ES2600253T3

ES2600253T3 - Uso de tensioactivos catiónicos para la inactivación de toxinas

Info

Publication number: ES2600253T3
Application number: ES09756735.8T
Authority: ES
Inventors: Abdul Gaffar; Xavier Rocabayera Bonvila
Original assignee: VEDEQSA Inc
Current assignee: VEDEQSA Inc
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2009-11-20
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2029-11-20
Also published as: EP2346501B1; US20110230558A1; AR074274A1; EP2346501A1; WO2010057966A1

Abstract

Uso de un tensioactivo cationico derivado de la condensacion de acidos grasos y aminoacidos dibasicos esterificados, de acuerdo con la siguiente formula (1):**Fórmula** en la que X- es un contraion derivado de un acido organico o inorganico, preferentemente Br-, Cl- o HSO4 -10 , o un anion a partir de un compuesto fenolico; R1: es una cadena de alquilo lineal de un acido graso saturado o un acido hidroxilico que tiene de 8 a 14 atomos de carbono unidos al grupo α-aminoacido a traves de un enlace amidico; R2: es una cadena de alquilo lineal o ramificada de 1 a 18 atomos de carbono o un grupo aromatico; R3: es -NH3 **Fórmula** o **Fórmula** donde n es de 0 a 4, para la inactivacion de endotoxinas (lipopolisacaridos, LPS) liberadas por bacterias gramnegativas, exotoxinas o aflatoxinas en productos alimentarios y bebidas.

Description

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DESCRIPCION

Uso de tensioactivos cationicos para la inactivacion de toxinas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al uso de agentes tensioactivos cationicos con propiedades antimicrobianas como agentes para la inactivacion de las toxinas

Tecnica anterior

Las endotoxinas son macromoleculas complejas que contienen Kpidos, hidratos de carbono y protemas. Se encuentran principalmente en la superficie de los organismos gramnegativos y se refieren generalmente como lipopolisacaridos (LPS). Estas macromoleculas son toxicas para el huesped y pueden ser fatales. Por ejemplo, pueden causar inflamacion, shock hipotensor grave y provocar diversas reacciones toxicas en el cuerpo. A veces se libera LPS a partir de bacterias que se estan muriendo o bien a traves de la accion del sistema de defensa natural del cuerpo o debido a la administracion de antibioticos (Holzheimer, R. G., 2001: J. Chemother. 13:159-172).

Los agentes antimicrobianos todavia representan el tratamiento mas importante de las reacciones toxicas inducidas por endotoxinas, pero son insuficientes, ya que no hay tratamiento eficaz neutralizante de las endotoxinas que inactiven y secuestren el LPS.

Recientemente, las lipopoliaminas han demostrado resultados prometedores para la neutralizacion de endotoxinas. Las lipopoliaminas son moleculas anfifilicas policationicas utilizadas originalmente como agentes de transfeccion de ADN. Estos agentes se unen y neutralizan el LPS con afinidad comparable a la polimixina B, un antibiotico peptidico policationico de origen microbiano, que es uno de los neutralizantes de LPS mas potentes, pero tiene una toxicidad significativa (David, S.A., 2001: J. Mol. Recognit. 14, 370-387; Jerala, R. & Porro, M., 2004. Curr.Top.Med.Chem. 4.1173-1184). La solicitud de patente de Estados Unidos 2007/0238655 describe el uso de la terapia de gelsolina para la prevencion de la mortalidad inducida por LPS.

La solicitud de patente de Estados Unidos 2007/0287750 describe ciertas sulfonamidas policationicas lipofilicas que desactivan el LPS. Sin embargo, estos compuestos tambien inducen la lisis de los globulos rojos y tienen una utilidad limitada in vivo. Los lipopeptidos para endotoxinas neutralizantes se divulgan en la solicitud de patente de Eslovenia SI 20877A. Los peptidos antimicrobianos para endotoxinas neutralizantes se describen en el documento WO 2001/92290A2. Este documento se refiere al peptido gomesina con 18 residuos de 18 que posee actividad para lisar los globulos rojos. El uso de agentes antimicrobianos, tales como taurolidina, se describe en el documento WO 99/34805A2. Estas sustancias antimicrobianas desactivan endotoxinas mediante la liberacion de formaldehido que es toxico. Otros agentes de union a endotoxinas basada en peptidos basados en protegrina se dan a conocer en el documento WO 97/18826A1. De manera similar, la protegrina de origen natural para neutralizar la endotoxina de bacterias gramnegativas se describen en Journal of Infeccion and Chemotherapy 1997, Vol. (1), pag. 27-32 de Sawada, H.

La tecnica anterior describe agentes para la union e inactivacion de endotoxinas que tienen varias deficiencias para su uso en alimentos, cosmeticos, bebidas y preparaciones farmaceuticas. La mayoria de ellos inducen la lisis de los globulos rojos, liberan subproductos toxicos o son caros de fabricar. Por lo tanto, hay un gran interes en la obtencion de nuevos agentes para inactivar endotoxinas que superen las desventajas de estas sustancias.

Otros productos toxicos excretados por los microorganismos son exotoxinas y aflatoxinas. Con estos tipos de toxinas existe la misma situacion insatisfactoria de no tener las herramientas para la inactivacion de estos productos.

Una exotoxina es una proteina soluble excretada por un microorganismo, incluyendo bacterias, hongos, algas y protozoos. Una exotoxina puede causar danos en el huesped mediante la destruccion de celulas o la interruption del metabolismo celular normal. Las bacterias gramnegativas, asi como las bacterias grampositivas, producen exotoxinas. Son muy potentes y pueden causar danos importantes en el huesped. Las exotoxinas pueden ser secretadas, o, de forma similar a las endotoxinas, puede liberarse durante la lisis de la celula.

