ES2577006T3

ES2577006T3 - Estabilización de termolisina en solución acuosa

Info

Publication number: ES2577006T3
Application number: ES12185993.8T
Authority: ES
Inventors: Werner Hoelke; Antje Liehre; Johann-Peter Thalhofer; Markus Weber
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2008-08-27
Filing date: 2009-08-25
Publication date: 2016-07-12
Anticipated expiration: 2029-08-25
Also published as: US9045743B2; ES2445866T3; EP2607481A1; KR20100025480A; EP2161333A1; SG159481A1; US20100248326A1; US8211684B2; JP2010051314A; EP2161333B1; HK1141829A1; CA2676509C; EP2607481B1; US9574186B2; CN101659950B; US20150337282A1; CA2676509A1; JP5634043B2; US20120244598A1; CN101659950A

Abstract

Una composición líquida que comprende la termolisina en una forma disociada y a una concentración en el rango de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, en el que a una temperatura en el rango de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C y al menos cinco horas después de la formación de la composición, la turbidez de la composición es igual a la turbidez de una solución de referencia, siendo la composición obtenible por un método que comprende la primera etapa (P) de mezclar una preparación sólida que comprende la termolisina con un disolvente acuoso y obteniendo una primera solución, en el que la preparación sólida comprende la termolisina a una concentración de aproximadamente 20% [p/p] o superior, y en el que la primera solución comprende (i) una sal de tampón capaz de mantener un pH en el rango de pH 4,5 y pH 9, (ii) una o más sales, y (iii) termolisina, y en la primera solución, la concentración de la preparación que comprende la termolisina en el disolvente acuoso está en el rango de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentración agregada de una o más sales incluyendo las sales de tampón está en el rango de aproximadamente 0,1 mM y 500 mM, y en el que el método comprende además la etapa posterior (Q) de añadir a la primera solución una cantidad medida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2, y una mezcla de los mismos, y disolver la sal adicional, y en el que la concentración total de la sal adicional en la solución obtenida después de la etapa (Q) se encuentra en el rango de aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 5 M, en la que la turbidez se determina mediante inspección visual de atenuación de la luz, o midiendo la densidad óptica con un fotómetro o por medición de la dispersión de la luz con un fotómetro de dispersión de luz, en el que la solución de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados a las mismas concentraciones correspondientes que en la composición, y en el que la solución de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma.

Description

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DESCRIPCION

Estabilizacion de termolisina en solucion acuosa

La presente invencion se refiere al campo de la bioqmmica. La presente invencion trata con la enzima proteolftica termolisina que tiende a ser inestable en solucion acuosa. La invencion proporciona metodos y composiciones para mejorar la estabilidad de la termolisina disuelta en solucion acuosa. La termolisina, la termolisina en bruto o un liofilizado que contiene la termolisina y una o mas sales, se pone en contacto con un tampon acuoso con una concentracion de sal baja y se forma una primera solucion. Posteriormente, se anade una sal adicional en forma solida y se disocia, formando de ese modo una segunda solucion que contiene la termolisina en una forma estabilizada.

Antecedentes de la invencion

La termolisina [EC 3.4.24.27; Numero de registro CAS 9073-78-3] es una metaloproteinasa neutral termoestable (tambien referida aqu como "proteasa neutral") producida en el caldo de cultivo de Bacillus thermoproteolyticus (Endo, S., J., Ferment. Technol. 40 (1962) 346-353; Matsubara, H., Feder, J., en: 3° Ed., P., D., (Ed.), The Enzymes, vol 3, Academic Press, New York, 1971, pp. 721-795). Se requiere un ion zinc para la actividad enzimatica y cuatro iones de calcio para la estabilidad estructural (Latt, S., A., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 37 (1969) 333339; Feder, J., et al. Biochemistry 10 (1971) 4552-4556; Tajima, M., et al. Eur. J. Biochem. 64 (1976) 243-247) y cataliza espedficamente la hidrolisis de los enlaces peptfdicos que contienen residuos de aminoacidos hidrofobos (Morihara, K., Tsuzuki, H., Eur. J. Biochem. 15 (1970) 374-380;. Inouye, K., et al. Biochem. J. 315 (1996) 133-138). La termolisina se utiliza ampliamente para la formacion del enlace peptfdico a traves de la reaccion inversa de hidrolisis (Oyama, K., et al., J. Chem. Soc. Perkin II (1981) 356-360; Nakanishi, K., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 613 (1990) 652-655; Trusek-Holownia, A., J. Biotechnol. 102 (2003) 153-163). El gen npr que codifica la termolisina se aislo de B. thermoproteolyticus (O'Donohue, M., J., et al., Biochem. J. 300 (1994) 599-603). El analisis de secuencia revela que la termolisina se sintetiza como una pre- protema que consiste en un peptido senal (28 residuos), una prosecuencia (204 residuos), y una secuencia madura (316 residuos) (O'Donohue, M., J., et al., supra). La prosecuencia actua como una chaperona intramolecular que conduce a una escision autocatalttica del enlace peptfdico que une la prosecuencias y la secuencia madura (O'Donohue, M., J., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 26477-26481, Marie-Claire, C., et al, J. Biol. Chem. 273 (1998) 5697-5701; Marie-Claire, C., et al., J. Mol. Biol. 285 (1999) 1911-1915).

