ES2587997T3

ES2587997T3 - Procedimiento de separación de células de una muestra

Info

Publication number: ES2587997T3
Application number: ES01129402.2T
Authority: ES
Inventors: Stewart Russell Jurgensen; Sheila Ann Lloyd
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2001-01-08
Filing date: 2001-12-10
Publication date: 2016-10-28
Anticipated expiration: 2021-12-10
Also published as: US7524641B2; US20070190584A1; JP4290916B2; JP2002253222A; US7205157B2; US20020090741A1; CA2365925C; EP1221342A2; MXPA01013107A; EP1221342A3; JP2008301835A; EP1221342B1; CA2365925A1

Abstract

Un procedimiento de recolección de componentes de un material de muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (i) proporcionar un material de muestra en un recipiente (32) de muestreo, teniendo dicho recipiente (32) de muestreo un flotador (48) con un paso para recibir y alargar capas de componentes de muestra a ser recolectados de dicha muestra, recibiéndose dicho flotador (48) en dicho recipiente (32), que tiene una dimensión y una forma que complementan el interior de dicho recipiente (32), e incluye resaltes (60) que definen un canal longitudinal (62) entre dicho flotador y dicho recipiente para recibir y alargar dichos componentes diana durante el centrifugado, (ii) proporcionar en dicho recipiente (32) de muestreo un soporte (64) de material particulado que tiene al menos un anticuerpo con una afinidad para asociarse con al menos un componente en dicha muestra asociada con dicho soporte (64) de material particulado, y mezclar dicho soporte (64) de material particulado con dicha muestra, (iii) centrifugar dicha muestra (32) con suficiente fuerza G para separar componentes de dicha muestra y para forzar a dicho soporte (64) de material particulado y al componente diana de dicha muestra a entrar dicho paso (62), y (iv) retirar dicho componente diana de dicho paso (62).

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de separacion de celulas de una muestra Campo de la invencion

La presente invencion esta dirigida a un procedimiento para separar un componente diana y, en particular, celulas diana de una muestra. Mas en particular, la invencion esta dirigida a un procedimiento de separacion de celulas diana de una muestra biologica mediante una separacion positiva o negativa y un centrifugado.

Antecedentes de la invencion

Se conocen numerosos procedimientos en la tecnica para separar diversos constituyentes de lfquidos biologicos y, en particular, muestras de sangre. Por ejemplo, el analisis de componentes sangumeos normalmente implica el centrifugado de sangre completa anticoagulada para separar las celulas del plasma y para separar las diversas celulas en capas segun la densidad de las celulas. Despues del centrifugado, se retira la fraccion de plasma de la muestra. La toma de muestras de sangre normalmente se lleva a cabo en un tubo al vado y luego se consigue la separacion de celulas mediante centrifugado del tubo de toma de muestras. El tubo puede contener un cuerpo separador que esta fabricado de un material plastico con un peso espedfico que permitira al separador asentarse durante la etapa de centrifugado sobre la parte superior de la capa componente formada en la muestra de sangre. El separador evita la mezcla de las fracciones componentes formadas y no formadas en la muestra de sangre centrifugada. El separador tambien estabiliza las capas centrifugadas para un su analisis y separacion.

Otro procedimiento para recuperar celulas de una muestra de sangre utiliza un inserto adyuvante colocado en el tubo de centrifugado que contiene la muestra antes del centrifugado. El inserto esta fabricado de un material plastico transparente y cabe en el interior del tubo de centrifugado. El inserto se desliza en el interior del tubo cuando es centrifugado para forzar a la muestra a entrar en el orificio del inserto. Las celulas a ser recolectadas de la muestra se juntan en el orificio del inserto, formando, de ese modo, capas de constituyentes que se separan segun el peso espedfico de los constituyentes. El orificio del inserto tiene una dimension para hacer que las capas se alarguen en comparacion con el grosor de la capa que se formana de lo contrario en el tubo sin el inserto. Las capas resultantes en el orificio pueden ser diferenciadas y retiradas del orificio utilizando una jeringa hipodermica u otra canula. En la patente U.S. n° 5.393.674 de Levine et al. se da a conocer un ejemplo de este procedimiento y de este dispositivo.

En la patente U.S. n° 5.707.876 de Levine se da a conocer otro procedimiento y otro aparato para separar constituyentes de una muestra. Este dispositivo utiliza uno o mas marcadores de lfmite que se colocan en el tubo antes del centrifugado. Los marcadores se deslizan por el interior del tubo cuando es centrifugado e identifican los lfmites de las capas constituyentes que se separan gravimetricamente durante el centrifugado. Se inserta una canula en el tubo a traves de un tapon elastomerico para inyectar un lfquido o gas en el tubo. Este material inyectado desplaza la muestra centrifugada y los marcadores de lfmite hacia un extremo del tubo para exprimir la muestra centrifugada del tubo.

Otros procedimientos para separar componentes de una muestra biologica utilizan microperlas paramagneticas que tienen un antfgeno acoplado a los mismas. Se mezcla la muestra con las microperlas y se incuba para asociar los constituyentes a la microperla. Entonces, se somete a la muestra a una separacion magnetica. En la patente U.S. n° 5.916.818 de Irsch et al. se da a conocer un ejemplo de este tipo de procedimiento.