La mayoria de las exotoxinas se pueden destruir por calentamiento. Pueden ejercer su efecto localmente o producir efectos sistemicos. Las exotoxinas bien conocidas incluyen la toxina botulinica producida por Clostridium botulinum y la exotoxina de Corynebacterium diphtheriae que se produce durante los sintomas potencialmente mortales de difteria.

Las exotoxinas son susceptibles a los anticuerpos producidos por el sistema inmunologico, pero muchas exotoxinas son tan toxicas que pueden ser mortales para el huesped antes de que el sistema inmunologico tenga la oportunidad de montar defensas contra ellas.

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Las aflatoxinas son micotoxinas de origen natural que son producidas por muchas especies de Aspergillus, un hongo, especialmente Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus. Las aflatoxinas son toxicas y se encuentran entre las sustancias mas carcinogenicas conocidas. Despues de entrar en el cuerpo, las aflatoxinas son metabolizadas por el higado en un intermedio reactivo, la aflatoxina Mi, un epoxido.

Los tensioactivos cationicos se conocen como conservantes utilizados en la industria alimentaria, cosmetica y farmaceutica. Los tensioactivos cationicos han resultado ser muy eficaces contra la proliferacion microbiana y, al mismo tiempo, seguros para el consumo por seres humanos y mam^feros en general. Por todo esto, los tensioactivos cationicos son una herramienta atractiva en la industria.

Se ha demostrado que los tensioactivos cationicos segun la formula (1) derivados de la condensacion de acidos grasos y aminoacidos dibasicos esterificados son sustancias protectoras altamente eficaces contra microorganismos.

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en la que:

X- es un contraion derivado de un acido organico o inorganico, preferentemente Br-, Cl- o HSO4-, o un anion a partir de un compuesto fenolico.

Ri: es una cadena de alquilo lineal de un acido graso saturado o acido hidroxilico que tiene de 8 a 14 atomos unidos al grupo a-aminoacido a traves de un enlace amidico.

R2: es una cadena de alquilo lineal o ramificada de 1 a 18 atomos de carbono o un grupo aromatico;

R3: es

—NH3

o

donde n es de 0 a 4.

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Los acidos organicos que pueden ser la fuente del contraion X- puede ser acido citrico, acido lactico, acido acetico, acido fumarico, acido maleico, acido gluconico, acido propionico, acido sorbico, acido benzoico, acido carbonico, acido glutamico u otros aminoacidos, acido laurico y acidos grasos tales como acido oleico y acido linoleico, mientras que los acidos inorganicos pueden ser acido fosforico, acido nitrico y acido tiocianico.

El compuesto fenolico que puede ser la base del anion X- es, por ejemplo, hidroxianisol butilado (BHA) y el hidroxitolueno butilado relacionado, hidroquinona de butilo terciario y parabenos, tales como metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno y butilparabeno.

El compuesto mas preferido de la clase anterior de compuestos es el ester etilico de la lauramida del monoclorhidrato de arginina, en lo sucesivo denominado LAE (n.° CAS 60372-77-2). Este compuesto es ahora bien

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conocido por su uso como agente antimicrobiano. En el uso practico, el LAE resulto ser bien tolerado y mostrar una toxicidad muy baja para los seres humanos. El LAE tiene la estructura quimica de formula (2) mostrada a continuacion en el presente documento.

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El compuesto LAE es notable por su actividad contra diferentes microorganismos, como bacterias, mohos y levaduras, que pueden estar presentes en los productos alimentarios (documento WO 03/034842) y tambien en formulaciones y preparaciones cosmeticas (documentos WO 03/013453, WO 03/013454 y WO 03/043593). El compuesto se ha descrito, ademas, por su efecto sobre los parasitos en los peces, tales como en las larvas de Anisakis o de otras especies (solicitud europea 07 382 004,5). Su accion conservante es particularmente pronunciada en una combinacion con un fungicida de polieno, tal como natamicina (PCT/EP2007/060598). Ademas, se ha demostrado que es eficaz para matar las endosporas y que tiene un efecto en las infecciones por virus (solicitud europea 08 382 025.8). Se ha descrito el uso especifico para la proteccion de los dientes contra la erosion dental (solicitud europea 08 382 007,6).

La preparacion general de los tensioactivos cationicos se describe en la patente espanola ES 512.643 y las solicitudes de patente internacional WO 96/21642, WO 01/94292 y WO 03/064669.

LAE, tambien conocido como arginato laurico, esta fabricado por Laboratorios Miret, S.A. (LAMIRSA, Espana). El arginato laurico aparece en las listas de la FDA (Food and Drug Administration) como una sustancia GRAS (generalmente reconocida como segura) como GRN 000164. El USDA ((Departamento de Agricultura de los Estados Unidos) ha aprobado su uso en productos carnicos y avicolas (Directiva del FSIS 7120.1) y tambien como ayuda del procesamiento para productos carnicos y avicolas frescos.

Se ha estudiado el metabolismo del tensioactivo cationico anterior de formula (2) en ratas; estos estudios han demostrado una rapida absorcion y metabolizacion en aminoacidos de origen natural y el acido laurico acido graso, que, finalmente, son excretados como dioxido de carbono y urea. Los estudios toxicologicos han demostrado que el LAE es completamente inofensivo para los animales y los seres humanos.

