ES2586206T3

ES2586206T3 - Composiciones y métodos de anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para subpoblaciones de linfocitos T

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Publication number: ES2586206T3
Application number: ES10012392.6T
Authority: ES
Inventors: Mark A. Exley; Samuel B. Wilson; Steven P. Balk
Original assignee: General Hospital Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc; Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Current assignee: General Hospital Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc; Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 2000-06-19
Filing date: 2001-06-19
Publication date: 2016-10-13
Anticipated expiration: 2021-06-19
Also published as: US20150299320A1; EP2336187A3; EP2336187B8; ES2389645T3; US20070160600A1; JP2004501165A; EP1297017A2; US8138314B2; PT1297017E; US20020164331A1; EP2336187B1; EP2336187A2; US20120258040A1; AU2001268599A1; DK1297017T3; CA2413866C; JP2013014587A; HK1158219A1; WO2001098357A2; CA2413866A1

Abstract

Un fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo purificado, en donde dicho fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo - reconoce y se une al bucle CDR3 de la cadena α de un receptor de antígeno de células T (TCR) invariante en una célula NK T invariante, - (i) se une (ii) inhibe la expansión o activación de al menos una sub-población de células T seleccionada del grupo de: células NK T, células T CD1d-reactivas y células T JαQ+, y - no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas, en donde dicho fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente o una molécula Fab, y en donde dicho derivado de anticuerpo es un anticuerpo conjugado a una toxina o radiomarcador.

Description

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de tipo 1.

En realizaciones deseables de cada método de la invención, el anticuerpo o la combinación de anticuerpos se une preferencialmente al linfocito T invariante. La subpoblación de linfocitos T, linfocitos T o linfocitos T que expresan el TCR son linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+. Los linfocitos T NK deseables son 5 linfocitos T reactivos para CD1dT, linfocitos T invariantes, linfocitos T no invariantes reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+. Los linfocitos T reactivos para CD1d deseables o los linfocitos T JQ+ son linfocitos T invariantes. Los linfocitos JQ+ deseables son linfocitos T V24+ JQ+. El anticuerpo o combinación de anticuerpos se une preferencialmente a un bucle CDR3 de un TCR expresado en el linfocito T y (i) se une preferencialmente y (ii) inhibe la expansión o activación del linfocito T unido. De forma deseable, el anticuerpo o combinación de anticuerpos se une 10 preferencialmente y (ii) inhibe la expansión o activación de sólo una subpoblación de linfocitos T seleccionada del grupo de linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JQ+. De forma deseable, un bucle CDR3 de un TCR unido por un anticuerpo o combinación de anticuerpos de la invención se expresa por un linfocito T NK, linfocito T reactivo para CD1d, linfocito T JQ+ o linfocito T invariante. También se contempla que los linfocitos T invariantes relativos a cualquiera de los aspectos de la invención puede no ser reactivo para CD1d. Los anticuerpos marcados

15 deseables incluyen anticuerpos unidos a biotina, FITC, PE o una perla magnética.

Se debe entender que cada uno de los aspectos de la invención se aplica igualmente a los anticuerpos de la presente invención (esto es, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos, como se define en las reivindicaciones). Cada uno de los aspectos de la invención también se aplica igualmente a una combinación de anticuerpos que juntos se unen preferencialmente a un bucle CDR3 del TCR. En diversas realizaciones, los anticuerpos en una combinación

20 de anticuerpos de la invención se ponen en contacto simultánea o secuencialmente con linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ o con una muestra que contiene linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+. En otras realizaciones, los anticuerpos en una combinación de anticuerpos de la invención se administran simultánea o secuencialmente a un animal para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección.

25 Cada aspecto de la invención también se aplica a cualquier subpoblación de linfocitos T oligoclonalmente expandida específica de antígeno en animales (por ejemplo, seres humanos, otros mamíferos y aves) en respuesta a un reto antigénico dado. Estas subpoblaciones de linfocitos T oligoclonalmente expandidas específicas de antígeno incluyen los linfocitos T oligoclonalmente expandidos en respuesta a un componente inmunodominante del antígeno en múltiples individuos.

30 También se señala que la presentación de un antígeno a un linfocito T de interés no requiere una célula presentadora de antígeno (CPA). Por ejemplo, se puede usar una forma soluble o inmovilizada de una molécula presentadora de antígeno para presentar un antígeno a un linfocito T o una muestra que contiene un linfocito T de interés bajo condiciones que permitan la activación o expansión del linfocito T sin la presencia de una CPA.

Por "bucle CDR3" se quiere decir los aminoácidos en la unión que se genera por el reordenamiento entre un segmento

35 V y un segmento J de la cadena TCR- o por el reordenamiento entre un segmento V, un segmento D y un segmento J de una cadena TCR-. La identificación del bucle CDR3 se simplifica por la presencia de una cisteína conservada en el extremo del segmento V. El primer aminoácido después de esta cisteína es el primer residuo del bucle CDR3.

La secuencia de un bucle CDR3 se puede identificar fácilmente en base a un alineamiento de secuencia de la secuencia de aminoácidos de un TCR de interés con una o más secuencias de otros TCR. Por ejemplo, se puede usar 40 una tabla de Kabat que contiene un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de numerosos receptores de linfocitos T para identificar el bucle CDR3 en una cadena TCR- o en una cadena - de interés (Johnson y Wu, Nuc. Acid. Res. 29(l): 205-206, 2001; http://immuno.bme.nwu.edu). El bucle CDR3 también se puede identificar en base a un alineamiento de secuencias con uno o más TCR para los que se ha identificado el bucle CDR3 en base a la estructura cristalina de rayos x (Reinherz et al., Science 286 (5446): 1913-1921,1999). Adicionalmente, se puede

45 identificar el bucle CDR3 determinando la estructura tridimensional de la cadena de TCR de interés.

Por "anticuerpo que se une preferencialmente a un bucle CDR3, un sitio de unión a antígeno o una unión - de un TCR" se quiere decir un anticuerpo que reconoce y se une a un bucle CDR3, un sitio de unión a antígeno o una unión - de un TCR o que reconoce y se une a un bucle CDR3, un sitio de unión a antígeno o una unión - de un TCR expresado en un linfocito T, pero que sustancialmente no reconoce ni se une a otras moléculas en una muestra, por 50 ejemplo, una muestra biológica, que incluye de forma natural otras proteínas o células. La señal en el ensayo ELISA descrito en el ejemplo 1 para la unión del anticuerpo a un bucle CDR3, un sitio de unión a antígeno o una unión - de un TCR expresado en un linfocito T es deseable, al menos 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o 500 veces mayor que la de la unión a una célula de control que no es un linfocito T o a un linfocito T que expresa TCR con bucles CDR3, uniones - y sitios de unión a antígeno con secuencias de aminoácidos que son menores de

55 un 99, 95, 90, 85, 80, 70, 60, 50, 40 o 20 % idénticas a la correspondiente secuencia del bucle CDR3, unión - o sitio de unión a antígeno unido preferencialmente al anticuerpo. Se pueden generar formas del anticuerpo humanizadas o de otras especies usando técnicas estándar.

De forma deseable, el anticuerpo se "purifica", lo que quiere decir que se ha separado de otros componentes que lo

acompañan de forma natural. Típicamente, el anticuerpo está sustancialmente puro cuando es al menos un 50 %, en peso, libre de proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas naturales con las que está asociado de forma natural. De forma deseable, el anticuerpo es al menos un 75 %, de forma más deseable, al menos un 90 %, y de la forma más deseable, al menos un 99 %, en peso, puro. Se puede obtener un anticuerpo sustancialmente puro que se une

5 preferencialmente a un bucle CDR3, unión - o un sitio de unión a antígeno de un TCR, por ejemplo, usando un método de la presente invención para inmunizar un mamífero para la generación del anticuerpo, por la construcción de un hibridoma que secreta el anticuerpo, sintetizando químicamente el anticuerpo o por separación del anticuerpo a partir de fuentes naturales. Se puede someter a ensayo la pureza por cualquier método adecuado, como se describe a continuación para el aislamiento de anticuerpos.

10 Por "unión - de un TCR" se quiere decir la interfase entre las cadenas  y  de un TCR. La interfase incluye interacciones no covalentes entre los dominios variables de las cadenas  y . De forma deseable, se usa la estructura tridimensional de la unión - o un modelo de la estructura tridimensional de la unión - en el diseño de polipéptidos

o moléculas pequeñas para inmunizar un mamífero para generar un anticuerpo para la unión - del TCR. Se han notificado varias estructuras tridimensionales de la interfase entre las cadenas  y  de un TCR y se pueden usar por 15 un experto en la técnica para modelar la interfase de las cadenas  y  de un TCR expresado por un linfocito T NK, reactivo para CD1d, JQ+ o invariante. Por ejemplo, en base a la estructura modelada o real de la interfase de las cadenas  y , se puede diseñar una molécula pequeña que tenga una estructura tridimensional similar a la de una región expuesta de la interfase. Adicionalmente, se puede diseñar un polipéptido que tenga una estructura tridimensional similar a la de una porción o toda la unión - de un TCR. Por ejemplo, se puede usar una estructura

20 modelada o real de un TCR de interés para obtener una estructura modelada o real de la unión - del TCR que después se puede imitar por un polipéptido diseñado (por ejemplo, un polipéptido de aproximadamente 100 aminoácidos). Se pueden añadir engarces o enlaces covalentes entre los dominios del polipéptido diseñado de modo que se genere un polipéptido monocatenario. Para estos procedimientos de modelado, se puede usar cualquier programa de modelado estándar, tal como MolScript.

25 De forma similar, se pueden usar estos métodos para generar anticuerpos que unen preferencialmente la unión - de un TCR de interés.

Por "sitio de unión a antígeno de un TCR" se quiere decir la región de un TCR que se une a un antígeno. Esta región incluye parte de la superficie expuesta de la región variable del TCR. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno contiene el bucle CDR3 de la cadena , el bucle CDR3 de la cadena , una porción predecible de los bucles CDR1, una porción

30 predecible de los bucles CDR2 y algunas superficies estructurales cercanas.

De forma deseable, se usa la estructura tridimensional del sitio de unión a antígeno o un modelo de la estructura tridimensional del sitio de unión a antígeno en el diseño de polipéptidos o moléculas pequeñas para inmunizar un mamífero para generar un anticuerpo para el sitio de unión a antígeno del TCR. Se han notificado varias estructuras tridimensionales de sitios de unión a antígeno de los TCR (en presencia o ausencia de un antígeno) y se pueden usar 35 por un experto en la técnica para modelar el sitio de unión a antígeno de un TCR expresado por un linfocito T NK, reactivo para CD1d, JQ+ o invariante. Adicionalmente, se puedo usar una estructura modelada o real de CD1d para determinar cómo podrían interaccionar otros compuestos con linfocitos T reactivos para CD1d. En base a la estructura modelada o real de un sitio de unión a antígeno, se puede diseñar una molécula pequeña o polipéptido que tenga una estructura tridimensional similar a la de una porción o todo el sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, se puede usar una

40 estructura modelada o real de un TCR de interés para obtener una estructura modelada o real del sitio de unión a antígeno del TCR que después se puede imitar por un polipéptido diseñado (por ejemplo, un polipéptido de aproximadamente 100 aminoácidos). Se pueden añadir engarces o enlaces covalentes entre los dominios del polipéptido diseñado de modo que se genere un polipéptido monocatenario. Para estos procedimientos de modelado, se puede usar cualquier programa de modelado estándar, tal como MolScript.

