicolor. Estos analisis de fluorescencia multicolor con algoritmos de deteccion de patrones proporcionan una tecnica de plataforma comun para el cribado de AAN (GroUmann K, y col., Cytometry A. febrero de 2011; 79(2): 118-25).

55 Como ejemplo, los autoanticuerpos (AAC) especfficos de enfermedades, son un fenomeno serologico de afecciones reumaticas sistemicas y trastornos hepaticos autoinmunitarios. En particular, la deteccion de AAN por IFI fue una de las primeras tecnicas disponibles en laboratorios habituales para el diagnostico serologico de enfermedades reumaticas sistemicas. A pesar del desarrollo del ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA) y de las tecnologfas de formacion de complejos multiples para la deteccion de AAC especfficos de enfermedades, la

deteccion de AAN por ensayos de IFI sigue siendo el procedimiento de referencia en la estrategia actual de diagnostico multifase. Pueden proporcionarse antfgenos recombinantes o purificados sobre perlas, que son analizadas posteriormente en busca de anticuerpos que se unen especfficamente a los antfgenos seleccionados usando inmunoensayos enzimaticos. Dichas estrategias muestran, sin embargo, desventajas significativas, debido a 5 sensibilidades y especificidades fuertemente diferentes entre diferentes antfgenos (Hayashi N, y col, 2001, Clinical Chemistry, 47: 9 1649-1659). Se han publicado ensayos fluorescentes basados en perlas multiples que muestran una correlacion razonable con procedimientos de diagnostico con autoanticuerpos basados en celulas (Smith J, y col, 2005, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1050: 286-294), aunque la baja sensibilidad para identificar muestras de control positivas para IFI indica que las estrategias de IFI siguen siendo el procedimiento preferido (Nifli AP, y col, Journal of 10 Immunological methods 311 (2006), 189-197).

Se han propuesto diversos sustratos para los ensayos de AAN por IFI, sin embargo, el procedimiento mas establecido es el cribado de AAC no especfficos de organos en celulas HEp-2. En general, despues de la evaluacion de AAN se realiza la deteccion de aAc especffico para, por ejemplo, antfgenos nucleares extrafbles (ANE) y 15 antfgenos citoplasmaticos por inmunoensayos que emplean antfgenos naturales purificados o recombinantes. Esta estrategia en dos fases presenta los siguientes beneficios: (i) cribado altamente sensible de los AAC mas frecuentes, no especfficos de organos, clfnicamente relevantes, (ii) combinacion optima con otras tecnicas de ensayo por la diferenciacion aguas abajo de reactividades de los AAC basandose en el patron de IFI detectado y en el diagnostico sospechado (por ejemplo, SS-A/Ro y SS-B/La), (iii) evaluacion de AAC clfnicamente relevantes sin la necesidad de 20 mas ensayos (por ejemplo, AAC anti-centromero) y (iv) evaluacion de AAC solo detectables por IFI en el caso de dianas autoantigenicas desconocidas o ensayos no disponibles en el mercado.

Otro ejemplo es la deteccion de anticuerpos citoplasmaticos antineutrofilos (ACAN) para el diagnostico diferencial de vasculitis sistemica (Bosch X, y col., Lancet 2006; 368: 404-18). Debido a la aparicion de ACAN en estos trastornos 25 autoinmunitarios sistemicos, la expresion vasculitis asociada a ACAN (VSAA) se ha acunado para estas entidades clfnicas. Los ACAN se descubrieron por IFI, que aun es el procedimiento recomendado para detectar estas reactividades de anticuerpos. Normalmente, los ACAN muestran dos patrones de tincion diferentes de granulocitos fijados en IFI; un patron citoplasmatico moteado (cACAN) y un patron perinuclear (pACAN). Los cACAN que se encuentran frecuentemente en pacientes con granulomatosis de Wegener (GW), estan dirigidos principalmente 30 contra la proteinasa 3 (PR3), ademas de otras dianas, mientras que los pACAN, producidos principalmente en la poliangitis microscopica (PAM), estan dirigidos principalmente contra la mieloperoxidasa (MPO) (Van der Woude FJ, y col., Lancet 1985; 1: 425-9; Csernok E, y col., Nat Clin Pract Rheumatol. Abril de 2006; 2(4): 174-5), ademas de otras dianas.

35 Se ha propuesto que las estimaciones de las concentraciones de anticuerpos, son utiles en el diagnostico y el tratamiento de estas entidades clfnicas. Los valores de anticuerpo normalmente se asocian con la gravedad de la enfermedad (Cohen Tervaert JW, y col., Arch Intern Med 1989; 149: 2461-5). Sin embargo, ha habido otros antfgenos diana para ACAN descritos en IFI que pueden encontrarse en pacientes sin VSAA (Savige J, y col., Best. Pract. Res. Clin. Rheumatol. 19: 263-76, Savige J, y col., Am J Clin Path 2003; 120:312-8). En consecuencia, de 40 acuerdo con las directrices consenso establecidas recientemente, ademas de la IFI, para la deteccion de ACAN se recomienda una tecnica diferente, tal como ELISA.

Sin embargo, las tecnicas empleadas para determinar varios anticuerpos mediante la estrategia bi- o multifase mencionada anteriormente implican una pluralidad de ensayos de constituyentes marcados individualmente. Con 45 respecto a la rentabilidad de los diagnosticos serologicos existe una clara demanda de combinar, por un lado, la deteccion de anticuerpos para dianas antigenicas celulares y tisulares y, por otro lado, para sus protefnas caracterizadas y purificadas, en un solo procedimiento con una etiqueta.

La caracterizacion actual de protefnas mediante tecnologfa de micromatrices no proporciona por sf sola ninguna 50 solucion satisfactoria. Al aumentar el numero de dianas antigenicas a ensayar en una sola micromatriz, la demanda de equipos de fabricacion asociados, la miniaturizacion y los materiales y el manejo especializados, haran que la produccion de dichas micromatrices sea cada vez mas compleja y costosa. Otras tecnicas, incluyendo el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA), los ensayos cromogenos, la cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatograffa de gases-espectroscopia de masas (GC-MS), y la 55 cromatograffa de capa fina (TLC), presentan la desventaja de estar limitadas en cuanto al numero de analitos en forma antigenica que puedan evaluarse simultaneamente. Ademas requieren mucho tiempo y equipos costosos. Por el contrario, empleando un sustrato de celulas HEp-2 para la deteccion de AAN se proporcionan mas de 1.200 dianas antigenicas para la identificacion de anticuerpos.

Resumen de la invencion

En vista del problema tecnico subyacente de la tecnica anterior, la presente invencion proporcionara un procedimiento para el diagnostico de enfermedades, que reduce un diagnostico multi-etapa a un procedimiento de 5 una etapa. Este problema se resuelve por las caracterfsticas de las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas de la presente invencion las proporcionan las reivindicaciones dependientes.

El objetivo de la invencion es, por lo tanto, proporcionar un procedimiento y un sistema para el diagnostico de enfermedades que detecta anticuerpos unidos a sustratos celulares y/o tisulares y detecta simultaneamente 10 anticuerpos unidos a sustratos sinteticos, tales como micropartfculas revestidas con antfgenos especfficos naturales purificados y/o recombinantes, proporcionando de este modo un procedimiento de “una etapa” para la deteccion simultanea de anticuerpos asociados con enfermedades tanto a baja especificidad (especffica celular y/o tisular) como a alta especificidad (especffica antigenica).

15 La invencion se refiere, ademas, a un dispositivo y a un kit para llevar a cabo el procedimiento de la presente invencion. El procedimiento tambien es adecuado para un procedimiento de cribado, en el que la reactividad de multiples sueros de pacientes puede ensayarse contra cualquier numero de antfgenos especfficos determinado.

