BR102020013266A2 - Biomoléculas sintéticas, método e kit de diagnóstico da esquistossomose mansoni, e uso - Google Patents

Abstract

biomoléculas sintéticas, método e kit de diagnóstico da esquistossomose mansoni, e uso. a presente tecnologia refere-se a área de biotecnologia. trata-se de um método e kit para o diagnóstico da esquistossomose mansoni, que utilizam como antígenos 2 peptídeos sob a forma sintética ou recombinante, isolados ou associados que são reativos com soros de humanos infectados com schistosoma mansoni. além disso, estas biomoléculas sintéticas podem ter potencial de serem usadas para produção de anticorpos e vacinas.

Description

BIOMOLÉCULAS SINTÉTICAS, MÉTODO E KIT DE DIAGNÓSTICO DA ESQUISTOSSOMOSE MANSONI, E USO CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[01] A presente tecnologia refere-se a área de Biotecnologia. Trata-se de um método e kit para o diagnóstico da esquistossomose mansoni, que utilizam como antígenos 2 peptídeos sob a forma sintética ou recombinante, isolados ou associados que são reativos com soros de humanos infectados com Schistosoma mansoni. Além disso, estas biomoléculas sintéticas podem ter potencial de serem usadas para produção de anticorpos e vacinas.

ESTADO DA TÉCNICA

[02] A esquistossomose consiste em uma doença infecto parasitária causada por trematódeos do gênero Schistosoma, que pode evoluir desde formas assintomáticas até formas extremamente graves. As três principais espécies que infectam os seres humanos são: Schistosoma haematobium (S. haematobium), Schistosoma japonicum (S. japonicum) e Schistosoma mansoni (S. mansoni). É uma doença tropical negligenciada que acomete populações mais carentes, sobretudo em regiões onde o acesso à água potável é escasso e as condições sanitárias são precárias.

[03] A doença é prevalente em 78 países, abrangendo principalmente a Ásia, África e América Latina. Estima-se que, mais de 250 milhões de pessoas estejam infectadas em todo o mundo e que no ano de 2016 pelo menos 206,4 milhões de pessoas necessitaram de tratamento preventivo, sendo mais de 89 milhões de pessoas tratadas.

[04] No Brasil, a doença é causada apenas pela espécie S. mansoni. As áreas endêmicas e focais abrangem 19 Unidades Federadas e segundo o Inquérito Nacional de Prevalência da Esquistossomose mansoni e Geo-helmintoses, realizado por Katz (2018), os maiores índices de positividade foram encontrados nas macrorregiões Nordeste e Sudeste.

[05] Com o intuito de evitar o contato com o parasito e realizar o controle da esquistossomose, estratégias preventivas são aplicadas, compreendendo o saneamento básico adequado para impedir que ovos do parasito presentes nas fezes cheguem a habitats do hospedeiro intermediário; a redução do número de hospedeiro intermediário, seja por moluscicidas ou por controle biológico e a educação básica ou informação educacional. Além disso, a transmissão da doença pode ser controlada pela administração de medicamentos em massa.

[06] O diagnóstico da esquistossomose pode ser realizado por meio de métodos parasitológicos, moleculares e imunológicos. As principais técnicas parasitológicas empregadas consistem, na sedimentação espontânea (HPJ) que foi redescoberta por Hoffmann e colaboradores (1934); a técnica original de Kato-Katz descrita por Kato e Miura (1954) e modificada por Katz e colaboradores (1972) e a técnica de centrifugação com formol acetato de etila (TF-Test®) (Three Fecal Test).

[07] As técnicas de diagnóstico recomendadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) são o Kato-Katz para infecções intestinais e a filtração de urina para as espécies urogenitais, ambos os métodos consistindo na identificação dos ovos do parasito em amostras de fezes ou urina, por meio do exame microscópico. Os métodos parasitológicos são altamente específicos, apresentam um baixo custo e uma execução relativamente simples.

[08] Contudo, dependendo do cenário em que a técnica é aplicada, verifica-se uma redução na sensibilidade, em decorrência das oscilações diárias na oviposição por vermes fêmeas, distribuição não aleatória dos ovos na amostra de fezes e declínio da quantidade de ovos devido a fatores como método, duração do procedimento experimental, transporte e condições de armazenamento.