45 Por "linfocito T invariante" se quiere decir un linfocito T que tiene un receptor de antígeno de linfocitos T invariantes reactivos para CD1d. Por "receptor de antígeno de linfocitos T invariantes reactivos para CD1d" se quiere decir un receptor de antígeno de linfocitos T que reconoce CD1d y tiene una cadena alfa que se genera a partir de un reordenamiento entre V24 y JQ que produce poca o ninguna diversidad en la región N (Kent et al., Human Immunology 60:1080-1089, 1999). En ratones, la cadena TCR- invariante se genera a partir de un reordenamiento

50 entre V14 y J281 que produce poca o ninguna diversidad en la región N. El reordenamiento equivalente se puede producir en otros mamíferos (por ejemplo, ratas) y en aves. Aunque la cadena TCR- invariante humana se empareja preferencialmente con V11, se puede emparejar con otras V. El receptor de antígeno de linfocitos T invariantes reactivos para CD1d humano reconoce CD1d, pero no los miembros de la familia CD1a, CD1b o CD1c estrechamente relacionados (Exley et al., J. Exp. Med. 186 (1): 109-120, 1997).

55 Por "fragmento" se quiere decir un polipéptido que tiene una región de aminoácidos consecutivos idéntica a la región correspondiente de un anticuerpo de la invención. El fragmento tiene la capacidad de unir, activar y/o expandir linfocitos T ex vivo o in vivo, como se determina usando los ensayos descritos en el presente documento. De forma deseable, el número, la actividad o la pureza de las células expandidas es al menos de un 20, 40, 60, 80 ó 90 % de lo producido por un anticuerpo de la invención, como se mide usando los ensayos proporcionados en el presente

60 documento. De forma deseable, la unión del fragmento al bucle CDR3, unión - o sitio de unión a antígeno de un TCR

es al menos de un 20, 40, 60, 80 ó 90 % de la de un anticuerpo de la invención.

Por "derivado" se quiere decir un anticuerpo o fragmento de la invención que se modifica químicamente o a través de tecnología de fusión génica o síntesis química, de modo que esté covalentemente unido a una toxina, compuesto terapéuticamente activo, enzima, citocina, radiomarcador, marcador fluorescente o etiqueta de afinidad. El grupo unido 5 covalentemente se puede unir al extremo amino, extremo carboxi, entre el extremo amino y carboxi, o a una cadena lateral de un aminoácido en el anticuerpo o fragmento. Por "etiqueta de afinidad" se quiere decir un péptido, proteína o compuesto que se une a otro péptido, proteína o compuesto. En una realización deseable, se usa la etiqueta de afinidad para purificación o inmovilización del derivado. En otra realización deseable, se usa la etiqueta de afinidad o toxina para dirigir el anticuerpo o fragmento a una célula, tejido o sistema de órgano específico in vivo. Aún en otra 10 realización deseable, se usa el marcador fluorescente o radiomarcador para la obtención de imágenes del derivado. Aún en otra realización deseable, se usa el compuesto terapéuticamente activo o radiomarcador para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno. En otra realización, el derivado o fragmento de un anticuerpo de la invención tiene una estabilidad incrementada o solubilidad incrementada en comparación con el anticuerpo. También se contempla que el anticuerpo, fragmento o derivado de la invención se puede unir no covalentemente a otro

15 anticuerpo unido covalentemente a una toxina, compuesto terapéuticamente activo, enzima, citocina, radiomarcador, marcador fluorescente, marcador magnético o etiqueta de afinidad.

Por "humanizado" se quiere decir la alteración de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de modo que se provoquen menores anticuerpos y/o respuestas inmunitarias contra el anticuerpo humanizado cuando se administra a un ser humano. Para el uso del anticuerpo en un mamífero, aparte de un ser humano, se puede convertir un anticuerpo

20 de la invención a ese formato de especie.

Por "anticuerpo bifuncional” se quiere decir un anticuerpo que incluye un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo unido covalentemente a otro anticuerpo u otro fragmento de un anticuerpo. De forma deseable, ambos anticuerpos o fragmentos se unen a diferentes epítopos expresados en el mismo linfocito T. De forma deseable, al menos un anticuerpo incluido en el anticuerpo bifuncional es un anticuerpo de la invención. De forma deseable, el anticuerpo se

25 une a CD3, CD161 o tanto CD3 como CD161. En otras realizaciones deseables, el anticuerpo se une a uno o más de los siguientes: V24, CD94, V11 y anti-CD28.

Por "péptidos cíclicos" se quiere decir un péptido no lineal que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 60 %, de forma deseable un 80 %, de forma más deseable un 90 %, y de la forma más deseable un 100 % idéntica a una región en el bucle CDR3 de un TCR. En una realización deseable, la secuencia de aminoácidos del péptido incluye 30 CVVSDRGSTLGRLADCG (SEQ ID N.º 1) del bucle CDR3 del TCR- invariante humano o una región de al menos 5, 8, 10 ó 15 aminoácidos consecutivos de SEQ ID N.º 1. En otra realización deseable, la secuencia de aminoácidos del péptido es idéntica a la de SEQ ID N.º 1. El péptido se puede ciclar por la formación de un enlace covalente entre el grupo amino N terminal del péptido o la cadena lateral de residuo y el grupo carboxilo C terminal o la cadena lateral de un residuo. Por ejemplo, se puede formar un péptido lactama por la ciclación entre el grupo amino N terminal o un 35 grupo amino de una cadena lateral de aminoácidos y el grupo carboxilo C terminal o una cadena lateral que contiene un carboxilo o amida, tal como la de ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina o asparragina. Otras ciclaciones posibles incluyen la formación de un tioéter por la reacción de un grupo tiol en una cadena lateral de cisteína con el grupo amino N terminal, grupo carboxilo C terminal, o la cadena lateral de otro aminoácido. También se puede formar un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína. También se contempla que se puede usar un péptido que tiene una

40 secuencia de aminoácidos de al menos un 60 %, de forma deseable un 80 %, de forma más deseable un 90 % y de la forma más deseable un 100 % idéntica a una región de otro bucle o superficie expuesta de la cadena alfa o beta del TCR invariante u otro TCR para la generación de anticuerpos para otro TCR. Los bucles deseables incluyen el bucle CDR3 de la cadena  o  de un linfocito T NK, linfocito T reactivo para CD1d, o linfocito T JQ+.

Por "mamífero deficiente en linfocitos T invariantes o CD1d" se quiere decir un mamífero que cuando se compara con

45 otros mamíferos de la misma especie tiene una cantidad reducida de o carece de moléculas CD1d funcionales, linfocitos T invariantes, cadenas TCR- o cadenas TCR-. Ejemplos deseables de estos mamíferos incluyen un ratón inactivado en CD1d (Sonoda et al., 1999, supra), un mamífero no tolerante al TCR invariante, un mamífero en el que se han retirado los linfocitos T invariantes, un mamífero que carece de parte de la cadena TCR- (Cui et al., Science 278:1623, 1997), un mamífero que carece de parte de la molécula VB8 o animales con linfocitos T NK, invariantes o

50 subpoblaciones relativas eliminadas por anticuerpos, citocinas o estimulación antigénica repetida.

Por "inmunizar" se quiere decir administrar a un animal (por ejemplo, un mamífero o un ave) cualquier péptido acoplado a transportadores, linfocitos T invariantes, o ambos, usando procedimientos estándar. Las vías de administración deseables incluyen vía intraperitoneal, intramuscular, intradérmica y subcutánea. La dosis y frecuencia de administración se puede determinar usando procedimientos estándar.

55 Por "aislar anticuerpos" se quiere purificar el anticuerpo de antisuero, líquido ascítico o sobrenadante de hibridomas. Los anticuerpos se pueden purificar por un experto en la técnica usando técnicas estándar, tales como las descritas en Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, p. 11.13.1-11.13.3, John Wiley & Sons, 1995). De forma deseable, el anticuerpo es al menos 2, 5 ó 10 veces tan puro como el material de partida, medido usando electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía en columna, densidad óptica, análisis de HPLC, o análisis de

60 western para detectar una reducción en la cantidad de proteínas contaminantes o ELISA para detectar un incremento

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corporal. En otra realización, la muestra es una muestra de médula ósea o cordón umbilical.

Por "purificar los linfocitos T" se quiere decir aislar las células de una muestra que contiene de forma natural otras células. Los linfocitos T se pueden purificar usando un anticuerpo de la invención o un anticuerpo anti-V24, CD4, CD8, CD56, CD161 o V11 en procedimientos estándar. Los métodos de purificación deseables incluyen de

5 clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunoprecipitación, cromatografía de inmunoafinidad, purificación por inmunoafinidad de perlas magnéticas y fijación celular con un anticuerpo unido a la placa. De forma deseable, los linfocitos T purificados son al menos 2, 5, 10, 50, 100, 500 ó 900 veces tan puros como la muestra original, como se mide usando análisis de ELISA o FACS para detectar la unión de los linfocitos T purificados a marcadores para la subpoblación de linfocitos T a la que pertenecen.

10 Por "subpoblación de linfocitos T purificada" se quiere decir una subpoblación de linfocitos T sustancialmente pura que está aislada de una muestra que contiene de forma natural otras células. La subpoblación de linfocitos T purificados se enriquece por al menos uno de los siguientes: linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+. De forma deseable, la subpoblación de linfocitos T se enriquece por sólo uno de los siguientes: linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+. La subpoblación de linfocitos T purificados es más pura que la pureza de la

15 subpoblación de linfocitos T que se encuentra en la naturaleza. De forma deseable, la subpoblación de linfocitos T purificada está al menos un 1, 5, 15, 30, 50, 75, 90 ó 99 %, en número, libre de células con las que está asociada de forma natural. Típicamente, estas otras células que están asociadas con la subpoblación de linfocitos T difieren de los linfocitos T pertenecientes a la subpoblación que no expresan una molécula de superficie celular, que no se unen a ligando, o que no tienen una actividad de la subpoblación de linfocitos T.

20 Por "complejo" se quiere decir un linfocito T unido a anticuerpo en el que la unión del anticuerpo al linfocito T es suficiente para permitir el aislamiento o la separación del complejo de una muestra.

Por "recuperar las células del complejo" se quiere separar los linfocitos T del anticuerpo usando procedimientos estándar.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

25 Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una ilustración esquemática de la relación entre los linfocitos T NK, linfocitos T invariantes reactivos para CD1d, linfocitos T no invariantes reactivos para CD1d y linfocitos T JQ+.

La figura 2A es un histograma de la tinción con un clon de linfocito T de control con los anticuerpos monoclonales anti-bucle CDR3 (3A6 o 6B11) o un control apareado de isótopo 6B11 (gGg1). La figura 2B es un histograma de la

30 correspondiente tinción de un clon de linfocito T NK invariante.

