BR102018013238A2 - Método para detectar anticorpos contra schistosoma, kit para detecção de infecção por schistosoma em uma amostra biológica, e, uso de um antígeno de schistosoma. - Google Patents
Método para detectar anticorpos contra schistosoma, kit para detecção de infecção por schistosoma em uma amostra biológica, e, uso de um antígeno de schistosoma. Download PDFInfo
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Abstract
método para detectar anticorpos contra schistosoma, kit para detecção de infecção por schistosoma em uma amostra biológica, e, uso de um antígeno de schistosoma. a esquistossomose continua sendo uma das infecções parasitárias mais prevalentes no mundo, e para o controle e monitoramento efetivo dessa doença é essencial que se disponha de métodos diagnósticos cada vez mais acurados. um antígeno de s. mansoni foi selecionado in silico para utilização no diagnóstico sorológico da esquistossomose e no controle de cura da doença pós-tratamento. o método diagnóstico desenvolvido foi capaz de diferenciar indivíduos infectados de áreas endêmicas, de indivíduos negativos de área endêmica e doadores saudáveis não residentes de área endêmica. além disso, também foi capaz de diferenciar soro de indivíduos infectados de área endêmica, de soro de indivíduos infectados 30 e 180 dias após tratamento, o que poderia ser utilizado para controle de cura, com especificidade de 100% e sensibilidade de 96,15%.
Description
[001] A invenção refere-se de forma geral a um método de diagnóstico de esquistossomose e a um kit de diagnóstico. Mais especificamente, a invenção se relaciona à detecção imunológica, com alta sensibilidade e especificidade, capaz de discriminar indivíduos infectados e não infectados, inclusive em áreas de baixa endemicidade, e de monitorar a cura após tratamento da doença.
[002] As esquistossomoses são uma das infecções parasitárias mais prevalentes no mundo, abrangendo 78 países (WHO.2014. Schistosomiasis fact sheet 115. World Health Organization, Geneva, Switzerland). Dentre as doenças negligenciadas, a esquistossomose se destaca por apresentar importante grau de morbidade, afetando mais de 240 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo que, somente no ano de 2013, mais de 40 milhões de pessoas necessitaram de tratamento para a doença (WHO - World Health Organization. Schistosomiasis: fact sheet n° 115. Maio, 2015.). Em um ranking de diversas doenças negligenciadas utilizando o indicador DALY (“Disability-Adjusted Life Years”), que quantifica o número de anos de vida perdidos devido a problemas relacionados a essas doenças, a esquistossomose ficou atrás somente de leishmaniose e infeções intestinais por nematódeos, com um DALY estimado em 3,31 milhões (Hotez et al., PLoS Negl Trop Dis. 2014; 24, 8(7):e2865).
[003] Apesar do seu papel fundamental, as estratégias de controle da esquistossomose baseadas em quimioterapia têm falhado em interromper a transmissão da doença. Parte desta falha poderia ser atribuída à ausência de um método acurado de diagnóstico capaz de determinar a prevalência real da doença na população e de monitorar o sucesso das intervenções terapêuticas (Berhe et al. Acta Trop. 2004; 92: 205-212; Utzinger et al., Acta Trop. 2011; 120, Supplement 1: S121-S137; Weerakoon et al., Clin Micro Biol Rev. 2015; 28: 939-967).
[004] Assim, métodos diagnósticos constituem um instrumento primordial para os programas de controle da doença.
[005] Os testes parasitológicos ainda são os métodos diagnósticos mais amplamente utilizados dos programas de controle de esquistossomose (Zhu YC. Acta Trop. 2005;96: 130-136; Doenhoff et al. Trends Parasitol. 2004; 20: 35-39) e, dentre estes, a técnica de Kato-Katz é o mais utilizado, devido ao seu baixo custo, capacidade de detectar infecções por diferentes helmintos e maior sensibilidade em áreas de infecções de alta intensidade (Katz et al. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1972; 14: 397-400; The control of schistosomiasis. Second report of the WHO Expert Committee. 529 World Health Organ Tech Rep Ser. 1993; 830: 1-86; Hawkins et al., PLoS Negl Trop Dis. 2016; 22:10). No entanto, em áreas de baixa endemicidade, com indivíduos apresentando baixa intensidade de infecção, a sensibilidade do teste é diminuída, exigindo o exame de maior número de lâminas ou associação dos testes parasitológicos com técnicas sorológicas e moleculares.
[006] Outra abordagem são os métodos moleculares de diagnóstico para detecção de DNA do parasito, baseados em PCR, que podem apresentar alta especificidade e sensibilidade, porém, possuem alto custo e alta complexidade quanto ao manuseio de equipamentos (Obeng et al., Ann Trop Med Parasitol. 2008; 102 (7): 625-63; Kjetland et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 2009; 81 (6): 1050-1055), sendo de difícil implementação na maior parte das áreas endêmicas.
[007] Outro exemplo que tem provido resultados satisfatórios no diagnóstico de esquistossomose é o teste imunocromatográfico (POC-CCA® - “urine-based point-of-care”, Rapid Medical Diagnostics, Pretoria, África do Sul), que detecta o Antígeno Catódico Circulante em amostras de urina. Este teste tem demonstrado promessa para uso em estudos epidemiológicos, em laboratórios clínicos e em áreas endêmicas, com sensibilidade maior que a técnica de Kato-Katz (Colley et al., Am J Trop Med Hyg. 2013;88: 426-432; Lamberton et al., PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8; Adriko et al., Acta Trop. 2014;136: 50-57; Greter et al., Am J Trop Med Hyg. 2016; 94: 361-364). Apesar das vantagens em relação à aplicabilidade de uso em campo, facilidade de coleta da amostra e resultado rápido, há ambiguidade de interpretação dos resultados nos casos de baixa intensidade de infecção (Bezerra et al. Acta Tropica. 2018; 128: 264-270), menor sensibilidade em áreas de baixa endemicidade, e ocorrência de falsos negativos e positivos (Legesse et al., Parasite. 2008;15: 151-155; Lodh et al.; Am J Trop Med Hyg. 2013;89: 46-50;).
[008] Métodos imunodiagnósticos baseados em sorologia têm sido amplamente utilizados no diagnóstico de esquistossomose, apresentando sensibilidade maior que os métodos parasitológicos (Doenhoff et al., Trends Parasitol. 2004; 20: 35-39; Ruppel et al., Clin Exp Immunol. 1987; 69: 291298; Tsang et al., Clin Lab Med. 1991; 11: 1029-1039; Silva et al., Mem Inst Oswaldo Cruz. 1998; 93: 279-282), particularmente em áreas de baixa endemicidade (Alarcón de Noya et al., Acta Trop. 1997; 66: 69-78; Hamilton et al., Parasitology. 1998;117 Suppl: S41-57).
[009] Dentre os testes sorológicos, o ensaio de ELISA é amplamente utilizado. Variações comuns do ensaio de ELISA permitem que ele possa ser utilizado tanto para detecção de anticorpos específicos quanto de antígenos do parasito no soro dos indivíduos (De Jonge et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1991; 85: 756-759).