[09] A primeira aplicação do método molecular no diagnóstico da esquistossomose humana em uma área endêmica, foi um ensaio de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês: Polymerase chain reaction) para a detecção de DNA de S. mansoni em amostras de fezes. O DNA-alvo consistiu de uma sequência repetitiva de 121 pares de bases altamente representada nos genomas de S. mansoni de ambos os sexos. Embora os métodos moleculares alcancem alta sensibilidade e especificidade, apresentam elevado custo e requerem equipamentos caros para sua realização, além de exigirem profissionais capacitados para a realização da técnica. Tais fatores podem dificultar o acesso a este tipo de diagnóstico. Outros métodos moleculares alternativos ao método convencional já são descritos como, a PCR em tempo real e PCR-ELISA.

[010] Já os testes imunológicos são especialmente relevantes para a vigilância da doença e triagem preliminar em áreas não endêmicas, onde a baixa sensibilidade dos testes parasitológicos pode resultar em diagnóstico falso-negativo de indivíduos infectados.

[011] Testes para detecção de antígenos e anticorpos, como o teste de precipitina circunoval (COPT, do inglês: Circumoval precipitin test), teste de hemaglutinação indireta (IHT, do inglês: Indirect hemagglutination test), ensaio de imunofluorescência indireta (IFA, do inglês: Indirect immunofluorescence assay) e o ELISA (do inglês: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) são exemplos de métodos imunológicos empregados no diagnóstico de S. mansoni.

[012] Dentre os métodos com potencial magnitude para complementar o diagnóstico da infecção por S. mansoni, encontra-se os imunodiagnósticos, destacando-se o ELISA, que apresenta vantagens como, elevada sensibilidade, possibilidade de automação e a capacidade de fornecer resultados quantitativos, abrindo perspectivas para utilização em estudos de campo. O ELISA é o teste sorológico mais empregado para o diagnóstico da esquistossomose, permitindo a detecção de classes distintas de anticorpos além da utilização de uma vasta gama de antígenos.

[013] A busca por um método de monitoramento e controle da esquistossomose com elevada confiabilidade, tem conduzido à investigação de antígenos promissores para a utilização no imunodiagnóstico. Um dos maiores entraves no desenvolvimento de testes de diagnóstico com alta sensibilidade e especificidade é a triagem de antígenos com potencial, visto que alguns fatores podem influenciar na seleção de um antígeno candidato ao diagnóstico, tais como a simplicidade de obtenção e produtividade, alta estabilidade em condições simples de estocagem, capacidade antigênica e possibilidade de uso em métodos sorológicos acessíveis e simples.

[014] Atualmente, os antígenos utilizados em ensaios sorológicos podem ser obtidos de distintos estágios do ciclo de vida do parasito. Comumente, esses antígenos empregados como um mix de proteínas expressas em diferentes estágios do parasito ou como proteínas específicas, purificadas. Preparação de antígeno solúvel de verme adulto (SWAP, do inglês: soluble adult worm antigen preparation), antígenos de cercárias, proteínas de esquistossômulos e antígeno solúvel de ovo (SEA, do inglês: soluble egg antigen) são fontes de material antigênico empregadas.

[015] Estes antígenos apresentam sensibilidade variando de moderada a alta, em ensaios de ELISA, no entanto, podem exibir baixa especificidade, em consequência de possíveis reações cruzadas com antígenos de outros helmintos.

[016] Avanços nas tecnologias de sequenciamento e a montagem das sequências genômicas, vêm possibilitando uma maior compreensão sobre a biologia dos parasitos S. mansoni, S. japonicum e S. haematobium. Isso auxilia na identificação de novos alvos e permite maior velocidade no desenvolvimento de novas drogas, vacinas e testes de diagnóstico.