Las figuras 3A y 3B son gráficas de puntos que muestran el análisis de FACS del reconocimiento de linfocitos T V24+ por el anticuerpo monoclonal 6B11. Los linfocitos T V24+ purificados con FACS se expandieron ex vivo durante 2 semanas con FA y se analizaron usando anticuerpos monoclonales V24-PE y V11-FITC (figura 3A) o V24-PE y 6B11-FITC (figura 3B).

35 Las figuras 4A y 4B son gráficas que muestran la expansión de células clasificadas de V24 que se cultivaron durante tres semanas con anticuerpo monoclonal anti-bucle CDR3 6B11 unido a placa o FA, respectivamente.

Las figuras 5A y 5B son gráficas que muestran el análisis de FACS de linfocitos T NK invariantes en un paciente antes y durante el tratamiento con IL-12, respectivamente. Se analizó sangre periférica de un paciente con cáncer de células renales avanzado para determinar las células CD3+V24+ inmediatamente antes del tratamiento con IL-12 y a la

40 finalización del primer ciclo de 6 semanas. Se han observado en todos los casos (n=10) fracciones bajas comparables de linfocitos T V24+, con ningún incremento significativo después del tratamiento.

Las figuras 6A-6C son gráficas que muestras la producción de IL-4 por células mononucleares de sangre periférica en masa, linfocitos T V24+ e invariantes policlonales ("poli."), respectivamente. Estas células se expandieron con -GalCer y después se estimularon con tampón, anticuerpo 6B11 unido a la placa, transfectantes cultivados

45 conjuntamente con Hela/CD1d o bien FA. Se determinó la cantidad de IL-4 secretada usando análisis de ELISA estándar.

Las figuras 7A-7C son gráficas que muestran la expansión comparable de linfocitos T NK invariantes fenotípica y funcionalmente idénticos de la misma muestra de donante sano por 6B11 y -GalCer. Se expandieron células clasificadas con 'MoFlo' V24 con células dendríticas autólogas pulsadas con -GalCer, anticuerpo monoclonal 6b11

50 o mitógeno (FA) durante una expansión de aproximadamente cuatro semanas con IL-2 sola.

La figura 8A es una gráfica que muestra el reconocimiento de los linfocitos T en masa a partir de una muestra de sangre periférica por el anticuerpo 3A6. La figura 8D es una gráfica de la dispersión frontal (FSC) y lateral (CDC) de células que muestra el control de paso para las células linfáticas que se analizaron usando el anticuerpo 6B11, 3A6 o

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chip está diseñado personalizado para el análisis cuantitativo incrementando el número de características tratadas para la detección de cada transcrito específico. Los valores para el número de copias de ARNm específico por millón después del tratamiento con control de IgG1 se representan por círculos abiertos: O, y sus correspondientes números de copias después de la activación con el tratamiento anti-CD3 por círculos cerrados: . Los genes que se 5 denominaron significativamente diferentes por un algoritmo de expresión génica y que cambiaron por al menos 2 veces se indican por una línea en negrita. La letra (A) denota que no se detectó el transcrito, y se debe señalar que los transcritos para MlP-1 y MIP-1 se suprimieron por estimulación anti-CD3 en el clon ME10. La figura 26C es una gráfica que muestra la cantidad de citocinas producidas por sobrenadantes a partir de diversos clones de linfocitos T V24JQ, en base al análisis en ELISA cuantitativo. La figura 26D es una gráfica que muestra la expresión de CD40L.

10 El clon de linfocito T BW5 se activó durante cuatro horas con estimulación de PMA/ionomicina y se analizó por citometría de flujo.

Las figuras 27A y 27B muestran la restricción para CD1d de la activación de linfocitos T V24JQ. La figura 27A muestra la restricción de la liberación y proliferación de citocina. Los clones de linfocitos T se cultivaron conjuntamente con transfectantes de C1R (que expresaban CD1a, CD1b, CD1c o CD1d) o anti-CD3 unido a placa. IL-4, IFN- o la

15 proliferación se sometió a ensayo como se describe en el presente documento. La figura 27B muestra la restricción de citolisis. El panel de transfectantes de C1R se examinó para detectar citolisis por clones de linfocitos T V24JQ en ensayos de liberación de 51Cr de cuatro horas estándar.

La figura 28A es una gráfica de la expresión de CD1d en células dendríticas mieloides, en base al análisis por citometría de flujo de células dendríticas cultivadas. La figura 28B es una imagen del análisis de inmunotransferencia 20 de células dendríticas y células transfectantes de C1R de control (que expresaban CD1a o CD1d). Las figuras 28C-28J son imágenes de la tinción inmunohistoquímica de secciones en serie de una biopsia de ganglios linfáticos reactiva representativa (total de 10 biopsias). La figura 28C es una imagen de la tinción con hematoxilina-eosina a baja potencia, y la figura 28D es una imagen de tinción con anti-CD3. El cuadro enmarca la región a través de la que se tomaron secciones en serie para la tinción con los diversos marcadores mostrados en vistas con magnificación

25 superior en las figuras 28E y 28F; (figura 28E) S100; (figura 28F) CD1d; (figura 28G) CD1a; (figura 28H) CD34. Se muestra la tinción de histiocitos sinusales (figuras 281 y 28K), y regiones parafoliculares (figuras 28L y 28M) para: hemato28ilina-eosina, (figuras 28I y 28L); CD68, un marcador de macrófagos, (figuras 28J y 28M); y CD1d, (figuras 28K y 28N).

Las figuras 29A-29D son gráficas que caracterizan la citolisis de células dendríticas mieloides por linfocitos T

30 V24JQ. La figura 29A es una gráfica que muestra la lisis alogénica de células dendríticas inmaduras y maduras por el clon de linfocito T V24JQ GW4 en ensayos de liberación de cromo. Los haplotipos de los donantes fueron: 1) Clon GW4, A2, A24, B8, B38, Cw7, DR3, DQ2; 2) donante DC M, A2, A68, B7, B45, Cw6, Cwl5; 3) donante DC O, A2, A24, B46, B60, DR14, DRw52, DQ1; 5) donante B, A1, A3, B7, B8, DRB1*1501, DRB5*0101, DQB1*0601. Las figuras 29B y 29C son gráficas de la citolisis autóloga y alogénica de células dendríticas por clones de linfocito T V24JQ. La

35 figura 29D es una gráfica de la anulación de citolisis por quelación de calcio e inhibición por adición del anticuerpo monoclonal anti-CD1d, 42.1. Los clones BW3 y BW5 se cultivaron conjuntamente con DC BW de sujeto en presencia

o ausencia de EGTA y MgCl2 (4 mM cada uno) o fragmentos F(ab')2 de anticuerpo monoclonal 42.1 o IgG de control a 100 g/ml. La figura 29E es una gráfica de barras que muestra la secreción de IL-4 y IFN- después del cultivo conjunto de clones de linfocito T V24JQ OY3 y BW5 con DC autólogo.

40 La figura 30 es una ilustración esquemática de un modelo que demuestra la interacción de linfocitos T restringidos para CD1d con células dendríticas mieloides. La activación de linfocitos T V24JQ invariantes da como resultado la secreción de citocinas y quimiocinas importantes para el reclutamiento y la activación de células dendríticas mieloides. Además, también se expresan moléculas coestimuladoras de la superficie celular importantes. Durante la maduración de las células dendríticas mieloides, CD1d está regulado por aumento y activa los linfocitos T restringidos para CD1d.

45 Además de la secreción de citocinas y quimiocinas, los linfocitos T V24JQ activados regulan por aumento perforina, granzima B y granulisina. La secreción dependiente de CD1d de estas da como resultado entonces la lisis de las células dendríticas mieloides.

Descripción detallada

Se han desarrollado métodos para generar anticuerpos para los receptores de antígeno de linfocitos T (TCR) de

50 linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ (figura 1). La invención también proporciona anticuerpos purificados (como se define en las reivindicaciones) para TCR de linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ que son útiles para aplicaciones de diagnóstico, de obtención de imágenes y terapéuticas para enfermedades o afecciones que están afectadas por el número y/o la actividad de linfocitos T o subpoblaciones de linfocitos T específicas. Los ejemplos de estas enfermedades o afecciones incluyen enfermedad

55 autoinmunitaria, infección vírica, infección bacteriana, infección parasitaria, infección por patógeno eucariota, alergia, asma, afección inflamatoria, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de injerto, enfermedad de inmunodeficiencia, aborto espontáneo, embarazo y cáncer. La expansión ex vivo o in vivo de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ usando los anticuerpos de la invención se puede realizar sola junto con la administración de otros productos terapéuticos, tales como citocinas o vacunas tumorales.

El uso de un anticuerpo monoclonal anti-bucle CDR3 para la expansión de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ en lugar del uso de un antígeno, tal como -GalCer, eliminaría el requisito de CPA autólogas, retirándolas como fuentes potenciales de variabilidad y simplificando en gran medida el procedimiento para ensayos clínicos. Además, el uso de un anticuerpo monoclonal (anticuerpo monoclonal) permitiría T la expansión

5 específica de linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ a diferencia de la expansión de linfocitos T policlonales no específicos de múltiples tipos celulares.

El receptor de antígeno de casi todos los clones individuales de linfocitos B y T es el producto de un reordenamiento somático aleatorio único. Estos reordenamientos provocan incluso que gemelos idénticos tengan millones de receptores que difieren entre sí. En contraste, el TCR invariante reactivo y selectivo para CD1d utilizado por la 10 invención representa una diana universal única. Debido a que la secuencia del bucle CDR3 del TCR- invariante es idéntica en todos los individuos, esta región se usa para generar anticuerpos monoclonales y policlonales novedosos que reconocen la cadena TCR- invariante humana. Los anticuerpos monoclonales pueden identificar y expandir preferencialmente linfocitos T invariantes ex vivo a partir de donantes normales. Los métodos de expansión celular usando anticuerpos monoclonales de la presente invención proporcionan tamaños de población de aproximadamente 15 > 108 linfocitos T invariantes en cultivos en masa y > 107 células para clones individuales empezando con 10-20 ml de sangre periférica. Sólo unas decenas de miles de linfocitos T invariantes han demostrado ser funcionales en experimentos de transferencia celular realizados en ratones (Sonoda et al., supra). Por tanto, los ensayos clínicos de fase 1 humanos pueden incorporar un brazo de escalada de dosis, tal como, comenzar aproximadamente con 106 células, y dirigir una dosis máxima de 109 células. Se espera que las infusiones de este intervalos sean bien toleradas.

20 Por ejemplo, las infusiones de leucocitos del donante emplear de manera rutinaria del orden de 1010 células no purificadas sin efectos secundarios significativos.

Además de su efecto antitumoral, los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JQ+ pueden contribuir a las respuestas inmunitarias protectoras frente a patógenos intracelulares. Por ejemplo, descubrimos se descubrió que la respuesta inmunitaria a un virus citopático agudo (virus de la encefalomiocarditis, EMCV-D) es

25 defectuoso en ratones inactivados con CD1d (Exley et al., J. Leuk Biol. 69:713,2001). Estos resultados sugieren que los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar en la prevención o tratamiento de una enfermedad infecciosa, incluyendo enfermedades provocadas por virus, bacterias, parásitos, hongos, protozoos u otros patógenos eucariotas.