Por lo tanto, un objetivo de la invencion es proporcionar un procedimiento para el diagnostico de enfermedades que 20 comprende la deteccion simultanea de anticuerpos unidos a uno o mas sustratos celulares y uno o mas sustratos sinteticos, caracterizado por:

a) proporcionar una mezcla de sustratos celulares y sinteticos, donde el sustrato sintetico es una micropartfcula o perla revestida con antfgeno al que es capaz de unirse un anticuerpo a detectar, y donde el sustrato celular es

25 una celula de mamffero, multiples celulas de mamffero y/o tejido organico,

b) incubacion de dicha mezcla de sustratos con una muestra que contiene el anticuerpo a detectar,

c) deteccion y/o identificacion de sustratos celulares y sinteticos y anticuerpos unidos a dichos sustratos usando 30 microscopfa de fluorescencia, y

d) evaluacion de datos de imagenes de inmunofluorescencia, preferentemente usando un sistema de interpretacion de reconocimiento de patrones automatizado.

35 El sustrato celular representa un sustrato biologico para union del antfgeno, tal como una celula de mamffero, con lo que pueden aplicarse combinaciones de diferentes tipos de tejido o celulas. Los sustratos tisulares, constituidos por multiples celulas de un tipo similar obtenidas de tejido organico, tambien pueden usarse como el “sustrato celular” en el procedimiento de la presente invencion.

40 En una realizacion preferida del procedimiento mencionado anteriormente, el sustrato celular o tisular puede ser celulas HEp-2, granulocitos humanos y/o tejido organico, preferentemente tejido pancreatico.

En una realizacion preferida, el sustrato sintetico es una micropartfcula o perla revestida con antfgeno nativo purificado y/o antfgeno recombinante. Los antfgenos pueden ser protefnas, peptidos, acidos nucleicos, tales como 45 ADN, estructuras celulares multimoleculares tales como centromeres, complejos de protefnas o estructuras de protefna-membrana, o esencialmente cualquier otro componente celular al que pueden unirse anticuerpos. Se pretende que el sustrato sintetico actue como un vehfculo para un antfgeno especffico, o una mezcla de antfgenos especfficos, purificados y/o recombinantes. En la tecnica se conocen vehfculos de micropartfculas y perlas de diversas sustancias y materiales, y son adecuados para el procedimiento de la presente invencion, por ejemplo, 50 micropartfculas, partfculas o perlas compuestas por polfmeros naturales o artificiales, sefarosa, celulosa, vidrio u oxidos metalicos.

En una realizacion preferida de la invencion, el procedimiento de diagnostico de enfermedades se caracteriza porque al revestimiento antigenico del sustrato sintetico se unen anticuerpos asociados con la presencia de la enfermedad. 55 El antfgeno que reviste el sustrato sintetico se selecciona de acuerdo con su asociacion con una enfermedad conocida. La identificacion de anticuerpos que se unen a antfgenos especfficos permite, por lo tanto, un diagnostico de enfermedad con “alta especificidad”, ademas de una deteccion de “baja especificidad” de anticuerpos unidos a sustratos celulares y/o tisulares.

Se pretende que los sustratos de la presente invencion sean detectados y/o identificados mediante una o mas caracterfsticas o parametros distintivos. En una realizacion, el procedimiento de la presente invencion se caracteriza por que las caracterfsticas opticas, fluorescentes y/o ffsicas de los sustratos se usan para detectar y/o identificar dichos sustratos. Por ejemplo, los diversos sustratos pueden identificarse por su tamano, forma, propiedades 5 fluorescentes u otros parametros durante el analisis microscopico. Los diversos parametros tambien pueden combinarse para los diversos sustratos, representando de este modo un tipo de codigo para la identificacion de sustratos, antfgenos y/o anticuerpos.

En una realizacion de la invencion, el procedimiento se caracteriza porque la caracterfstica fluorescente de 10 concentracion de fluoroforo, por ejemplo concentracion de rodamina, y/o la caracterfstica ffsica de tamano se usa para identificar el sustrato sintetico, con lo que el tamano de la perla o micropartfcula esta preferentemente entre 1100 pm, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100 pm, o cualquier valor similar. Pueden combinarse multiples perlas o micropartfculas de diferentes tamanos, con lo que cada tamano de perla este revestido con un antfgeno diferente, de modo que una estrategia similar a una matriz para multiples antfgenos pueda 15 aplicarse simultaneamente con sustratos celulares.

En una realizacion preferida de la presente invencion, se usa microscopfa fluorescente multicolor para identificar dichos sustratos y/o autoanticuerpos unidos, con lo que los sustratos y/o anticuerpos unidos muestran diferentes colores fluorescentes, preferentemente azul, verde y rojo.

20

En una realizacion de la presente invencion, el sustrato celular esta marcado con un colorante fluorescente con emision en el azul, por ejemplo DAPI, el sustrato sintetico esta marcado con un colorante fluorescente con emision en el verde, por ejemplo rodamina o FITC, y/o el anticuerpo unido de forma especffica es detectado por un anticuerpo especffico anti-inmunoglobulina humana marcado con un colorante fluorescente con emision en el rojo, 25 por ejemplo Cy5 y/o aloficocianina (APC).

El procedimiento de la presente invencion se refiere especialmente a enfermedades o trastornos donde la deteccion de anticuerpos proporciona un diagnostico eficaz. En una realizacion preferida, el procedimiento se caracteriza porque la enfermedad es un trastorno autoinmunitario o infeccioso, preferentemente una afeccion reumatica 30 sistemica, trastorno hepatico autoinmunitario, diabetes de tipo 1, enfermedad de Lyme o virus del herpes simple.

Aunque las enfermedades autoinmunitarias son diffciles de diagnosticar, la identificacion de uno o mas antfgenos especffico a los que se unen autoanticuerpos, ademas del patron de union de autoanticuerpos sobre el sustrato celular, permite un diagnostico mas preciso en un periodo mas corto que lo que se conocfa anteriormente. La 35 presente invencion permite un procedimiento de diagnostico que combina estrategias basadas en matrices y celulares que, hasta ahora, nunca fue considerado posible.

En una realizacion de la invencion, los anticuerpos a detectar son anticuerpos antinucleares (AAN) o anticuerpos citoplasmaticos antineutrofilos (ACAN).

40

En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque se usan celulas HEp-2 para analizar la tincion de anticuerpos antinucleares (AAN).

En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque los patrones de tincion 45 celular de AAN, los antfgenos correspondientes y las enfermedades asociadas, tal como se presentan en la tabla 3, la tabla 4 y/o la tabla 5, se usan en el diagnostico de enfermedades.

En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque se usan granulocitos humanos para analizar la tincion de anticuerpos citoplasmaticos antineutrofilos (ACAN).

50

En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque los patrones de tincion celular de ACAN, los antfgenos correspondientes y las enfermedades asociadas, tal como se presentan en la tabla 1 y/o la tabla 2, se usan en el diagnostico de enfermedades.

55 En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque los anticuerpos citoplasmaticos antineutrofilos (ACAN) muestran una tincion perinuclear (p-ACAN) o tincion citoplasmatica moteada (cACAN) de granulocitos humanos.

En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque los anticuerpos estan

dirigidos contra las protefnas proteinasa 3 (PR3) o mieloperoxidasa (MPO), o sus antfgenos.

En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque los anticuerpos muestran tincion citoplasmatica moteada (cACAN) de granulocitos humanos y se unen a proteinasa 3 (PR3), con lo 5 que la protefna o sus antfgenos estan provistos sobre un sustrato sintetico, proporcionando por lo tanto un diagnostico de granulomatosis de Wegener (GW).

En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque los anticuerpos muestran tincion perinuclear (p-ACAN) de granulocitos humanos y se unen a mieloperoxidasa (MPO), con lo que la 10 protefna o sus antfgenos estan provistos sobre un sustrato sintetico, proporcionando por lo tanto un diagnostico de vasculitis asociada a ACAN (VSAA).