[017] O acúmulo de informações genômicas em bancos de dados de domínio público possibilitou o surgimento, no século 21, de uma estratégia multidisciplinar para identificação de alvos vacinais e candidatos ao diagnóstico, denominada imunobioinformática. Nas últimas décadas, houve uma evolução na área da imunobioinformática e os métodos para predição de epítopos (menor porção do antígeno capaz de ser reconhecida pelo sistema imune) têm sido empregados com sucesso em distintas áreas. Nesse sentido, antígenos recombinantes e sintéticos, triados por ferramentas de imunobioinformática, podem representar alternativas para a utilização de antígenos brutos no diagnóstico da esquistossomose. Esses antígenos têm sido muito empregados com a finalidade de aumentar a especificidade do teste e, consequentemente, minimizar a ocorrência de reações cruzadas, uma vez que o parasito não é utilizado.

[018] Mediante à necessidade de investigação de novos candidatos que possam propiciar um diagnóstico com elevada sensibilidade e especificidade, na presente invenção, foram selecionados dois epítopos (Tabela 1), triados a partir de duas proteínas comprovadamente promissoras ao diagnóstico da esquistossomose mansoni, CCA e Sm200.

[019] Estudos vêm demonstrando constantemente que antígenos circulantes, excretados por vermes adultos na circulação do hospedeiro definitivo, constituem potenciais candidatos ao diagnóstico. Dois antígenos proteoglicanos específicos derivados do intestino do Schistosoma, antígeno anódico circulante (CAA) e antígeno catódico circulante (CCA), têm sido o foco das pesquisas sobre antígenos circulantes. Os níveis desse antígeno estão relacionados à presença e a intensidade de infecção (Fillié, et al. Evaluation of an ELISA for combined measurement of CAA and CCA in schistosomiasis mansoni. Acta Trop., v. 57, n. 4, p. 279-287, 1994; Grenfell, et al. New approaches with different types of circulating cathodic antigen for the diagnosis of patients with low Schistosoma mansoni load. PLoS Negl Trop Dis., v. 7, n. 2, 2013).

[020] A Sm200 é uma glicoproteína de massa molecular de 200kDa (Sm200), ancorada à membrana de vermes adultos de S. mansoni por meio de uma ligação de glicosilfosfatidilinositol (GPI). A glicoproteína é conhecida por estar exposta na superfície do verme adulto após o tratamento com praziquantel e foi associada à sua eficácia, visto que em camundongos com depleção de células B, os anticorpos contra a glicoproteína podem reconstituir a eficácia do tratamento com o medicamento, para níveis normais. A parte C-terminal da glicoproteína, estudada por Carvalho e colaboradores (2014) demonstrou potencial no diagnóstico da esquistossomose, uma vez que ensaios de ELISA revelaram elevada especificidade e não mostraram reatividade cruzada com soros de outras espécies relacionadas. Nesse âmbito essa proteína também foi selecionada para a triagem de um epítopo.

[021] Por meio da triagem por bioinformática, a partir das proteínas CCA e Sm200, os dois epítopos selecionados na presente invenção, foram candidatos promissores a comporem futuros kits de diagnóstico, vacinas e produção de anticorpos monoclonais. Pelo fato destes epítopos 1 e 2, descritos na presente invenção, terem sido triados a partir de proteínas já comprovadamente promissoras ao diagnóstico da esquistossomose mansoni, a probabilidade de demonstrarem-se potenciais candidatos ao diagnóstico de indivíduos infectados com S. mansoni, poderia ser aumentada.

[022] Nesse contexto, salienta-se que as ferramentas de bioinformática vêm sendo utilizadas em diversos trabalhos para a investigação de novos antígenos que possam ser empregados no diagnóstico da esquistossomose.

[023] A invenção CN105884878, intitulada “Schistosoma mansoni diagnostic antigen screening and application” depositada em 24 de agosto de 2019, refere-se a um kit de diagnóstico imunológico de S. mansoni que utiliza combinações de antígenos triados por ferramentas de bioinformática baseado em sequências de expressão características de S. mansoni (EST). A tecnologia da presente invenção difere da invenção CN105884878 ao utilizar outra abordagem de bioinformática para buscar por antígenos de S. mansoni assim tendo como resultado sequências peptídicas diferentes do pedido CN105884878.