Debido a que los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JQ+ pueden aumentar las respuestas

30 de desviación inmunitaria o Th1, Th2, dependiendo de las condiciones de estímulo, la respuesta de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JQ+ se puede modular por la administración in vivo de una citocina antes, durante o después de la infusión de los linfocitos T NK expandidos ex vivo linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JQ+ o bien conduciendo la expansión ex vivo de las células en presencia de una citocina, o una combinación de ambos métodos. Usando una citocina, tal como IL-12, IL-15 o IL-18, que se sabe que influye en los

35 linfocitos T hacia las respuestas de Th1 se espera que incremente la eficacia de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y los linfocitos T JQ+ en la prevención o tratamiento de cáncer, enfermedad infecciosa, alergia, asma, embarazo e inflamación. De forma alternativa, se puede usar cualquier otra citocina, tal como IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IFN-/, IFN- y GM-CSF, para influir en los linfocitos T hacia respuestas de Th2 para la prevención o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y enfermedad de injerto contra huésped para las que

40 las respuestas de Th2 son protectoras. De forma alternativa, se puede usar la citocina para influir en los linfocitos T en contra de las respuestas de Th1 y Th2 y hacia las respuestas de desviación inmunitaria, lo que puede contribuir al mantenimiento del embarazo. Las respuestas de desviación inmunitaria incluyen la supresión de una respuesta inmunitaria en curso, tal como una respuesta en un sitio inmunitario privilegiado. TGF- e IL-10 son ejemplos de citocinas que pueden participar en respuestas de desviación inmunitaria (Sonoda et al., supra).

45 Además de su uso en la expansión de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ ex vivo, los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar a un mamífero, tal como un ser humano, para incrementar el número de linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos JQ+ in vivo para la prevención

o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas, alergias, asma, afecciones inflamatorias, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de injerto, enfermedad de inmunodeficiencia, aborto espontáneo, 50 embarazo o cáncer. Por ejemplo, se encontró una reducción en los niveles de determinados linfocitos T, tales como los linfocitos T NK invariantes en pacientes con cáncer de próstata, esclerosis múltiple, VIH y diabetes de tipo 1 (ejemplos 9, 11 y 12). Adicionalmente, se ha notificado previamente una reducción en el número de linfocitos T V24+ CD161+ para pacientes con melanoma (Kawano et al., Cancer Res. 59:5102, 1999) Por Tanto, la pérdida de la función de los linfocitos T NK invariantes puede ser un hallazgo general en el cáncer avanzado. De forma alternativa, se pueden usar 55 anticuerpos que se unen e inhiben la expansión o una actividad de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d y linfocitos T JQ+, tal como la producción de citocina o citotoxicidad, para inhibir la patogénesis de linfocitos T en un mamífero. Por ejemplo, una alergia puede estar provocada o exacerbada por la respuesta de Th2 de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+, y por tanto, la inhibición de la expansión o la respuesta de Th2 de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ puede ser útil en la prevención o tratamiento

60 de esta afección. De forma similar, la reducción de la respuesta de Th1 de linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ puede mejorar, estabilizar o prevenir enfermedades autoinmunitarias o prevenir los abortos

espontáneos. La respuesta de Th1 inducida por agentes infecciosos, tales como los virus de la hepatitis, también puede provocar daños que se pueden minimizar por la inhibición de estas células. Ejemplos de algunos de los anticuerpos que pueden inhibir estas células incluyen moléculas monovalentes o Fab o anticuerpos que se conjugan con una toxina o radiomarcador que daña las células después de la unión del anticuerpo a las células. Los anticuerpos

5 también se pueden unir a un TCR expresado en las células y prevenir la unión de un ligando al TCR.

Los anticuerpos de la invención también se pueden usar para aplicaciones de obtención de imágenes. En particular, los anticuerpos se pueden acoplar a un marcador fluorescente o radiomarcador para su uso en la visualización de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ en muestras de biopsias, sangre y otro material o fluidos corporales. Los anticuerpos también se pueden usar para purificar los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para 10 CD1d o linfocitos T JQ+ de estas muestras. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden unir a otros linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ que sean linfocitos T no invariantes y que sean más abundantes que los linfocitos T invariantes en algunos lugares, tales como la médula ósea y el hígado. El uso de un anticuerpo de la presente invención para purificar linfocitos T invariantes de una muestra de sangre periférica, en la que aproximadamente un 0,1 % de las células son linfocitos T invariantes, ha permitido el aislamiento de células que

15 sean un 90-95 % linfocitos T invariantes. Se puede lograr una pureza incluso mayor usando múltiples rondas de purificación o usando múltiples anticuerpos por ronda.

Además, se puede lograr una pureza mayor o un mayor número de células poniendo en contacto también los linfocitos T con un antígeno y células presentadoras de antígeno (CPA). Se puede usar cualquier antígeno (por ejemplo, una proteína, péptido, lípido, carbohidrato, ácido nucleico, agente infeccioso o molécula pequeña) para los linfocitos T de

20 interés. Ejemplos de posibles antígenos para los linfocitos T reactivos para CD1d incluyen antígenos de lípidos o glucosil-fosfatidilinositol de un patógeno infeccioso y -GalCer. Otros posibles antígenos incluyen antígenos de péptidos y proteínas, tales como los presentados por una molécula de MHC de clase I o clase II.

Adicionalmente, se puede presentar un antígeno a un linfocito T de interés en ausencia de CPA. Por ejemplo, se puede usar una forma soluble, asociada a liposomas o inmovilizada de una molécula presentadora de antígeno (por ejemplo, 25 CD1d, MCH de clase I o MCH de clase II) para presentar un antígeno (por ejemplo, un lípido o un péptido) a un linfocito T o una muestra que contiene un linfocito T de interés bajo condiciones que permitan la activación o expansión del linfocito T sin la presencia de una CPA. La molécula presentadora de antígeno que se usa puede ser una molécula natural o puede ser una molécula modificada química o genéticamente como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la molécula se puede expresar como una proteína de fusión, tal como una GST, proteína de unión a maltosa, 30 hexa-histidina, o proteína de fusión de región de Fc. Una molécula presentadora de antígeno expresada como una proteína de fusión que contiene un dominio de unión a membrana, dominio transmembrana o región hidrófoba se puede mezclar con moléculas de lípidos para formar un liposoma o micela que contenga la proteína de fusión. Este liposoma o micela que tiene una célula presentadora de antígeno sobre su superficie imita la capacidad de una CPA de presentar un antígeno a un linfocito T. De forma alternativa, se puede inmovilizar una molécula presentadora de

35 antígeno sobre un soporte sólido, tal como cualquier superficie rígida o semirrígida. El soporte puede ser cualquier material insoluble en agua poroso o no poroso, incluyendo, sin limitación, membranas, filtros, chips, portaobjetos, láminas, fibras, perlas magnéticas o no magnéticas, geles, tubos, tiras, placas, barras, polímeros, partículas, micropartículas y capilares. Si se desea, el soporte puede tener una variedad de formas de superficie, tales como pozos, zanjas, alfileres, canales y poros, a los que se unen las proteínas.

40 Una molécula presentadora de antígeno que está en solución, inmovilizada sobre un soporte sólido o bien contenida en un liposoma o micela puede estar en contacto con un antígeno para la subpoblación de linfocitos T de interés bajo condiciones que permitan que la molécula presentadora de antígeno se una al antígeno. Después, este antígeno puede interaccionar con los linfocitos T de interés, dando como resultado a la expansión y/o activación de los linfocitos

T. Estos métodos en los que un linfocito T de interés se expande o se activa por un antígeno en ausencia de CPA

45 pueden ser deseables en un marco clínico en el que las células adicionales, tales como las CPA pueden no ser deseables.

El uso de los anticuerpos de la invención para la cuantificación de linfocitos T invariantes por citometría de flujo tiene muchas ventajas sobre los métodos actuales. Los métodos actuales incluyen la citometría de flujo con menos anticuerpos específicos o bien un método basado en PCR, que implica sintetizar y amplificar ADNc correspondiente al 50 ARNm que codifica la cadena TCR- y comparar este ADNc amplificado con el de un clon de linfocito T invariante y un clon de linfocito T de control, como se describe en el ejemplo 6. El método de citometría de flujo tiene la ventaja de determinar el número total de linfocitos T invariantes; mientras que el método basado en PCR sólo determina la frecuencia relativa de los linfocitos T invariantes en una muestra. Además, la citometría de flujo permite la determinación de los marcadores que se expresan en los linfocitos T invariantes. El método de citometría de flujo

55 también es un método más sencillo y rápido que se puede realizar aproximadamente en una hora en comparación con aproximadamente un día para el método de PCR y que no requiere habilidad en las técnicas de biología molecular. Por tanto, el método de citometría de flujo que usa los anticuerpos de la presente invención puede ser más deseable en un marco clínico. También se pueden usar métodos similares para cuantificar otros linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ usando los anticuerpos de la presente invención.

60 Adicionalmente, se pueden usar los anticuerpos en el diagnóstico de un sujeto que tiene o que corre el riesgo de una enfermedad. Como se describe en los ejemplos 6, 9 y 10, se pueden usar los anticuerpos para cuantificar el número de

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Se pueden usar los anticuerpos resultantes para aplicaciones de diagnóstico o clínicas que implican otros animales del mismo género o especie que el animal huésped usado para la producción de anticuerpos. Adicionalmente, se pueden usar los anticuerpos de la invención en aplicaciones que impliquen animales de un género diferente del animal huésped. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos que se produzcan en pollos para el tratamiento o prevención de

5 enfermedad en otros pollos o en otras aves.

Para generar anticuerpos para el tratamiento, prevención o diagnóstico de una enfermedad o afección particular, se puede usar el bucle CDR3 de una subpoblación de linfocitos T que esté asociado con esa enfermedad o afección (véase, por ejemplo, la tabla 1). Por ejemplo, se pueden usar subpoblaciones de linfocitos T que estén presentes en niveles incrementados o disminuidos o que tengan una actividad incrementada o disminuida en sujetos con una 10 enfermedad o afección relacionada con la correspondiente subpoblación de linfocitos T en sujetos de control sin la enfermedad o afección para la generación de anticuerpos de la invención. Adicionalmente, se pueden aislar linfocitos T a partir de una muestra (tal como una muestra de biopsia) obtenida de un sujeto con una enfermedad o afección. Se puede determinar la identidad de las subpoblaciones de linfocitos T en la muestra usando técnicas estándar, tales como por análisis de FACS usando anticuerpos reactivos con diversos marcadores de linfocitos T o por secuenciación 15 de las cadenas de TCR- o cadenas . Se puede usar el bucle CDR3 de una subpoblación de linfocitos T aislada para la producción de anticuerpos. Se pueden administrar estos anticuerpos a sujetos con la enfermedad o afección (incluyendo el sujeto original a partir del que se aisló la subpoblación de linfocitos T así como otros sujetos con la afección) para modular el número y/o actividad de linfocitos T relevantes in vivo. También se pueden usar los anticuerpos para la expansión ex vivo de los linfocitos T relevantes seguido de una readministración de los linfocitos T

20 expandidos al sujeto.