[0010] Uma das dificuldades iniciais no desenvolvimento de testes sorológicos para detecção de anticorpos é a escolha dos antígenos apropriados. Existem diversos fatores que influenciam a escolha de um antígeno para ser utilizado em testes diagnósticos, tais como: produtividade e facilidade de obtenção, elevada estabilidade em condições simples de estocagem, antigenicidade, especificidade e compatibilidade com técnicas sorológicas baratas e simples. Os antígenos podem ser obtidos de diversos estágios evolutivos do parasito. Os mais utilizados são os extratos brutos, preparados mediante ruptura de vermes, cercárias ou ovos. O antígeno solúvel de vermes adultos (SWAP) é a fonte mais fácil e abundante de material antigênico (Doenhoff et al.; Trends Parasitol. 2004; 20: 35-39). Antígenos de cercárias são menos empregados devido à sua baixa sensibilidade e especificidade (Lunde & Ottensen. The A J Trop Med & Hyg. 1980; 29: 8285). O homogeneizado de ovos, conhecido como SEA, contém grande número de frações antigênicas, apesar de somente uma minoria desses constituintes ser liberada por ovos viáveis, como demonstrado por Ashton e colaboradores (Ashton et al., Parasitology. 2001; 122: 329-338). Porém, a ocorrência de reações cruzadas, principalmente observadas com o uso de antígenos brutos, que contêm frações antigênicas compartilhadas com diversos parasitos, também é um dos grandes problemas do uso destes antígenos (Mott & Dixon Bull. World Health Organ. 1982; 60: 729-753; Correa-Oliveira et al., Am J Trop Med Hyg. 1988; 38: 348-355; Montenegro, Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1992; 87: 333-335; Ishida et al. Acta Trop. 2003; 89: 73-84; Luo et al. Acta Trop.2009; 112: 91-96). Para superar este obstáculo, antígenos purificados e recombinantes têm sido utilizados (Dunne et al., Trans R Soc Trop Med Hyg. 1984;78: 460-470; Tsang et al., J Immunol. 1983;130: 1359-1365; Ruppel et al., Clin Exp Immunol. 1985;62: 499-506. 08; Doenhoff et al., Trans R Soc Trop Med Hyg. 1993;87: 42-48; Bligh et al.; Ann Trop Med Parasitol. 2010;104: 511-520; de Oliveira et al.; Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102: 360-366; Sulbarán et al., Parasite Immunol. 2010;32: 20-28; Zhong et al., Acta Trop. 2010;116: 1-8).
[0011] Nesse contexto, os problemas cruciais do estado da técnica são: (i) a baixa sensibilidade de testes de diagnóstico de esquistossomose baseados na detecção de ovos nas fezes e na urina em áreas de baixa prevalência e (ii) a incapacidade dos testes sorológicos já desenvolvidos em diferenciar entre infecção ativa, prévia ou reinfecção, limitando seu uso no monitoramento do sucesso do tratamento (Hinz R, et al. Mol Cell Probes. 2017; 31:2-21).
[0012] As limitações das estratégias utilizadas no controle da esquistossomose evidenciam a necessidade de desenvolvimento de um padrão ouro, ou seja, de um diagnóstico mais sensível que seja capaz de discriminar indivíduos infectados e não infectados de áreas de baixa prevalência de infecção e de monitorar a cura após tratamento da doença. É altamente desejável o desenvolvimento de técnicas que sejam mais eficientes que os métodos atualmente disponíveis. O desenvolvimento de testes de diagnóstico mais sensíveis e específicos adaptados para áreas de baixa intensidade de infecção é colocado como uma das ações estratégicas da Organização Mundial da Saúde (e de outros envolvidos) no plano estratégico 2012-2020. E ressaltado ainda nesse plano estratégico que antígenos recombinantes são necessários para que os métodos sorológicos possam ser padronizados (WHO Schistosomiasis: progress report 2001-2011 and strategic plan 2012-2020 World Health Organization, Geneva (2013), pp. 1-80).
[0013] A presente invenção foi desenvolvida a partir da necessidade de um diagnóstico da esquistossomose que possua altas especificidade e sensibilidade, para ser aplicado, inclusive, em áreas de baixa intensidade de infecção, e que seja capaz de diferenciar indivíduos curados após tratamento quimioterápico.
[0014] A invenção passará a ser apresentada com maiores detalhes abaixo.
[0015] Em um aspecto, é provido um método para detectar anticorpos contra Schistosoma em um indivíduo, compreendendo as etapas de:
- (i) contatar uma amostra biológica do dito indivíduo a um antígeno compreendendo SEQ ID NO: 2 ou um fragmento do mesmo; e
- (ii) detectar a ligação do referido antígeno com um anticorpo anti-Schistosoma na amostra biológica, usando um agente de detecção, assim detectando infecção por Schistosoma no dito indivíduo.
[0016] Em uma concretização, o fragmento compreende a SEQ ID NO: 3.
[0017] Em uma outra concretização, o antígeno apresenta pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 3.
[0018] Em ainda uma outra concretização, o antígeno compreende de 2-15 repetições de SEQ ID NO: 3.
[0019] Em uma concretização, o indivíduo é humano, e a amostra biológica é selecionada do grupo consistindo de sangue, soro, plasma, saliva, leite, colostro e urina.
[0020] Em uma concretização, o antígeno é ligado, conjugado ou imobilizado sobre ou a um suporte sólido.
[0021] Em uma outra forma de concretização, o antígeno é misturado à amostra biológica.
[0022] Em uma concretização, o suporte sólido é selecionado do grupo consistindo de uma placa de microtitulação, membranas, microesferas, partícula magnética ou uma fibra de sensor óptico.
[0023] Em uma concretização, o agente de detecção é um anticorpo marcado.
[0024] Em outra forma de concretização, o agente de detecção é um antígeno marcado.
[0025] Em uma concretização, o agente de detecção é marcado com um marcador selecionado de uma enzima, um radioisótopo, um grupo fluorescente, um grupo luminescente, biotina, estreptavidina, ou partículas de corante.
[0026] Em uma concretização, o método compreende ainda uma etapa de comparar o nível de anticorpos específicos para o antígeno em uma amostra teste com o nível de anticorpos em uma amostra controle não infectada, em que o nível de anticorpos específicos para o antígeno compreendendo SEQ ID NO: 2 ou um fragmento do mesmo acima do controle é indicativo de infecção por Schistosoma.
[0027] Em um outro aspecto, é provido um kit para detecção de infecção por Schistosoma em uma amostra biológica de um indivíduo, compreendendo o antígeno compreendendo SEQ ID NO: 2 ou um fragmento do mesmo, um conjunto de controles positivo e negativo e instruções de uso.
[0028] Em uma concretização, o fragmento compreende a SEQ ID NO: 3.
[0029] Em uma outra concretização, o kit compreende ainda pelo menos um agente de detecção marcado.
[0030] Em um outro aspecto adicional, é provido o uso do antígeno compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou um fragmento do mesmo para manufatura de um kit para detecção de esquistossomose a partir de uma amostra biológica de um indivíduo, ou em um método para detectar anticorpos contra Schistosoma em um indivíduo.
[0031] Figura 1: Estratégia da seleção do alvo diagnóstico. (A) Cada etapa do fluxo de análise foi numerada de acordo com a estratégia usada para a seleção do alvo. (B) Representação esquemática da base de dados relacional desenvolvida para integrar os dados obtidos após as predições computacionais. Cada tabela representa as análises e parâmetros de cada programa ou preditor utilizado e estão ligadas a uma tabela principal que contém o proteoma de S. mansoni. (C) Número de proteínas selecionadas após cada etapa de (A).
[0032] Figura 2: Detecção de níveis de IgG em soros de humanos por ensaio de ELISA utilizando Smp_150390.1 (307-321) (SEQ ID NO: 3). Amostras de soro foram coletadas de indivíduos moradores de área endêmica para infecção com S. mansoni. Foram avaliadas 25 amostras de indivíduos com exame de fezes negativo (NEG) e 26 amostras de indivíduos com amostra de fezes positivas (INF). Adicionalmente, soro de 13 doadores saudáveis (HD), não moradores de área endêmica para S. mansoni, também foram avaliados. Diferenças estatisticamente significativas nos níveis de IgG estão indicadas por barras. As linhas tracejadas representam o ponto de corte.
[0033] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular e imunologia são bem conhecidas de um técnico no assunto. O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.
[0034] Frente aos avanços na área de bioinformática e à disponibilidade do genoma do S. mansoni (Berriman et al., Nature. 2009; 460 (7253): 352-358), os inventores selecionaram, por análises in silico e fluxo de trabalho analítico-computacional, um novo antígeno do S. mansoni para uso no imunodiagnóstico da esquistossomose e de cura da doença pós-tratamento.
[0035] Assim, a invenção provê métodos e kits úteis para realizar detecção imunológica de antígeno, para diagnóstico de esquistossomose.