Por lo tanto, el LAE y los compuestos relacionados son particularmente adecuados para su uso en la conservacion de todos los productos alimenticios perecederos. El LAE y los compuestos relacionados son igualmente adecuados para su uso en productos cosmeticos o medicos y en dispositivos medicos, en los que el crecimiento de microorganismos es frecuente.

Como se ha senalado anteriormente, los tensioactivos cationicos son notables por su accion inhibidora sobre la proliferacion de diferentes microorganismos, tales como bacterias, hongos y levaduras. Las concentraciones inhibitorias minimas de LAE se muestran en la tabla 1 siguiente.

Tabla 1

Tipo: Microorganismo CMI (ppm)

: Arthrobacter oxydans ATCC 8010 64

: Bacillus cereus var mycoide ATCC 11778 32

: Bacillus subtilis ATCC 6633 16

: Clostridium perfringens ATCC 77454 16

Bacterias Gram+: Listeria monocytogenes ATCC 7644 10

: Staphylococcus aureus ATCC 6538 32

: Micrococcus luteus ATCC 9631 128

: Lactobacillus delbrueckii ssp lactis CECT 372 16 32

: Leuconostoc mesenteroides CETC 912

: Alcaligenes faecalis ATCC 8750 64

Bacterias Gram-: Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 128

Citrobacter freundii ATCC 22636: 64

: Enterobacter aerogenes CECT 689 32

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: Escherichia coli ATCC 8739 32

: Escherichia coli 0157H7 20

: Klebsiella pneumoniae var pneumoniae 32

: CECT 32

: 178 64

: Proteus mirabilis CECT 170 32

: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 32

: Salmonella typhimurium ATCC16028 2

: Serratia marcenses CECT 274

: Mycobacterium phlei ATCC 41423

: Aspergillus niger ATCC14604 32

: Aureobasidium pullulans ATCC 9348 16

Hongos: Gliocadium virens ATCC 4645 32

Chaetonium globosum ATCC 6205: 16

: Penicillium chrysogenum CECT 2802 128

: Penicillium funiculosum CECT 2914 16

: Candida albicans ATCC 10231 16

Levadura: Rhodotorula rubra CECT 1158 16

: Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 32

Se prefiere disolver el compuesto directamente antes de su uso en uno de los siguientes disolventes preferidos de calidad alimentaria: agua, etanol, propilenglicol, alcohol isopropNico, otros glicoles, mezclas de glicoles y mezclas de glicoles y agua, diacetina, triacetina, glicerol, sorbitol, manitol y xilitol. Si el tratamiento se lleva a cabo a un valor de pH especifico, el uso de una solucion tampon correspondiente puede ser recomendable. Por otro lado, el compuesto puede usarse facilmente en su forma solida o formularse con vehiculos solidos tales como sal, azucar, maltodextrina, hidrocoloides y sorbitol.

Para los agentes tensioactivos cationicos de la formula anterior (1), la actividad antibacteriana y la actividad biologica contra otros microorganismos tales como hongos y levaduras estan bien documentadas.

Sumario de la invencion

La materia sujeto que no esta abarcada por el alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invencion reivindicada en el presente documento.

Es el objeto de la presente invencion es proporcionar un nuevo metodo para la inactivacion de los efectos de las toxinas en los productos alimentarios y bebidas y sobre las superficies de los equipos medicos.

Mas en particular, es el objeto de la presente invencion proporcionar un nuevo metodo para la inhibition de endotoxinas (LPS) liberadas de bacterias Gramnegativas con el fin de reducir o mitigar los danos causados por LPS en los animales y los seres humanos que ingieren productos alimentarios o bebidas que estan contaminadas con endotoxinas, o que han estado en contacto con las superficies de los equipos medicos que estan contaminadas.

Es el objeto adicional de la presente invencion es proporcionar un nuevo metodo para la inhibicion de exotoxinas y aflatoxinas en los productos alimentarios y bebidas y sobre las superficies de los equipos medicos.

Los inventores de la presente invencion han observado, sorprendentemente, que los objetos de la presente invencion pueden resolverse mediante el uso de los tensioactivos cationicos derivados de la condensacion de acidos grasos y aminoacidos dibasicos esterificados de la formula anterior (1). Se ha observado, que la adicion directa de estos tensioactivos cationicos derivados de la condensation de acidos grasos y aminoacidos dibasicos esterificados de la formula anterior (1) para productos alimentarios y bebidas provoca la inactivacion de las endotoxinas. Se ha observado que los tensioactivos cationicos derivados de la condensacion de acidos grasos y aminoacidos dibasicos esterificados de la formula anterior (1) puede conducir a una reduction de la inflamacion y a una mejora del shock hipotensor despues del contacto con endotoxinas y, en consecuencia, los tensioactivos cationicos son adecuados para su uso en un metodo de tratamiento medico para la inactivacion in vivo de las endotoxinas que son liberadas a partir de bacterias gramnegativas. Se han observado efectos beneficiosos similares en la interaction con las exotoxinas y las aflatoxinas.

Descripcion de las realizaciones preferidas

El compuesto mas preferido de la clase anterior de compuestos es el ester etilico de la lauramida del monoclorhidrato de arginina, en lo sucesivo denominado LAE (n.° CAS 60372-77-2). Este compuesto es particularmente eficaz para la inactivacion de las toxinas. El LAE tiene la estructura quimica de formula (2) mostrada a continuation en el presente documento.

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Los tensioactivos cationicos de la formula general (1) se han descrito como agentes antimicrobianos.

Los tensioactivos cationicos se utilizan regularmente como agentes conservantes en productos tales como productos alimentarios y preparados medicos y cosmeticos o para dispositivos medicos.