En una realizacion adicional de la presente invencion, el procedimiento se caracteriza porque la muestra comprende sangre, suero, lfquido cefalorraqufdeo, lfquido sinovial, o saliva obtenida de un sujeto, con lo que el sujeto debe 15 entenderse como un paciente del que se sospecha que tiene una enfermedad o dolencia que se diagnosticara usando el procedimiento de la presente invencion.

La invencion tambien abarca un procedimiento mediante el cual el sistema de interpretacion esta controlado por software disenado especialmente, tal como software que ha sido desarrollado especfficamente para aplicacion en el 20 procedimiento de la presente invencion, que consiste en modulos para el control de dispositivos y de autoenfoque, adquisicion de imagenes, analisis de imagenes, y/o algoritmos de reconocimiento de patrones.

En una realizacion, el procedimiento de la invencion se caracteriza porque el sistema de interpretacion se usa para evaluar los datos de imagenes de inmunofluorescencia de acuerdo con la siguiente jerarqufa:

25

i) senal de tincion positiva,

ii) localizacion de la tincion, preferentemente mediante clasificacion de patrones de tincion en sustrato celular o sustrato sintetico, y

30

iii) determinacion de patrones celulares, preferentemente patrones perinucleares y/o citoplasmaticos para granulocitos; patrones nucleares citoplasmaticos y/o cromatfnicos de celulas mitoticas para celulas HEp-2.

Esta jerarqufa facilita un analisis rapido y preciso de las imagenes microscopicas adquiridas y, por lo tanto, permite 35 un diagnostico basandose en parametros multiples en los datos de inmunofluorescencia.

En una realizacion, el procedimiento de la invencion se caracteriza porque la clasificacion de patrones de tincion en celulares o sinteticos y la determinacion de patrones celulares se consigue a traves de una combinacion de caracterfsticas de estructura y textura de la imagen de inmunofluorescencia definiendo un conjunto de reglas para 40 cada patron. Esta clasificacion puede llevarse a cabo mediante software disenado especialmente, tal como software que ha sido desarrollado especfficamente para aplicacion en el procedimiento de la presente invencion.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un sistema para la deteccion simultanea de anticuerpos unidos a uno o mas sustratos celulares y uno o mas sustratos sinteticos de acuerdo con el procedimiento de una cualquiera 45 de las reivindicaciones anteriores, que comprende

a) un microscopio fluorescente con una camara, una platina de exploracion motorizada y diodos emisores de luz multicanal (LED), y

50 b) un dispositivo informatico con software que consiste en modulos para control de dispositivos y autoenfoque, adquisicion de imagenes automatizada, analisis de imagenes automatizado, y algoritmos de reconocimiento de patrones automatizados con lo que se analizan canales de tres colores, preferentemente azul, verde y rojo, y

c) una mezcla de sustratos celulares y sinteticos con una muestra que contiene el anticuerpo a detectar y permite 55 la deteccion y/o identificacion de sustratos celulares y sinteticos y anticuerpos unidos a dichos sustratos, donde el sustrato sintetico es una micropartfcula o perla revestida con antfgeno al que es capaz de unirse un anticuerpo a detectar, y donde el sustrato celular es una celula de mamffero, multiples celulas de mamffero y/o tejido organico.

El sistema de la presente invencion se ha desarrollado especfficamente para aplicacion en el procedimiento de diagnostico de enfermedades de la presente invencion. Dicho sistema puede comprender un microscopio fluorescente acoplado a un ordenador de procesamiento de datos, tal como un PC.

5 Un aspecto de la invencion es tambien un kit para la deteccion simultanea y/o la identificacion de anticuerpos unidos a uno o mas sustratos celulares y uno o mas sustratos sinteticos de acuerdo con el procedimiento de las reivindicaciones 1-21, que comprende a) portaobjetos con sustrato celular fijado mezclado con el sustrato sintetico revestido de anticuerpo, con lo que el sustrato celular es preferentemente celulas HEp-2 y/o granulocitos humanos, y los sustratos sinteticos se distinguen entre si de acuerdo con sus caracterfsticas opticas, fluorescentes y/o ffsicas, 10 donde el sustrato sintetico es una micropartfcula o perla revestida con antfgeno al que es capaz de unirse un anticuerpo a detectar, y donde el sustrato celular es una celula de mamffero, multiples celulas de mamffero y/o tejido organico, y b) conjugado con un anticuerpo especffico de inmunoglobulina, conjugado con una etiqueta fluorescente, preferentemente FITC, Cy5 y/o APC, y opcionalmente tampon de lavado, cubreobjetos, medio de cobertura, sustrato sintetico no revestido, con o sin etiqueta fluorescente, y/o etiquetas fluorescentes adicionales para sustratos 15 sinteticos.

Los kits de la presente invencion permiten un procedimiento de diagnostico extremadamente simplificado y economico en comparacion con los estandares conocidos en la tecnica. Un portaobjetos del kit puede contener multiples sustratos sinteticos con multiples epftopos, que esencialmente combinan una estrategia basada en 20 matrices con la estrategia de sustrato celular, proporcionando de este modo una herramienta de diagnostico mas completa y eficiente que cualquier cosa conocida en la tecnica, que esta presente en una forma compacta que es economicamente viable.

Descripcion detallada de la invencion

25

El procedimiento de la presente invencion permite el diagnostico de enfermedades para las que normalmente se requieren diagnosticos multi-etapa. Las etapas de diagnostico multiples para la evaluacion de anticuerpos que se unen a especificidades crecientes se combinan en este procedimiento para proporcionar un diagnostico mas rapido, eficiente y exacto en un solo analisis de diagnostico.

30

Este procedimiento se refiere especialmente a enfermedades o trastornos donde la deteccion de anticuerpos proporciona un diagnostico eficaz, tales como enfermedades infecciosas y trastornos autoinmunitarios. El procedimiento permite el cribado de no solamente la presencia y patron de union de anticuerpos en celulas o tejidos, sino que tambien puede proporcionar informacion mas especffica sobre los antfgenos individuales a los que se 35 dirigen los anticuerpos. Esto facilita el diagnostico de trastornos especfficos en un procedimiento de una etapa.

El termino diagnostico se refiere a la identificacion y/o determinacion de la naturaleza o causa de una enfermedad a traves de la evaluacion de caracterfsticas del paciente. La presente invencion proporciona un procedimiento de diagnostico que, cuando se lleva a cabo, proporciona una indicacion de una enfermedad o enfermedades 40 particulares que pueden estar presentes en el paciente. Por ejemplo, multiples enfermedades autoinmunitarias pueden estar presentes en un sujeto cualquiera, de modo que el procedimiento de la presente invencion no excluye la existencia de otras enfermedades mediante la identificacion de una enfermedad, por ejemplo multiples enfermedades tambien podrfan detectarse o diagnosticarse simultaneamente o por separado, usando el procedimiento de la presente invencion.

45

El procedimiento de la presente invencion esta particularmente adaptado para el diagnostico de trastornos inflamatorios reumaticos sistemicos, tales como vasculitis sistemica autoinmunitaria. Dichos trastornos asociados con anticuerpos dirigidos a antfgenos dentro de granulocitos (ACAN), tales como poliangitis microscopica (PAM), asociada con anticuerpos contra la mieloperoxidasa (MPO), y granulomatosis de Wegener (GW), asociada con 50 anticuerpos contra proteinasa 3 (PR3), pueden diagnosticarse usando el procedimiento de la presente invencion. El lupus eritematoso sistemico puede diagnosticarse, por ejemplo, cuando se asocia con anticuerpos dirigidos a ADN bicatenario. La polimiositis tambien puede diagnosticarse usando la presente invencion, por ejemplo, cuando se asocia con anticuerpos dirigidos a antfgenos dentro de celulas HEp-2 tales como tARN sintetasas.