[0036] Como usado aqui, “antígeno” deve ser entendido no seu significado amplo e pode ser qualquer molécula, célula ou partícula. Por exemplo, um antígeno inclui, mas não é limitado a uma célula, um polissacarídeo, uma proteína, um peptídeo, um ácido nucleico e um lipídio, ou uma mistura de dois ou mais destes.
[0037] Um antígeno pode estar em sua forma pura, ou estar em uma mistura. Um antígeno pode estar em uma forma modificada (por exemplo, modificada por químicos), ou pode estar em uma forma não modificada.
[0038] “Anticorpo” deve ser entendido no seu significado amplo. Um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina que tem a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno em particular. Os anticorpos são bem conhecidos a um técnico no assunto. Um anticorpo inclui, mas não é limitado a, um anticorpo tradicional, um fragmento de um anticorpo tradicional contendo um sítio de ligação ao antígeno, um anticorpo recombinante contendo um sítio de ligação ao antígeno, uma proteína que se liga a um antígeno, e um produto compreendo uma ligação entre duas ou mais destes.
[0039] Um anticorpo pode estar em sua forma pura, ou estar em uma mistura. Um anticorpo pode estar em uma forma modificada (por exemplo, modificada por químicos), ou pode estar em uma forma não modificada.
[0040] O termo “agente de detecção” refere-se a um agente usado para detectar um antígeno ou um anticorpo. Um agente de detecção pode ser tanto um antígeno quanto um anticorpo. Um agente de detecção pode ser tanto um antígeno ou um anticorpo marcado. Métodos adequados de marcação podem ser usados na presente invenção e incluem, sem limitação, marcação com isótopos, modificação química, conjugação com enzima, marcação com corante fluorescente, luminescente e outros métodos de marcação comumente conhecidos pelo técnico no assunto. Portanto, um agente de detecção inclui, mas não está limitado a, uma molécula química, uma molécula de peptídeo, uma molécula de proteína, um molécula de RNA, uma molécula de DNA, um anticorpo tradicional, um fragmento de um anticorpo tradicional contendo um sítio de ligação a antígeno, um anticorpo recombinante contendo um sítio de ligação a antígeno, uma proteína que se liga a um antígeno, uma célula, uma partícula, e um produto compreendendo uma ligação entre duas ou mais do acima.
[0041] Um agente de detecção pode estar na forma pura, ou pode estar em uma forma impura (por exemplo, contido em uma mistura com outros compostos ou materiais). Um agente de detecção pode estar em uma forma modificada ou não modificada. De acordo com a ordem de um agente de detecção usado em um método, um agente de detecção pode ser chamado de “agente de detecção primário”, “agente de detecção secundário”, “agente de detecção terciário” e assim por diante.
[0042] O termo “sistema de detecção” refere-se a um sistema que pode ser usado para fornecer uma leitura compreendendo informação relacionada com a quantidade ou qualidade de uma proteína ou um agente em uma amostra. A escolha de um sistema de detecção depende da escolha do agente de detecção usado em um método da invenção. Por exemplo, um sistema de detecção inclui, mas não é limitado a, filme de raio-X, ou outro material sensível a radiação beta/gama se o agente de detecção for marcado com isótopo; uma câmera CCD ou inspeção visual ou outro dispositivo capaz de perceber o sinal se o agente de detecção for marcado com enzima e gerar uma reação química que pode resultar em sinal colorido ou quimioluminescente capaz de ser detectado; e se o agente de detecção for marcado com fluorescência, um microscópio, um escâner ou uma câmera de fluorescência pode ser usado.
[0043] “Suporte” ou “fase sólida”, utilizados intercambiavelmente, referem-se a uma fase que se liga a um alvo a ser detectado. Exemplos de tais suportes incluem, mas não são limitados a membranas, tais como as de nitrocelulose, PVDF ou nylon, uma fase sólida para ELISA, tais como poliacrilamida, material plástico como poliestireno ou polivinilcloreto, metal, vidro ou semelhantes, e amostras de tecidos tais como tecidos ou células em vidro, plástico ou outros materiais. Alternativamente, o suporte pode ser também uma microesfera, partícula magnética ou uma fibra de sensor óptico, tal como os descritos na patente n° US 5,359,681.
[0044] Um “agente bloqueador” refere-se a um reagente que se liga a sítios de ligação não específicos em um substrato. Exemplos incluem Tween-20, BSA ou combinações dos mesmos. Em um aspecto, BSA pode ser substituído por, por exemplo, caseína ou outros agentes conhecidos na arte.
[0045] A invenção provê métodos, kits de detecção de um anticorpo de Schistosoma, e uso de um antígeno para diagnóstico de esquistossomose.
[0046] Assim, em um aspecto, nos métodos da presente invenção, um anticorpo anti-Schistosoma é detectado.
[0047] Em uma concretização, o método é útil para detecção de anticorpos específicos para um antígeno de Schistosoma usando quaisquer métodos de detecção imunológica, incluindo, mas não limitado a, Western blots, Dot blots, ELISA, imunocromatografia de fluxo lateral, imunofluorescência, citometria de fluxo. Vide, por exemplo, Harlow e Lane. 1988. Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para uma descrição de formatos de imunoensaios. Em uma concretização preferencial, é provido um método de detecção de anticorpo anti-Schistosoma por ELISA, e ainda mais preferencialmente, por ELISA indireto ou ELISA competitivo.
[0048] Quando o ELISA visa detectar um anticorpo produzido contra um determinado antígeno, essa detecção pode ser realizada com um antígeno do parasita imobilizado no suporte sólido do ensaio, ou utilizando um anticorpo produzido contra o antígeno e imobilizado em um suporte sólido. No segundo caso, o anticorpo imobilizado competirá com o anticorpo que se quer detectar pela ligação ao antígeno em questão. Ambos os tipos de detecções são inclusos no presente pedido.
[0049] De forma mais específica, incluso na presente invenção, está o o ELISA indireto, que é um método ELISA que pode ser usado para triagem e determinação de título de anticorpos durante o curso de sua produção. Para detectar um anticorpo que reconheça um antígeno, o antígeno é imobilizado no suporte ou fase sólida, por exemplo, em poços das placas de microtitulação, e incubado com amostras de teste contendo ou não anticorpos anti-Schistosoma. Pode ser necessária uma ou mais incubações adicionais com soluções contendo agentes de detecção (por exemplo, fosfatase alcalina conjugada com proteína A, proteína G, ou anticorpos que se ligam anticorpo anti-Schistosoma). Uma incubação com um substrato de enzima repórter também pode ser necessária. Os agentes de detecção não ligados são lavados. Um sistema de detecção, tal como UV, fluorescência, quimioluminescência ou outros métodos, é usado para detectar o agente de detecção, cujo sinal será diretamente proporcional à quantidade de anticorpo anti-Schistosoma a ser detectado na amostra de teste, e o anticorpo é qualitativa e/ou quantitativamente detectado.
[0050] O ELISA competitivo é uma variação do ELISA, que pode ser usado para triagem e determinação de título de anticorpos durante o curso de sua produção. Pelo menos dois anticorpos são usados: um deles é um “anticorpo de captura”, por exemplo, mas não limitado a um anticorpo policlonal ou monoclonal, e o outro é um anticorpo presente na amostra de teste. Qualquer método disponível na arte pode ser utilizado por um técnico no assunto para preparar anticorpos de captura contra o antígeno da invenção. Para detectar o anticorpo na amostra de teste, um agente de detecção, por exemplo, um antígeno marcado, é incubado juntamente com a amostra de teste, contendo ou não anticorpo específico para o antígeno, sob um suporte ou fase sólida onde se encontra imobilizado um anticorpo de captura. Os anticorpos de captura e os anticorpos da amostra de teste competem pela ligação do antígeno marcado. Desta forma, quanto mais anticorpos houver na amostra de teste, menos antígenos marcados se ligarão ao anticorpo de captura imobilizado na placa. Uma incubação com um substrato de enzima repórter também pode ser necessária. Um sistema de detecção, tal como UV, fluorescência, quimioluminescência ou outros métodos, é usado para detectar o agente de detecção, cujo sinal é inversamente proporcional à quantidade de anticorpos na solução de teste. Desta forma, a presença de anticorpo antiSchistosoma na amostra teste é qualitativa e/ou quantitativamente detectado.