Se prefiere especialmente el uso de los tensioactivos cationicos de formula general (1) para la conservacion de productos carnicos, como, por ejemplo carne, productos de aves de corral, pescado, crustaceos, vegetales, verduras, emulsiones, salsas, productos de confiteria, panaderia, productos lacteos, productos a base de huevos, mermeladas, gelatinas, bebidas, zumos, vinos y cervezas.

Sorprendentemente, ahora, los inventores han descubierto que el LAE (monoclorhidrato del ester etilico de N-alfa- lauroil-L-arginina etil) y sus homologos se unen a LPS (lipopolisacaridos) y los neutralizan. Debido a la baja toxicidad de LAE para su uso en alimentos, bebidas, cosmeticos y aplicaciones farmaceuticas, este sorprendente hallazgo tiene un gran valor practico para la neutralizacion y destoxificacion de las toxinas producidas por bacterias patogenas.

El LAE y sus homologos descritos en el presente documento se pueden anadir directamente a alimentos, carnes, bebidas, productos de aves de corral, peces y crustaceos (gambas, mariscos) para inactivar las toxinas a la concentracion de la concentracion en el alimento de 0,1 mg/kg a 100.000 mg/kg, preferentemente a de 1 mg/kg a 10.000 mg/kg, y mas preferentemente de 5 mg/kg a 1000 mg/kg.

El LAE y sus homologos descritos en el presente documento se pueden administrar a animales o pacientes humanos por cualquier metodo convencional disponible para su uso, en combination con excipientes, productos terapeuticos farmaceuticos, ya sea como agentes terapeuticos individuales o en una combinacion de agentes terapeuticos.

a dosis administrada a un animal, particularmente a un ser humano, en el contexto de la presente invencion debe ser suficiente para afectar a una respuesta terapeutica en el animal o el paciente humano durante un periodo de tiempo razonable. Un experto en la materia reconocera que la dosificacion dependera de diversos factores, incluyendo una afeccion del animal, el peso corporal del animal, asi como la afeccion que se este analizando

Una dosis adecuada es la que dara como resultado una concentracion del agente activo en un paciente que se sabe que afecta a la respuesta deseada.

El tamano de la dosis estara determinado por la via, el momento y la frecuencia de administration, asi como la existencia, la naturaleza y la extension de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompanar la administracion del compuesto y al efecto fisiologico deseado.

Formas de dosificacion farmaceuticas utiles para administracion de los compuestos de acuerdo con la presente invention se pueden ilustrar del siguiente modo:

Capsulas de cubierta dura:

Se prepara un gran numero de capsulas unitarias cargando capsulas de gelatina dura convencionales de dos piezas con 1.000 mg de principio activo en polvo, 150 mg de lactosa, 50 mg de celulosa y 6 mg de estearato de magnesio.

Capsulas de gelatina blanda

Se prepara una mezcla de ingrediente activo en un aceite digerible, tal como aceite de soja, aceite de semilla de algodon o aceite de oliva y se inyecta por medio de una bomba de desplazamiento positivo en gelatina fundida, para formar capsulas de gelatina blanda que contienen de 100 a 1.000 mg de principio activo. Las capsulas se lavan y se

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secan. Los tensioactivos cationicos se pueden disolver en una mezcla de polietilenglicol, glicerina y sorbitol, para preparar una mezcla de medicina miscible en agua.

Los tensioactivos cationicos de formula (1), mas en particular LAE, como el tipo preferido de tensioactivo cationico, se pueden administrar por via oral en formas de dosificacion solidas, tales como capsulas, comprimidos y polvos, o en formas de dosificacion liquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. Tambien se puede administrar por via parenteral, en formas de dosificacion liquidas esteriles. Los tensioactivos cationicos de formula (1) tambien se pueden administrar por via intranasal (gotas nasales) o por inhalacion de una niebla de polvo de farmaco. Otras formas de dosificacion son potencialmente posibles, tales como la administracion transdermica, a traves de un mecanismo de parche o pomada. El principio activo puede administrarse empleando un sistema de administracion de liberacion sostenida o retardada o un sistema de administracion de liberacion inmediata.

La dosis administrada a los pacientes variara, por supuesto, en funcion de factores conocidos, tales como las caracteristicas farmacodinamicas del agente concreto y su modo y via de administracion; la edad, el estado de salud y el peso del receptor; la naturaleza y extension de los sintomas; el tipo de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; y el efecto deseado. Una dosis diaria de principio activo de tensioactivo cationico de formula (1) por administracion oral se puede esperar que sea de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal a 900 mg/kilogramo de peso corporal, preferentemente de 0,05 mg/kg de peso corporal a 90 mg/kg de peso corporal y, mas preferentemente, de 0,1 mg/kg de peso corporal a 9 mg/kg de peso corporal.

Las formas de dosificacion para la administracion oral (composiciones adecuadas para administracion) contienen de 1 a 500 mg de principio activo del agente tensioactivo cationico por unidad. En estas composiciones farmaceuticas, normalmente el principio activo estara presente en una cantidad de 0,05 % - 95 % en peso basado en el peso total de la composicion.