También se pueden generar los anticuerpos de la invención para cualquier subpoblación de linfocitos T oligoclonalmente expandida específica de antígeno en animales (por ejemplo, seres humanos, otros mamíferos y aves) en respuesta a los retos antigénicos dados. Estos subgrupos de linfocitos T incluyen los linfocitos T oligoclonalmente expandidos en respuesta a un componente inmunodominante del antígeno en múltiples individuos.

25 Por ejemplo, se puede administrar un antígeno de interés a un animal, y se pueden aislar los subgrupos de linfocitos T oligoclonalmente expandidos que se generan por esta administración y usar para la producción de anticuerpos como se describe en el presente documento.

Tabla 1. Citas de los receptores de linfocitos T que se pueden usar para generar anticuerpos para aplicaciones clínicas que implican la enfermedad o afección indicada.

Enfermedad/Afección: Cita

Esclerosis múltiple: Wucherpfennig et al., J. Exp. Med. 175:993-1002 (1992).

Patógenos medioambientales/Promoción de tolerancia oral: Blumberg et al., J. Immunol. 150:5144-5153 (1993).

Colitis ulcerosa: Chott et al., J. Immunol 156:3024:3035, (1996).

Colitis ulcerosa: Shigematsu et al., J. Clin. Lab. Immunol. 48:177-186(1996).

Enfermedad inflamatoria intestinal crónica: Probert et al., J. Immunol. 157:3183-3191 (1996).

Antígenos: Porcelli et al., J. Exp. Med. 178:1-16 (1993).

Artritis reumatoide: Fitzgerald et al., J. Immunol. 154:3538-3547 (1995).

Artritis reumatoide: Sottini et al., J. Autoimmun. 6:621-637 (1993).

Artritis reumatoide: Hingorani et al., J. Immunol. 156:852-858 (1996).

Polimiositis: Bender et al., J. Exp. Med. 181:1863-1868 (1995).

Arteritis de células gigantes: Grunewald et al., Artritis Rheum. 37:1221-1227 (1994).

Trasplante de médula ósea: Gorochov et al, Blood 83:587-595 (1994).

Esclerosis sistémica: Kuwana et al, J. Immunol 158:485-491 (1997).

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Proliferación IL-4 IFN- IFN-/IL-4

línea 1 sin IL-12 36239 1,4 60,4 43,1

+IL-12 56593 4,8 >500 >100

línea 2 sin IL-12 21858 1,1 18,1 16,5

+IL-12 42499 1,6 331,8 207

Se establecieron líneas de linfocitos T V24+V11+ reactivos para CD1d con y sin IL-12 y se estimularon con anticuerpo CD161 en exceso y anti-CD3 unido a la placa limitante para estimular específicamente linfocitos T NK invariantes.

Por tanto, se pueden repolarizar linfocitos T invariantes para el fenotipo Th1 cultivando en IL-12 0,3 nM (Exley et al.,

5 supra (1998)) durante expansión ex vivo con un anticuerpo de la presente invención. IL-15, IL-18 e INF de tipo 1 también son conocidos por potenciar la polarización Th1 de linfocitos T humanos. Otras citocinas o combinaciones de citocinas que pueden influir en los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ hacia respuestas de desviación inmunitaria, Th1 o Th2, incluyen IL-2, IL-4, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL 15, IL-18, IFN-/, IFN- y GM-CSF. La respuesta Th2 puede ser deseable para la prevención o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.

10 De forma alternativa, para el mantenimiento del embarazo, se pueden usar citocinas para influir en linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ hacia respuestas de desviación inmunitaria en lugar de respuestas Th1 o Th2. Los anticuerpos anti-IL-4 o anti-IL-12 que se unen a las citocinas producidas por los linfocitos T durante la expansión también pueden favorecer la desviación inmunitaria o la respuesta Th2 de estos linfocitos T. Estas citocinas se pueden presentar durante todo el período de tiempo de la expansión de linfocitos T o pueden estar presentes sólo

15 durante una parte del período de tiempo de la expansión de linfocitos T, tal como durante los últimos días de la expansión de linfocitos T.

Después de la expansión en presencia de una o más de estas citocinas, los linfocitos T se pueden someter a prueba funcionalmente para determinar la secreción de L-4, IL-10, GM-CSF e IFN-. También se puede determinar la regulación de la citotoxicidad contra CD1d+ (CIR, CD1d), dianas 'NK' (JY, K562,721.221 y YAC-1), dianas LAK por

20 suplementación con citocinas (Exley et al., supra (1997); Exley et al., J. supra, (1998)).

De forma alternativa, se pueden administrar in vivo una o más de las citocinas a los pacientes antes, durante o después de la reintroducción de los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ expandidos ex vivo para influir a las células reintroducidas hacia respuestas de desviación inmunitaria, Th1 o Th2.

Ejemplo 6: Determinación del cambio en el número o la actividad de linfocitos T invariantes inducidos por un 25 tratamiento para el tratamiento o prevención de enfermedad

Se pueden usar los anticuerpos monoclonales de la presente invención en un método sensible y específico para determinar si un tratamiento para el tratamiento o prevención de una enfermedad incrementa el número y/o une preferencialmente o modula la función de linfocitos T invariantes. En contraste, el análisis usado previamente para determinar el efecto del tratamiento anti-cáncer de IL-12 in vivo sobre linfocitos T invariantes se ha realizado con el 30 método relativamente insensible de citometría de flujo con el anticuerpo monoclonal V24, en algunos casos junto con el anticuerpo monoclonal V11, lo que no ha detectado un incremento en linfocitos T invariantes (n = 10) (figura 5). Dado el bajo número de linfocitos T invariantes en donantes sanos y el número incluso menor que se ha encontrado en pacientes con cáncer avanzado, se puede usar el método descrito a continuación para determinar con más precisión el efecto del tratamiento con IL-12, u otros tratamientos, sobre linfocitos T invariantes. Se pueden determinar los efectos

35 de dosis acumulativas en linfocitos T invariantes realizando este análisis después de cada dosis.

Los pacientes pueden servir como sus propios controles en estos experimentos. Se pueden obtener aproximadamente 20 ml de sangre periférica de los pacientes antes de que se inicie el tratamiento y posteriormente durante el tratamiento. Se puede usar una pequeña alícuota de estas células (aproximadamente 106 células) para la síntesis de ADNc, correspondiente a ARNm que codifica la cadena TCR-, y la amplificación por PCR usando cebadores de Ca y

40 V24 para determinar la frecuencia de las células que expresan la cadena de TCR- invariante. Se puede determinar la fracción de TCR invariante en la población total por calibración con un clon de linfocito T invariante diluido en serie en un clon de linfocito T de control.

Como alternativa al análisis de PCR anterior, se puede usar citometría de flujo para determinar la frecuencia y el número de linfocitos T invariantes. Debido al bajo número implicado, en particular en pacientes con cáncer, se usa un 45 número mínimo de condiciones y un gran número de acontecimientos analizados (100.000) para cada muestra. Se

pueden anticuerpos monoclonales anti-bucle CDR3 6B11 y/o 3A6, que se han conjugado exitosamente con fluoresceína usando métodos estándar, en un análisis de FACS de 1 ó 2-colores sencillo. Adicionalmente, se puede usar FACS multi-color para el análisis simultáneo de la cadena de TCR- invariante usando uno o más anticuerpos monoclonales de la presente invención y anticuerpos para otros marcadores de linfocitos T invariantes (V24, CD4,

5 CD8, CD56, CD161, V11). Se pueden comparar estos resultados para las muestras de pacientes antes y después del tratamiento para determinar el efecto del tratamiento sobre el número de linfocitos T invariantes. Se puede evaluar la producción de citocinas y la citotoxicidad por células activadas, como se describe en el ejemplo 5. S pueden normalizar los resultados para el número de linfocitos T invariantes, permitiendo comparaciones directas para pacientes antes y después del tratamiento.

10 De forma alternativa, se puede requerir una ronda de expansión para la cuantificación. La muestra del paciente se pueden someter directamente a la expansión de anticuerpo monoclonal o la muestra se puede enriquecer por linfocitos T invariantes por clasificación de FACS de alta velocidad o purificación de perlas magnéticas antes de la ampliación, usando procedimientos estándar. Para el enriquecimiento por clasificación de FACS, se puede realizar la clasificación de un color usando anti-V24, 6B11 o 3A6 o clasificación de 2 colores usando 6B11 o 3A6 y anti-V24, V11 o CD161.

15 De forma alternativa, para el enriquecimiento de la purificación por inmunoafinidad, se pueden llevar a cabo una o más selecciones negativas o positivas. Por ejemplo, se puede usar una disminución negativa para retirar monocitos y/o linfocitos B. Después, se pudo realizar una selección positiva usando el anticuerpo monoclonal V24 y/o un anticuerpo monoclonal anti-bucle CDR3.

Se pueden cultivar las células con un anticuerpo monoclonal anti-bucle CDR3 soluble o unido a la placa (6B11 o 3A6)

20 o con CPA alogénicas o autólogas pulsadas con antígeno. Aunque las expansiones de una sola ronda de linfocitos T son ampliamente representativas de proporciones iniciales, las células se pueden cultivar de forma alternativa durante aproximadamente una semana antes de la expansión para que descansen las células activadas que responden mal a la expansión en comparación con las células en reposo.

Aproximadamente 3-4 semanas después de la estimulación primaria, se puede analizar una parte de las células por

25 citometría de flujo con anticuerpos monoclonales V24, V11 y 6B11 para determinar la fracción de linfocitos T invariantes. Se puede comparar la producción de citocinas y la citotoxicidad normalizada para el número de linfocitos T invariantes para los pacientes antes y después del tratamiento, como se describe anteriormente. Además, se puede usar el análisis de PCR o el análisis de FACS de las células antes de la estimulación primaria para determinar en qué medida el incremento en la recuperación de linfocitos T invariantes (después de la estimulación primaria) refleja la

30 expansión in vivo debida al tratamiento frente al incremento en la respuesta a la estimulación ex vivo.

Este análisis llevado a cabo en 8-10 pacientes (con un promedio de dos puntos de tiempo después del tratamiento) debe ser adecuado para determinar si el tratamiento tiene el potencial de para incrementar el número o modular la actividad de linfocitos T invariantes. Si se demuestran estos efectos positivos sobre los linfocitos T invariantes, entonces se pueden realizar otros estudios que correlaciones las respuestas de linfocitos T invariantes con la dosis, el

35 programa y otras funciones inmunológicas. Por ejemplo, los cambios en los números de linfocitos T invariantes y/o respuestas se pueden correlacionar con los parámetros inmunitarios clave, incluyendo IFN- de suero, TNF e IL-15; expresión de IL-12 y otros receptores de quimiocinas y citocinas Th1; y cambios en linfocitos T, mieloide, y otros marcadores celulares (Fas, FasL, Linfotoxina-, CD3, CD4, CD8, LFA-1, CD80, CD86, CD161).

