ES2589530T3 - Patrón cuantitativo para espectrometría de masas de proteínas - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido de fusión para la cuantificación de un polipéptido diana por espectroscopia de masas, en el que: dicho polipéptido de fusión consiste en 35-455 restos de aminoácidos y comprende (i) una región diana, que es un fragmento del polipéptido diana y (ii) una región marcadora, que no es un fragmento de polipéptido diana, dicha región diana consiste en 15-205 restos de aminoácidos y comprende al menos dos regiones de identificación; dicha región diana consiste en 20-250 restos de aminoácidos y comprende al menos dos regiones de identificación; cada región de identificación tiene la estructura Y-Z-X4-28-Y-Z, todas las Y se seleccionan de uno de (i)-(iv), en los que (i) es R o K, (ii) es Y, F, W o L, (iii) es E y (iv) es D, y cada X y cada Z son de forma independiente cualquier resto de aminoácido, siempre que las Z no sean P si las Y se seleccionan de (i)-(iii); cada región de identificación comprende al menos un resto de aminoácido que comprende un isótopo pesado; dicha región marcadora consiste en proteína de unión a albúmina (ABP) o un fragmento de la misma; y el mismo resto Y puede constituir el extremo carboxílico de una primera región de identificación y el extremo amino de una segunda región de identificación.
Description
isótopos de forma diferente en comparación con dicho polipéptido o dichos polipéptidos de fusión.
Aunque el método descrito para determinar la cantidad absoluta de un polipéptido diana proporciona cuantificación absoluta de un polipéptido a partir de un único experimento de masa, los métodos para crear un patrón cuantitativo y
5 para determinar la cantidad absoluta de uno o más polipéptidos diana, respectivamente, se refieren a (i) preparación y cuantificación de un patrón y (ii) uso de este patrón en la cuantificación de uno o más de una pluralidad de polipéptidos comprendidos en una muestra. Resulta importante que dicho enfoque es susceptible de multiplexación. En otras palabras, no solamente uno, sino también una pluralidad de polipéptidos comprendidos en una muestra puede determinarse conjuntamente de manera cuantitativa.
De acuerdo con el método para crear un patrón cuantitativo, se proporciona uno o una pluralidad de polipéptidos de fusión. De acuerdo con la etapa (b) del mismo, un polipéptido de fusión en el momento se combina con una cantidad conocida de un polipéptido marcador. Esta mezcla binaria se somete a digestión proteolítica, análisis espectrométrico de masas y cuantificación para proporcionar la cantidad absoluta de uno de dichos polipéptidos de
15 fusión a la vez. Realizando la etapa (b) para el, los o todos los polipéptidos de fusión comprendidos en el patrón, el patrón se caracteriza cuantitativamente y puede usarse en un método de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención. El método del segundo aspecto proporciona en la etapa (a) la fabricación física del patrón cuantitativo y en la etapa (b) su caracterización con respecto a cantidades absolutas del polipéptido o los polipéptidos de fusión constituyentes. Los patrones cuantitativos preferidos también se denominan “mezcla maestra PrEST” en el presente documento.
Un método para determinar la cantidad absoluta de uno o más polipéptidos diana puede, de acuerdo con la etapa (a), incorporar el método para crear un patrón cuantitativo en su totalidad. Como alternativa, la etapa (a) puede omitirse. En ese caso, se entiende que el patrón cuantitativo para añadir de acuerdo con la etapa (b) se caracteriza
25 de acuerdo con la etapa (b) del método para crear un patrón cuantitativo.
En consecuencia, el patrón interno (es decir el polipéptido de fusión) se cuantifica de este modo en una primera etapa usando un patrón interno del patrón interno (es decir el polipéptido marcador), y una proteína diana en una muestra se cuantifica en una segunda etapa posterior usando el patrón interno cuantificado (es decir el polipéptido de fusión modificado en la primera etapa). La primera etapa puede llevarse a cabo en un sitio, tal como en el local de la compañía proporcionando polipéptidos de fusión cuantificados, mientras que la segunda etapa se lleva a cabo en otro sitio, tal como en un laboratorio en el que se cuantifican proteínas en muestras biológicas para fines de diagnóstico.
35 Como se ha indicado, dichos uno o más polipéptidos diana tienen masa alterada, preferentemente están marcados con isótopo de forma diferente en comparación con dichos polipéptidos de fusión. En otras palabras, y en los casos en los que dichos polipéptidos de fusión no estén marcados con isótopos, es necesario preparar una muestra en la que el o los polipéptidos diana comprendidos en la muestra están marcados con isótopos. Por otro lado, no surge un requisito para preparar una muestra marcada con isótopos para las realizaciones que quedan dentro del tercer aspecto en el que dichos polipéptidos de fusión están marcados con isótopo.
Puede usarse más de un polipéptido de fusión que comprende diferentes subsecuencias de un polipéptido diana en dicha muestra. Se usa después más de un polipéptido de fusión en la cuantificación de un polipéptido diana dado. Este se describe adicionalmente en los ejemplos incluidos con la presente y proporciona precisión mejorada y
45 significación estadística.
Uno o dos marcadores pueden estar presentes en dichos polipéptidos de fusión, seleccionándose dicho marcador o dichos marcadores de un marcador de purificación y un marcador de solubilidad. Esto acepta la presencia conjunta de dos marcadores diferentes. Se describen adicionalmente posteriormente implementaciones preferidas de uno de los marcadores marcadores. Se entiende que el marcador de solubilidad se usa preferentemente como un marcador de cuantificación (“secuencia marcadora”) de acuerdo con los métodos.
Dicha muestra puede comprender células y/o fluidos corporales. Dichas células pueden ser de diversos tipos o de un solo tipo. Además, las células pueden incluirse en uno o más tejidos. En la medida en que se prevén células
55 humanas, se prefiere que dicha célula humana no se obtenga de un embrión humano, en particular no mediante métodos que impliquen la destrucción de un embrión humano. Por otro lado, están al alcance del experto en la materia células madre embrionarias humanas. En consecuencia, los métodos pueden realizarse con células madre embrionarias humanas sin ninguna necesidad de usar o destruir un embrión humano. La muestra puede comprender uno o más fluidos corporales, seleccionándose preferentemente dichos fluidos corporales de sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, leche materna, líquido cefalorraquídeo, moco, líquido peritoneal, líquido pleural, saliva, semen, sudor, lágrimas, secreción vaginal y orina.
Dicha adición puede efectuarse antes de la digestión proteolítica de los polipéptidos. Esta realización se refiere a los casos en los que la muestra para analizar comprende o consiste en células. Dicha adición se refiere a la adición de 65 un polipéptido de fusión y un polipéptido marcador de acuerdo con el método para determinar la cantidad absoluta de un polipéptido diana, o para añadir el patrón cuantitativo de acuerdo con el método para determinar la cantidad
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