[024] O documento KR20120088028, intitulado “ A synthetic antigen against Schistosoma japonicum useful in diagnosing schistosoma and the diagnostic kit for detecting schistosoma comprising the same” depositada em 08 de agosto de 2012, refere-se ao uso de três antígenos, 23K Glutationa S-transferase (23K GST), 23K Glutathione S- (23K GST M1) e 23K Triofosfatase Isomerase (23K TPI) de S. japonicum para ser utilizado no diagnostico imunológico de S. mansoni e outras esquistossomoses. O presente estudo se difere por utilizar antígenos

[025] advindos de S. mansoni em que as sequências presentes são diferentes da KR20120088028.

[026] O documento MX350668, intitulado “Synthetic gene for expressing sm-14 in pichia pastoris, methods for producing and purifying sm-14 and the use thereof as a vaccine and diagnostic medium” depositada em 12 de setembro de 2017, refere-se à produção da proteína recombinante sm14 de S. mansoni uso em formulação vacinal e para diagnóstico, sendo que esta proteína foi expressa utilizando o sistema de expressão Pichia pastoris. A tecnologia se diferencia do presente pedido pelo alvo de busca antigênica e por não utilizar nenhuma das 2 sequências peptídicas contidas no presente pedido.

[027] O documento WO2015172706, intitulado “Screen of Schistosoma mansoni diagnostic antigen and use” depositada em 19 de novembro de 2015, no qual descreve o uso de 17 moléculas (SmSP-001, SmSP-004, SmSP-013, SmSP-015, SmSP-016, SmSS P-017, SmSP-019, SmSP-051, SmSP-080, SmSP-129, SmSP-144, SmSP-160, SmSP-162, SmSP-196, SmSP-203, SmSP-204m, SmSP-204m) de S. mansoni como possíveis alvos para o diagnóstico da doença. O presente pedido se diferencia do WO2015172706 pelo alvo escolhido ser de proteínas diferentes (CCA e Sm200) além das sequências no presente estudo não estar presente no documento WO2015172706.

[028] Nos documentos de patente BR1020160052025, BR1020170194400, BR1020180078674 os autores reivindicam o uso de uma proteína recombinante entre 20 e 30 kDa com capacidade de diagnosticar esquistossomose mansoni. Já os documentos de patente BR1020180128035, BR1020180167235 e BR1020180731017 os autores reivindicam o uso de uma única proteína sintética pequena (peptídeo) para ser utilizada como diagnóstico de esquistossomose mansoni. A presente invenção difere das tecnologias anteriores por utilizarem antígenos com altos valores de antigenicidade de forma separada, podendo ser usados em proporções variadas para fins biotecnológicos.

[029] O documento BR1020190256010, intitulado “Peptídeos sintéticos, método e kit de diagnóstico da esquistossomose mansoni, e uso” depositado em 04 de dezembro de 2019, refere-se ao uso de dois peptídeos triados por bioinformática a partir de proteínas hipotéticas de S. mansoni para o diagnóstico imunológico da esquistossomose mansoni. O presente pedido se diferencia do BR1020190256010 pelos alvos escolhidos serem provenientes de proteínas conhecidas e as sequências no presente estudo serem diferentes do documento BR102019025601.

[030] A presente tecnologia refere-se a um método e kit para o diagnóstico da esquistossomose mansoni, que utilizam como antígenos os 2 peptídeos (P3 e P4) sob a forma sintética ou recombinante, isolados ou associados.

[031] No estado da técnica não foi encontrada nenhuma tecnologia para o diagnóstico da esquistossomose mansoni que compreenda o uso dos dois peptídeos, selecionados por ferramentas de bioinformática a partir de proteínas já comprovadamente promissoras, como descrito na presente invenção. Por meio dos ensaios de ELISA, foi verificado que os dois peptídeos separados ou combinados são capazes de serem reconhecidos por anticorpos presentes no soro de indivíduos com esquistossomose mansoni e de discriminar entre amostra positiva e negativa. Logo, podem representar potenciais candidatos ao diagnóstico da doença.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[032] Figura 1: ELISA in-house da padronização da quantidade do peptídeo 3 - P3 (Peptídeo proveniente da proteína CCA). O ensaio de ELISA foi realizado utilizando amostras de dois pacientes positivos para a presença de ovos e dois negativos, na microplaca Greiner. A placa foi sensibilizada com 17.5, 35, 70 e 140ng/poço do P3 a 4°C/16-18 horas, bloqueada com albumina 5% a 37°C/1 hora e incubada com soros diluídos 1:100 à 37°C/2 horas e anticorpo anti-IgG humano diluído 1:5.000 a 37°C/1 hora. A revelação foi feita com TMB por 30 minutos e parada com ácido sulfúrico 0,2M. A leitura foi realizada a 450nm. Legenda: SN 1 e 2 - soros negativos; SP 1 e 2 - soros positivos. As letras diferentes denotam diferença significativa entre os grupos, ao nível de 5% de significância.