Este método para determinar el cambio en el número o actividad de linfocitos T invariantes también se puede aplicar a

40 linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+. Si se requiere una etapa de preenriquecimiento para cuantificar estos linfocitos T, se puede usar cualquier anticuerpo que se una a estas células, incluyendo los anticuerpos de la presente invención, en la etapa de purificación inicial o se puede usar una selección negativa para retirar las células que no sean linfocitos T o células que no sean linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+.

45 Ejemplo 7: Expansión y reintroducción de linfocitos T invariantes expandidos ex vivo en mamíferos

Los linfocitos T invariantes de una muestra de sangre periférica (20 ml o del producto de leucoféresis) de un mamífero se pueden enriquecer antes de la expansión ex vivo usando clasificación de FACS o purificación por inmunoafinidad o expandir directamente usando un anticuerpo de la presente invención, como se describe en los ejemplos anteriores. Como se menciona en el ejemplo 5, las células se pueden expandir en presencia de una citocita para influirlas hacia 50 respuestas de desviación inmunitaria, Th1 o Th2. Además, se puede añadir IL-2, IL-7, o un mitógeno para estimular la expansión celular. Si es necesario, se puede llevar a cabo una expansión ex vivo secundaria, posiblemente después de una segunda etapa de enriquecimiento, bajo condiciones usadas para la expansión primaria para incrementar tanto el número de células como la pureza. Después de la estimulación, se pueden someter a ensayo las células para determinar la pureza y la producción de citocinas y citotoxicidad, como se describe anteriormente. Se debe señalar que 55 los inventores y otros han podido establecer líneas y clones de linfocitos T humanos a largo plazo a partir de donantes normales por múltiples rondas de estimulación; por tanto, se esperan resultados similares en otros pacientes. De forma deseable, se obtienen al menos 106, de forma más deseable, al menos 108, y de la forma más deseable al menos 109 linfocitos T invariantes después la expansión. De forma deseable, los linfocitos T invariantes son al menos un 60 %, 80 ó 90 % puros, en base a la presencia de marcadores de linfocitos T invariantes V24, V11 y CD161, y mantienen la

producción de IFN y citotoxicidad contra dianas CD1d+ y 'NK'.

Si las estimulaciones secundarias no proporcionan números celulares adecuados, entonces se pueden usar rondas adicionales de estimulación. De forma alternativa, el número de células de partida se puede incrementar usando muestras de sangre más grandes o a través de leucoféresis. En este caso, se puede realizar un enriquecimiento inicial

5 de linfocitos T invariantes por selección positiva usando el anticuerpo monoclonal V24 o 6B11 conjugado con perlas, como se describe anteriormente. Para incrementar la pureza, también se pueden purificar los linfocitos T invariantes por FACS o anticuerpo conjugado con perlas antes de la reinfusión. Adicionalmente, el potencial terapéutico de la reinfusión celular de líneas de linfocitos T invariantes policlonales expandidos se puede comparar con el de los clones de linfocitos T invariantes expandidos, o mezclas de los mismos.

10 No se desea que la administración de linfocitos T invariantes expandidos ex vivo se limite a un modo particular de administración, dosificación o frecuencia de dosificación; el presente modo contempla todos los modos de administración, incluyendo la vía intramuscular, intravenosa, intraarticular, intralesional, subcutánea, o cualquier otra vía suficiente para proporcionar una dosis adecuada para prevenir o tratar una enfermedad autoinmunitaria, infección vírica, infección bacteriana, infección parasitaria, infección por un patógeno eucariota, alergia, asma, afección

15 inflamatoria, enfermedad de injerto contra huésped, aborto espontáneo, embarazo o cáncer. De forma deseable, las células se reintroducen en el mamífero a partir del que se tomó la muestra de sangre. También se contempla que se pueden administrar las células a un mamífero diferente. Se pueden administrar las células al mamífero en una dosis única o en múltiples dosis. Cuando se administra en múltiples dosis, la dosis se pueden separar entre sí, por ejemplo, durante de una semana a un mes. Como se menciona en el ejemplo 5, también se pueden administrar una o más

20 citocinas antes, durante o después de la administración de las células para influirlas hacia respuestas de desviación inmunitaria, Th1 o Th2. Se debe entender que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Adicionalmente, los linfocitos T se pueden reintroducir como células en reposo o activadas, dependiendo de la aplicación. Las células en reposo requerirían una

25 activación in vivo.

Ejemplo 8: Expansión y reintroducción de linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ expandidos ex vivo en mamíferos

Otros linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ se pueden expandir ex vivo como se describe en el ejemplo 7. Este método se puede modificar expandiendo linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o 30 linfocitos T JQ+ de médula ósea, hígado, cordón umbilical u otras muestras. De forma deseable, la muestra contiene un mayor porcentaje de linfocitos T no invariantes reactivos para CD1d que la sangre periférica. Adicionalmente, se puede usar la coestimulación (usando CD1d, lípidos, otros antígenos o anticuerpos) o la inhibición de la coestimulación para expandir una subpoblación deseada de linfocitos T. Por ejemplo, la estimulación de CD28 puede favorecer la expansión de linfocitos T no invariantes reactivos para CD1d sobre los linfocitos T invariantes. Los anticuerpo

35 anti-CD161 solubles que bloquean la estimulación de CD161 también pueden favorecer la expansión de linfocitos T no invariantes que son menos dependientes de la estimulación de CD161 que los linfocitos T invariantes. La cantidad de anticuerpo unido a la placa también se puede reducir, lo que puede incrementar la dependencia sobre la coestimulación por expansión de los linfocitos T.

Adicionalmente, se puede usar la presencia de diferentes citocinas o combinaciones de citocinas para favorecer la

40 expansión de una subpoblación deseada de linfocitos T. Por ejemplo, los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ se pueden incubar con IL-4, IL-7 o IL-12 durante la expansión.

Los linfocitos T NK, linfocitos T reactivos para CD1d o linfocitos T JQ+ expandidos se pueden reintroducir en mamíferos como se describe en el ejemplo 7.

Ejemplo 9: Reducción en el número de linfocitos T NK invariantes en pacientes con cáncer

45 Como se describe adicionalmente a continuación, los pacientes con cáncer de próstata tienen menos linfocitos T NK invariantes que los pacientes sanos. Por tanto, los anticuerpos de la invención que incrementan el número o la actividad de linfocitos T NK invariantes se pueden usar como productos terapéuticos para la prevención, estabilización

o tratamiento de cáncer de próstata. Además, se pueden administrar linfocitos T NK invariantes expandidos ex vivo a los sujetos para prevenir, estabilizar o tratar cáncer de próstata.

50 Los linfocitos T NK invariantes también pueden estar presentes en niveles reducidos en sujetos con otros tipos de cáncer; por tanto, estos métodos se pueden usar para tratar otras formas de cáncer.

Pacientes con cáncer analizados en este estudio

Los pacientes con cáncer en este estudio tenían cáncer de próstata independiente de los andrógenos avanzado (Catalona, N. Engl. J. Med. 331:996,1994; Bubley y Balk, Hematol. Oncol.Clin. North. Am. 10:713, 1996). Todos los 55 pacientes se trataron previamente con tratamiento de ablación de andrógenos por orquiectomía o administración de un agonista de la hormona liberadora de hormona leutinizante (LHRH). En el momento del estudio, todos los pacientes

imagen15

intervalo: 14 x 105 a 90 x 105

Cáncer de próstata (n = 7): media 4x 105

intervalo: 0 a 20 x 105

Tabla 5. Porcentaje de células V24+ que son linfocitos T invariantes en base a la tinción con el anticuerpo V24 y el anticuerpo anti-Vb11 o bien 6B11

V24+Vb11+ V24+ 6B11+ (invariante)Donante V24+ V24+

Sano

n = 3: media (intervalo) 4,8 % (2-7 %) 4,3 % (1,4-6,5 %)

Cáncer de próstata n = 6: media (intervalo) 2,3 % (0-8,0 %) 0,4 % (0-2,3 %)

5 Resultados de la expansión de linfocitos T NK invariantes de donantes sanos

Debido al pequeño número de linfocitos T NK invariantes en sangre periférica, se llevó a cabo una ronda de expansión ex vivo para evaluar adicionalmente la frecuencia y la función de estas células. Se aislaron linfocitos T NK invariantes de donantes sanos y pacientes con cáncer de próstata avanzado a partir de sangre periférica a través de una purificación FACS inicial con un anticuerpo monoclonal específico V24, seguido de una expansión selectiva in vitro

10 durante de tres a cuatro semanas, con -GalCer y PBMC irradiadas autólogas como fuente de CPA. Después, se analizaron los linfocitos T por tinción doble con los anticuerpos monoclonales V24 y V11 o 6B11.

Los linfocitos T V24+ purificados con FACS estimulados in vitro con un mitógeno de linfocitos T, FA, proporcionó sólo una pequeña población de linfocitos T V24+ V11+ que variaba en número con diferentes donantes (figura 20A). En contraste, la estimulación de los linfocitos T V24+ purificados de donantes sanos con -GalCer y PBMC irradiadas

15 autólogas proporcionó una gran población de V24+ V11+ (figura 20B, 94,4 % del células totales). El análisis fenotípico adicional de estos linfocitos T V24+ V11+ expandidos con -GalCer de una serie de donantes sanos demostró grandes poblaciones de CD4+ y CD4-CD8-y mostró que la mayoría de cada donante (> 70 %) expresó CD161.

Se evaluaron los linfocitos T V24+ V11+ expandidos con -GalCer de donantes sanos para determinar el

20 reconocimiento de CD1d y la producción de citocinas. En consonancia con muchas de las células que eran linfocitos T NK invariantes reactivos para CD1d, las células produjeron cantidades sustanciales tanto de IL-4 como de IFN- en respuesta a las células C1R transfectadas con CD1d, pero no a células C1R transfectadas con control (figura 20C). La especificidad para CD1d de este reconocimiento se demostró además bloqueando con un anticuerpo monoclonal anti-CD1d, 51.1, pero no un Ab de control apareado con isotipo. Las respuestas de citocinas a CD1d fueron

25 equivalentes a las obtenidas después de la estimulación policlonal de estos linfocitos T con FA, confirmando que la mayoría de las células eran efectivamente linfocitos T reactivos para CD1d. Estas respuestas eran todas comparables a las obtenidas previamente con clones de linfocitos T NK invariantes de donantes sanos (Exley et al., J. Exp. Med. 186:109, 1997; Exley et al., J. Exp. Med. 188:867, 1998), indicando que estos últimos clones establecidos in vitro reflejaron el estado funcional de las células in vivo.