[0051] Assim, o método da presente invenção compreende:
- - Contatar uma amostra biológica com o antígeno da presente invenção, e
- - Detectar ligação do referido antígeno com um anticorpo antiSchistosoma presente na referida amostra biológica.
[0052] Opcionalmente, antes da etapa de contatar a amostra biológica com o antígeno, o método pode ainda compreender uma etapa de sensibilização ou imobilização do antígeno ou do anticorpo de captura no suporte sólido onde o método ocorre, e uma etapa de bloqueio deste mesmo suporte sólido. Ainda, antes da etapa de detecção da ligação do anticorpo presente na amostra biológica, o método pode compreender uma etapa de ligação de um ou mais agentes de detecção. Finalmente, após a etapa de detecção, o método pode compreender uma etapa de comparar o nível de anticorpos específicos para o antígeno em uma amostra biológica com o nível de anticorpos em uma amostra controle não infectada, em que o nível de anticorpos específicos para o antígeno acima do controle é indicativo de infecção por Schistosoma.
[0053] Desta forma, em uma forma de concretização, o método compreende:
- - Sensibilizar uma fase sólida com um antígeno,
- - Bloquear a fase sólida com um reagente bloqueador,
- - Contatar uma amostra biológica com a fase sólida da etapa anterior, e
- - Detectar a presença de um anticorpo anti-Schistosoma na amostra biológica com um agente de detecção.
[0054] Opcionalmente, antes da etapa de detecção, é possível haver incubação da fase sólida com outros agentes de detecção adicionais.
[0055] Em outra forma de concretização, o método compreende:
- - Sensibilizar uma fase sólida com um anticorpo de captura,
- - Bloquear a fase sólida com um reagente bloqueador,
- - Contatar uma amostra biológica com um agente de detecção,
- - Contatar a mistura de amostra biológica e agente de detecção com a fase sólida,
- - Detectar a presença de um anticorpo anti-Schistosoma na amostra biológica.
[0056] Nesta concretização, o agente de detecção é um antígeno marcado.
[0057] Em uma concretização da invenção, o antígeno pode ser uma célula de helminto, íntegra ou lisada. Especificamente, o antígeno é o helminto do gênero Schistosoma, mais especificamente, Schistosoma mansoni, ainda mais especificamente, uma proteína de Schistosoma mansoni, e ainda mais especificamente, um fragmento de uma proteína expressa de Schistosoma mansoni.
[0058] A identificação e a seleção de um antígeno adequado podem ser feitas através do uso de abordagens computacionais de imunoinformática, seguindo um fluxo de trabalho analítico-computacional desenvolvido com esse propósito. Assim, na presente invenção, um fluxograma de análises in silico foi desenvolvido e utilizado para procurar por proteínas que poderiam ser utilizadas no diagnóstico sorológico da esquistossomose utilizando como ponto de partida todo o proteoma predito do parasita S. mansoni. Nesse contexto, foram utilizados critérios considerados importantes para o reconhecimento de proteínas do parasito por anticorpos do hospedeiro humano, tais como: presença de peptídeo sinal, baixa similaridade com proteínas humanas e de camundongos, presença de epítopos lineares de células B e T preditos, localização favorável (secretada ou de membrana) e expressão em estágios de vida do parasito presentes no hospedeiro definitivo. Proteínas selecionadas dessa maneira têm potencial para serem consideradas boas candidatas para o diagnóstico sorológico de esquistossomose, uma vez que passaram por todos os critérios de seleção para serem potenciais antígenos.
[0059] O antígeno ideal deveria ser um peptídeo com especificidade e sensibilidade maiores que os testes diagnósticos de esquistossomose atualmente utilizados e também capaz de identificar indivíduos curados após a quimioterapia. Dentre vários candidatos identificados, um peptídeo agregou todas essas qualidades. Esse antígeno, correspondendo a um peptídeo de S. mansoni, passará a ser descrito mais abaixo. Como aqui usado, “peptídeo” é um polímero de resíduos de aminoácidos. Pelo termo “peptídeo sintético” é entendido um peptídeo que não compreende uma molécula de proteína que ocorre na natureza. O peptídeo é sintético no sentido de que pode ser produzido pela intervenção humana usando técnicas como síntese química, técnicas do DNA recombinante, ou fragmentação de uma proteína inteira, e outros.
[0060] A não ser que seja requerido, os aminoácidos podem ser tanto um D-aminoácido quanto um L-aminoácido. Como discutido aqui, pequenas variações na sequência de aminoácidos de proteínas/peptídeos são contempladas como parte do conceito inventivo da invenção, desde que as variantes mantenham pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade com SEQ ID NO: 2 (anotado como Smp_150390.1), ou um fragmento do mesmo. Mais especificamente, o fragmento compreende ou consiste da SEQ ID NO: 3, ou sequências com identidade de pelo menos 80%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferencialmente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com SEQ ID NO: 3.
[0061] O antígeno da presente invenção também pode ter alguns aminoácidos modificados e/ou deletados sem afetar a sua atividade fisiológica. Em particular, substituições conservativas de aminoácidos são contempladas. As substituições conservativas são aquelas que acontecem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. Os aminoácidos são geralmente divididos em famílias: (1) ácido = aspartato, glutamato (2) básico = lisina, arginina, histidina; (3) apolar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar não carregado = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Por exemplo, é razoável esperar que uma única substituição de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido por um outro aminoácido estruturalmente relacionado não levará a um efeito sobre a propriedade de ligação da molécula resultante, especialmente se esta substituição não envolver um aminoácido dentro de um sítio reconhecido pelo agente de detecção.
[0062] Os antígenos da presente invenção podem ser obtidos sinteticamente, no todo ou em parte, conforme métodos conhecidos na arte, por exemplo, conforme descrito por métodos na arte, como o método de Merrifield (Merrifield RB. J. Am. Chem. Soc. 1963; 85: 2149-2153). Peptídeos podem ser sintetizados em grandes quantidades usando métodos em fase sólida automático, provendo assim um antígeno reproduzível de alta integridade e pureza.
[0063] Ainda, os antígenos da presente invenção podem ser expressos usando, por exemplo, um polinucleotídeo conforme descrito na SEQ ID NO: 1, ou um fragmento deste, como o fragmento que codifica a SEQ ID NO: 3, operacionalmente ligado a uma sequência de controle adequada em um vetor de expressão adequado para expressão em célula hospedeira, que pode ser, por exemplo, de bactérias, leveduras, insetos, plantas ou mamífero.
[0064] Ainda, também se contemplam que os antígenos da presente invenção pode ser um antígeno multiepítopo, compreendendo repetições da SEQ ID NO: 3 ligados por uma sequência linker. O número de repetições pode ser de 2 a 15, mais preferencialmente, de 3 a 10, ainda mais preferencialmente, de 4 a 10.
[0065] O polinucleotídeo deve ser operacionalmente ligado a um ou mais elementos regulatórios, formando um cassete de expressão. Os elementos regulatórios são conhecidos da arte, e compreendem um promotor, um enhancer, ou similares, para controle da expressão gênica de forma a permitir a expressão do polinucleotídeo de interesse no hospedeiro. É bem conhecido do técnico no assunto que o tipo de elemento regulatório pode variar dependendo do hospedeiro.
[0066] Em uma outra forma de concretização, o cassete de expressão pode ser inserido em uma variedade de vetores adequados, tais como, por exemplo, plasmídeos, fagos, vetores virais ou retrovirais. O técnico no assunto saberá o vetor mais adequado. Como exemplo ilustrativo, se o microrganismo for Escherichia coli, pode-se utilizar qualquer plasmídeo comercial adequado para este hospedeiro, como por exemplo o plasmídeo comercial pET28 (Novagen).