55 Con la presente invencion tambien pueden diagnosticarse trastornos hepaticos autoinmunitarios, tales como hepatitis autoinmunitaria, por ejemplo, cuando se asocian con anticuerpos dirigidos a antfgenos dentro de celulas HEp-2. Tambien pueden diagnosticarse trastornos asociados con anticuerpos contra actina fibrilar, el receptor de asialoglucoprotefna u otros antfgenos dentro de hepatocitos.

En la tabla 1 se presenta una lista de tipos de anticuerpo citoplasmatico antineutrofilos relevantes y patrones

celulares asociados en granulocitos. La tabla 1 proporciona ejemplos de anticuerpos, patrones de tincion y su relevancia clmica asociada. Esta tabla no pretende limitar el alcance de la invencion.

Tabla 1.

Tipos de anticuerpos y patrones celulares relevantes

Anticuerpo: Antfgeno, epttopo Distribucion histologica Deteccion por TIF y otros procedimientos Presencia y relevancia de diagnostico

ACAN: Enzimas en granulos citoplasmaticos, granulocitos neutrofilos, por ejemplo, proteinasa 3, mieloperoxidasa, elastasa, catepsina G, azurocidina, lactoferrina, lisozima, BPI Citoplasma: granulos espedficos (granulocitos neutrofilos) Granular, perinuclear o atfpica (citoplasmatica): cACAN, pACAN, aACAN o xACAN; TIF indirecta sobre granulocitos neutrofilos (fijados con etanol o formalina) cACAN (proteinasa 3) y pACAN (mieloperoxidasa) son marcadores para vasculitis sistemica. Ademas, patrones de pACAN tfpicos o atfpicos se descubren en artritis reumatoide, enfermedades intestinales inflamatorias cronicas, colangitis esclerosante primaria y fibrosis qrnstica.

cACAN: Enzimas en granulos citoplasmaticos granulocitos neutrofilos: proteinasa-3 (PR-3) y BPI Citoplasma: granulos espedficos (granulocitos neutrofilos) Granular (citoplasma), cACAN: a menudo debido a anticuerpos dirigidos contra PR-3, tambien debido a anticuerpos dirigidos contra BPI, TIF indirecta sobre granulocitos neutrofilos (fijados con etanol o formalina) cACAN (proteinasa 3) casi exclusivamente en granulomatosis de Wegener, cribado tambien en casos potenciales de vasculitis sistemica

pACAN: Enzimas en granulos citoplasmaticos granulocitos neutrofilos: mieloperoxidasa (MPO), elastasa, catepsina G, azurocidina, lactoferrina, lisozima y otros antfgenos diana aun no identificados Citoplasma: granulos espedficos (granulocitos neutrofilos) Perinuclear (citoplasma), pACAN: generalmente debido a anticuerpos dirigidos contra MPO. El patron es causado por desplazamiento durante la fijacion con etanol. Con fijacion con formalina, el patron es citoplasmatico granular; TIF indirecta sobre granulocitos neutrofilos (fijados con etanol) pACAN se indica en vasculitis (vasculitis asociada a ACAN, por ejemplo, poliangitis microscopica y glomerulonefritis pauciinmunitaria), enfermedades intestinales inflamatorias cronicas, hepatitis autoinmunitaria

En la tabla 2 se presenta una lista de antfgenos relevantes que pueden aplicarse al sustrato sintetico de la presente invencion. Este listado no pretende limitar el alcance de la invencion. A partir de la tabla 1 es evidente que, para cada uno de los patrones celulares, pueden indicarse multiples enfermedades. Con el fin de proporcionar un 10 diagnostico mas concreto, se requiere informacion mas detallada sobre el antfgeno particular al que se unen los anticuerpos. Se vuelve evidente a partir de la tabla 2 que cada uno de los antfgenos particulares muestra una asociacion estrecha con una enfermedad, de modo que una senal positiva para dicho antfgeno en el procedimiento de la presente invencion, en combinacion con el patron celular, permite un diagnostico mejorado en comparacion con aquellas tecnicas conocidas en la tecnica.

15

La presente invencion representa, por lo tanto, una novedosa combinacion de tecnicas analfticas para proporcionar un diagnostico mejorado. La invencion se refiere a una invencion de combinacion, con lo que la novedad de los componentes individuales no es importante, sino que, en su lugar, la combinacion particular tal como se reivindica causa resultados sorprendentes y un efecto sinergico. La presente invencion muestra un efecto sinergico entre los 20 componentes, con lo que el analisis simultaneo de anticuerpos del paciente a especificidad tanto baja (celular y/o tisular) como alta (antigenica) proporciona un procedimiento mucho mas rapido y un diagnostico mas concreto en

comparacion con aquellos procedimientos conocidos en la tecnica anterior.

Tabla 2.

Antigenos individuales que son relevantes para aplicacion sobre el sustrato sintetico o perlas de la presente invencion

Anticuerpo: Antfgeno, epftopo Distribucion histologica Deteccion por TIF y otros procedimientos Presencia y relevancia de diagnostico

Mieloperoxidasa: Homodfmero de mieloperoxidasa de aprox. 140 kD, cataliza la peroxidacion de cloruro a hipoclorito; destruccion intracelular de microorganismos fagocitados, inactivacion de inhibidores de proteasa Citoplasma: granulos azurofilos (granulocitos neutrofilos) ELISA con mieloperoxidasa purificada MPO-ACAN es un marcador de diagnostico para poliangitis microscopica (PAM) y para glomerulonefritis necrotica focal pauciinmunitaria (puede desarrollarse a glomerulonefritis rapidamente progresiva, GMRP. Nota: la glomerulonefritis pauciinmunitaria como parte de vasculitis sistemica o como forma idiopatica (sin vasculitis extra-renal)

Proteinasa 3: Proteinasa-3, serina proteinasa neutra Citoplasma: granulos azurofilos (granulocitos neutrofilos) ELISA con proteinasa-3 purificada o recombinante (expresada en celulas eucariotas) PR3-ACAN es un marcador de diagnostico para granulomatosis de Wegener. Formas temprana y abortiva, ademas una serie de formas de Wegener limitadas, puede diagnosticarse debido a la elevada especificidad. La senal de PR3-ACAN se correlaciona con la actividad de la enfermedad

Elastasa
Elastasa: Citoplasma: granulos azurofilos (granulocitos neutrofilos) ELISA con elastasa purificada vease pACAN

Catepsina G
Catepsina G: Citoplasma: granulos azurofilos (granulocitos neutrofilos) ELISA con catepsina G purificada vease pACAN

Lactoferrina
Lactoferrina: Citoplasma: granulos azurofilos (granulocitos neutrofilos) ELISA con lactoferrina purificada vease pACAN

Lisozima
Lisozima: Citoplasma: granulos azurofilos (granulocitos neutrofilos) ELISA con lisozima purificada vease pACAN

Azurocidina: Azurocidina, protefna Citoplasma: ELISA con Azurocidina-ACAN de forma

: antimicrobiana granulos azurocidina predominante en vasculitis

: cationica (CAP37) azurofilos (granulocitos neutrofilos) purificada sistemica; los anticuerpos para azurodicina a menudo pueden ser detectados junto con otras especificidades de ACAN

En la tabla 3 se presenta una lista de anticuerpos antinucleares relevantes y relevancia clfnica asociada. Este listado no limita el alcance de la invencion. Se representa la incidencia de anticuerpos antinucleares en enfermedades autoinmunitarias sistemicas. La incidencia de anticuerpos antinucleares y su asociacion con enfermedades 5 especfficas es conocida en la tecnica (Arbuckle MR y col. New Engl J Med 2003; 349: 1226-33, Bradwell AR y Hughes RG. Atlas of HEp-2 patterns. 3a ed. 2007, Dalakas MC y col. Lancet 2003, 362: 971-82, Fox RI. Lancet 2005; 366: 321-31, Rahman A y col. New Engl J Med 2008; 358: 929-39, Tan EM y col. Arthritis Rheum 1997; 40: 1601-11, Ziswiler H-R y col. Swiss Med Wkly 2007; 137: 586-90).