La extincion teorica a 280 nm de la termolisina intacta en agua se puede calcular utilizando la "herramienta ProtParam", que esta disponible al publico a traves de Internet (
http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). ProtParam es una herramienta que permite el calculo de varios parametros ffsicos y qrnmicos para una determinada protema almacenada en Swiss-Prot o TrEMBL o para una secuencia introducida por el usuario. Los parametros calculados incluyen el peso molecular, pi teorico, composicion de aminoacidos, composicion atomica, coeficiente de extincion, vida media estimada, mdice de inestabilidad, mdice alifatico y gran promedio de hidropaticidad. En consecuencia, puede ser calculado el valor de la absorbancia teorica en agua de A (1 mg / ml), de 1,696 a 280 nm.

El fabricante de termolisina (Daiwa Kasei K.K., Japon) refiriendose a Ohta, Y. et al. (J. Biol. Chem. 241 (1966) 5919 hasta 5925) indica una absorbancia de A (1 mg / ml), de 1,765 a 280 nm en tampon Tris HCl 50 mM, pH 7.

Inouye, K., et al. (J. Biochem. 123 (1998) 847-852) describe un valor de absorbancia A (1 mg / ml) de 1,83, determinada a 277 nm y 25 °C para la termolisina Lot T8BA51 (Daiwa Kasei K.K., Osaka, Japon) en CaCl2 10 mM, Tris HCl 40 mM, pH 7,5.

La termolisina se puede obtener como un liofilizado de proveedores comerciales. Daiwa Kasei K.K. (Japon) distribuye una termolisina con un peso molecular de 34.600 Da (Daltons), un pH optimo a un pH de 8,0, y una temperatura optima en el intervalo de 65 °C y 70 °C. Segun el fabricante, la enzima es estable en un intervalo de pH de pH 5,0 y pH 8,5. Se indica una solubilidad de 0,02% en solucion tampon diluida. Se puede comprar termolisina doblemente cristalizada como un polvo liofilizado amorfo, en el que la protema enzimatica en la materia seca es del 60% [p/p] o superior. El secado de la materia contiene, ademas, acetato de calcio anhidro (alrededor del 20% [p/p]) y acetato de sodio anhidro (alrededor del 10% [p/p]). Para mas cristalizacion el fabricante describe un metodo que comprende las etapas de suspender el liofilizado a una concentracion en el intervalo de 1% [p/ v] y 5% [p/ v] en una solucion acuosa de calcio-acetato 0,01 M. El material en suspension se disuelve mediante la adicion suficiente por goteo de hidroxido de sodio 0,2 N con agitacion para llevar el pH de la solucion acuosa a un valor en el intervalo de pH 11,0 y pH 11,4. Despues de la eliminacion de cualquier residuo no disuelto, el pH de la solucion se ajusta a pH 6,0 con acido acetico 0,2 N. La cristalizacion se completa generalmente en aproximadamente 2 dfas. Todo el proceso se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 0 °C y 2 °C.

Las preparaciones de termolisina tambien estan disponibles a partir de Daiwa Kasei K.K. (Japon) bajo el nombre comercial Thermoase.

El documento PE 0 640 687 describe una solucion acuosa de CaCl2 7 mM y NaCl 1,75 M en el que Thermoase se

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disolvio para dar lugar a una concentracion de aproximadamente 36 mg/ml. La pureza de termolisina en el polvo de Thermoase seco fue aproximadamente del 20%. Teniendo en cuenta la pureza, la concentracion de termolisina en la solucion acuosa fue de aproximadamente 7 mg / ml.