[0067] Os polinucleotídeos da invenção podem ser inseridos em um vetor que contenha marcadores de seleção de transformação, tais como genes de resistência a antibióticos.
[0068] Desta forma, um aspecto aqui reportado é um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, em que cada resíduo de aminoácido do polipeptídeo é codificado por um ou mais (pelo menos um) códon(s). O termo “aminoácido” denota o grupo α-aminoácidos que diretamente ou na forma de um precursor pode ser codificado por um ácido nucleico. Os aminoácidos individuais são codificados por ácidos nucleicos consistindo de três nucleotídeos, conhecidos como códons ou terno de bases. Cada aminoácido é codificado por pelo menos um códon. O fato do mesmo aminoácido ser codificado por diferentes códons é conhecido como “degeneração do código genético”. O termo “aminoácido”, como usado no presente pedido, denota os α-aminoácidos que ocorrem naturalmente, compreendendo alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[0069] O termo “códon” denota um oligonucleotídeo consistindo de três nucleotídeos que codifica um aminoácido definido. Devido à degeneração do código genético, a maioria dos aminoácidos é codificada por mais de um códon. Estes diferentes códons que codificam o mesmo aminoácido têm diferentes frequências relativas de uso nos diferentes organismos. Portanto, um aminoácido específico é codificado tanto por um códon exato ou por um grupo de diferentes códons. Da mesma forma, a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo pode ser codificada por diferentes ácidos nucleicos. Portanto, um aminoácido específico (resíduo) em um polipeptídeo pode ser codificado por um grupo de diferentes códons, cada um destes códons tendo uma frequência de uso dentro de uma determinada célula ou organismo.
[0070] Assim, um versado na técnica sabe que diferentes espécies podem demonstrar “uso de códon preferencial”. Como usado aqui, o termo "uso de códon preferencial" ou "códons preferenciais" é um termo da arte com referência aos códons de tradução de proteína que são usados com maior frequência em células de uma certa espécie, assim favorecendo um dentre poucos representativos dos códons possíveis codificando cada aminoácido. Por exemplo, o aminoácido treonina (Thr) pode ser codificado por ACA, ACC, ACG, ou ACT, mas em células de mamíferos, ACC é o códon mais comumente usado; em outras espécies, por exemplo, células de inseto, levedura, virus ou bactérias, diferentes códons Thr podem ser preferenciais.
[0071] Como um grande número de sequências gênicas de diferentes organismos está atualmente disponível, é possível calcular as frequências relativas de uso de códon nos diferentes organismos. Ilustrativamente, tabelas de uso de códons estão disponíveis em ’’Codon Usage Database”, em www.kazusa.or.jp/codon/ (Nakamura et al., 2000. Nucl. Acids Res. V. 28, p. 292) e em EMBOSS (The European Molecular Biology Open Software Suite (Rice et al., 2000. Trends Gen. v. 16, pp. 276-277).
[0072] É evidente que devido à degeneração do código genético e à possibilidade de uma variação na sequência de nucleotideos sem afetar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Desta forma, a presente invenção refere-se a qualquer ácido nucleico que codifica toda ou uma porção funcional das sequências de aminoácidos mostrados na SEQ ID NO: 2 ou na SEQ ID NO: 3.
[0073] O vetor ou cassete compreendendo a sequência de interesse da presente invenção é usado para introduzir estas sequências no hospedeiro, por métodos bem conhecidos na arte, como eletroporação ou choque térmico.
[0074] As técnicas de engenharia genética que podem ser utilizadas para reproduzir a presente invenção são técnicas rotineiramente utilizadas pelo técnico no assunto, incluindo, por exemplo, aqueles descritos em Sambrook e Russel, Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA. Alguns métodos são descritos nos Exemplos.
[0075] O suporte sólido pode ser sensibilizado com os antígenos ou anticorpos de captura usando uma variedade de técnicas conhecidas pelo técnico no assunto, que são amplamente descritos na arte. No contexto da presente invenção, o termo “sensibilização”, utilizado intercambiavelmente com o termo “imobilização”, se refere tanto à associação não covalente, tal como a adsorção, como à ligação covalente (que pode ser via uma ligação direta entre o antígeno e grupos funcionais sobre o suporte, ou pode ser uma ligação por meio de um agente de reticulação). Para este fim, o antígeno ou anticorpo de captura é dissolvido em um tampão adequado, aqui chamado de “tampão de solubilização”, que apresenta pH alcalino variando tipicamente de 7,0 a 10,0, mais preferencialmente em cerca de 9,0 a 10,0. Um exemplo é o tampão carbonato/bicarbonato, mas o técnico no assunto pode facilmente determinar outros tampões, de acordo com os diferentes protocolos conhecidos na arte. O tempo de contato do antígeno ou do anticorpo de captura com o suporte sólido varia com a temperatura, mas é tipicamente entre cerca de 1 hora a “overnight”, em temperatura variando de cerca de 2°C a cerca de 5°C.
[0076] Em uma outra concretização, na etapa de bloqueio da fase sólida, são usados agentes bloqueadores. A etapa de bloqueio bloqueia quaisquer sítios de ligação hidrofóbicos na fase sólida para evitar a ligação não específica de proteínas, portanto, reduzindo o sinal de fundo e/ou prevenindo resultados falso-positivos.
[0077] Exemplos de agentes bloqueadores incluem, mas não estão limitados a leite desnatado, caseína, BSA, ovoalbumina, gelatina, entre outros. O agente bloqueador é diluído em um tampão, por exemplo, tampão PBS, gerando a solução de bloqueio. Outros tampões da técnica podem ser utilizados. O pH da solução de bloqueio pode estar na faixa de 7,0 a 10,0, mais preferencialmente em torno de 7,0 a 9,0. O tempo de contato desta solução com o suporte sólido varia de cerca de 30 minutos a cerca de 6 horas, em temperatura variando de cerca de 25° C a cerca de 40° C, mais preferencialmente, cerca de 30° C a cerca de 40° C.
[0078] Em uma concretização adicional, uma vez realizado o bloqueio da fase sólida, esta é colocada em contato com a amostra de teste. Neste sentido, o método da presente invenção detecta indivíduos com esquistossomose via o uso de uma amostra biológica de um indivíduo que tenha sido potencialmente exposto a Schistosoma, mais especificamente, a Schistosoma mansoni. A amostra biológica pode ser qualquer amostra obtida do corpo que pode conter um agente de detecção. Tais amostras biológicas podem ser selecionadas do grupo incluindo sangue, soro, plasma, saliva, leite, colostro e urina. Preferencialmente, a amostra biológica é sangue, soro, urina e plasma.
[0079] Também é preferível que a amostra biológica seja obtida de indivíduos suspeitos de exposição a Schistosoma. Uma amostra biológica pode ser também modificada antes do uso, tal como por diluição, purificação em várias frações, centrifugação e semelhantes. Por exemplo, a amostra biológica contendo o primeiro agente de detecção pode ser usada na forma pura ou diluída em um tampão, como por exemplo, o tampão de bloqueio da etapa anterior.
[0080] Deve ser notado que uma amostra biológica pode ser isenta de um agente de detecção que pode interagir com Schistosoma. Isto ocorre quando o sujeito não foi exposto a Schistosoma.
[0081] Em uma concretização, a amostra biológica é aplicada a um suporte sólido sensibilizado com o antígeno de S. mansoni. A amostra biológica é deixada por um período de tempo suficiente e sob condições adequadas que permitam a formação estável de um complexo antígeno-anticorpo anti-Schistosoma. Tipicamente, a amostra biológica compreendendo ou não o anticorpo anti-Schistosoma permanece em contato com o suporte sólido por cerca de 30 minutos a cerca de 6 horas, em temperatura variando de cerca de 25° C a cerca de 40° C, mais preferencialmente, cerca de 30° C a cerca de 40° C.
[0082] Uma vez formado o complexo, um agente de detecção é adicionado para detectar a complexo formado entre o antígeno e o anticorpo anti-Schistosoma presente na amostra biológica.