[033] Figura 2: ELISA in house da padronização da quantidade do peptídeo 4 - P4 (Peptídeo proveniente da proteína Sm200). O ensaio de ELISA foi realizado utilizando amostras de dois pacientes positivos para a presença de ovos e dois negativos, na microplaca Greiner. A placa foi sensibilizada com 17.5, 35, 70 e 140ng/poço do P4 a 4°C/16-18 horas, bloqueada com albumina 5% a 37°C/1 hora e incubada com soros diluídos 1:100 à 37°C/2 horas e anticorpo anti-IgG humano diluído 1:5.000 a 37°C/1 hora. A revelação foi feita com TMB por 30 minutos e parada com ácido sulfúrico 0,2M. A leitura foi realizada a 450nm. Legenda: SN 1 e 2 - soros negativos; SP 1 e 2 - soros positivos. As letras diferentes denotam diferença significativa entre os grupos, ao nível de 5% de significância.

[034] Figura 3: ELISA in house da combinação dos peptídeos P3 e P4. O ensaio de ELISA foi realizado utilizando amostra de um paciente positivo para a presença de ovos e um soro negativo, na microplaca Greiner. A placa foi sensibilizada com 16 combinações dos peptídeos variando suas quantidades entre 17.5, 35, 70 e 140ng/poço (1.P317,5+P417,5; 2.P31 7,5+P435;3.P31 7,5+P470;4.P31 7,5+P41 40;5.P335+P41 7,5;6.P335+P435; 7.P335+P470;8.P335+P4140;9.P370+P417,5;10.P370+P435;11.P370+P470;12. P370+P4140; 13.P3140+P417,5;14.P3140+P435; 15.P3140+P470; 16.P3140+P4140 ) a 4°C/16-18 horas. Posteriormente, a placa foi bloqueada com albumina 5% a 37°C/1 hora e incubada com o soro positivo e negativo diluído 1:100 à 37°C/2 horas e anticorpo anti-IgG humano diluído 1:5.000 a 37°C/1 hora. A revelação foi feita com TMB por 30 minutos e parada com ácido sulfúrico 0,2M. A leitura foi realizada a 450nm. Legenda: SN P3 - 140ng de P3 frente ao soro negativo; SN P4 - 140ng de P4 frente ao soro negativo; SN P3 + P4 - Combinação de 140ng de P3 e 140 ng de P4 frente ao soro negativo. Os * denotam diferença significativa com todos os soros positivos, ao nível de 5% de significância.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[035] A presente tecnologia refere-se a 2 (dois) peptídeos reativos com soros de humanos infectados com S. mansoni, além de um método e kit para o diagnóstico da esquistossomose mansoni, que utilizam como antígenos os 2 peptídeos sob a forma sintética ou recombinante, isolados ou associados.

[036] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método e kit para o diagnóstico da esquistossomose mansoni que utilizam como antígenos, 2 peptídeos sob a forma sintética ou recombinante, isolados ou associados que são reativos com soros de humanos infectados com S. mansoni.

[037] O método proposto para o diagnóstico da esquistossomose mansoni compreende as seguintes etapas:

[038] a) exposição de uma amostra contendo anticorpos específicos para pelo menos um dos peptídeos descritos na presente tecnologia, estando estes peptídeos ligados a um suporte sólido ou a um carreador;

[039] b) adição de um anticorpo secundário ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a) supracitada;

[040] c) detecção dos anticorpos específicos para esquistossomose mansoni na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).

[041] Na etapa “a”, as amostras utilizadas são selecionadas do grupo compreendendo sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal.