30 Disminución de la expansión de linfocitos T NK invariantes de pacientes con cáncer de próstata avanzado

Los linfocitos T NK invariantes de pacientes con cáncer de próstata independiente de los andrógenos avanzado se examinaron de forma similar. Con relación a los donantes sanos, se produjo una disminución en el número total de células cultivadas recuperado de pacientes con cáncer de próstata resistente a la ablación androgénica y una marcada disminución en la fracción de células expandidas que eran linfocitos T NK invariantes V24+ V11+ (figuras 21A y 21B,

98,5 % frente a un 13,6 % de linfocitos T NK invariantes en un donante sano y un paciente con cáncer de próstata resistente a ablación androgénica, respectivamente). También se muestran linfocitos T V24+ expandidos con -GalCer de un paciente con paciente con cáncer de próstata tratado con ablación androgénica en remisión (75 % de linfocitos T NK invariantes), indicando que el tratamiento de ablación androgénica no tiene en cuenta la disminución en

5 la expansión de los linfocitos T NK invariantes (figura 21C).

Los datos de una serie de pacientes con cáncer de próstata independiente de los andrógenos avanzado, todos con enfermedad metastásica y un aumento en los niveles de antígeno específico de próstata (PSA), confirmó la recuperación marcadamente disminuida de linfocitos T NK invariantes V24+ V11+ (media de un 10 % de pacientes con cáncer de próstata frente a > 80 % de donantes sanos) (figura 21D). Estos resultados fueron consistentes con la 10 disminución del número de linfocitos T NK invariantes detectado por la tinción de V24 y V11 o 6B11 en sangre periférica de pacientes con cáncer de próstata avanzado. Otros factores, incluyendo una disminución en la proliferación o un incremento en la apoptosis durante las estimulaciones in vitro también podrían haber contribuido a la disminución en la recuperación. En contraste, la recuperación de linfocitos T NK invariantes V24+ V11+ de pacientes con cáncer de próstata que recibían tratamiento de ablación androgénica, pero que se encontraban en remisión,

15 estaba más cercana a los donantes sanos (figura 21D).

Ejemplo 10: Reducción en la actividad de linfocitos T NK invariantes en pacientes con cáncer

Además de estar presentes en niveles reducidos, los linfocitos T NK invariantes presentan una reducción en la actividad en pacientes con cáncer de próstata. En particular, estos linfocitos T NK invariantes produjeron menos IFN- (un efector de Th1). Como se describe a continuación, la incubación con IL-12 incrementó la actividad de estos

20 linfocitos T NK invariantes para producir IFN-. Estos resultados apoyan la capacidad de IL-12 para influir los linfocitos T NK invariantes hacia respuestas Th1, tales como la actividad citotóxica que es deseable para el tratamiento de cáncer.

Métodos usados para la medida de la producción de citocinas y la reactividad de CD1d

Para la producción de citocinas, se cocultivaron 1x105 células/pocillo en placas de 96 pocillos con un número

25 equivalente de de placas cultivados conjuntamente con un número igual de células C1R transfectadas con CD1d o con control en medio RPMI 1640 con un 10 % de FBS, 20 U/ml de IL-2 y 1 ng/ml de PMA, como se describe previamente (Exley et al., J. Exp. Med. 186:109, 1997). Se bloquearon las respuestas celulares para CD1d con un anticuerpo anti-CD1d, 51.1, a 10 µg/ml (Exley et al., J. Exp. Med. 186:109, 1997; Exley et al., Immunology 100:37,2000). Se recogieron los sobrenadantes a las 48 horas y a las 72 horas para las medidas de IL-4 e IFN-, respectivamente. Se

30 determinaron los niveles de citocinas liberadas por triplicado por ELISA de captura con pares de anticuerpos apareados con relación a los estándares de citocinas (Endogen, Inc. Cambridge, MA). El límite del intervalo de detección de estos ensayos, tanto para IFN- como IL-4 fue de 10-50 pg/ml.

Resultados que demuestran la pérdida de producción de IFN- por linfocitos T NK invariantes de pacientes con cáncer

Los linfocitos T NK invariantes derivados de pacientes de cáncer de próstata proliferaron y produjeron niveles similares

35 de IL-4 en respuesta a células transfectadas con CD1d de como linfocitos T NK invariantes de un donante sano (figura 22A). Sin embargo, su producción de TNF- se redujo notablemente con relación a los linfocitos T NK invariantes del donante sano (figura 22B). El análisis de la producción de IL-4 frente a IFN- por linfocitos T NK invariantes expandidos con -GalCer de una serie de pacientes con cáncer de próstata avanzado y donantes sanos confirmó una pérdida notable de la producción de IFN- por las células derivadas de pacientes con cáncer de próstata (figura 22C escala

40 logarítmica para IFN-). Esta pérdida de IFN- con relación a IL-4 fue más evidente cuando se compararon las proporciones de producción de IFN-/IL-4, con una diferencia aproximada de 50 veces entre líneas de linfocitos T NK derivados de cáncer de próstata y donantes sanos (figura 22E).

Para determinar si esta pérdida de producción de IFN- era frecuente para otras poblaciones de linfocitos T, se estimularon linfocitos T de sangre periférica en masa de pacientes con cáncer de próstata independiente de los

45 andrógenos avanzado y donantes sanos in vitro con FA. Los resultados mostraron que la producción de IFN- por linfocitos T en masa de pacientes con cáncer de próstata estaba intacta (figura 22D), con proporciones IFN-/IL-4 similares observados en las células de de pacientes con cáncer de próstata frente a donantes sanos (figura 22E). En conjunto, estos datos demostraron una pérdida selectiva de la producción de IFN- en la población de linfocitos T NK invariantes de pacientes con cáncer de próstata avanzado.

50 Ya que los linfocitos T NK invariantes pueden contribuir a los efectos antitumorales de IL-12, a continuación se determinó si estas células derivadas de paciente con cáncer podían responder a IL-12. Se trataron linfocitos T NK invariantes derivados de cáncer de próstata con IL-12 (1 ng/ml) durante la última semana de cultivo para determinar si podían responder a esta citocina. Las células tratadas con IL-12 mostraron un incremento notable en la producción de IFN-, y presentaron proporciones de producción de IFN-/IL-4 que eran comparables a las de los donantes sanos

55 (figura 22E, cáncer + IL-12).

Ejemplo 11: Niveles reducidos de linfocitos T NK en pacientes con esclerosis múltiple

La esclerosis múltiple (EM), es una enfermedad desmielinizante inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) que implica una probable respuesta autoinmunitaria dirigida contra antígenos asociados a la propia mielina. Para determinar si los pacientes con EM tienen un menor número de linfocitos T NK, se compararon los porcentajes de linfocitos T NK (V24JQ+) en muestras de sangre periférica en pacientes con EM con enfermedad progresiva

5 primaria (n = 6) o remitente recidivante (n = 8) con donantes sanos (n = 6). El porcentaje de linfocitos T NK en donantes normales fue similar a los informes previos (0,114 ± 0,020), mientras que el porcentaje de linfocitos T NK en pacientes con BM con enfermedad progresiva primaria (0,010 ± 0,007) o remitente recidivante (0,027 ± 0,071) fue significativamente menor. El menor número de linfocitos T NK en pacientes con EM sugiere que el incremento en el número y/o actividad de linfocitos T NK puede ser útil para el tratamiento o prevención de EM, tal como EM remitente recidivante, progresiva primaria o progresiva Crónica. Adicionalmente, las muestras de pacientes con EM se pueden tomar a varios puntos temporales para determinar si el número de linfocitos T NK en la periferia de estos pacientes con EM fluctúa en función del tiempo y se correlaciona con el estado de sus síntomas de enfermedad.

Ejemplo 12: Uso de 6B11 como herramienta de diagnóstico para el estudio de cohortes clínicas

Los linfocitos T restringidos para CD1d pueden desempeñar un papel inmunorregulador en múltiples trastornos

15 inmunológicos. Para someter a prueba la utilidad diagnóstica del anticuerpo 6B11 para controlar el estado clínico de pacientes infectados con VIH y con prediabetes de alto riesgo, se usaron el anticuerpo 6B11-FITC en combinación con el anticuerpo V24-PE para determinar la frecuencia de linfocitos T restringidos para CD1d circulantes en pacientes diabéticos el día de diagnóstico y en la cohorte MACS de VIH seguidos en el centro médico de UCLA. Se tiñeron PBL y se analizó por FACS como se describe anteriormente. Además, se determinaron subtipos de células dendríticas (DC) para la cohorte MACS de VIH. Los resultados se representan en las figuras 23 y 24.

Ejemplo 13: Expresión génica en linfocitos T invariantes de gemelos idénticos discordantes para diabetes de tipo 1

Una identificación del patrón de genes activado en un tipo de linfocitos T particular puede proporcionar información predictiva de la función de la subpoblación de linfocitos T. Por ejemplo, los cambios en los patrones de expresión

25 génica en la familia de citocinas/quimiocinas son particularmente relevantes dada la asociación de la secreción de citocinas y la función in vivo para linfocitos T. Como se describe a continuación, se determinó el patrón de expresión génica para linfocitos T V24JQ para entender mejor el papel de estas células en la autoinmunidad y en la diabetes de tipo 1. Este método también se puede usar para determinar el papel de cualquier otra subpoblación de linfocitos T de interés en el desarrollo y/o progresión de cualquier enfermedad o afección.

Para estudiar las consecuencias trascripcionales de la activación del receptor de linfocitos T en clones de linfocitos T V24JQ humanos, se usaron microchips de ADN se usa para cuantificar los cambios en los niveles de ARNm después de la estimulación con anti-CD3 de clones derivados de gemelos idénticos discordantes para diabetes de tipo 1 y secreción de IL-4 (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97 (13): 7411-7416, 200). La activación dio como resultado la modulación significativa de 226 transcritos en el clon de secreción de IL-4 y 86 en el clon de IL-4-nula. Sólo

35 veintiocho de estos genes estaban en común. Las diferencias observadas sugieren tanto una diferenciación ineficaz de linfocitos T V24JQ de diabetes como un papel de los linfocitos T invariantes en el reclutamiento y activación de células del linaje mieloide.

Debido a que el defecto en la secreción de IL-fue 4 probablemente el resultado de múltiples diferencias, se eligió un par de clones representativos para el análisis intensivo usando microchips de ADN que controlan la expresión de aproximadamente 6800 genes (colección Unigene). Los microchips de ADN proporcionan un enfoque práctico y reproducible para un estudio a gran escala de diferencias complejas en la expresión génica (Lockhart et al., Nature Biotechnology 14, 1675-1680, 1996; Holstege et al., Science 283, 83-87, 1999; Cho et al., Molecular Cell 2, 65-73, 1998). Se determinaron los perfiles de expresión después de cuatro horas de estimulación con anti-CD3 o IgG de control. Se seleccionó este punto de tiempo porque se usó en un análisis previo de secreción de citocinas en clones

45 derivados de los pares de gemelos monozigóticos discordantes para diabetes de tipo 1. El número de genes con expresión detectable antes o bien después de la estimulación fue casi idéntico para los clones que secretan IL-4 nula e IL-4 (1523 y 1558, respectivamente). Como se esperaba, la frecuencia de la mayoría de los transcritos se mantuvo sin cambios. Sólo se compartió aproximadamente 2/3 de este conjunto (988) entre los dos clones. El número de genes cuya expresión después de esta estimulación con anti-CD3 se encontró que se incrementaba o disminuía en al menos 2 veces con relación a los no estimulados fue de 86 (6 %) y 226 (15 %) en los clones IL-4-nula e IL-4+, respectivamente. Para analizar más a fondo las diferencias en la expresión génica entre los clones que secretaban IL-4 nula e IL-4, se agruparon los genes en seis patrones de expresión distintos, usando el algoritmo de mapas autoorganizativos (Tamayo et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 96, 2907-2912,1999).