[0083] O agente de detecção é diluído em um tampão, como por exemplo, o tampão de bloqueio utilizado anteriormente. Tipicamente, o agente de detecção permanece em contato com o suporte sólido por cerca de 30 minutos a cerca de 6 horas, em temperatura variando de cerca de 25° C a 40° C, mais preferencialmente, cerca de 30° C a cerca de 40° C.
[0084] Se houver uso de mais de um agente de detecção, eles são incubados na fase sólida separadamente.
[0085] Em uma outra concretização, um suporte sólido é sensibilizado com um anticorpo de captura anti-Schistosoma. A amostra biológica é misturada com agente de detecção (p.ex. um antígeno marcado) por um período de tempo suficiente e sob condições adequadas que permitam a formação estável de um complexo antígeno-agente de detecção. Esta mistura é aplicada a um suporte sólido sensibilizado com um anticorpo de captura anti-Schistosoma. A amostra biológica é deixada por um período de tempo suficiente e sob condições adequadas que permitam a formação estável de um complexo agente de detecção-anticorpo de captura, nas mesmas condições acima.
[0086] Em qualquer forma de concretização acima mencionadas, entre as etapas, o suporte sólido é lavado com tampão em pH neutro, variando tipicamente de 7,0 a 7,4, por exemplo, PBS, para evitar a ligação inespecífica e, assim, reduzir o sinal de fundo.
[0087] O técnico no assunto irá saber como selecionar agentes de detecção para o complexo antígeno-anticorpo. Um agente de detecção pode ser, mas não está limitado a uma molécula química, uma molécula de peptídeo, uma molécula de proteína, uma molécula de RNA, uma molécula de DNA, um anticorpo poli ou monoclonal, um fragmento de um anticorpo contendo um sítio de ligação a antígeno, um anticorpo recombinante contendo um sítio de ligação a antígeno.
[0088] Um agente de detecção comumente utilizado compreende polipeptídeos A, G, L, A/G que se ligam a anticorpos. Estes polipeptídeos podem se ligar à região conservada do anticorpo. Ainda outros agentes de detecção comumente utilizados é avidina ou estreptavidina, que podem se ligar a anticorpos ou polipeptídeo biotinilados. Outro agente de detecção mais comumente utilizado é um anticorpo. Anticorpos anti-imunoglobulina humana pode ser um anticorpo contra IgA, IgE, IgG ou IgM humanos. Em uma concretização preferida, o anticorpo é um anticorpo anti-IgG humano.
[0089] O técnico no assunto sabe que há uma variedade de métodos de marcação para um agente de detecção. Os métodos de marcação incluem, mas não estão limitados a, uma enzima como peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), beta-galactosidase ou outras enzimas. Um agente de detecção também pode ser marcado com isótopos radioativos de iodo ou outros isótopos. Um agente de detecção também pode ser marcado com um fluorocromo (um corante fluorescente) que pode ser detectado por um microscópio de fluorescência ou fluorômetro, escâner ou câmera. Alternativamente, um agente de detecção pode ser marcado por biotina, que pode se ligar à avidina ou estreptavidina.
[0090] A detecção do complexo antígeno :: anticorpo pode ser baseada em um método conhecido na arte. O técnico no assunto conhece os diferentes sistemas de detecção usados em ELISA e que podem ser aplicados aos métodos da invenção aqui descritos. Estes sistemas de detecção incluem, mas não estão limitados a sistemas de detecção usando reações cromogênicas ou enzimas repórteres como peroxidase de rábano (HRP) e fosfatase alcalina (AP). As enzimas repórteres podem usar diferentes substratos para detecção cromogênica. Por exemplo, HRP pode usar OPD (ortofenilenediamina), 4CN (4-cloro-1-naftol), DAB/NiCl2 (3,3’-diaminobenzidina/NiCl2), ou TMB como substratos para a detecção cromogênica.
[0091] No caso de um ELISA indireto, um resultado negativo define-se como ausência de sinal emitido pelo agente de detecção marcado, comparável a um controle negativo (por exemplo, um material biológico provindo de um indivíduo que não foi exposto à Schistosoma). Ao contrário, um nível de sinal emitido pelo agente de detecção marcado acima do controle é indicativo de infecção por Schistosoma.
[0092] No caso de um ELISA competitivo, um resultado negativo define-se como presença de sinal emitido pelo agente de detecção marcado, comparável a um controle negativo (por exemplo, um material biológico provindo de um indivíduo que não foi exposto à Schistosoma). Ao contrário, um nível de sinal emitido pelo agente de detecção marcado abaixo do controle é indicativo de infecção por Schistosoma.
[0093] Nos métodos da presente invenção, o técnico no assunto sabe das modificações a serem realizadas para melhorar a razão de sinal / sinal de fundo. Estas modificações incluem, mas não estão limitadas, a adicionar uma ou múltiplas etapas ao método descrito acima.
[0094] Em outro aspecto, é provido um kit compreendendo um ou mais componentes úteis para realizar um ELISA e instruções para usar o kit. Por exemplo, tais instruções podem incluir um ou mais componentes para realizar o método. Por exemplo, o kit pode compreender controle negativo e/ou positivo, agente(s) de detecção, e quaisquer outros reagentes necessários para a condução do método de diagnóstico aqui descrito.
[0095] A presente invenção é descrita pelos exemplos não limitantes abaixo, que são meramente ilustrativas. Várias modificações e variações das concretizações são evidentes ao técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.
[0096] 13.273 transcritos de S. mansoni foram obtidos do banco SchistoDB 2.0 (Zerlotini et al. Nucleic Acids Res. 2009; 37: 579-582). Os dados de expressão proteica correspondentes a diferentes estágios do ciclo de vida do parasita no hospedeiro humano, incluindo ovo, esquistôssomulo, esquistôssomulo pulmonar e verme adulto foram obtidos e armazenados para a realização das predições computacionais.
[0097] Adicionalmente foram obtidos os proteomas de H. sapiens e M. musculus do banco de dados do NCBI (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/), com 32.799 e 28.871 sequências de proteínas, respectivamente.
[0098] Todas as proteínas de S. mansoni foram triadas para epítopos de células B e TCD4+. Para a predição de epítopos de célula B, foram utilizados BepiPred 1.0 (Larsen et al., Immunome Res. 2006; 2: 2), AAP12 (Chen et al., Amino Acids. 2007; 33: 423-428) e BCPred12 (EL-Manzalawy et al., J Mol Recognit JMR. 2008; 21: 243-255); e para a predição de epítopos de TCD4+, foi usado NetMHCII 2.2 [Nielsen et al.; BMC Bioinformatics. 2009; 10: 296), que prediz a afinidade de epítopos a diferentes alelos. Todos os alelos disponíveis nessa versão do programa foram utilizados. Além disso, todos os programas para predição de epítopos foram utilizados com os parâmetros default.
[0099] Esta análise foi baseada na predição consenso obtida pelos seguintes algoritmos: DisEMBL (Linding et al., Structure. 2003; 11: 14531459), GlobPlot [Linding et al.; Nucleic Acids Res. 2003; 31: 3701-3708), IUPred (Dosztányi et al.; J Mol Biol. 2005; 347: 827-839), e VSL2B [Peng et al.; BMC Bioinformatics. 2006; 7: 208). A região de uma proteína foi considerada desordenada quando 40 ou mais aminoácidos consecutivos foram preditos como desordenados, uma vez que se demonstrou que a acurácia de predição foi maior em regiões desordenadas mais longas [Pengfei et al;. BMC Bioinformatics. 2009; 10: (Suppl 1) S42). Esses programas foram empregados de acordo com metodologia descrita e validada por Ruy et al.; BMC Genomics.2014; 15(1):1100.