Ademas, en la patente U.S. n° 5.834.217 de Levine et al. se da a conocer un procedimiento de diagnostico que comprende muestras de sangre en un tubo transparente. El tubo contiene uno o mas cuerpos tales como flotadores o perlas de plastico de distintas densidades. Cada uno de dichos cuerpos porta materiales de asociacion con captura de analitos tales como anticuerpos. Se anade al menos un material de asociacion marcado que tambien es espedfico para un epftopo en el analito diana a las muestras, de manera que se formen complejos de material de asociacion marcado/analito/cuerpo en la muestra. Tras el centrifugado, los complejos se asentaran en distintas areas en el tubo segun la densidad respectiva de los cuerpos.

Estos procedimientos anteriores han sido eficaces, en general, para su fin concebido. Sin embargo, existe una necesidad continua en la industria de procedimientos mejorados para separar las celulas de una muestra biologica.

Sumario de la invencion

La presente invencion esta dirigida a un procedimiento para separar celulas de una muestra y, en particular, una muestra biologica. En consecuencia, un objeto primario de la invencion es proporcionar un procedimiento para recolectar un constituyente espedfico de una muestra biologica.

Otro objeto de la invencion es proporcionar un procedimiento para la separacion de un constituyente espedfico de un lfquido biologico en concentraciones mas elevadas que puede obtenerse mediante procedimientos anteriores.

Un objeto adicional de la invencion es proporcionar un procedimiento para recolectar celulas seleccionadas de un lfquido biologico con niveles reducidos de constituyentes contaminantes.

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Otro objeto mas de la invencion es proporcionar un procedimiento para recolectar celulas raras de un Kquido biologico, estando las celulas raras recolectadas sustancialmente libres de celulas mononucleares.

Otro objeto de la invencion es proporcionar un procedimiento para recolectar celulas de una muestra biologica utilizando un soporte de material particulado que tiene un recubrimiento de un anticuerpo que tiene una afinidad para una celula diana en la muestra.

Un objeto adicional de la invencion es proporcionar un procedimiento para recolectar un constituyente diana de una muestra biologica utilizando microperlas recubiertas de un anticuerpo que tiene una afinidad por los globulos blancos.

Otro objeto mas de la invencion es proporcionar un procedimiento para recolectar un componente diana de una muestra biologica centrifugando la muestra en presencia de un soporte de material particulado que tiene una selectividad positiva o negativa por el componente diana.

Otro objeto de la invencion es proporcionar un procedimiento para recolectar celulas de una muestra biologica mezclando la muestra con una cantidad de partfculas portadoras que contienen un anticuerpo que tiene una afinidad por los globulos blancos y teniendo las partfculas una densidad mayor que la densidad de los globulos blancos para retirar los globulos blancos de la muestra.

Un objeto adicional de la invencion es proporcionar un procedimiento de recoleccion de las celulas diana de una muestra biologica mezclando la muestra con una cantidad de perlas portadoras que contienen un anticuerpo que tiene una afinidad por las celulas diana y teniendo las perlas una densidad inferior a la densidad de los globulos blancos para retirar las celulas diana de la muestra.

Otro objeto mas de la invencion es proporcionar un procedimiento para separar las celulas diana de una muestra y detectar las celulas diana en un tubo, separandose las celulas diana mezclando la muestra con perlas portadoras que tienen una afinidad bien por las celulas diana o bien por las celulas contaminantes.

Se consiguen los objetos y las ventajas de la invencion proporcionando un procedimiento de recoleccion de componentes de un material de muestra. El procedimiento comprende las etapas de:

(i) proporcionar un material de muestra en un recipiente de muestreo, teniendo dicho recipiente de muestreo un flotador con un paso para recibir y alargar capas de componentes de muestra a ser recolectados de dicha muestra, siendo recibido dicho flotador en dicho recipiente, que tiene una dimension y una forma complementarios al interior de dicho recipiente, e incluye resaltes que definen un canal longitudinal entre dicho flotador y dicho recipiente para recibir y alargar dicho componente diana durante el centrifugado,

(ii) proporcionar en dicho recipiente de muestreo un soporte de material particulado que tiene al menos un anticuerpo con una afinidad para asociarse con al menos un componente en dicha muestra asociada a dicho soporte de material particulado, y mezclar dicho soporte de material particulado con dicha muestra,

(iii) centrifugar dicho recipiente y dicha muestra con suficiente fuerza G para separar componentes de dicha muestra y para forzar a dicho soporte de material particulado y al componente diana de dicha muestra a entrar en dicho paso, y

(iv) retirar dicho componente diana de dicho paso.

El anterior procedimiento es adecuado para recolectar un componente diana de una muestra de sangre completa. En una realizacion preferente el procedimiento comprende las etapas de proporcionar una muestra de sangre completa en un tubo de muestreo, conteniendo el tubo de muestreo un flotador dimensionado para caber en el interior del tubo de muestreo y que tiene un paso para recibir y alargar capas de constituyentes de sangre a ser recolectados de la muestra, mezclando la muestra con al menos un soporte de material particulado que contiene un anticuerpo que tiene una afinidad de asociacion con un constituyente espedfico de muestra, centrifugar el tubo y la muestra con suficiente fuerza G para mover el flotador hacia un extremo del tubo y para forzar a un componente diana de la muestra a entrar en el paso, y retirar el componente diana del paso.

Estos objetos, ventajas y otras caractensticas destacadas de la invencion seran mas evidentes a partir de la vista de los dibujos adjuntos y de la siguiente descripcion detallada de la invencion.