Las formulaciones adecuadas para administracion oral pueden consistir en (a) soluciones liquidas, tal como una cantidad eficaz del compuesto disuelta en diluyentes, tales como agua, solucion salina, o zumo de naranja; (b) capsulas, sobres, comprimidos, pastillas, y trociscos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como solidos o granulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un liquido apropiado; y (e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones liquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencilico, propilenglicol, glicerina y los alcoholes de polietileno, con o sin la adicion de un tensioactivo farmaceuticamente aceptable, agente de suspension o agente emulsionante. Las formas de capsula pueden ser del tipo de gelatina con recubrimiento duro o blando habitual que contiene, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y cargas inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, y almidon de maiz. Las formas de comprimidos pueden incluir una o mas de las siguientes: lactosa, sacarosa, manitol, almidon de maiz, almidon de patata, acido alginico, celulosa microcristalina, goma arabiga, gelatina, goma guar, dioxido de silicio coloidal, croscarmelosa sodica, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de cinc, acido estearico, y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes tampon, agentes disgregantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes y vehiculos farmacologicamente compatibles. Las formas de pastilla pueden comprender el principio activo de la presente divulgacion en un sabor, habitualmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto, asi como pastillas que comprenden el principio activo de la presente divulgacion en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga, emulsiones y geles, que contienen, ademas del ingrediente activo, vehiculos tales como se conocen en la materia.

Los compuestos de la presente divulgacion, solos o en combinacion con otros componentes adecuados, se pueden preparar en formulaciones en aerosol para administrarse por inhalacion. Estas formulaciones en aerosol se pueden colocar en propelentes presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano y nitrogeno. Tambien se pueden formular como productos farmaceuticos para preparaciones no presurizadas, tal como en un nebulizador o un atomizador.

La dosificacion en administracion parenteral estara en el intervalo de 0,01 a 900 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,05 a 90 mg/kg de peso corporal y, lo mas preferentemente, de 0,1 a 9 mg/kg de peso corporal.

Las formulaciones adecuadas para la administracion parenteral incluyen soluciones inyectables esteriles isotonicas acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacterioestaticos y solutos, que hacen que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor que se pretenda;,y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El compuesto se puede administrar en diluyentes fisiologicamente aceptables en un vehiculo farmaceutico, tal como un liquido o mezcla de liquidos esteriles, incluyendo agua, solucion salina, dextrosa acuosa y soluciones de azucares relacionados, un alcohol, tal como etanol, isopropanolol o alcohol hexadecilico, glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol, tales como polietilenglicol 400, cetales de glicerol tales como 2,2-dimetil- 1,3-dioxolano-4-metanol, eteres, un aceite, un acido graso, un ester de acido graso o glicerido o un glicerido de acido graso acetilado con o sin la adicion de un tensioactivo farmaceuticamente aceptable, tal como un jabon o un detergente, agente de suspension, tales como pectina, carbomeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmaceuticos. Los aceites que se pueden utilizar en formulaciones parenterales incluyen petroleo, aceites animales, vegetales o sinteticos. Los ejemplos especificos

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de aceites incluyen de cacahuete, de soja, de sesamo, de semilla de algodon, de ma^z, de oliva, vaselina, y mineral. Los acidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen acido oleico, acido estearico y acido isoestearico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de esteres de acidos grasos adecuados. Los jabones adecuados, para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales de metales alcalinos grasos, amonio, y trietanolamina, y detergentes adecuados incluyen (a) detergentes cationicos tales como, por ejemplo haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio; (b) detergentes no ionicos, tales como, por ejemplo, oxidos de aminas grasas, alcanolamidas de acidos grasos, y copolimeros de polioxietileno polipropileno; (c) detergentes anfoteros, tales como, por ejemplo, alquilbetaaminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2- alquilimidazolina; y (d) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contienen normalmente del 0,1 % al 25 % en peso del tensioactivo cationico en la solucion. En tales formulaciones se pueden usar conservantes y tampones adecuados. Con el fin de minimizar o eliminar la irritacion en el sitio de inyeccion, tales composiciones pueden contener uno o mas tensioactivos no ionicos que tienen un equilibrio hidrofilo-lipofilo (HLB) de aproximadamente 12 a 17. La cantidad de dichos tensioactivos en las formulaciones varia desde el 5 % al 15 % en peso. Los tensioactivos no ionicos adecuados que tienen un equilibrio hidrofilo-lipofilo (HLB) de 12 a 17 incluyen esteres de acidos grasos de sorbitano de polietilenglicol, tales como monooleato de sorbitano y aductos de alto peso molecular de oxido de etileno con una base hidrofobica, formados mediante la condensacion de oxido de propileno con propilenglicol.

Los excipientes farmaceuticamente aceptables son tambien bien conocidos por los expertos en la tecnica. La eleccion del excipiente se determinara, en parte, mediante el compuesto en particular, asi como por el metodo particular usado para administrar la composition. De acuerdo con lo anterior, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de la composicion farmaceutica de la presente invention. Los siguientes metodos y excipientes son meramente de ejemplo y no son en modo alguno limitativos. Los excipientes farmaceuticamente aceptables, preferentemente, no interfieren en la action de los principios activos y no causan efectos secundarios adversos. Los vehiculos y excipientes adecuados incluyen disolventes tales como agua, alcohol y propilenglicol, absorbentes solidos y diluyentes, agentes de superficie activa agentes de suspension, aglutinantes de comprimidos, lubricantes, sabores y agentes colorantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitaria o de dosis multiple, tales como ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en estado de secado por congelation (liofilizada) que requiere unicamente la adicion de los excipientes liquidos esteriles, por ejemplo, agua para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones inyectables inmediatas pueden prepararse a partir de polvos, granulos y comprimidos extemporaneas. Los requisitos para los vehiculos farmaceuticos eficaces para las composiciones inyectables son bien conocidos para los expertos en la materia, vease, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, Eds., 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., 622-630 (1986). Las formulaciones adecuadas para administration topica incluyen pastillas para chupar que comprenden el principio activo en un sabor, normalmente un edulcorante artificial tal como sucralosa y sacarina y goma arabiga y goma de tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga; y colutorios que comprenden el principio activo en un vehiculo liquido adecuado; asi como cremas, emulsiones y geles que contienen, ademas del ingrediente activo, vehiculos tales como los conocidos en la tecnica.