[00100] Os seguintes algoritmos foram utilizados: Sigcleave (von Heijne G. Nucleic Acids Res. 1986; 14: 4683-4690), TargetP 1.1 (Emanuelsson et al.; J Mol Biol. 2000; 300: 1005-1016) e SignalP 4.0 (Emanuelsson et al.; J Mol Biol. 2000; 300: 1005-1016), para verificar a presença de peptídeos sinais; TMHMM 2.0 (Krogh et al., J Mol Biol. 2001; 305: 567-580; Sonnhammer et al., Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 1998; 6: 175-182) para verificar domínios transmembranas; e SherLoc2 (Briesemeister et al.; J Proteome Res. 2009; 8: 5363-5366) para verificar a localização subcelular. Para a identificação de peptídeo sinal pelo programa Sigcleave, foi utilizado o parâmetro “-send 70” para verificar a presença de peptídeo sinal nos primeiros 70 resíduos de aminoácido de cada proteína, considerando a porção N-terminal. Para o programa TMHMM, foi utilizado o parâmetro “-short” (relatório em uma única linha para cada proteína). O programa SheLoc2 foi utilizado com parâmetros default. Foram excluídos das análises os peptídeos presentes em regiões preditas como peptídeo sinal, por não estarem presentes na proteína madura, e também regiões preditas pelo TMHMM como regiões intracelulares ou embebidas na membrana plasmática.
[00101] O algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al;. J Mol Biol. 1990; 215: 403-410) foi utilizado para realizar as buscas por similaridade de sequências de alvos diagnósticos pré-selecionados de S. mansoni contra proteínas humanas preditas. Esta análise é necessária para evitar reação cruzada com o organismo hospedeiro. Proteínas com mais de 60% de similaridade com proteínas humanas foram excluídas como potenciais alvos. Após a seleção de peptídeos específicos, foi feita uma nova busca por similaridade de sequências para evitar peptídeos com 100% de similaridade com peptídeos humanos. Para as buscas, os parâmetros utilizados no programa blastp foram: “-e 0.000001”, “-v 10”, “-b 10”, “-F F”.
[00102] Todas as predições descritas nos exemplos anteriores foram realizadas em servidores locais e carregadas no fluxo de trabalho analítico-computacional desenvolvido para selecionar potenciais antígenos de diagnóstico. Para possibilitar a integração dos resultados e a extração da informação, um banco de dados relacional foi desenvolvido, ficando hospedado nos servidores locais (Fig. 1A). A primeira etapa envolveu a seleção de proteínas com peptídeos sinal, conforme predito por Sigcleave, TargetP 1.1 ou SignalP. Em seguida, foi utilizado o algoritmo BLAST para excluir proteínas com mais de 60% de similaridade com o proteoma predito humano. Após essas análises, foram selecionadas as proteínas com pelo menos um epítopo de célula B linear predito por BepiPred 1.0, BCPreds e AAP12. Epítopos com escores de predição acima de 1,0 desses três preditores foram escolhidos. As proteínas contendo os epítopos preditos foram subsequentemente submetidas à predição de localização subcelular com SherLoc2 e avaliadas quanto a domínios transmembranas com TMHMM 2.0. Proteínas alvo preditas no compartimento extracelular ou na membrana plasmática foram selecionadas. Estas proteínas alvo foram analisadas quanto à presença de epítopos de células T CD4 + com afinidade por pelo menos 13 (e no máximo 17) alelos MHCII preditos pelo NetMHCII 2.2. Finalmente, a fim de utilizar as informações referentes aos estágios do ciclo de vida do parasita no hospedeiro definitivo, duas estratégias diferentes foram aplicadas. Na primeira, foram selecionadas proteínas preditas como simultaneamente expressas em esquistossômulo, esquistossômulo pulmonar, verme adulto e ovo. Na segunda, as proteínas expressas simultaneamente em todos os estágios acima, exceto ovo, foram escolhidas.
[00103] Os dados do proteoma predito de S. mansoni, dos estágios do ciclo de vida do parasita e de todas as predições realizadas foram automaticamente integradas no banco de dados relacional MySQL (Fig 1B). Esse banco foi desenvolvido para extrair informação biologicamente relevante relacionada com alvos diagnósticos usando o fluxo de análise descrito anteriormente.
[00104] A síntese de peptídeos personalizados foi realizada utilizando a informação de sequência dos epítopos preditos das proteínas selecionadas pelo fluxo descrito acima.
[00105] A estratégia da seleção de peptídeos baseou-se nos seguintes passos: a) sequências preditas como epítopos lineares de células B por AAP12 e BCPreds com um escore de pelo menos 1, e por BepiPred 1.0 com um escore de pelo menos 1,5; b) se as análises falharam em encontrar um peptídeo, uma segunda busca foi realizada considerando apenas AAP12 e BepiPred 1.0, e os mesmos escores descritos acima; e c) se nenhum epítopo foi encontrado ainda, os escores de corte foram alterados para pelo menos 0,9 para AAP12 e pelo menos 1 para BepiPred 1.0.
[00106] Após a finalização da seleção, foi realizado um passo de filtragem adicional, removendo epítopos com as seguintes características: a) localizados nas regiões de peptídeos sinais preditos; b) localizados nas regiões dos domínios transmembrana preditos; e c) preditos como idêntico aos epítopos humanos.
[00107] Na etapa final, foram selecionados preferencialmente os epítopos contendo IDRs em sua vizinhança e preditos por BCPreds, mesmo com um escore mais baixo. Após a seleção dos epítopos, foram realizadas buscas por similaridade de sequências usando o programa BLAST dos peptídeos selecionados contra o proteoma predito do hospedeiro e todas as proteínas do Ancylostoma ceylanicum; A. duodenale; Ascaris lumbricoides; Enterobius vermicularis; Hymenolepis nana; Necator americanus; Taenia solium; T. saginata; Trichuris trichiura, disponíveis na base de dados do NCBI, a fim de evitar peptídeos similares.
[00108] Peptídeos selecionados foram sintetizados artificialmente, usando sintetizador PS3TM (Protein 241 Technologies, Inc) por síntese química em fase sólida usando estratégia Fmoc, seguida de clivagem como descrita por Chan & White (Chan & White, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach. Editora Oxford University Press, 2000), e purificadas por cromatografia líquida de alta performance. Alternativamente, os peptídeos foram sintetizados pela empresa Genescript com pureza maior que 90%. Todos os peptídeos foram diluídos em DMSO (dimetil sulfóxido) a uma concentração de 1 μg/μL e estocados a -70 °C.
[00109] Soros de 58 indivíduos (feminino/masculino: 24/34) de uma área de baixa endemicidade para a infecção por S. mansoni (Pedra Preta, Minas Gerais, Brasil) e soro de 13 indivíduos doadores saudáveis (grupo HD) (feminino/masculino: 06/07) que não viviam em uma área endêmica para esquistossomose foram utilizados. A prevalência determinada por exame de duas lâminas de Kato-Katz, que é recomendado pelo Ministério da Saúde Brasileira para determinar infecção, foi de 8% com uma carga de parasita média de 40.6 opg. No entanto, uma positividade de 35.8% foi verificada quando as amostras de fezes foram analisadas usando as técnicas de Kato-Katz (18 lâminas) e TF-Teste® (Siqueira et al.; Mem Inst Oswaldo Cruz. 2015; 110: 209-214). Indivíduos co-infectados com Ascaris lumbricoides, Thricuris trichiura, ancilostoma, Taenia sp, Hymenolepis nana e Enterobius vermiculares foram observados nesta área endêmica, mas nesta avaliação, apenas soro de indivíduos monoinfectados por S. mansoni foram usados, antes e depois do tratamento.
[00110] A discriminação de amostras de soros negativos (grupo NEG) e positivos (grupo INF) de indivíduos de áreas endêmicas foi realizada de acordo com a metodologia parasitológica e molecular descrita por Siqueira et al (Siqueira et al.; Mem Inst Oswaldo Cruz. 2015; 110: 209-214). Resumidamente, cada participante forneceu quatro amostras separadas de fezes em cada um dos quatro dias consecutivos para uso com a técnica de Kato-Katz (Katz et al., Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1972;14: 397-400), TF-Teste® (Gomes et al.; J Clin Lab Anal. 2004; 18: 132-138; Siqueira et al.; Mem Inst Oswaldo Cruz. 2011; 106: 844-850) e PCR-ELISA (Gomes et al.; PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4). Amostras de soro dos indivíduos foram obtidas após a centrifugação de amostras de sangue a 3000g por 5 minutos. Estas amostras foram mantidas a -20°C até o momento de uso. Amostras de soro de 26 indivíduos infectados por S. mansoni e de 25 indivíduos de área endêmica com exame de fezes negativo foram avaliadas.