Breve descripcion del dibujo

Lo siguiente es una breve descripcion de los dibujos en los que:

La Figura 1 es una vista lateral en corte transversal del tubo de centrifugado en una realizacion, que no se encuentra bajo la invencion reivindicada, que se muestra como el miembro de flotador colocado en el tubo; la Figura 2 es una vista en corte transversal del tubo de la Figura 1 tras el centrifugado;

la Figura 3 es una vista en perspectiva de un dispositivo de separacion por centrifugado en otra realizacion de la invencion;

la Figura 4 es una vista en planta del flotador de la realizacion de la Figura 3; y

la Figura 5 es una vista lateral en corte transversal del flotador tomada a lo largo de la lmea 5-5 de la Figura 4.

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Descripcion detallada de las realizaciones preferentes

La presente invencion esta dirigida a procedimientos para recolectar un componente diana y, en particular, celulas diana de una muestra biologica. Mas en particular, la invencion esta dirigida a procedimientos para recolectar celulas raras de una muestra biologica con menos celulas contaminantes presentes en las celulas raras recolectadas.

En una realizacion preferente, el procedimiento de recoleccion de un componente diana utiliza al menos un agente aglomerante con capacidad para asociarse con un componente de la muestra para contribuir a aislar o mejorar el componente diana durante la separacion por centrifugado. El agente aglomerante puede ser un anticuerpo seleccionado para tener una afinidad bien por el componente diana o bien por uno o mas componentes contaminantes. En realizaciones preferentes de la invencion, se proporciona el agente de afinidad de union, tal como un anticuerpo, como un recubrimiento sobre un soporte de material particulado que tiene un tamano y una densidad de partfcula que es compatible con el componente que esta siendo recolectado para aumentar la separacion y la recuperacion del componente diana de la muestra. En las realizaciones de la invencion expuestas a continuacion con mas detalle, el soporte de material particulado puede tener una densidad menor o mayor que la densidad del constituyente contaminante de la muestra.

En realizaciones adicionales, el procedimiento esta dirigido a recolectar celulas raras y, en particular, celulas tumorales de muestras biologicas y, en particular, muestras de sangre completa anticoagulada. El procedimiento puede ser utilizado para recuperar una variedad de otros tipos de celula, tales como celulas madre y celulas fetales, de muestras de sangre.

El procedimiento de la invencion en una realizacion somete a la muestra biologica a una separacion por centrifugacion, mezclandose la muestra con un soporte de material particulado que tiene un anticuerpo u otros agentes de afinidad de union unidos a la superficie del soporte de material particulado. Preferentemente, la etapa de centrifugado utiliza un dispositivo de recoleccion por centrifugado. Preferentemente, se proporcionar el anticuerpo como un recubrimiento sobre la superficie del soporte de material particulado. El soporte de material particulado en las realizaciones preferentes es una cantidad de microperlas fabricada de una resina adecuada de plastico no reactivo. Ejemplos de resinas adecuadas de plastico incluyen el poliestireno, el polidivinilbenceno y el polivinilcloruro.

Se pueden producir las microperlas para ser utilizadas en el procedimiento de la invencion mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica. En realizaciones de la invencion, las microperlas tienen un tamano de partfcula que vana desde 0,05 pm hasta 7 pm, y normalmente desde 4 pm hasta 5 pm.

El soporte de material particulado, tal como las microperlas de plastico, tiene una densidad que complementa los diversos componentes de la muestra para permitir un enriquecimiento del componente diana y, en particular, para permitir el enriquecimiento de las celulas raras. En una realizacion, el soporte de material particulado incluye un anticuerpo que tiene una afinidad de union con el componente diana, tal como celulas tumorales. En realizaciones adicionales, se pueden utilizar otros agentes de afinidad de union. En general, se crefa que despues del centrifugado, se concentraban las celulas tumorales en la superficie de contacto de la region plaqueta/plasma y por encima de la mayona de globulos blancos mas densos. En general, las celulas tumorales recolectadas tienen una concentracion elevada de celulas mononucleares contaminantes. Ahora se ha descubierto que las celulas tumorales no se concentran siempre en la superficie de contacto entre las capas de celulas y son diffciles de recuperar sin una contaminacion significativa de otras celulas interferentes. En una realizacion de la invencion, el soporte de material particulado tiene una densidad que es menor que la densidad de los globulos blancos, de forma que el soporte de material particulado y las celulas tumorales que estan asociadas al soporte, o capturadas en el mismo, estan concentradas por encima de la capa de globulos blancos.

En una primera realizacion de la invencion, el procedimiento de recoleccion y de enriquecimiento de un componente diana es un procedimiento de seleccion positiva que comprende las etapas de poner en contacto el lfquido de muestra con un agente aglomerante que tiene capacidad de unirse con el componente diana, y centrifugar la muestra con un dispositivo con capacidad para expandir capas constituyentes y enriquecer el componente diana. Entonces, se puede recolectar el componente diana y puede ser procesado para identificar y cultivar el componente mediante procedimientos conocidos. Ejemplos de procedimientos adecuados de identificacion incluyen una citometna de flujo y una amplificacion molecular de acido nucleico.

El centrifugado en una realizacion, que no se encuentra bajo la invencion reivindicada, se lleva a cabo utilizando un dispositivo 10 de centrifugado segun se muestra en las Figuras 1 y 2. El dispositivo 10 en la realizacion ilustrada, incluye un recipiente, tal como un tubo 12, que esta fabricado, preferentemente, de vidrio u otro material transparente, tal como plastico. El tubo 12 tiene un extremo inferior cerrado 14 y un extremo superior abierto 16. Se coloca un tope 18 en el extremo superior abierto 16 para cerrar el tubo 12. Preferentemente, el tope 18 esta fabricado de un material elastomerico o similar a caucho adecuado que puede ser perforado por medio de una canula, aguja u otro dispositivo de perforacion. El tope 18 tiene una porcion 20 de cuerpo sustancialmente cilmdrica que tiene una dimension externa para formar un encaje ajustado por friccion en el extremo superior 16 del tubo 12. Un reborde 21 se extiende radialmente hacia fuera desde un extremo superior del tope 18 para acoplarse con el extremo superior 16 del tubo 12.