Cuando se examina sobre los microchips de ADN, la activación de clones de linfocitos T V24JQ por anti-CD3 dio

55 como resultado cambios significativos en los transcritos de la familia de citocinas/quimiocinas. Se encontraron diferencias notables en la expresión de genes en esta categoría cuando se compara el clon IL-4+ con el IL-4-nula (figura 25A). Cada uno de los cambios transcripcionales observados en MlP-1, MIP-1, TNF-, TNF-, IL-5, IL-13, y GM-CSF se ha verificado en el nivel de proteínas por ELISA. Cuando se compararon los clones de los gemelos discordantes para la enfermedad, se detectaron cambios fuertes en varios transcritos en el clon IL-4-nula incluyendo los que están en común con el clon de secreción de IL-4, un total de 1523 los transcritos estaban presentes en niveles

significativos, de los que 535 eran únicos del clon IL-4-nula. Además, los pares de clones secretaron cantidades equivalentes de IFN- en respuesta a anti-CD3. De forma importante, si una parte significativa de la función efectora de los linfocitos T CD161+ V24JQ se produce a través de la secreción de citocinas, entonces el clon de IL-4 nula no ha participado en el espectro completo de la función diferenciada. Recientemente, también se han destacado defectos en

5 la capacidad tanto de responder a la activación como posteriormente de secretar citocinas se ha mencionado en los linfocitos T NK de ratones NOD (Falcone, J. of Experimental Medicine 190, 963-972, 1999). Además, esta combinación de citocinas/quimiocinas sugiere que los linfocitos T CD161+ también pueden reclutar y regular células dendríticas inmaduras y monocitos.

Cuando se comparan los clones IL-4+ e IL-4-nula, se destacan diferencias significativas en la expresión en otros genes

10 importantes para la supervivencia celular, la secreción de citocinas y el flujo de calcio que en parte se activan a través de la señalización de PI 3-cinasa, tal como BCLxL, IAP, PLC1 y la familia tec cinasa, Itk. Estos transcritos se encontraron en una abundancia significativamente mayor en el clon IL-4+. También se destacaron diferencias en los ARNm de expresión que codifican factores de transcripción y moduladores de señalización importantes para la secreción de citocinas y Th-fenotipo. Estos incluyeron GATA3, STAT1, STAT4, JunB, JunD y NFAT4. En particular,

15 recientemente se ha informado de que JunB y GATA3 se expresan preferencialmente en los linfocitos T Th2. La activación transcripcional de GATA3, JunB, así como de JunD, se encontró de forma selectiva en el clon IL-4+. Los transcritos para STAT1 (señalización de IFN-), STAT4 (señalización de IL-12) y CD161 (un coactivador de la proliferación de linfocitos T V24JQ y secreción de IFN-) se sobreexpresaron en el clon IL-4-nula con relación al clon IL-4+. De forma importante, el factor de transcripción NFAT4 que se pensó que actuaba en parte como un supresor de

20 la transcripción de IL-4 se sobreexpresó en el clon IL-4-nula con relación al clon IL-4+. Según estos datos, la regulación discordante de otros genes, tales como factores de transcripción se podría predecir que es importante para controlar el Th-fenotipo. Un modelo para genes regulados cuya expresión coincide con las observaciones biológicas independientes se presenta en la figura 25B.

El perfil transcripcional de clones de linfocitos T V24JQ activados reveló que el defecto en la secreción de IL-4

25 observada en el clon de un paciente diabético (en comparación con el gemelos idéntico no diabético) solo es una de un gran número de diferencias en la expresión génica. De forma importante, se encontraron diferencias en la expresión de productos génicos cuya activación se regula en parte por PI3-cinasa y parece que son necesarias para la generación de un linfocito T V24JQ completamente diferenciado.

Ejemplo 14: CD1d en células dendríticas mieloides estimula la secreción de citocinas de y la actividad 30 citolítica de linfocitos T V24JQ

DC son una población diferenciada de células presentadoras de antígeno derivadas de la médula ósea que desempeñan un papel clave en la iniciación de las respuestas de linfocitos T. En seres humanos, se encuentras tres poblaciones de DC en frecuencias muy bajas (0,03-0,3 %) en la sangre periférica. Las DC humanas incluyen dos poblaciones mieloides (precursores de células de Langerhans (Lin-/CD11c+/CD1a+/ IL-3R-) y DC de tejido 35 (Lin-/CD11c+/CD1a-/IL-3R-)) y una población de DC "plasmacitoide" (PDC) (Lin-/CD11c-/CD1a-/IL-3R+). La población de PDC también expresa CXCR3 y CD62L que facilita la vuelta a las vénulas endoteliales altas y el movimiento en los tejidos linfáticos. Las DPC sufren la activación linfática a través de la unión de CD40 o por exposición a LPS y producen una variedad de citocinas y regulan por aumento la capacidad estimuladora de linfocitos T. Las MDC ocupan la epidermis o bien la dermis y otros sitios tisulares, respectivamente. Las MDC residen en tejidos periféricos en un 40 estado inmaduro y captan fácilmente antígenos hasta el momento en el que reciben una señal proporcionada por infección o daño tisular. En este punto se activan y migran a los ganglios linfáticos de drenaje en los que producen fácilmente citocina, tal como IL-12p70 y activan linfocitos T naturales. Estudios recientes apoyan un papel diferencial para las poblaciones de MDC y PDC en la dirección del desarrollo de las respuestas Th1 y Th2. Los estudios en ratones y seres humanos también sugieren que la maduración y función de MDC defectuosas pueden desempeñar

45 una función en la patogénesis de diabetes de tipo 1.

El papel fundamental de las células dendríticas mieloides en la inducción de respuestas inmunitarias celulares Th1 aumenta la posibilidad de que los linfocitos T V24JQ puedan ejercer sus efectos inmunomoduladores a través de la interacción con estas células. Para someter a prueba esta hipótesis, se evaluaron los patrones de expresión para CD1d encontrados en DC in vivo e in vitro y se examinaron las consecuencias funcionales de una interacción entre los

50 clones de linfocitos T V24JQ y las células DC.

Clones de linfocitos T V24JQ usados para este estudio

La derivación de clones de linfocitos T V24JQ se ha descrito previamente (Wilson et al., Nature 391:177,1998). En resumen, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes normales se sometieron a clasificación celular individual para determinar las células doble positivas para V24/V11, que después se cultivaron con PBMC 55 alimentadoras irradiadas (50.000 células/pocillo), 721.221 células linfoblastoides irradiadas (500 células/pocillo), FA-P (1 g/ml), IL-2 (10 U/ml), y IL-7 (10 U/ml) en RPMI 1640 (Sigma) que contenía un 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor, L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U/ml de penicilina, y 10 g/ml de estreptomicina (R10). Después, se propagaron los clones resultantes, con reestimulación periódica por anticuerpo anti-CD3 en presencia de PBMC alimentadora alogénica irradiada y anticuerpo anti-CD3. Se confirmó que los clones eran positivos para V24 y

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23.: Un método de aumentar el tamaño de una sub-población de células T, comprendiendo dicho método poner en contacto una muestra que comprende dichas células T con un anticuerpo que preferiblemente une o modula la expansión o activación de al menos una sub-población de células T seleccionada del grupo de células NK T, células T CD1d-reactivas y células T JαQ+, y células T que expresan un bucle CDR3 o una unión α-β de un TCR que está preferiblemente unido por dicho anticuerpo, en el que dicho contacto se produce bajo condiciones que resultan en un aumento en el número de dichas células T.

24.: El método de 23, que comprende, además, poner en contacto dicha muestra con un antígeno y células presentadoras de antígeno bajo condiciones que permiten dicho contacto para aumentar el número de dichas células T; en el que dicho antígeno no es una α-galactosilceramida.

25.: El método de 24, en el que dicho antígeno es un lípido o antígeno de glicosil-fosfatidilinositol de un patógeno infeccioso, un antígeno de una célula cancerosa o un auto-lípido.

26.: El método de 23, que comprende, además, poner en contacto dicha muestra con un antígeno y células presentadoras de antígeno bajo condiciones que permiten dicho contacto para aumentar el número de dichas células T; en el que dicho antígeno es una α-galactosilceramida.

27. Un método de aumentar el tamaño de una sub-población de células T, comprendiendo dicho método:

(a): poner en contacto una muestra que comprende dichas células T con un anticuerpo o una combinación de anticuerpos que preferiblemente une un bucle CDR3 o una unión α-β de un TCR; o un anticuerpo que preferiblemente une o modula la expansión o activación de al menos una sub-población de células T seleccionada del grupo de células NK T, células T CD1d-reactivas y células T JαQ+; realizándose dicha puesta en contacto bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre dichas células T y dicho anticuerpo o combinación de anticuerpos;

(b) aislar dicho complejo; y

(c): poner en contacto dichas células T en dicho complejo o recuperadas de dicho complejo con un antígeno y células presentadoras de antígeno bajo condiciones que permiten dicho contacto para aumentar el número de dichas células T; en el que dicho antígeno no es α-galactosilceramida.

28. El método de 27, en el que dicho antígeno es un lípido o antígeno de glicosil-fosfatidilinositol de un patógeno infeccioso, un antígeno de una célula cancerosa o un auto-lípido.

29. Un método de aumentar el tamaño de una sub-población de células T, comprendiendo dicho método:

(b) aislar dicho complejo; y

(c): poner en contacto dichas células T en dicho complejo o recuperadas de dicho complejo con un antígeno y células presentadoras de antígeno bajo condiciones que permiten dicho contacto para aumentar el número de dichas células T; en el que dicho antígeno es α-galactosilceramida.

30.: El método de 27 ó 29, que comprende, además, poner en contacto dicha muestra o dicho complejo con una o más citoquinas.

31.: Un método de aumentar el tamaño de una sub-población de células T en un mamífero, comprendiendo dicho método:

(a) obtener una muestra que comprende dichas células T a partir de dicho mamífero;

(b) poner en contacto dichas células T con un anticuerpo o una combinación de anticuerpos que preferiblemente une o modula la expansión o activación de al menos una sub-población de células T seleccionada del grupo de células NK T, células T CD1d-reactivas, células T JαQ+ y células T que expresan un bucle CDR3 o una unión α-β de un TCR que está preferiblemente unido por dicho anticuerpo o dicha combinación de anticuerpos; realizándose dicho contacto bajo condiciones que permitan que dicho contacto aumente el número de dichas células T; y

(c) administrar dichas células T contactadas a dicho mamífero.

32. El método de 31, que comprende, además, purificar dichas células T antes de dicha etapa de puesta en contacto o después de dicha etapa de puesta en contacto.

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Claims

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