[00111] Todos os participantes com exame de fezes positivo para esquistossomose determinado por métodos parasitológicos foram tratados com praziquantel em uma dose única de 60mg/Kg para crianças e 50mg/Kg para adultos, como recomendado pelo Ministério da Saúde brasileiro. Os soros foram obtidos 30 e 180 dias após o tratamento (grupos 30DPT e 180DPT); nestes pontos as fezes também foram coletadas. A taxa de cura foi determinada pelo exame de 18 lâminas Kato-Katz e TF-Teste®. Dezessete e nove amostras de soro foram avaliados 30 e 180 dias após o tratamento, respectivamente. Algumas amostras de soro eram de indivíduos previamente avaliados no grupo infectado.
[00112] O ensaio de ELISA foi primeiramente padronizado utilizando 1 ou 2μg/ml de peptídeo sintético incubado com pool de soro de indivíduos pertencentes ao grupo de doadores saudáveis; grupo negativo ou grupo infectado em diluição serial em PBS Tween (PBS 150mM contendo 0.05% de Tween 20), começando de 1:20 e terminando em 1:1.280. O conjugado foi avaliado em uma diluição de 1:60.000 (IgG-HRP anti-humano, Sigma-Aldrich). Após a padronização, o ensaio foi realizado em placas de fundo chato (Maxisorp NUNC®) sensibilizadas com 100μl/poço de tampão carbonato bicarbonato 0.05M, pH 9.6, contendo peptídeo na concentração de 1μg/mL, e incubadas por aproximadamente 16 horas a 4°C. Para remover as proteínas não ligadas, as placas foram lavadas 3X com PBS 150mM contendo 0.05% de Tween 20 (PBSTween) e bloqueadas com PBS Tween 20 + 10% de soro fetal bovino por 2 horas à 37°C. Os soros de indivíduos foram diluídos 1:320 em PBSTween. Estes soros foram adicionados (100 μl/poço) às placas e incubados por 2 horas à 37°C. Após lavagem das placas (3x), um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado à peroxidase (Sigma Aldrich) foi utilizado na diluição 1:60.000 em PBSTween, por uma hora à 37°C. Após três lavagens, a reação foi revelada por 10 minutos com 100μL tetrametilbenzidina (TMB) e interrompida com 50μL de ácido sulfúrico 4N. A densidade ótica foi então determinada em leitor automático de ELISA (Multiskan - Thermo Scientific), utilizando-se filtro de comprimento de onda de 450nm.
[00113] A proteína predita Smp_150390.1 (SEQ ID NO: 2) é expressa em esquistossômulo, esquistossômulo pulmonar e verme adulto, e não apresenta nenhuma similaridade com proteínas do hospedeiro e de outros helmintos. Um fragmento desta proteína, aqui descrito como SEQ ID NO: 3, foi quimicamente sintetizado e empregado em ensaios ELISA contra soro humano dos seguintes grupos experimentais: HD, NEG, INF, 30DPT e180DPT, como descrito no Exemplo 3.
[00114] Uma reatividade de IgG significante contra o peptídeo de SEQ ID NO: 3 foi observado no grupo de indivíduos infectados por S. mansoni em comparação com doadores saudáveis. Níveis significantes de IgG também foram observados no grupo infectado quando comparado com indivíduos de área endêmica com exame negativo de fezes (Fig. 2). Uma redução significativa na reatividade do soro foi observada nos grupos 30DPT e 180DPT (Fig. 2).
[00115] A especificidade do ensaio ELISA foi de 100%, enquanto que a sensibilidade foi de 96,15%, utilizando o peptídeo de SEQ ID NO: 3, quando o ponto de corte foi determinado usando os dados de doador saudável e de grupo infectado. Resultados similares foram observados quando o ponto de corte foi determinado usando os dados de indivíduos não infectados de área endêmica. Além disso, o peptídeo de SEQ ID NO: 3 foi capaz de diferenciar soros de indivíduos de uma área de baixa endemicidade antes e depois do tratamento.
[00116] Estes resultados surpreendentes demonstram que um teste ELISA usando este SEQ ID NO: 2, ou fragmentos desta, como SEQ ID NO: 3, têm ótimo potencial para ser utilizado no controle de cura após tratamento e em inquéritos epidemiológicos.
[00117] O software GraphPad Prism 4.0 (San Diego, CA, USA) foi utilizado para análise estatística. O teste de Kruskall-Wallis seguido pelo de comparações múltiplas de Dunn’s foram utilizados nas amostras que não apresentaram distribuição normal. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 4.0 (San Diego, Ca, USA). Curvas de Características de Operação do Receptor (Curvas ROC - Receiver Operating Characteristic) foram utilizadas para calcular a sensibilidade, especificidade e os pontos de corte entre grupos infectados e doadores saudáveis ou entre grupos infectados e não infectados de área endêmica. Valores preditivos positivos (PPV) e Valores Preditivos Negativos (NPV) foram determinados pela seguinte formula PPV=número de positivos verdadeiros/(número de positivos verdadeiros + número de falso positivos); NPV= número de negativos verdadeiros /(número de negativos verdadeiros + número de falso negativos).
[00118] É evidente que os exemplos acima foram apresentados apenas em caráter ilustrativo, e que modificações e variações dos mesmos, óbvias para os técnicos no assunto, são consideradas como inclusas no escopo da presente invenção, tal como definida nas reivindicações a seguir.
Claims (17)
- Método para detectar anticorpos contra Schistosoma em um indivíduo, o método caracterizado por compreender as etapas de:
- (i) contatar uma amostra biológica do dito indivíduo a um antígeno compreendendo SEQ ID NO: 2, ou um fragmento do mesmo; e
- (ii) detectar a ligação do referido antígeno com um anticorpo anti-Schistosoma na amostra biológica, usando um agente de detecção, assim detectando infecção por Schistosoma no dito indivíduo.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento compreende a SEQ ID NO: 3.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno apresenta pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 3.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno compreende de 2-15 repetições de SEQ ID NO: 3.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a amostra biológica é selecionada do grupo consistindo de sangue, soro, plasma, saliva, leite, colostro e urina.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno é ligado, conjugado ou imobilizado sobre ou a um suporte sólido.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno é misturado à amostra biológica.
- Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é selecionado do grupo que consiste de placa de microtitulação, membranas, microesferas, partícula magnética ou fibra de sensor óptico.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de detecção é um anticorpo marcado.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de detecção é um antígeno marcado.
- Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o agente de detecção é marcado com um marcador selecionado de uma enzima, um radioisótopo, um grupo fluorescente, um grupo luminescente, biotina, estreptavidina, ou partículas de corante.
- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de comparar o nível de anticorpos específicos para o antígeno em uma amostra teste com o nível de anticorpos em uma amostra controle não infectada, em que o nível de anticorpos específicos para o antígeno compreendendo SEQ ID NO: 2 ou um fragmento do mesmo acima do controle é indicativo de infecção por Schistosoma.
- Kit para detecção de infecção por Schistosoma em uma amostra biológica de um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender o antígeno compreendendo SEQ ID NO: 2, ou um fragmento do mesmo, um conjunto de controles positivo e negativo e instruções de uso.
- Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento compreende a SEQ ID NO: 3.
- Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender ainda pelo menos um agente de detecção marcado.
- Uso do antígeno compreendendo SEQ ID NO: 2 ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um kit para detecção de esquistossomose a partir de uma amostra biológica de um indivíduo, ou em um método para detectar anticorpos contra Schistosoma em um indivíduo.
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