ES2585206T3 - Anticuerpos agonistas anti-Notch3 y su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con Notch3 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une especificamente al receptor Notch 3, en donde el anticuerpo se une especificamente a un epitopo en la SEQ ID NO: 10, y en donde el anticuerpo es un agonista de Notch 3 que activa la senalizacion mediada por el receptor Notch 3 a traves del receptor Notch 3 independiente de una union de ligando al receptor Notch 3.

Description

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Los anticuerpos de la presente invención comprenden anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos que reconocen un único sitio antigénico. Su especificidad uniforme hace que los anticuerpos monoclonales sean mucho más útiles que los anticuerpos policlonales, que habitualmente contienen anticuerpos que reconocen diversos diferentes sitios antigénicos. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando tecnología de hibridoma, tales como los descritos por Kohler, et al., Nature 256:495 (1975); patente de Estados Unidos n.º 4.376.110; Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. (1988) y Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981), métodos de ADN recombinante, u otros métodos conocidos para los expertos en la materia. Otros ejemplos de métodos que pueden emplearse para producir anticuerpos monoclonales incluyen, aunque sin limitación, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor, et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole, et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)), y la técnica de hibridoma EBV (Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pág. 77-96, Alan R. Liss (1985)). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el MAb de esta invención puede cultivarse in vitro

o in vivo.

En el modelo de hibridoma, se inmuniza un hospedador tal como un ratón, un ratón humanizado, un ratón con un sistema inmunológico humano, hámster, conejo, camello, o cualquier otro animal hospedador apropiado, para producir linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Como alternativa, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Los linfocitos después se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pág. 59-103 (1986)).

Generalmente, en la preparación de hibridomas productores de anticuerpos, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de ganglio linfático si se desean fuentes de mamífero no humanas. Los linfocitos después se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pág. 59-103 (1986)). Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino o humano. Normalmente, se emplea una línea celular de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medo de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), sustancias que evitan el crecimiento de células HGPRT deficientes.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de forma eficaz, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas líneas celulares de mieloma están las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. solicitud de Estados Unidos n.º, y células SP2/0 o X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Md. EE.UU. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratónhumano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pág. 51-63 (1987)). También puede usarse la línea celular de mieloma de ratón NSO (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, R.U.).

El medio de cultivo en que se cultivan las células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra Notch3. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse pro inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Dichas técnicas son conocidas en la técnica y pertenecen a las habilidades de los expertos. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal a Notch3 puede determinarse, por ejemplo, por un análisis de Scatchard (Munson, et al., Anal Biochem 107:220 (1980)).

Después de identificarse las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución limitante y cultivarse por métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pág. 59-103 (1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM) o medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente o se aíslan del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, cromatografía de exclusión en gel, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

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dominios CH1, CH2, y CH3. También se incluyen en la invención fragmentos de unión a antígeno que comprenden cualquier combinación de región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son de ser humano, primates no humanos, roedores (por ejemplo, ratones y ratas), burros, ovejas, conejos, cabras, cobayas, camellos, caballos o pollos.

Como se usa en este documento, "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe infra y, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.º 5.939.598 de Kucherlapati, et al.

Los anticuerpos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de Notch3 o pueden ser específicos tanto para Notch3 como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J Immunol 147:60 (1991); las patentes de Estados Unidos n.º 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny, et al., J Immunol 148:1547 (1992).

Los anticuerpos pueden describirse o especificase en término del epítopo o epítopos o parte o partes de Notch3 que reconocen o a las que se unen específicamente. El epítopo o epítopos o parte o partes del polipéptido pueden especificarse como se describe en este documento, por ejemplo, por las posiciones N-terminal y C-terminal, por el tamaño en los restos contiguos de aminoácido, o como se enumera en las Tablas y Figuras.

Los anticuerpos también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Los anticuerpos que se unen a polipéptidos Notch3, que tienen al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 60 %, al menos un 55 %, y al menos un 50 %, de identidad (calculada usando métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento) con Notch3 también se incluyen en la presente descripción. Los anticuerpos anti-Notch3 también pueden unirse con una KD de menos de aproximadamente 107 M, menos de aproximadamente 106 M, o menos de aproximadamente 105 M para otras proteínas, tales como anticuerpos anti-Notch3 de especies diferentes a aquella contra la que está dirigido el anticuerpo anti-Notch3.

En realizaciones específicas, los anticuerpos reaccionan de forma cruzada con homólogos de mono de Notch3 humana y los correspondientes epítopos de los mismos. En una realización específica, la reactividad cruzada descrita anteriormente es con respecto a cualquier polipéptido antigénico o inmunogénico específico individual, o una o más combinaciones de los polipéptidos antigénicos y/o inmunogénicos específicos descritos en este documento.

Se incluyen adicionalmente anticuerpos que se unen a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridan con un polinucleótido que codifica Notch3 en condiciones rigurosas de hibridación. Los anticuerpos también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un polipéptido descrito en este documento. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación en equilibrio o KD de 108 a 1015 M, 108 a 1012 M, 108 a 1010 M, o 1010 a 1012 M. La descripción también proporciona anticuerpos que inhiben de forma competitiva la unión de un anticuerpo a un epítopo de la descripción como se determina por cualquier método conocido en la técnica para determinar la unión competitiva, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en este documento. En realizaciones preferidas, el anticuerpo inhibe de forma competitiva la unión al epítopo en al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %,o almenosun50 %.

Vectores y células hospedadoras

En otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias aisladas de ácido nucleico que codifican una variante de anticuerpo como se describe en este documento, construcciones de vector que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos de la presente invención, células hospedadoras que comprenden dicho vector, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante de la variante de anticuerpo, el ácido nucleico codificante se aísla e inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica la variante de anticuerpo se aísla fácilmente y secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de la variante de anticuerpo). Pueden usarse técnicas convencionales para clonación y transformación en la preparación de líneas celulares que expresan los anticuerpos de la presente invención.

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