10 Abreviaturas: LES: lupus eritematoso sistemico; EMTC: enfermedad mixta del tejido conectivo (sfndrome de Sharp); DM/PM dermato/polimiositis; AR: artritis reumatoide; ESc: esclerosis/esclerodermia sistemica; ESSL: esclerodermia sistemica limitada (sfndrome de CREST); LE med.: lupus eritematoso inducido por medicamentos; CAI: colangitis autoinmunitaria; CBP: cirrosis biliar primaria.

15 Las enfermedades proporcionadas en las tablas 1 a 4 pretender ser ejemplos de dolencias, afecciones y/o enfermedades a diagnosticar mediante el procedimiento de la presente invencion.

Tabla 3.

Incidencia (%) de anticuerpos antinucleares (IgG) en enfermedades autoinmunitarias sistemicas

Antfgeno Hep-2: LES LE med. EMTC AR Sjogren ESc ESSL DM/PM

AAN IIF HEp2 1 :>:160 a: 95 95 100 14 74 87 55-80 60

ds-ADN: 70-80 3 <5 <5 <5 <5 <5 <5

nucleosomas: 60-90 95 <5 11 8 <5 - <5

centrosomas: - - - - - 10 55-80 -

Sm: 10-30 - - - - - - -

U1-snRNP (Sm-RNP) b: 60 - 100 <5 3 6 <5 6

snRNP p68 / A: 20-50 100 <5 3 6 <5 6

SS-A/Ro p52: 30 c - <5 <5 65 <5 <5 25^

SS-A/Ro p60: 30-40 - <5 10 75 9 <5 15

SS-B/La: 15-20 c - <5 15 50 <5 <5 5

rRNP e: 20 - - - - - - -

Scl-70: - - - - 5 30 - 50 13 10

fibrilarina (U3-snoRNP): - - - - - 8 3 -

ARN-polimerasas: <5 - <5 <5 - 4-20 - -

Jo-1: - - - - - 3 - 16

PL-7, PL-12: - - - - - - - 4

SRP: - - - - - - - <3

Mi-2: - - - - - - - 10-15

PM-Scl: - - - - - 3 25-50 f - 8 25-50 f

PCNA: 3 - - - - - - -

Leyenda para la tabla 3: a especificidad 95 % b complejo U1-snRNP-: IgG contra Sm y/o U1-snRNP p68/A y/o epftopos terciarios c Importancia patogena en lupus neonatal con av-Block en hasta el 5% de los casos. SS-A/Ro52 IgG reconocen un

receptor serotoninergico: 5-HT4 cardiaco y los inhiben mediante corrientes de calcio de tipo L activadas por

serotonina (ICa). d SS-A/Ro p52 IgG junto con Jo-1 IgG en miopatfas inflamatorias e rRNP: RNP ribosomico con las protefnas P0, P1 y P2 f In DM/PM con ESc

La tabla 4 presenta patrones nucleares (IFI) para anticuerpos antinucleares cuando estan unidos a celulas HEp-2.

Puede verse a partir de la tabla 4 que patrones celulares/nucleares similares o iguales son visibles para diferentes enfermedades. La tabla 5 presenta patrones celulares adicionales (citoplasmaticos) para anticuerpos unidos a celulas HEp-2. Aunque un analisis celular puede proporcionar indicios o soporte para la presencia o ausencia de una enfermedad autoinmunitaria, la inmunofluorescencia indirecta usando solamente sustratos celulares no puede 5 proporcionar un diagnostico concreto optimo. Tambien se proporcionan en las tablas 4 y 5 listas de antfgenos particulares, que podrfan aplicarse al sustrato sintetico de la presente invencion. La combinacion de patron celular (interfase nuclear, mitosis y citoplasma) y antfgeno especffico (antfgeno) causa a continuacion un diagnostico mejorado y mas seguro de la enfermedad o afeccion.

10 Tabla 4.

Deteccion de anticuerpos antinucleares (AAN) en celulas HEp-2 (AAN IIF HEp2)

Interfase nuclear: Mitosis Antfgeno Asociacion a

: (Cromatina) enfermedades

moteada fina,: negativa SS-A (Ro52 o Ro60), SS- B (La) Sjogren, LES, EMTC

moteada fina,: negativa ARN-Polimerasa II, ESc

moteada fina,: negativa Ku, inter alia LES, Sjogren, ESc, DM/PM

moteada fina,: negativa Mi-2 (Helicasa) DM-ESc

moteada: negativa Sm LES

moteada: negativa U1-snRNP EMTC, LES, ESc

moteada: negativa otro snRNP PM-ESc, LES, EMTC, Raynaud, Sjogren

moteada gruesa: negativa hnRNP (matriz nuclear) LES, EMTC, AR, ESc

moteada, 46 puntos / nuclear: positive Centromero (principalmente CENP-B) ESSL

moteada, 5 - 15 puntos / nuclear: negativa Puntos en el nucleo (sp100) CAI / CBP

moteada, 2 - 6 puntos / nuclear: negativa Cuerpos espiralados en el nucleo (coilina p80) CAI / CBP

moteada, celulas individuales (fase S): negativa PCNA (Ciclina) LES

homogenea / nucleolos forma circular: debil Scl-70 (Topoisomerasa) ESc

homogenea / periferica: positiva ds-ADN LES

homogenea / periferica: positiva Histona LE med.

membrana granular: negativa Nucleoporinas, gp210 CAI / CBP

nucleolo moteada: punteada ARN-Polimerasa I, regiones organizadoras ESc, LES, EMTC, AR


: nucleolares (RON)

nucleolo grumoso: positiva Fibrilarina (U3-snoRNP) ESc

nucleolo homogeneo: negativa PM-Scl DM/PM + ESc

nucleolo homogeneo, nucleoplasma debil homogenea-moteada: negativa Th/To ESSL, Raynaud, LES, PM, AR

Tabla 5.

Citoplasma: Antfgeno Asociacion a enfermedades

moteada, difusa: mitocondrias (piruvato deshidrogenasa) CBP

granular, fina, difusa: Protefnas P ribosomicas (rRNP) LES

granular: Jo-1 (histidil-tARN-sintetasa) PM

granular: PL-7 (treonil-tARN-sintetasa) PM

granular: PL-12 (alanil-tARN-sintetasa) PM

granular: SRP (protefnas de 54 kDa (entre otras)) Sfndrome de miopatfa anti-SRP-, en su mayorfa relacionada con una PM

fibrilar, difusa: actina polimerizada AlHep tipo 1

fibrilar, difusa: tubulina, vimentina Infecciones

5 La diabetes de tipo 1 tambien puede diagnosticarse usando la presente invencion, por ejemplo, cuando se asocia con anticuerpos dirigidos contra celulas de los islotes pancreaticos, glutamato descarboxilasa o tirosina fosfatasa IA- 2.

Una clase mas de trastornos que puede diagnosticarse con el procedimiento de la presente invencion se refiere a 10 enfermedades infecciosas. Dichas enfermedades incluyen borreliosis o enfermedad de Lyme, donde la enfermedad se asocia con anticuerpos dirigidos contra Borrelia o protefnas de Borrelia tales como la p21, p41, p100, OSPC u OSPA.