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El tubo 12 tiene una longitud y un diametro adecuados para centrifugar un Ifquido de muestra. En una realizacion, el tubo 12 tiene una longitud de aproximadamente 75 mm, un diametro interno de aproximadamente 40 mm y una capacidad de aproximadamente 0,9 ml.

Se dispone un flotador 22 en el tubo 12, segun se muestra en la Figura 1. El flotador 22 esta dimensionado para encajar ajustadamente en el tubo 12 y deslizarse por la longitud del tubo 12 durante el centrifugado de la muestra. El flotador 22, en la realizacion ilustrada, incluye un recubrimiento externo 24 que tiene una forma cilmdrica que complementa la superficie interna del tubo 12. El recubrimiento externo 24 esta fabricado, preferentemente, de un material flexible, tal como resina de vinilo, que puede deformarse ligeramente durante el centrifugado. El recubrimiento externo 24 puede expandirse y contraerse en respuesta a la fuerza centnfuga, de forma que el flotador 22 pueda deslizarse en el interior del tubo 12. El material flexible vuelve a su forma y a sus dimensiones originales en condiciones estaticas, de forma que el recubrimiento externo 24 contacte ajustadamente con la superficie interna del tubo 12 y pueda deslizarse en el interior del tubo 12 bajo la fuerza centnfuga. Se puede aplicar un lubricante de silicona a la superficie interna del tubo 12 para contribuir al movimiento deslizante del flotador 22.

El flotador 22 incluye un recubrimiento interno 26 que tiene un paso u orificio axial 28 que forma un paso. El recubrimiento interno 26 esta acoplado al recubrimiento externo 24 por medio de un agente adherente u otro procedimiento adecuado. El recubrimiento interno 26 esta fabricado de un material ngido que es estable dimensionalmente durante el centrifugado, de forma que no se produzca sustancialmente ninguna distorsion durante el centrifugado. El orificio axial 28 tiene una longitud y un diametro adecuados para expandir una fraccion del material de muestra durante el centrifugado. En una realizacion de la invencion, el orificio axial 28 tiene un diametro interno de aproximadamente 1,265 mm y una longitud de aproximadamente 4,0 mm. Preferentemente, el recubrimiento interno 26 esta fabricado de un plastico tal como poliestireno que no interfiere con los componentes de la muestra. Se concibe que el flotador 22 sea ejemplar de un dispositivo adecuado de centrifugado con capacidad para separar y expandir una fraccion celular. Se comprendera que hay otros dispositivos que pueden utilizarse durante el centrifugado para separar fracciones de celulas raras. Normalmente, los dispositivos adecuados incluyen un paso o un area estrechados para alargar capas constituyentes durante el centrifugado para permitir la separacion de las capas constituyentes.

El flotador 22 esta dimensionado para caber en el tubo 12 y deslizarse por el interior del tubo 12 mientras se centrifuga para asentarse entre las capas de densidad seleccionada del lfquido de muestra y forzar al componente diana a entrar en el orificio axial 28 del flotador 22. El orificio axial 28 del flotador 22 tiene un volumen interno adecuado para recoger una porcion sustancial del componente diana. El volumen interno y el diametro del flotador expanden de forma eficaz la capa del componente diana. En la patente U.S. n° 5.393.674 de Levine et al. se da a conocer un ejemplo de este tipo de dispositivo de recoleccion de celulas.

Se selecciona el flotador 22 para que tenga una densidad para complementar el componente diana y la muestra, de forma que el componente diana se junta en el orificio axial 28 permitiendo que el flotador 22 se asiente en un punto predeterminado en la muestra. En una realizacion de la invencion, el flotador 22 tiene una densidad para asentarse entre la capa resultante de plasma y la capa de globulos rojos despues del centrifugado. En la presente realizacion, las celulas raras que se juntan normalmente en la superficie de contacto entre las capas de plasma y de globulos rojos que se juntan en el orificio axial 28 donde pueden ser recuperadas.

Se centrifuga la muestra a una tasa suficiente para separar los diversos constituyentes en capas. El centrifugado puede ser a una velocidad para producir una fuerza de centrifugado de 400 G hasta 800 G, dependiendo del lfquido de muestra. En realizaciones, el centrifugado puede producir una fuerza de 1.000 G o mas.

El procedimiento de la invencion puede ser una seleccion positiva o una seleccion negativa para recolectar componentes, y en particular celulas raras. En el procedimiento de seleccion positiva, se mezcla un lfquido de muestra con al menos un anticuerpo que tiene una afinidad por el componente diana. Una seleccion negativa mezcla la muestra con un anticuerpo que tiene una afinidad por las celulas contaminantes, tales como leucocitos y/o globulos rojos. Los reactivos de anticuerpos adecuados de seleccion negativa en forma de conjugados y complejos especializados estan disponibles en StemCell Technologies Inc. y Miltenyi BioTech GmbH. Los anticuerpos no derivados estan disponibles en otras fuentes, tales como Pharmagen, Inc. Entonces, se puede centrifugar la mezcla resultante utilizando el dispositivo flotador de recoleccion para recolectar el componente diana enriquecido. Antes del centrifugado, se puede combinar la muestra con un medio de gradiente de densidades como se conoce en la tecnica para aumentar la separacion del componente diana.