[042] Na etapa “b”, o anticorpo secundário pode ser as imunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgE ou respectivas subclasses; a proteína pode ser a Proteína A e/ou a Proteína G; e a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou à proteína é selecionada do grupo abrangendo peroxidase, fosfatase alcalina, betagalactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Por outro lado, o marcador é selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

[043] Por fim, na etapa “c”, o reagente para detectar a enzima ou o marcador é selecionado do grupo abrangendo qualquer substrato cromógeno que seja reconhecido por alguma das enzimas ou algum dos marcadores mencionados acima.

[044] O kit para o diagnóstico da esquistossomose mansoni compreende as seguintes etapas:

[045] a) Suporte sólido tratado como grupamentos químicos que podem refletir em baixa ou alta adsorção de antígenos de interesse ou carreador contendo pelo menos um dos 2 (dois) peptídeos sintéticos;

[046] b) Anticorpo secundário monoclonal ou policlonal ou uma proteína, conjugados a uma enzima peroxidase ou fosfatase alcalina ou a um outro marcador;

[047] c) O Reagente para detectar a enzima ou o marcador podendo ser colorimetrico como TMB, luminol ou outro revelador.

[048] O suporte sólido mencionado no item “a” pode ser escolhido do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno. De preferência, deve consistir em placas de microtitulação de 96 poços, tubos, esferas ou papéis de nitrocelulose e/ou nylon.

[049] O anticorpo secundário mencionado no item “b” pode compreender IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses e a proteína pode ser a proteína A e/ou proteína G.

[050] Para os itens “b” e “c”, a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou proteína pode ser selecionada do grupo incluindo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Em relação ao marcador, pode ser selecionado do grupo incluindo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e compostos quimioluminescentes.

[051] Por fim, no item “c”, o reagente para detectar a enzima ou o marcador mencionado pode ser selecionado do grupo incluindo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas ou algum dos marcadores mencionados acima.

[052] Kits de diagnóstico para a esquistossomose mansoni podem ser desenvolvidos utilizando os peptídeos descritos na presente invenção.

[053] A presente invenção pode ser mais bem compreendida por meio dos exemplos que se seguem, não limitantes da tecnologia.

EXEMPLO 1. IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS E SELEÇÃO DOS EPÍTOPOS

[054] Obtenção da sequência proteica. Por meio da busca na literatura foram selecionadas proteínas de antigenicidade conhecida e as sequências das mesmas foram obtidas no banco de dados GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/): CCA - Circulating Cathodic Antigen (número de acesso: U94619.1), Sm200 (número de acesso: M99494.1).

[055] Análises in silico das proteínas. A parte exposta das proteínas foi analisada pelo programa de predição de epítopo quanto a afinidade pelo receptor de antígenos de células B (BCR) pelo programa BCpred (http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/) (EL-MANZALAWY, Y; DOBBS, D; HONAVAR, V. Predicting linear B-cell epitopes using string kernels. J Mol Recognit, v.21, p.243-255, 2008).

[056] O programa VaxiJen (http://ddgpharmfac.net/VaxiJen/VaxiJen/VaxiJen .html) (DOYTCHINOVA, I. A.; FLOWER, D. R. VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC bioinformatics, v.8, n.1, p.4, 2007) foi utilizado para fazer a predição de antigenicidade dos epítopos identificados pelo BCpred. O resultado obtido mostra a probabilidade de ser antigênico ou não antigênico, de acordo com um threshold predefinido.

[057] Com o intuito de evitar possíveis resultados falso-positivos e falso-negativos em kits de diagnóstico, foi verificado por meio do programa NCBI Blast+ (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/ncbiblast/) (CAMACHO, C. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics, v.10, n.1, p.421, 2009) se os epítopos selecionados apresentavam similaridade com proteínas de outras espécies filogeneticamente conservadas ou não.