El virus del herpes simple es otra enfermedad infecciosa que puede diagnosticarse usando la presente invencion, 15 por ejemplo cuando se asocia con anticuerpos dirigidos contra el virus del herpes simple de tipo 1 (herpes labial) y tipo 2 (herpes genital). Pueden usarse celulas infectadas por herpes como sustrato celular, junto con sustrato sintetico que contiene antfgenos de herpes especfficos, tales como gG1 y gC1 para el tipo 1 y gG2 para el tipo 2.

El uso de soportes pequenos revestidos de antfgeno, tales como las micropartfculas codificadas por caracterfsticas 20 opticas o ffsicas de las mismas, o por adhesion con moleculas de informacion, junto con sustratos celulares y/o tisulares en un entorno de ensayo, proporciona sorprendentemente una base adecuada para la evaluacion simultanea de multiples actividades de anticuerpo perfiladas anteriormente en la estrategia multi-fase.

El procedimiento reportero optimo para dicha tecnica de deteccion es la fluorescencia multicolor, que puede 25 emplearse facilmente para codificar partfculas y como una etiqueta para evaluar de manera simultanea multiples interacciones antfgeno-anticuerpo especfficas. Un microscopio totalmente automatizado con un software de reconocimiento de patrones, lee las senales de fluorescencia que codifican partfculas revestidas con diversos antfgenos especfficos, ademas de las senales de fluorescencia producidas por la deteccion de anticuerpos unidos a dianas sobre sustratos de partfculas, celulares y/o tisulares.

El software de reconocimiento de patrones permite la determinacion simultanea de sustratos celulares y/o tisulares y sinteticos Un conjunto de reglas definido para cada patron (para patrones de sustratos tanto celulares/tisulares como sinteticos) permite al software identificar a que sustrato especffico corresponde cada serial fluorescente. Esto sucede gracias a las caracterfsticas opticas, fluorescentes y/o ffsicas exclusivas de los diferentes sustratos. Estas 5 caracterfsticas actuan como un codigo para que el software reconozca a que sustrato se han unido los anticuerpos (y por lo tanto a que antfgeno especffico). La determinacion automatica de patrones especfficos celulares (tales como perinuclear y citoplasmatico para granulocitos; nuclear, citoplasmatico, citoplasmatico moteado, cromatfnico de celulas mitoticas para celulas HEp-2) proporciona informacion adicional que conduce al diagnostico de la enfermedad, tal como se ha explicado anteriormente para PAM y GW.

10

El uso del reconocimiento sofisticado de patrones anula la necesidad de que el personal tenga que estar altamente formado y de que tenga que entender las varias diferentes configuraciones de sistemas y los patrones de fluorescencia que son especfficos de anticuerpos particulares. Dichos requisitos normalmente requieren costes elevados en la formacion del personal. En terminos de estandares de calidad y especificaciones de validacion, a 15 menudo es necesario realizar repeticiones experimentales, lo que requiere la supervision de cientfficos o de cualquier otro personal altamente cualificado. Se necesita una reproducibilidad coherente y una alta calidad particularmente en la IFI basada en celulas. La interpretacion de patrones por inmunofluorescencia se ve influenciada por el conocimiento y la cualificacion individual del investigador. Por lo tanto, es comun que exista una alta variabilidad intra- e interlaboratorios y representa un problema de diagnostico importante, especialmente en 20 laboratorios no especializados.

La lectura automatizada de patrones de inmunofluorescencia para la deteccion de anticuerpos contra dianas celulares y antigenicas purificadas por sistemas automatizados de interpretacion y reconocimiento inteligente de patrones, proporciona una base fiable para diagnosticos serologicos rentables, particularmente para los laboratorios 25 con un gran numero de muestras. La oportunidad de aplicar analisis y gestion de datos electronicos modernos puede aliviar significativamente la pesada carga de trabajo en dichos laboratorios.

Descripcion de las figuras

30 La invencion se describe adicionalmente mediante las figuras. Estas no pretenden limitar el alcance de la invencion.

Figura 1: analisis inmunofluorescente simultaneo de ACAN y anticuerpos para MPO

Figura 2: analisis inmunofluorescente simultaneo de ACAN y anticuerpos para PR3 35

Fig. 1: en la figura 1 se muestran los resultados del analisis inmunofluorescente simultaneo de ACAN y anticuerpos para MPO. Una muestra de suero, que ya se habfa ensayado como positiva para pACAN (MPO), y otra muestra de suero, que ya se habfa ensayado como positiva para cACAN (PR3), se ensayaron en portaobjetos con granulocitos humanos junto con micropartfculas revestidas con MPO. La ubicacion de los granulocitos en el portaobjetos se 40 detecto mediante tincion con DAPI mientras que las micropartfculas revestidas con antfgeno se evaluaron mediante fluorescencia con rodamina o FITC. El suero positivo para pACAN demostro una senal positiva tanto con los granulocitos inmovilizados como con las micropartfculas revestidas con MPO. La union de los anticuerpos a la MPO ubicada en los granulocitos e inmovilizada sobre las partfculas (mostradas con flechas) se mostro mediante tincion especffica con el conjugado Cy5. Por el contrario, el suero positivo para cACAN genero una reaccion positiva 45 solamente con los granulocitos.

Fig. 2: en la figura 2 se muestran los resultados del analisis inmunofluorescente simultaneo de ACAN y anticuerpos para PR3. Una muestra de suero, que ya se habfa ensayado como positiva para pACAN (MPO), y una muestra de suero que ya se habfa ensayado como positiva para cACAN (PR3), se ensayaron en portaobjetos con granulocitos 50 humanos junto con micropartfculas revestidas con PR3. La ubicacion de los granulocitos se detecto mediante tincion con DAPI mientras que las micropartfculas revestidas con antfgeno se evaluaron mediante fluorescencia con rodamina o FITC. El suero positivo para cACAN demostro una senal positiva tanto con los granulocitos inmovilizados como con las micropartfculas revestidas con PR3. La union de los anticuerpos a PR3 ubicada en los granulocitos e inmovilizada sobre las partfculas (mostradas con flechas) se mostro mediante tincion especffica con el conjugado 55 Cy5. Por el contrario, el suero positivo para cACAN genero una reaccion positiva solamente con los granulocitos.

Ejemplos

Para llevar a cabo la presente invencion, como se demuestra en los ejemplos, se utilizan los siguientes

procedimientos que ademas pretenden describir la invencion mediante ejemplos practicos y no representar una descripcion limitante de la invencion.

Pacientes:

5

Se recogieron muestras de suero de 10 pacientes con GW positiva para cACAN en IFI (positivas para PR3) y de 10 pacientes con otra VSAA positiva para pACAN (positiva para MPO) y se almacenaron a -20°C. El diagnostico de GW se baso en las definiciones consenso de Chapel Hill para la GW. Como controles de enfermedad en el estudio se inscribieron diez pacientes que cumplfan los criterios de diagnostico para lupus eritematoso sistemico (LES). Como 10 controles sanos se usaron sueros de 10 donantes de sangre. Todas las muestras se extrajeron en el momento del consentimiento y la inscripcion de los pacientes.

Deteccion de ACAN mediante IFI convencional:

15 Los ACAN se detectaron procesando muestras de pacientes sobre granulocitos humanos fijados con etanol y formalina de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (GA Generic Assays GmbH, Dahlewitz, Alemania). En resumen, los granulocitos fijados se incubaron en una camara con humedad a temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos con 25 pl de suero diluido de forma sucesiva, comenzando con una dilucion de 1:20. Despues del lavado, los inmunocomplejos se detectaron incubando las muestras con anticuerpos de oveja anti-IgG humana 20 conjugados con fluorescefna durante 30 minutos a TA. Posteriormente, las muestras se lavaron, se fijaron y se analizaron manualmente por microscopfa de fluorescencia.