El procedimiento de recoleccion de seleccion positiva en una realizacion de la invencion utiliza un soporte de material particulado que tiene un recubrimiento de anticuerpo con una afinidad hacia el componente diana. En realizaciones preferentes, el soporte de material particulado es una cantidad de microperlas de plastico con un recubrimiento de un anticuerpo con una afinidad de asociacion con las celulas raras a ser recolectadas y, en particular, celulas tumorales.

La densidad de las microperlas y la densidad del flotador estan coordinadas para recoger las microperlas en el orificio axial del flotador. La recoleccion de seleccion positiva utiliza microperlas que tienen un tamano de partfcula de: 0,05 pm a 7 pm, y normalmente de 4 a 5 pm, y una densidad inferior a la de los globulos blancos. Las

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microperlas pueden tener una densidad en el intervalo de 1,00 a 1,05 y, preferentemente, 1,02 a 1,03. Las microperlas y las celulas raras capturadas tienen una densidad de forma que estan concentradas en el flotador cuando se centrifugan la muestra y el flotador. El flotador tiene una densidad apropiada, de forma que el flotador se asiente en la muestra despues del centrifugado, donde se asientan normalmente las celulas raras. En la presente realizacion, las microperlas son suficientemente ligeras para flotar por encima de las capas centrifugadas de globulos blancos y rojos. Preferentemente, el flotador tiene una densidad para flotar por encima de las capas de globulos blancos y rojos para recolectar las microperlas.

Las microperlas estan fabricadas de un material adecuado que es no reactivo con el componente diana y, en particular, es no reactivo con las celulas raras. Los materiales adecuados incluyen poliacrilamidas, poliuretanos, polisulfonas, resinas fluoradas o cloradas, tales como polivinilcloruro, polietileno, polipropileno, policarbonatos y poliesteres. El tamano de partfcula es normalmente de 4 a 5 pm, aunque el tamano de partfcula puede variar dependiendo del componente diana y del diametro interno del flotador. Un numero de microperlas disponibles comercialmente tienen un antigeno adherido a la superficie de las microperlas. El anticuerpo puede estar unido directamente a la superficie de la microperla o por medio de un agente de adherencia intermedio. Las microperlas adecuadas recubiertas de anticuerpos estan disponibles comercialmente en Miltenyi Biotec GmbH. Un ejemplo de microperla adecuada esta disponible en Miltenyi Biotec con el nombre comercial MACS CD 27.

El anticuerpo en el procedimiento de seleccion positiva tiene una afinidad de asociacion con las celulas raras y esta seleccionado segun las celulas raras diana a ser recolectadas de la muestra. Ejemplos de celulas raras a ser recolectadas incluyen celulas tumorales, celulas fetales. Ejemplos de celulas tumorales que pueden estar asociadas al soporte de material particulado pueden ser de origen epitelial y pueden estar localizadas o no localizadas. Las celulas tumorales pueden ser de la vejiga, del cerebro, de la mama, del colon, del rinon, del hugado, del pulmon, del ovario, del pancreas, de la prostata, del recto y del estomago. Las celulas tumorales tambien pueden tener la forma de sarcoma, tal como fibrosarcoma o rabdosarcoma, tumor hematopoyetico del linaje linfoide o mieloide, melanoma, teratocarcinoma, neuroblastoma o glioma.

Preferentemente, las microperlas tienen un area superficial suficiente para contener una cantidad del anticuerpo seleccionado para unirse con una cantidad eficaz de las celulas raras que estan siendo seleccionadas. La cantidad de las microperlas combinadas con la muestra puede variar con la afinidad del anticuerpo, con la concentracion de las celulas raras en la muestra, con la naturaleza de la muestra y con el volumen de la muestra.

El procedimiento de la invencion es adecuado para ser utilizado en la recoleccion de celulas raras de diversos lfquidos corporales y, en particular, sangre anticoagulada. Otros lfquidos que pueden ser analizados en busca de un contenido de celulas raras incluyen la orina, la saliva, el lfquido linfatico, el lfquido espinal, el semen, el lfquido amniotico, los lfquidos de cavidades y los extractos de tejido.

Un procedimiento, que no se encuentra bajo la invencion reivindicada, se lleva a cabo utilizando el tubo 12 de centrifugado y el flotador 28. En realizaciones preferentes, se vacfa o se llena el tubo 12 con un gas inerte a una presion interna subatmosferica. La muestra que ha de ser sometida a ensayo es transferida de un tubo primario de toma de muestras por medio de un dispositivo de transferencia que tiene una aguja o canula doble de perforacion. La aguja se extiende desde el dispositivo de transferencia hasta el tubo perforando el tope en el tubo 12. La presion reducida en el tubo 12 succiona la muestra de lfquido al interior del tubo 12. Se puede proporcionar un gel tixotropico en el tubo 12 segun se conoce en la tecnica para preservar la formacion de bandas en la muestra cuando es centrifugada. Se pueden anadir diversos agentes de separacion adicionales, tinciones y similares al tubo 12 para promover la separacion y la identificacion de componentes. Se proporcionan las microperlas que contienen el anticuerpo en el tubo 12 y son mezcladas con la muestra de lfquido mediante una sacudida o agitacion suave. Entonces, se incuba la muestra para unir el componente diana a las microperlas.