Inouye, K., et al. (J. Biochem. 123 (1998) 847-852) describio que la termolisina es una protema moderadamente soluble. Se sugirio que la superficie de la protema es hidrofoba en gran medida y el hecho de que la termolisina se puede purificar de manera eficiente por medio de cromatograffa de interaccion hidrofobica apoya esta nocion (Inouye, K., et al., Protein Expression and Purification 46 (2006) 248-255). Como consecuencia de su baja solubilidad, la enzima tiene una fuerte tendencia a precipitar al cabo de horas a partir de soluciones recien preparadas.

Inouye, K. et al. (J Biochem., Supra) demostro ademas que la solubilidad de la termolisina en un disolvente acuoso se puede aumentar si ciertas sales neutras se disuelven en el disolvente cuando se pone en contacto con una preparacion liofilizada de termolisina. El efecto ha demostrado ser dependiente de (1) temperatura, (2) la sal neutra particular presente en el disolvente, y (3) la concentracion de la sal neutra correspondiente. En el documento de Inouye, K. et al. (J. Biochem. supra) la Figura 2 describe los resultados de una serie de experimentos en los que una cantidad excesiva de polvo liofilizado de termolisina (preparacion de termolisina tres veces cristalizada y liofilizada (Daiwa Kasei KK, Osaka, Japon; Lote T8BA51; se uso sin purificacion adicional) se mezclo con un "tampon estandar" (CaCl2 10 mM, Tris HCl 40 mM, pH 7,5) que contema adicionalmente una sal a una concentracion predeterminada (en el rango de 0,5 M y 5 M). la concentracion de protema disuelta se determino espectrofotometricamente usando un valor de absorbancia, A (1 mg / ml), a 277 nm de 1,83 y una masa molecular de 34,6 kDa.

Las tablas 1-4 reproducen los valores numericos aproximados que indican las concentraciones de protema disuelta como se representa graficamente en la Figura 2 de Inouye, K. et al. (J. Biochem. supra), a dos temperaturas diferentes (0 °C y 37 °C). Las concentraciones de protema tabuladas son en mg/ml. En cada tabla las sales disueltas en el tampon estandar se indican, asf como sus correspondientes concentraciones.

Tabla 1

Concentraciones de protema (en [mg/ml]) soluble a 0 °C en tampon estandar que contiene sal


: concentracion de sal en tampon estandar

sal: 0,5 M 1,0 M 1,5 M 2,0 M 2,5 M

NaCl: ~6,4 ~8,9 ~10,3 ~12,2 ~ 11,6

KCl: ~4,5 ~6,3 ~7,5 ~6,5 ~5,3

LiCl: 1,9 ~3,3 ~4,5 ~5,3 ~6,6

NaBr: ~4,4 ~6,6 ~15,6 ~25,3 ~38,4

NaJ: ~5,5 ~7,8 ~20,3 ~29,2 ~32,5

Tabla 2_______________________________________________________________________________

________Concentraciones de protema (en [mg/mll) soluble a 37 °C en tampon estandar que contiene sal


: concentracion de sal en tampon estandar

sal: 3,0 M 3,5 M 4,0 M 4,5 M 5,0 M

NaCl: ~9,5 ~8,1 ~6,9 ~5,3 ~3,8

KCl: ~5,2 ~4,4 ~2,5 ~4,1 ~3,4

LiCl: ~8,0 ~11,1 ~14,7 ~21,6 ~26,3

NaBr: ~ 40 ~ 30 ~36,6 ~27,8 ~25,3

NaJ: ~34,4 ~37,5 ~38,6 ~42,3 §

§ fuera del rango de deteccion

Tabla 3

Concentraciones de protema (en [mg/mll) soluble a 37 °C en tampon estandar que contiene sal


: concentracion de sal en tampon estandar

sal: 0,5 M 1,0 M 1,5 M 2,0 M 2,5 M

NaCl: ~2,7 ~3,8 ~5,5 ~ 7,5 ~ 8,8

KCl: ~1,6 ~3,1 ~3,2 ~4,2 ~3,4

LiCl: ~0,9 ~2,2 ~2,5 ~3,1 ~4,5

NaBr: ~3,4 ~5,0 ~9,7 ~13,3 ~18

NaJ: ~3,4 ~6,2 ~ 18 ~24,5 ~34,4

Tabla 4

Concentraciones de protema (en [mg/mll) soluble a 37 °C en tampon estandar que contiene sal