Deteccion de anticuerpos contra MPO y PR3 mediante ELISA:

25 Los autoanticuerpos contra MPO y proteinasa 3 en los sueros de los pacientes se detectaron utilizando ELISA de diferentes generaciones empleando PR3 y MPO humanas purificadas como antfgenos de fase solida, respectivamente, de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes (GA Generic Assays GmbH, Dahlewitz, Alemania; Aesku.Diagnostics GmbH, Wendelsheim, Alemania).

30 Deteccion simultanea de ACAN y anticuerpos para MPO y PR3:

Se aislaron granulocitos humanos mediante un gradiente de densidad. Se recogio la banda enriquecida con granulocitos. Tras la lisis de los eritrocitos, se lavaron los granulocitos con PBS. Los granulocitos separados se mezclaron con perlas revestidas con MPO o PR3 marcadas con rodamina. Esta mezcla se inmovilizo sobre la 35 superficie de portaobjetos para diagnostico de 6 pocillos fabricados de vidrio. Los portaobjetos se fijaron con etanol. Para la IFI, los portaobjetos combinados con granulocitos/perlas se incubaron en una camara con humedad a temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos con 25 pl de suero diluido a 1:20. Tras el lavado, los inmunocomplejos unidos se detectaron incubando las muestras con anticuerpos de cabra anti-IgG humana conjugados con Cy5 (Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 30 minutos a TA. Posteriormente, las muestras se 40 lavaron, se fijaron y se analizaron por el sistema de reconocimiento automatico de patrones de senales de fluorescencia (vease a continuacion).

Reconocimiento automatizado de patrones de senales fluorescentes:

45 Los patrones fluorescentes de las muestras de suero para la deteccion multiple simultanea de anticuerpos unidos a antfgenos celulares, y unidos a antfgenos aplicados sobre micropartfculas, se evaluaron automaticamente usando un microscopio invertido motorizado (Olympus IX81, Olympus Corp., Japon) con una platina de barrido motorizada (IM120, Marzhauser, Alemania), diodos emisores de luz (LED) a 400 nm, 490 nm, 525 nm y 635 nm (precisExcite, CoolLED, RU), y una camara de escala de grises (PS4, Kappa, Alemania). El sistema de interpretacion se 50 controlaba por un programa informatico especialmente disenado, que consistfa en modulos para control de dispositivos y autoenfoque, analisis de imagenes, y algoritmos de reconocimiento de patrones. El novedoso autoenfoque basado en la caracterizacion de objetos por formacion de imagenes de Haralick a traves de la transicion en una escala de grises usaba, como colorante fluorescente para el reconocimiento y el enfoque de los objetos, 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI). Para eliminar artefactos, se realizo un analisis adicional de imagenes cualitativo 55 dividiendo la imagen en sub-objetos del mismo tamano.

La segmentacion de los objetos se realizo usando un algoritmo umbral basado en histograma seguido de trasformacion de Watershed. Los objetos segmentados se caracterizaron por descriptores regionales, topologicos y de textura/superficie. Se implementaron mas de 1.400 criterios de descripcion de objetos.

Los datos de imageries por fluorescencia se evaluaron segun la siguiente jerarqufa: i) senal de tincion positiva, ii) localizacion de la tincion (celular o micropartfcula), y iii) determinacion de los patrones de tincion celular: perinuclear o citoplasmatico.

Las celulas se identificaron por tincion con DAPI y las micropartfculas por fluorescencia con rodamina. Tambien se uso fluorescencia con FITC para identificar el sustrato sintetico. Inmunofluorescencia especffica de Cy5, para la union especffica de anticuerpos, se analizo en el tercer canal de fluorescencia. La clasificacion se consiguio mediante la combinacion de las caracterfsticas de estructura y textura mediante definicion de reglas para cada 10 objeto.

Para evaluar los datos de imagenes se calculo un fndice de reactividad (IR) combinando la intensidad absoluta de la imagen, el contraste y el numero de niveles de escala de grises del total de imagenes. Aunque el IR esta influenciado por el tiempo de exposicion, que depende de la senal de imagenes mas elevada despues de la 15 exclusion de los artefactos, se podfan detectar incluso patrones con senales absolutas debiles. La determinacion de los valores umbral para la diferenciacion de senales positivas se realizo basandose en valores del IR de 200 donantes de sangre normales.

La invencion se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Estos no pretenden limitar el alcance de 20 la invencion.

Ejemplo 1: Deteccion simultanea de ACAN y anticuerpos para MPO

Para la deteccion simultanea de ACAN y anticuerpos para MPO, se inmovilizaron granulocitos humanos en 25 suspension con perlas revestidas con MPO en los pocillos de los portaobjetos para diagnostico de 6 pocillos fabricados de vidrio. Los nucleos de los granulocitos se detectaron mediante tincion con DAPI, mientras que las perlas revestidas se localizaron marcando con rodamina. Para la IFI, los portaobjetos combinados con granulocitos/perlas se incubaron con suero diluido a 1:20. Despues del lavado, los inmunocomplejos formados se detectaron incubando las muestras con anticuerpos de cabra anti-IgG humana conjugados con Cy5.

30

Se analizaron los portaobjetos con granulocitos y perlas revestidas con MPO (figura 1). En el panel superior, se muestran imagenes de tincion de un suero pACAN tomadas con los tres canales diferentes: para DAPI (a la izquierda), FITC/rodamina (en el centro) y Cy5 (a la derecha). En el panel inferior, el portaobjetos combinado se tino con un suero cACAN. Solamente la imagen tenida con el suero pACAN mostraba tambien una tincion positiva para 35 las partfculas revestidas con MPO en el canal Cy5 especffico. Por lo tanto, la tincion perinuclear de los granulocitos, que es tfpica de anticuerpos para MPO, se confirmo mediante la tincion de las perlas revestidas con MPO.

Ejemplo 2: Deteccion simultanea de ACAN y anticuerpos para PR3

40 Para la deteccion simultanea de ACAN y anticuerpos para PR3, se inmovilizaron granulocitos humanos en suspension con perlas revestidas con PR3 en los pocillos de portaobjetos para diagnostico de 6 pocillos fabricados de vidrio. Los nucleos de los granulocitos se detectaron por tincion con DAPI, mientras que las perlas revestidas se localizaron marcando con rodamina. Para la IFI, los portaobjetos combinados con granulocitos/perlas se incubaron con suero diluido a 1:20. Despues del lavado, los inmunocomplejos formados se detectaron incubando las muestras 45 con anticuerpos de cabra anti-IgG humana conjugados con Cy5.

Se analizaron los portaobjetos con granulocitos y perlas revestidas con PR3 (figura 2). En el panel superior, se muestran imagenes de tincion de un suero pACAN tomadas con los tres canales diferentes: para DAPI (a la izquierda), FITC/rodamina (en el centro) y Cy5 (a la derecha). En el panel inferior, el portaobjetos combinado se tino 50 con un suero cACAN. La figura 2 muestra las imagenes de tincion usando micropartfculas revestidas con PR3, en vez de las partfculas revestidas con MPO como en el ejemplo 1. A diferencia del ejemplo 1, el suero cACAN demuestra una reaccion positiva con las perlas revestidas con PR3 en el panel inferior. Por lo tanto, la tincion citoplasmatica de los granulocitos tfpica de los anticuerpos para PR3 se confirmo mediante la tincion de las perlas revestidas con PR3.

55

Ejemplo 3: Evaluacion de sueros especfficos de enfermedad y de control

Con el fin de ensayar la especificidad de la deteccion de anticuerpos ACAN, anti-PR3 y anti-MPO mediante IFI en portaobjetos tanto con granulocitos como con micropartfculas revestidas con antfgeno, se evaluo el suero de 10

pacientes con GW anti-PR3 positivos, el suero de 10 pacientes con VSAA anti-MPO positivos, el suero de 10 pacientes con LES, y el suero de 10 donantes de sangre. El diagnostico de GW se basaba en las definiciones consenso de Chapel Hill para la GW. En el estudio, se inscribieron diez pacientes que cumplfan los criterios de diagnostico de LES como controles de enfermedad. Los sueros de 10 donantes de sangre se utilizaron como 5 controles sanos.