El LAE se puede aplicar como polvo seco o en forma liquida o formulation de crema con aposito para heridas en cantidades de 0,01 mg/kg de peso corporal a 2.000 mg/kg de peso corporal para prevenir la sepsis y estimular la curacion, siendo las cantidades preferidas de 0,05 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal y, lo mas preferido, de 0,1 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal.

Adicionalmente, las formulaciones adecuadas para la administracion rectal se pueden presentar como supositorios mezclando con diversas bases, tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Las formulaciones adecuadas para administracion vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverization que contienen ademas del ingrediente activo, transportadores como los conocidos en la tecnica que son adecuados.

Los tensioactivos cationicos de la formula (1), mas en particular LAE de la formula (2), se pueden utilizar para el tratamiento de cualquier superficie que puede entrar en contacto con cualquiera de las toxinas descritas en la presente solicitud, tales como endotoxinas, exotoxinas y aflatoxinas. Este uso especifico puede ser particularmente util para tales superficies que forman parte de los equipos medicos, tales como, por ejemplo, cateteres u otro equipo de infusion. El tratamiento de las superficies de los cateteres y otros equipos de infusion con los tensioactivos cationicos de la formula (1) conduce al efecto altamente favorable de inactivar cualquier endotoxina que pueden estar presentes en el medio que fluye a traves del cateter u otro equipo de infusion. El nivel de dosis adecuada esta entre el 0,2 % y el 1 % de tensioactivo cationico unido a la superficie de los cateteres u otros dispositivos medicos. De la misma manera, puede inactivar cualquier exotoxina o aflatoxina que pueda estar presente. Esta es una realization particularmente preferida de la presente invencion.

La utilidad de la presente invencion sera evidente a partir de los siguientes ejemplos ilustrativos. Cualquier gama de los valores dados en el presente documento se puede ampliar o modificar sin perder los efectos que se pretenden, como sera evidente para el experto con una comprension de la ensenanza en el presente documento.

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Ejemplo 1

Efecto de diferentes concentraciones de LAE sobre endotoxinas producidas por E. coli 0113: H10 Objetivo:

El primer objetivo de este experimento fue evaluar y comparar dos ensayos LAL (ensayo turbidimetrico y de pirocromo). El segundo objetivo de este experimento preliminar fue determinar el efecto del LAE sobre endotoxinas producidas por E. coli O113:H10 que se utiliza como patron La actividad de la endotoxina tratada con LAE se evaluo a traves de ambos metodos.

Materiales y metodos:

El ensayo turbidimetrico LAL se llevo a cabo de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Pyrotell-T, The associates of Cape Cod, Inc.). La curva patron se construyo sobre la base de 300, 30, 3, 0,3, 0,03 y 0,003 UE/ml. En el experimento se uso la misma endotoxina a concentraciones de 12,5 mg/ml.

El LAE se aplico a concentraciones de 0, 5, 10, 20, 30, 50 |jg/ml para evaluar la capacidad de este compuesto para desactivar endotoxinas. Se uso agua de reactivo LAL (LRW) para hacer todas las diluciones de endotoxinas, incluyendo los patrones. MIRENAT-CF es una solucion del 10,5 % de LAE en propilenglicol, por lo que las diluciones de MIRENAT-Cf se realizaron inicialmente en propilenglicol, por lo que la concentracion de LAE se mantuvo como la unica variable. Para el posible procedimiento de desactivacion, la endotoxina se incubo junto con LAE durante dos horas a 37 °C. El ensayo turbidimetrico se llevo a cabo dos veces usando el tiempo de inicio de DO405 = 0,05. El ensayo de pirocromo se llevo a cabo vez utilizando la misma plantilla en placas.

Resultados:

Efecto de diferentes concentraciones de LAE sobre endotoxinas producidas por E. coli 0113: H10

Tabla 2

CONCENTRACION DE LAE: CONCENTRACION DE ENDOTOXINA (UE/ml

(pg/ml): x10E3)

0: 120

10: 80

50: 61

LAE a 50 jg/ml redujo la actividad de la endotoxina en un 50 %

Los resultados de los dos ensayos fueron similares, sin embargo, el ensayo de pirocromo no fue tan sensible a concentraciones mas bajas de endotoxina.

Efecto del propilenglicol sobre la recuperacion de endotoxinas mediante el ensayo de LAL Objetivo:

Se usa propilenglicol (PG) como disolvente para LAE en los productos MIRENAT Este compuesto se utilizara como control negativo en los experimentos; pero que puede interferir con el proceso de recuperacion de endotoxinas mediante el ensayo LAL. El soporte tecnico en Associates of Cape Cod indico que el PG se ha clasificado como sustancia interferente, sin embargo, a las concentraciones a las que se utiliza este compuesto dentro de la placa (1 jg/ml) no debe interferir con el ensayo. En este experimento se analiza el efecto de PG sobre la recuperacion de endotoxinas.

Materiales y metodos:

500 jl del LPS de S. typhimurium LPS (intervalo 50-0,4 jg/ml) se mezclaron con 500 jl de la solucion de 1 mg/ml del PG o con 500 jl de agua destilada esteril usada para hacer las diluciones. Cada mezcla se incubo durante dos horas a 37 °C y despues se diluyo en serie dentro de los tubos de reaccion de vidrio utilizando el agua de reactivo LAL. A continuacion, se uso un ensayo turbidimetrico LAL para evaluar la recuperacion de las endotoxinas despues del tratamiento con PG. El experimento se repitio dos veces por duplicado.