EXEMPLO 2. ELISA in-house

[058] ELISA in-house da padronização da quantidade dos peptídeos. A microplaca de ELISA (Greiner - média adsorção) foi sensibilizada adicionando as quantidades dos peptídeos P3 e P4 de 17.5, 35, 70 e 140ng em 100μL de tampão de adsorção carbonato bicarbonato pH 9,6 em cada poço. As placas foram incubadas a 4°C durante 16-18 horas. Decorrido o tempo de sensibilização, as placas foram lavadas 5 vezes com 200 μL de tampão de lavagem PBST (PBS + 0,05% de Tween) em cada poço. Para a retirada do excesso do tampão de lavagem, as placas foram friccionadas sobre papel absorvente ao término da lavagem. Posteriormente, adicionou-se, em cada poço, 200 μL de solução bloqueio com albumina a 5% em PBST e as placas foram incubadas a 37°C por 1 hora. Decorrido o tempo de bloqueio, as placas foram lavadas 5 vezes com 300 μL de tampão de lavagem em cada poço. Para a retirada do restante do tampão de lavagem, as placas foram friccionadas sobre papel absorvente ao término da lavagem. Posteriormente, foram adicionados 100 μL dos soros, na diluição de 1:100 em solução bloqueio e, em seguida, as placas foram então incubadas a 37°C durante 2 horas. Decorrido o tempo de incubação com os soros, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com 200 μL tampão de lavagem por poço. Em seguida, adicionou-se 100 μL do anticorpo secundário (anti- IgG conjugada com peroxidase) em cada poço, na diluição de 1:5.000 em PBST e as placas foram incubadas a 37°C por 1 hora. Decorrido o tempo, as placas foram lavadas 5 vezes com 200 μL tampão de lavagem por poço e, ao final da lavagem, as placas foram vertidas sobre papel absorvente para retirada do excesso de tampão. Por fim, 100 μL da solução reveladora (TMB) foram adicionados em cada poço e as placas foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente, sob abrigo da luz. Decorrido o tempo de revelação, a reação foi parada pela adição de 100 μL de ácido sulfúrico 0,2 mol/L em cada poço. Em seguida, foi realizada a leitura das placas em leitor de ELISA em faixa de luz de 450nm. Os resultados dos ELISAs são mostrados nas figuras 1 e 2.

ELISA in-house da combinação dos peptídeos

[059] A microplaca de ELISA (Greiner - média adsorção) foi sensibilizada com 16 combinações dos peptídeos (P3 e P4) variando suas quantidades entre 17.5, 35, 70 e 140ng em 100μL de tampão de adsorção carbonato bicarbonato pH 9,6 em cada poço. A placa foi incubada a 4°C durante 16-18 horas. Decorrido o tempo de sensibilização, a placa foi lavada 5 vezes com 200 μL de tampão de lavagem PBST (PBS + 0,05% de Tween) em cada poço. Para a retirada do restante do tampão de lavagem, a placa foi friccionada sobre papel absorvente ao término da lavagem. Posteriormente, adicionou-se, em cada poço, 200 μL de solução bloqueio com albumina a 5% em PBST e a placa foi incubada a 37°C por 1 hora. Decorrido o tempo de bloqueio, a placa foi lavada 5 vezes com 300 μL de tampão de lavagem em cada poço. Para a retirada do restante do tampão de lavagem, a placa foi friccionada sobre papel absorvente ao término da lavagem. Em seguida, foram adicionados 100 μL dos soros positivos e negativo, na diluição de 1:100 em solução bloqueio e a placa foi então incubada a 37°C durante 2 horas. Decorrido o tempo de incubação com os soros, a placa foi novamente lavada 5 vezes com 200 μL tampão de lavagem por poço. Em seguida, adicionou-se 100 μL do anticorpo secundário (anti- IgG conjugada com peroxidase) em cada poço, na diluição de 1:5.000 em PBST e a placa foi incubada a 37°C por 1 hora. Decorrido o tempo, a placa foi lavada 5 vezes com 200 μL tampão de lavagem por poço e, ao final da lavagem, a placa foi vertida sobre papel absorvente para retirada do excesso de tampão. Por fim, 100 μL da solução reveladora (TMB) foram adicionados em cada poço e a placa foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente, sob abrigo da luz. Decorrido o tempo de revelação, a reação foi parada pela adição de 100 μL de ácido sulfúrico 0,2 mol/L em cada poço. Em seguida, foi realizada a leitura da placa em leitor de ELISA em faixa de luz de 450nm. O resultado do ELISA é mostrado na figura 3.