Se centrifugan el tubo, el flotador y la muestra a una velocidad suficiente y durante un tiempo necesario para separar los constituyentes de la muestra en capas y forzar a las microperlas y al componente diana atrapado a entrar en el orificio axial del flotador. La muestra puede ser centrifugada a una velocidad para proporcionar suficiente fuerza de centrifugado para provocar la separacion de las capas. Se detiene lentamente y se retira el tubo de la centrifugadora. Entonces, una aguja o canula perfora el tope y se inserta en el orificio axial para retirar la muestra que contiene las microperlas. La muestra recolectada es procesada y analizada adicionalmente mediante diversos procedimientos segun se conoce en la tecnica. En una realizacion, las celulas recolectadas son analizadas utilizando un citometro de flujo. Las celulas raras u otros componentes diana pueden ser lavados y separados de las microperlas y del anticuerpo de union mediante procedimientos conocidos. Las celulas raras recolectadas resultantes estan significativamente enriquecidas en comparacion con muchos procedimientos anteriores y tienen un nivel sustancialmente inferior de contaminante de globulos rojos y blancos.

En una realizacion de la invencion, el procedimiento es un procedimiento de seleccion negativa para el enriquecimiento de celulas raras. Las celulas raras son enriquecidas utilizando un agente aglomerante que puede unirse con las celulas no raras contaminantes, tales como globulos rojos o globulos blancos.

En realizaciones preferentes, el agente aglomerante puede unirse a uno o mas globulos blancos y/o globulos rojos o unirse a antfgenos de superficie en las celulas. Los agentes aglomerantes pueden ser anticuerpos que pueden

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aglutinar los globulos blancos o unir los globulos blancos a los globulos rojos. Se pueden separar las partfculas mas grandes y mas densas resultantes de las celulas no raras durante el centrifugado. Los anticuerpos adecuados que pueden unirse con las celulas no raras, y capturarlas, incluyen anticuerpos antihumanos. Ejemplos de anticuerpos adecuados que pueden ser utilizados para unirse con los globulos blancos (leucocitos) incluyen los anticuerpos leucocitarios CD tales como CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD28, CD36, CD42a, CD43, CD44, CD45, CD45R, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD57 y CD61. Otros agentes aglomerantes que pueden ser utilizados incluyen una mezcla de CD45 antihumano, CD 19 antihumano, CD 14 antihumano y CD3 antihumano.

Preferentemente, los anticuerpos estan asociados a la superficie de las microperlas como en las realizaciones anteriores. Las microperlas en el procedimiento de seleccion negativa tienen un tamano de partfcula adecuado para la muestra y el componente diana. En general, el tamano de partfcula vana desde 0,05 pm hasta 7 pm y, preferentemente desde 4 pm hasta 5 pm. En la presente realizacion, las perlas tienen, preferentemente, una densidad superior a la densidad de los globulos blancos y, mas preferentemente de: 1,07 hasta 1,09 g/ml, y normalmente en el intervalo de 1,08 hasta 1,09 g/ml. De esta forma, las microperlas se hunden durante el centrifugado y las celulas raras se asientan por encima de las capas de globulos rojos y blancos. El flotador tiene una densidad para flotar sobre las capas de celulas no raras, de manera que las celulas raras se asienten en el orificio axial del flotador del que pueden ser retiradas.

El procedimiento de recoleccion de seleccion negativa es similar a la seccion positiva expuesta anteriormente. Se proporciona el lfquido de muestra en el tubo y es mezclado con las microperlas que contienen los anticuerpos de celulas no raras. Despues de la incubacion, se incuba y se centrifuga el tubo que contiene la mezcla durante un tiempo suficiente para provocar que las capas se separen y las celulas raras se junten en el orificio axial del flotador del que se pueden retirar las celulas raras.

En realizaciones adicionales de la invencion, el procedimiento emplea dos microperlas que tienen distintos agentes de afinidad de union para capturar dos componentes distintos. En una realizacion, se mezcla con la muestra una cantidad de primeras microperlas que tienen un agente de afinidad de union con una afinidad por celulas raras, tales como celulas tumorales. Las primeras microperlas tienen una densidad para separarse de los globulos blancos y rojos. Las primeras microperlas tienen un tamano de partfcula, una densidad y un agente de afinidad de union sustancialmente identicos que las microperlas de la seleccion positiva de la anterior realizacion. Tambien se mezcla con la muestra una cantidad de segundas microperlas que tienen un agente de afinidad de union con una afinidad por los globulos blancos, globulos rojos o una combinacion de los mismos proveniente de las celulas raras. Se centrifuga la mezcla resultante con el flotador, de forma que las primeras microperlas con las celulas raras capturadas se asientan en el paso axial, del que pueden ser recuperadas. Las segundas microperlas tienen un tamano de partfcula, una densidad y un agente de afinidad de union sustancialmente identicos que el procedimiento de seleccion negativa de la anterior realizacion. De esta forma, las segundas microperlas se separan de las primeras microperlas durante el centrifugado para separar las celulas contaminantes, tales como los globulos rojos y/o blancos de las celulas diana y de las primeras microperlas. Las primeras microperlas tienen un tamano de partfcula y una densidad para ser recogidas en el paso axial del flotador para recuperar las celulas diana.