Resultados

El propilenglicol, a las concentraciones utilizadas para el ensayo, no interfiere con la recuperacion del LPS.

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10

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Ejemplo 2

Investigacion de la respuesta de desactivacion de endotoxinas en funcion de la concentracion de LAE con Salmonella typhimurium.

Objetivo:

El objetivo de este experimento era construir la curva de respuesta a la dosis para las concentraciones de LAE en el intervalo de 5-50 |jg/ml (50-500 ppm de la preparation MIRENAT-CF).

Materiales y metodos:

La solution madre de 1 mg/ml de LPS de S. typhimurium se preparo usando el LPS disponible comercialmente obtenido de List Biological Laboratories, Inc. (n.° cat. 225). La solucion de 20 jg/ml de LPS se preparo diluyendo en serie la reserva Todas las soluciones de LPS se mantuvieron a temperaturas de refrigeration de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Las soluciones de LAE preparadas se usaron en el experimento. Para el procedimiento, 500 jl de 20 jg/ml de endotoxinas se mezclaron con 500 jl de la solucion de LAE (10, 20, 40, 60 y 100 jg/ml) en tubos de reaction de vidrio, dando la concentracion final de LPS, 10 jg/ml y el intervalo de concentracion de LAE, 5-50 jg/ml. Como control negativo, el LPS se mezclo con una solucion acuosa de 1 mg/ml de propilenglicol. La mezcla se incubo durante 2 horas a 37 °C. Cada muestra se diluyo en serie utilizando el agua de reactivo LAL que se va a analizar para la actividad de la endotoxina.

Resultados y discusion:

Las tres diluciones de cada muestra usada en la placa (1000X, 10.000X, 100.000X) estaban dentro del intervalo de la curva patron. Los resultados se ajustaron usando el factor de dilution apropiado. La misma curva patron siguio una buena tendencia.

LAE a concentraciones de 5 a 50 jg/ml disminuyo significativamente la actividad de las endotoxinas de S. typhimurium.

Los resultados indicaron que LAE en forma de MIRENAT-CF disminuyo la actividad de las endotoxinas de S. typhimurium, tal como se detectan mediante el ensayo LAL.

Tabla 3

CONCENTRACION DE LAE: CONCENTRACION DE ENDOTOXINA (UE/ml

(Mg/ml): x10E3)

0: 17000

5: 4000

10: 3995

20: 3000

30: 4000

50: 2500

Este efecto de desactivacion, sin embargo, no sigue una respuesta a la dosis para el intervalo de concentracion investigada del LAE (5-50 jg/ml).

Los resultados obtenidos en los ejemplos 1 y 2 demuestran claramente la sorprendente capacidad de LAE en concentraciones muy bajas para inactivar las endotoxinas de Salmonella y E. coli.

Ejemplo 3

Efecto de LAE sobre la actividad de LPS sobre los sistemas de cultivo celular humanos

Para evaluar si LAE es capaz de unirse a las endotoxinas y neutraliza su efecto citotoxico, se realizo el siguiente experimento. La toxicidad de las endotoxinas se midio usando celulas humanas.

Las lineas de celulas epiteliales humanas (KB) se obtuvieron de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo y se cultivaron en medio BGJ (Gibco, Buffalo, NY) a 37 °C con 5 % de CO2. El medio se suplemento con suero de ternera caliente al 5 %. Las celulas se colocaron en placas de 24 pocillos con 0,5 ml de medio por pocillo. La liberation de peptidasas de las lineas celulares humanas en respuesta a LPS se midio por un sustrato fluorigenico basado en cumarina utilizada para estudiar enzimas eucariotas que degradan las proteinas de la matriz extracelular (colageno y fibronectina) y se inactivo mediante inhibidores de las metaloproteasas de la matriz (Yang et al. Resumen105 en el

105 Congreso general de la ASM). Resultados y discusion

5 Cuando las celulas humanas se exponen a LPS, las celulas liberan peptidasas, lo que indica que no hay dano celular. La liberacion de peptidasa se midio mediante la prueba de fluorescencia sensible.

Los resultados representados a continuacion en la tabla 4 indican el efecto dependiente de la dosis de LPS sobre la induction de peptidasa.

10

La liberacion de peptidasa de una muestra no tratada fue de 400 unidades de fluorescencia.

15

La adicion de LAE a una concentration de 2 |jg/ml al LPS dio lugar a una reduction significativa de la respuesta de peptidasa a ambas dosis de LPS analizadas.

Tabla 4

Conc. de LAE (Mg/ml): Conc. de LPS (Mg/ml) Peptidasa liberada (unidades de fluorescencia)

0 (muestra blanco): 0 400

2: 0 296

0: 10 900

2: 10 580

0: 20 1200

2: 20 655

La exposition de las celulas a 10 jg/ml o 20 jg/ml de LPS provoco la liberacion de peptidasa. Cuando el LPS se mezclo previamente con 2 jg/ml de LAE, la toxicidad de LPS (medida mediante la liberacion de fluorescencia) se 20 redujo sorprendentemente en un 35,6 % para la premezcla con 10 jg/ml de LPS y en un 45,4 % para la premezcla con 20 jg/ml de LPS.