[060] De acordo com os resultados dos ensaios de ELISA mostrados nas figuras 1 e 2, foi possível verificar que os peptídeos foram reconhecidos por anticorpos anti-S. mansoni presentes nos soros testados. O P3 apresentou uma diferença estatisticamente significativa entre a quantidade de 140ng e as demais quantidades avaliadas, exceto para 70ng, frente ao soro negativo 2. Analisando o soro positivo 2, a concentração de 140ng foi estatisticamente significativa dentre as demais. Os soros negativo e positivo 1 não apresentaram diferença estatisticamente significativa dentre as quatro concentrações avaliadas.

[061] Para o P4, a concentração de 140ng foi estatisticamente diferente das demais em todos os soros, exceto o para o soro negativo 2.

[062] Com base na figura 3, foi possível notar que utilizando as 16 combinações dos peptídeos houve diferença estatística entre o reconhecimento dos peptídeos pelos anticorpos presentes no soro positivo em relação ao soro negativo. Nota-se também que dentre as 16 combinações, as maiores absorbâncias foram observadas no P4 140ng e na combinação P3 70ng + P4 17,5ng. Embora não exista diferença estatisticamente significante elas, pode ser mais vantajoso utilizar a combinação de P3 70ng + P4 17,5ng em relação à apenas P4 140 ng por requerer menor quantidade de peptídeos. Tais resultados sugerem o potencial dos peptídeos P3 e P4 como insumos biotecnológicos.

Claims (9)

1. Método para diagnóstico da esquistossomose mansoni caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   • a) Exposição de uma amostra a pelo menos um dos peptídeos estando tais moléculas ligadas a um suporte sólido ou carreador;
   • b) Adição de um anticorpo secundário ou uma proteína que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);
   • c) Detecção dos anticorpos específicos para a esquistossomose mansoni na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou os marcadores citados na etapa (b);
2. Método para o diagnóstico de esquistossomose mansoni, de acordo com a reivindicação 1, etapa “a”, caracterizado por utilizar amostras de sangue, soro, plasma e/ou outro fluido;
3. Método para o diagnóstico de esquistossomose mansoni, de acordo com a reivindicação 1, etapa “b”, caracterizado por o anticorpo secundário ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e/ou respectivas subclasses; pela proteína ser preferencialmente a Proteína A e/ou Proteína G; pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo ser peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, uréase, xantina oxidase, glicose oxidase e penicinilase e pelo marcador ser selecionado do grupo compreendendo ser enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e compostos quimioluminescentes;
4. Método para o diagnóstico da esquistossomose mansoni, de acordo com a reivindicação 1, etapa “c”, caracterizada por a detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados aos anticorpos anti-S.mansoni ser feita utilizando reagentes selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas dos marcadores da reivindicação 3;
5. Kit para diagnóstico da esquistossomose mansoni caracterizado por compreender suporte sólido tratado como grupamentos químicos que podem refletir em baixa ou alta adsorção de antígenos de interesse ou carreador contendo pelo menos um dos peptídeos; anticorpo secundário monoclonal ou policlonal ou uma proteína, conjugados a uma enzima, como peroxidase ou fosfatase alcalina ou a um outro marcador e reagente para detectar a enzima ou o marcador podendo ser colorimétrico como TMB, luminol ou outro revelador;
6. Kit para diagnóstico da esquistossomose mansoni, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o suporte ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno, preferencialmente constituindo em placas de microtitulação de 96 poços, tubos, esferas ou papeis de nitrocelulose e/ou nylon;
7. Kit para diagnóstico da esquistossomose mansoni, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou proteína poder ser selecionada do grupo incluindo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase e o marcador ser selecionado do grupo incluindo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e/ou quimioluminescentes;
8. Kit para diagnóstico da esquistossomose mansoni, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo reagente para detectar a enzima ou o marcador poder ser selecionado do grupo incluindo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas ou algum dos marcadores;
9. Método e/ou kits para o diagnóstico da esquistossomose mansoni, caracterizado por utilizar os peptídeos descritos na presente invenção.

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