Con referencia a la Figura 3, se muestra una realizacion del dispositivo 30 de centrifugado para ser utilizado en el procedimiento segun la invencion. El dispositivo 30 es particularmente adecuado para diversas manipulaciones de celulas despues de la separacion de una muestra. Por ejemplo, se pueden separar las celulas raras de una muestra y pueden ser sometidas a diversos procedimientos de deteccion y de verificacion con el dispositivo 30. En la presente realizacion, el dispositivo 30 incluye un recipiente hueco 32 que tiene una forma sustancialmente rectangular. El recipiente 32 incluye una pared frontal 34, y una pared trasera opuesta 36 que tiene una longitud y una anchura. Las paredes laterales opuestas 38 y una pared inferior 40 se extienden entre la pared frontal 34 y la pared trasera 36 para formar una cavidad abierta 42. El recipiente 32 incluye un extremo abierto 44 para recibir un tope 46 para cerrar la cavidad 42. Preferentemente, el recipiente 32 esta fabricado de un material transparente tal como vidrio o plastico.

El recipiente 32 esta dimensionado para recibir un volumen de una muestra biologica adecuada para el analisis de un componente diana. En general, el recipiente 32 tiene un volumen de 8 ml a 10 ml y, preferentemente, aproximadamente de 9 ml. En la realizacion ilustrada, las paredes laterales 38 del recipiente 32 tienen una dimension para definir un grosor de la cavidad 42 que es suficientemente delgado para visualizar, detectar y analizar un componente diana a traves de la pared frontal 34. Ejemplos de procedimientos adecuados de deteccion y de analisis incluyen la microscopia para visualizar las celulas en la muestra. El recipiente 32 tiene, normalmente, una longitud de 7 cm a 8 cm, y una anchura aproximada de 3 cm a 4 cm. Las paredes laterales 38 estan dimensionadas de manera que la cavidad 42 tenga un grosor de 3 mm a 6 mm y, preferentemente, aproximadamente de 4 mm.

El recipiente 32 incluye un flotador amovible 48 que puede deslizarse por el interior del recipiente 32 en la dimension longitudinal de una forma similar a la anterior realizacion. El flotador 48 esta dimensionado para caber en el interior de la cavidad 42 del recipiente 32 y tiene una dimension externa que se corresponde con la dimension interna del recipiente 32. Segun se muestra en las Figuras 3-5, el flotador 48 tiene una base 50 con una superficie inferior 54

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sustancialmente plana. La base 50 incluye un extremo anterior inclinado 56 y un extremo posterior inclinado 58. Hay acoplados varios resaltes 60 a la superficie superior 54 de la base 50.

Segun se muestra en la Figura 5, los resaltes 60 se extienden en la direccion longitudinal con respecto a la dimension longitudinal de la base 50. Los resaltes 60 estan alineadas en pares para formar canales 62 que se extienden la longitud de la base 50 entre resaltes adyacentes. Los resaltes 60 tienen una altura para encajar estrechamente en la superficie interna del recipiente 32. Los canales 62 estan dimensionados para separar y alargar las capas durante el centrifugado.

En la presente realizacion, se coloca una muestra biologica, tal como una muestra de sangre, en el recipiente 32. Se mezcla con la muestra una cantidad de microperlas 64 que tienen un agente de afinidad de union por un componente diana. Entonces, se centrifuga el recipiente 32 como en la anterior realizacion para recoger las microperlas 64 con el componente diana capturado en los canales longitudinales 62 del flotador 48. Entonces, se pueden analizar las microperlas 52 y el componente diana capturado visualizando el componente diana en el interior del recipiente 32 mediante procedimientos de microscopia segun se conoce en la tecnica.

En las realizaciones mostradas en la Figura 5, la muestra de sangre despues del centrifugado, se separa formando una capa de globulos rojos 66, una capa de fraccion celular 68 de granulocitos, una fraccion 70 de celula mononuclear, una fraccion 72 de plasma y una superficie 74 de contacto plaqueta/plasma. En un procedimiento de seleccion positiva, las microperlas 64 tienen una afinidad por el compuesto diana y se recogen en los canales 62. De forma alternativa, las microperlas 64 pueden tener una afinidad por los globulos blancos y/o rojos en un procedimiento de seleccion negativa. Los canales 62 estan formados entre resaltes 60 y estan rodeados por la pared superior 34 del recipiente 32. El borde anterior inclinado 56 y el borde posterior inclinado 58 desvfan la muestra a traves de los canales 62 segun se desliza el flotador 48 por el recipiente 32. Se retienen las microperlas en una capa delgada en los canales 62 cerca de la pared superior 34 del recipiente 32, de forma que se puedan visualizar las microperlas 64 a traves de la pared superior 34 mediante microscopia u otros procedimientos analfticos, segun se conoce en la tecnica. Preferentemente, la pared frontal 34 del recipiente 32 es sustancialmente plana para evitar la distorsion optica asociada normalmente con los recipientes cilmdricos.

Ejemplo

Este ejemplo compara las celulas tumorales recolectadas de una muestra con y sin una seleccion negativa. Se compararon las separaciones del recolector de 6,0 ml de sangre completa recien recogida que fueron adicionadas con 0, 50 y 500 celulas tumorales de prostata PC-3 cultivadas. Se mezclo un coctel de anticuerpos obtenido de StemCell Technologies, Inc. con el nombre comercial RosetteSep con cada una de las muestras de sangre y fueron incubados durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se preparo una muestra de sangre de control sin el tratamiento de anticuerpos. El coctel de anticuerpos proporciono una seleccion negativa para retirar los globulos blancos no deseados.