A una concentracion muy baja, 2 jg de LAE/ml fueron eficaces en la reduccion de la toxicidad de la endotoxina a las celulas humanas. Esta baja concentracion se eligio para asegurar que el LAE per se no provoco la liberacion de las 25 enzimas, dado que a 2 jg de LAE/ml dieron lugar a la liberacion de peptidasa de menos de 300 unidades, similar al blanco Por lo tanto, el efecto se debe a la union de LAE a LPS para reducir la toxicidad.

Claims

5

10

15

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35

REIVINDICACIONES

1. Uso de un tensioactivo cationico derivado de la condensacion de acidos grasos y aminoacidos dibasicos esterificados, de acuerdo con la siguiente formula (1):

imagen1

en la que

X- es un contraion derivado de un acido organico o inorganico, preferentemente Br-, Cl- o HSO4-, o un anion a partir de un compuesto fenolico;

Ri: es una cadena de alquilo lineal de un acido graso saturado o un acido hidroxilico que tiene de 8 a 14 atomos de carbono unidos al grupo a-aminoacido a traves de un enlace amidico;

R2: es una cadena de alquilo lineal o ramificada de 1 a 18 atomos de carbono o un grupo aromatico;

R3: es

—NH3

o

donde n es de 0 a 4,

imagen2

/~NH

< 3

NH

para la inactivacion de endotoxinas (lipopolisacaridos, LPS) liberadas por bacterias gramnegativas, exotoxinas o aflatoxinas en productos alimentarios y bebidas.
2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el tensioactivo cationico se anade a un producto alimentario a una concentracion de 0,1 a 100.000 mg/kg del producto alimentario, preferentemente de 1 a 10.000 mg/kg de producto alimentario y, lo mas preferentemente, de 5 a 1.000 mg/kg de producto alimentario
3. Uso de un tensioactivo cationico derivado de la condensacion de acidos grasos y aminoacidos dibasicos esterificados, de acuerdo con la siguiente formula (1):

5

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imagen3

en la que

X- es un contraion derivado de un acido organico o inorganico, preferentemente Br-, Cl- o HSO4-, o un anion a partir de un compuesto fenolico;

Ri: es una cadena de alquilo lineal de un acido graso saturado o un acido hidroxflico que tiene de 8 a 14 atomos de carbono unidos al grupo a-aminoacido a traves de un enlace amidico;

R2: es una cadena de alquilo lineal o ramificada de 1 a 18 atomos de carbono o un grupo aromatico;

R3: es

—NH3

o

imagen4

imagen5

donde n es de 0 a 4,

para la inactivacion de endotoxinas (lipopolisacaridos, LPS) liberadas por bacterias gramnegativas, exotoxinas o aflatoxinas en superficies de equipos medicos.
4. El uso de acuerdo con la reivindicacion 3 en un metodo para el tratamiento de dispositivos medicos mediante recubrimiento con tensioactivos cationicos unidos a sus superficies a niveles de dosis de entre el 0,2 % y el 1 %.
5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto es el ester etflico de la lauramida del clorhidrato de arginina (LAE).
6. Un tensioactivo cationico derivado de la condensacion de acidos grasos y aminoacidos dibasicos esterificados, de acuerdo con la siguiente formula (1):

5

10

15

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30

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imagen6

en la que

X- es un contraion derivado de un acido organico o inorganico, preferentemente Br-, Cl- o HSO4-, o un anion a partir de un compuesto fenolico;

Ri: es una cadena de alquilo lineal de un acido graso saturado o un acido hidroxilico que tiene de 8 a 14 atomos de carbono unidos al grupo a-aminoacido a traves de un enlace amidico;

R2: es una cadena de alquilo lineal o ramificada de 1 a 18 atomos de carbono o un grupo aromatico;

R3: es

—NH3

imagen7

donde n es de 0 a 4,

para su uso en un metodo de tratamiento medico para la inactivacion in vivo de endotoxinas (lipopolisacaridos, LPS) liberadas por bacterias gramnegativas, exotoxinas o aflatoxinas.
7. El tensioactivo cationico para el uso de acuerdo con la reivindicacion 6 en un metodo para el tratamiento del cuerpo humano o animal por administration oral, topica y parenteral.
8. El tensioactivo cationico para el uso de acuerdo con la reivindicacion 6 en un metodo para el tratamiento del cuerpo humano o animal por administracion rectal o vaginal o mediante inhalacion.
9. El tensioactivo cationico para el uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el tensioactivo cationico se administra por via oral a una dosis de 0,01 a 900 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,05 a 90 mg/kg de peso corporal y, mas preferentemente, de 0,1 a 9 mg/kg de peso corporal.
10. El tensioactivo cationico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que la administracion oral puede consistir en una suspension, una emulsion, una forma liquida, tales como elixires y jarabes, o una forma solida, tales como capsulas, comprimidos, sobres, pastillas para chupar, polvo o trociscos.
11. El tensioactivo cationico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el tensioactivo cationico se administra por via parenteral a una dosis de 0,01 a 900 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,05 a 90 mg/kg de peso corporal y, mas preferentemente, de 0,1 a 9 mg/kg de peso corporal.
12. El tensioactivo cationico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde la administracion parenteral puede consistir en una forma liquida esteril.
13. El tensioactivo cationico para el uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el tensioactivo cationico se

administra mediante aplicacion dermica a una dosis de 0,01 a 2.000 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,05 a 500 mg/kg de peso corporal y, mas preferentemente, de 0,1 a 50 mg/kg de peso corporal.
14. El tensioactivo cationico para el uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde la administracion dermica 5 puede consistir en un mecanismo de parche o una pomada.
15. El tensioactivo cationico para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en el que el compuesto es el ester etilico de la lauramida de clorhidrato de arginina (LAE).