La reactividad de ACAN se determino de acuerdo con el patron de inmunofluorescencia de tincion positiva de granulocitos. La reactividad a las micropartfculas revestidas con MPO o con PR3 se evaluo simultaneamente mediante deteccion de tincion positiva de micropartfculas.

10

Casi todos los sueros GW que fueron positivos a cACAN en IFI, revelaron una reactividad positiva con las perlas revestidas con PR3 (90%) y un patron cACAN con granulocitos fijados (100%) del portaobjetos combinado. Por el contrario, todos los sueros VSAA que fueron positivos para pACAN en IFI, demostraron una reactividad positiva con las perlas revestidas con MPO y un patron pACAN con granulocitos fijados. Todos los pacientes de control fueron 15 negativos con los granulocitos fijados o las micropartfculas revestidas de antfgeno. Los resultados se muestran en la tabla 6.

20

Estudios adicionales que usan el procedimiento de la presente invencion para diagnosticar enfermedades asociadas con AAN revelan resultados similarmente eficaces.

Tabla 6.

Deteccion simultanea de ACAN en granulocitos y anticuerpos para MPO y PR3 en perlas revestidas con antfgeno

: granulocitos macropartfculas

cACAN: pACAN anti-PR3 anti-MPO

Pacientes de GW anti-PR3 pos.: 10/10 0/10 9/10 0/10

Pacientes de VSAA anti-MPO pos.: 0/10 9/10 0/10 10/10

Pacientes de LES: 0/10 0/10 0/10 0/10

Donantes de sangre: 0/10 0/10 0/10 0/10

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para el diagnostico de enfermedades que comprende la deteccion simultanea de anticuerpos unidos a uno o mas sustratos celulares y uno o mas sustratos sinteticos, caracterizado por:

5 a) proporcionar una mezcla de sustratos celulares y sinteticos, donde el sustrato sintetico es una micropartfcula o perla revestida con antfgeno al que es capaz de unirse un anticuerpo a detectar, y donde el sustrato celular es una celula de mamffero, multiples celulas de mamffero y/o tejido organico,

b) incubacion de dicha mezcla de sustratos con una muestra obtenida de un paciente que contiene el anticuerpo a detectar,

10 c) deteccion y/o identificacion de sustratos celulares y sinteticos y anticuerpos unidos a dichos sustratos usando microscopfa de fluorescencia, y

d) evaluacion de datos de imagenes de inmunofluorescencia.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque el sustrato celular es celulas 15 HEp-2 y/o granulocitos humanos.
3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el sustrato sintetico esta revestido con antfgeno nativo purificado y/o antfgeno recombinante.

20 4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado

porque al revestimiento antigenico del sustrato sintetico se le unen anticuerpos asociados con la presencia de la enfermedad.
5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado 25 porque las caracterfsticas opticas, fluorescentes y/o ffsicas de los sustratos se usan para identificar dichos

sustratos.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion anterior, caracterizado porque la caracterfstica fluorescente de concentracion de fluoroforo, por ejemplo concentracion de rodamina, y/o la caracterfstica ffsica de

30 tamano se usa para identificar el sustrato sintetico, con lo que el tamano de micropartfcula esta preferentemente entre 1-100 pm.
7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se usa microscopfa de fluorescencia multicolor para identificar dichos sustratos y/o autoanticuerpos unidos,

35 con lo que sustratos y/o anticuerpos unidos muestras colores fluorescentes diferentes.
8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la enfermedad es un trastorno autoinmunitario o infeccioso.

40 9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado

porque los anticuerpos a detectar son anticuerpos antinucleares (AAN) o anticuerpos citoplasmaticos antineutrofilos (ACAN).
10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado 45 porque

- los anticuerpos muestran tincion citoplasmatica moteada (cACAN) de granulocitos humanos y se unen a proteinasa 3 (PR3), con lo que la protefna proteinasa 3 o sus antfgenos estan provistos sobre un sustrato sintetico, proporcionando por lo tanto un diagnostico de granulomatosis de Wegener (GW), o

- los anticuerpos muestran tincion perinuclear (pACAN) de granulocitos humanos y se unen a mieloperoxidasa 50 (MPO), con lo que la protefna mieloperoxidasa o sus antfgenos estan provistos sobre un sustrato sintetico,

proporcionando por lo tanto un diagnostico de vasculitis asociada a ACAN (VSAA).
11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la evaluacion de datos de imagenes de inmunofluorescencia se lleva a cabo usando un sistema de

55 interpretacion de reconocimiento de patrones automatizado, donde dicho sistema de interpretacion esta controlado mediante software disenado especialmente, que consiste en modulos para control de dispositivos y autoenfoque, adquisicion de imagenes, analisis de imagenes, y/o algoritmos de reconocimiento de patrones.
12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado

porque el sistema de interpretacion se usa para evaluar los datos de imageries de inmunofluorescencia de acuerdo con la siguiente jerarqufa:

i. senal de tincion positiva,

ii. localizacion de la tincion mediante clasificacion de patrones de tincion en sustrato celular o sustrato sintetico, y

5 iii. determinacion de patrones celulares seleccionados entre el grupo que consiste en patrones perinucleares y/o citoplasmaticos para granulocitos; patrones nucleares citoplasmaticos y/o cromatfnicos de celulas mitoticas para celulas HEp-2.
13. Sistema para la deteccion simultanea de anticuerpos unidos a uno o mas sustratos celulares y uno o 10 mas sustratos sinteticos de acuerdo con el procedimiento de una cualquiera de las realizaciones anteriores, que

comprende

a) un microscopio fluorescente con una camara, una platina de exploracion motorizada y diodos emisores de luz multicanal (LED),

b) un dispositivo informatico con software que consiste en modulos para control de dispositivos y autoenfoque, 15 adquisicion de imagenes automatizada, analisis de imagenes automatizado, y algoritmos de reconocimiento de

patrones automatizados con lo que se analizan canales de tres colores, y

c) una mezcla de sustratos celulares y sinteticos con una muestra que contiene el anticuerpo a detectar y permite la deteccion y/o identificacion de sustratos celulares y sinteticos y anticuerpos unidos a dichos sustratos, donde el sustrato sintetico es una micropartfcula o perla revestida con antfgeno al que es capaz de unirse un anticuerpo a

20 detectar, y donde el sustrato celular es una celula de mamffero, multiples celulas de mamffero y/o tejido organico.
14. Sistema para la deteccion simultanea de anticuerpos unidos a uno o mas sustratos celulares y uno o mas sustratos sinteticos de acuerdo con la reivindicacion anterior, donde dicho sistema comprende software de reconocimiento de patrones que determina simultanea sustratos tanto celulares como sinteticos.

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15. Kit para la deteccion simultanea de anticuerpos unidos a uno o mas sustratos celulares y uno o mas sustratos sinteticos de acuerdo con el procedimiento de las reivindicaciones 1-12, que comprende

a) Portaobjetos con sustrato celular fijado mezclado con el sustrato sintetico revestido de anticuerpo, y los sustratos sinteticos se distinguen entre si de acuerdo con sus caracterfsticas opticas, fluorescentes y/o ffsicas, donde el

30 sustrato sintetico es una micropartfcula o perla revestida con antfgeno al que es capaz de unirse un anticuerpo a detectar, y donde el sustrato celular es una celula de mamffero, multiples celulas de mamffero y/o tejido organico, y

b) conjugado con un anticuerpo especffico de inmunoglobulina conjugado con una etiqueta fluorescente, preferentemente FITC, Cy5 y/o APC.

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