Las muestras de sangre fueron estratificadas sobre un medio de densidad en un tubo 16 x 100 PET Vacutainer obtenido en Becton Dickinson que contiene un flotador recolector y 2 ml de medio de densidad POLYMORPHPREP™. Se centrifugaron las muestras en una centrifugadora de cubo oscilante durante 30 minutos a 20°C a un tasa de aproximadamente 650 g. La muestra de control mostro la presencia de globulos blancos con las celulas tumorales en el flotador recolector. El tratamiento con anticuerpos demostro celulas tumorales recogidas en el flotador recolector con una poblacion muy reducida de globulos blancos. Se retiraron las celulas tumorales del flotador recolector. Una citometna de flujo demostro la recuperacion de aproximadamente un 90% de celulas tumorales.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de recoleccion de componentes de un material de muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(i) proporcionar un material de muestra en un recipiente (32) de muestreo, teniendo dicho recipiente (32) de muestreo un flotador (48) con un paso para recibir y alargar capas de componentes de muestra a ser recolectados de dicha muestra, recibiendose dicho flotador (48) en dicho recipiente (32), que tiene una dimension y una forma que complementan el interior de dicho recipiente (32), e incluye resaltes (60) que definen un canal longitudinal (62) entre dicho flotador y dicho recipiente para recibir y alargar dichos componentes diana durante el centrifugado,

(ii) proporcionar en dicho recipiente (32) de muestreo un soporte (64) de material particulado que tiene al menos un anticuerpo con una afinidad para asociarse con al menos un componente en dicha muestra asociada con dicho soporte (64) de material particulado, y mezclar dicho soporte (64) de material particulado con dicha muestra,

(iii) centrifugar dicha muestra (32) con suficiente fuerza G para separar componentes de dicha muestra y para forzar a dicho soporte (64) de material particulado y al componente diana de dicha muestra a entrar dicho paso (62), y

(iv) retirar dicho componente diana de dicho paso (62).
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho anticuerpo tiene una afinidad por capturar dicho componente diana, comprendiendo dicho procedimiento centrifugar dicho recipiente durante suficiente tiempo y a una velocidad suficiente para recoger dicho soporte de material particulado y el componente diana capturado en dicho canal longitudinal.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho recipiente tiene una superficie interna, y dicho flotador tiene una superficie externa que complementa dicha superficie interna.
4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que dicho al menos un anticuerpo esta asociado a una superficie de dicho soporte de material particulado.
5. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que dicho soporte comprende una cantidad eficaz de microperlas que tienen una densidad superior a una densidad de los globulos blancos y en el que dicho anticuerpo tiene una afinidad por los globulos blancos.
6. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(i) proporcionar la muestra en un tubo de muestreo, conteniendo dicho tubo de muestreo un flotador dimensionado para caber en el interior de dicho tubo de muestreo y teniendo un paso para recibir y alargar capas de constituyentes de sangre a ser recolectados de dicha muestra,

(ii) mezclar dicha muestra con al menos un soporte de material particulado que contiene un anticuerpo que tiene una afinidad de asociacion con un componente espedfico de muestra,

(iii) centrifugar dicho tubo y dicha muestra con suficiente fuerza G para mover dicho flotador hacia un extremo de dicho tubo y para forzar a un componente diana de dicha muestra a entrar en dicho paso, y

(iv) retirar dicho componente diana de dicho paso.
7. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, comprendiendo dicho procedimiento:

(i) proporcionar una muestra en un tubo de muestreo, conteniendo dicho tubo de muestreo un flotador dimensionado para caber en el interior de dicho tubo de muestreo y teniendo un paso para recibir y alargar capas de constituyentes de sangre a ser recolectados de dicha muestra,

(ii) mezclar dicha muestra con una cantidad de primeras perlas portadoras que tienen un recubrimiento de un primer anticuerpo que tiene una afinidad de asociacion con un componente diana en dicha muestra, y una cantidad de segundas perlas portadoras que tienen un recubrimiento de dicho segundo anticuerpo que tiene una afinidad de asociacion con un componente distinto de dicho componente diana,

(iii) centrifugar dicho tubo y dicha muestra con suficiente fuerza G para mover dicho flotador hacia un extremo de dicho tubo y para forzar a dichas primeras perlas portadoras y componente diana a entrar en dicho paso, y

(iv) retirar dichas primeras perlas portadoras y componente diana de dicho paso.
8. El procedimiento de la reivindicacion 6 o 7, que comprende, ademas, la etapa de incubar dicha muestra antes del centrifugado.
9. El procedimiento de la reivindicacion 6 o 7, que comprende, ademas, la etapa de separar dicho componente diana de dicho soporte de material particulado.
10. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que la muestra es una muestra de sangre completa, y dicho procedimiento comprende las etapas de:

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(i) proporcionar la muestra de sangre completa en un tubo de muestreo, conteniendo dicho tubo de

muestreo un flotador dimensionado para caber en el interior de dicho tubo de muestreo y teniendo un

paso para recibir y alargar capas de constituyentes de sangre a ser recolectados de dicha muestra,

(ii) mezclar dicha muestra con una cantidad de primeras perlas portadoras que tienen un recubrimiento de un primer anticuerpo que tiene una afinidad de asociacion con un constituyente diana en dicha muestra, y una cantidad de segundas perlas portadoras que tienen un recubrimiento de dicho segundo anticuerpo que tiene una afinidad de asociacion con los globulos blancos,

(iii) centrifugar dicho tubo y dicha muestra con suficiente fuerza G para mover dicho flotador hacia un

extremo de dicho tubo y forzar a dichas primeras perlas portadoras y constituyente diana a entrar en

dicho paso, y

(iv) retirar dichas primeras perlas portadoras y constituyente diana de dicho paso.