: concentracion de sal sal en tampon estandar


: 3,0 M | 3,5 M | 4,0 M | 4,5 M | 5,0 M

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sal: NaCl ~7,4 ~5,5 ~3,1 ~2,3 ~1,0

KCl: ~3,1 ~2,8 ~2,2 ~1,9 ~0,6

LiCl: ~7,0 ~8,8 ~11,3 ~18 ~22,3

NaBr: ~22,2 ~24,4 ~26,3 ~29 ~33,1

NaJ: ~36,7 ~38,1 ~35,3 ~38,6 ~38,0

En consecuencia, para las sales seleccionadas las mayores concentraciones de protema soluble fueron cada uno de aproximadamente

8,8 mg/ml a 37 °C en presencia de NaCl 2,5 M,

12.2 mg/ml a 0 °C en presencia de NaCl 2 M,

4.2 mg/ml a 37 °C en presencia de KCl 2 M,

7,5 mg/ml a 0 °C en presencia de KCl 1,5 M,

22.3 mg/ml a 37 °C en presencia de LiCl 5 M,

26.3 mg/ml a 0 °C en presencia de LiCl 5 M,

33,1 mg/ml a 37 °C en presencia de NaBr 5 M,

40 mg/ml a 0 °C en presencia de NaBr 3 M,

38,6 mg/ml en 37 °C en presencia de NaJ 4,5 M, y > 45 mg/ml a 0 °C en presencia de NaJ 5 M.

La termolisina es una proteasa agresiva que en solucion produce un ataque autoproteolttica. De este modo, ambas preparaciones cristalizada y liofilizada de la termolisina, asf como soluciones de tales preparaciones contienen cantidades de diferentes fragmentos autoproteolfticos de termolisina.

Con el fin de limitar el ataque autoproteolftico, se aplican bajas temperaturas a las soluciones que contienen termolisina. Sin embargo, en tales condiciones solamente se reduce la actividad enzimatica (es decir, aun esta presente cierta actividad proteolftica), y no produce un cese definitivo. En este sentido se observa que Inouye, K. et al. (J Biochem., supra) determina el contenido de protema de soluciones sin ninguna etapa de purificacion. Las concentraciones de protema detectadas por lo tanto corresponden a mezclas de termolisina intacta y fragmentos de degradacion de los mismos.

En vista del estado de la tecnica, es un objeto de la presente invencion proporcionar metodos y composiciones con una forma estabilizada de termolisina en una solucion acuosa. Al proporcionar una forma estabilizada, se reduce la tendencia de termolisina para precipitar, y las soluciones de la enzima permanecen en un estado homogeneo durante un tiempo prolongado.

Los inventores han encontrado inesperadamente que mediante la disolucion de termolisina primero en un tampon con una baja concentracion de iones y anadiendo despues una sal y disolviendo la sal en la solucion que ya contiene termolisina sorprendentemente permite formar una solucion con una alta concentracion de termolisina. Al mismo tiempo, bajo estas condiciones de acuerdo con la invencion la termolisina disociada se estabiliza en la solucion, es decir, la solucion permanece clara por una mayor cantidad de tiempo durante el cual no se forma precipitado.

La invencion proporciona un beneficio significativo cuando tienen que mantenerse cantidades de termolisina en solucion para dispensar almuotas de la misma, o para la fabricacion de mezclas con preparaciones de otras enzimas, tales como enzimas de colagenasa. Tales mezclas de enzimas proteolfticas son de uso particular en la disociacion de tejido de los organos para la separacion de los subconjuntos de celulas del tejido.

Resumen de la invencion

Un primer aspecto de la presente invencion es una composicion lfquida que comprende la termolisina en una forma disociada y a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, en el que a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C y al menos cinco horas despues de la formacion de la composicion, la turbidez de la composicion es igual a la turbidez de una solucion de referencia, siendo la composicion obtenible por un metodo que comprende la primera etapa (P) de mezclar una preparacion solida que comprende la termolisina con un disolvente acuoso y produciendo una primera solucion, en la que la preparacion solida comprende la termolisina a una concentracion de aproximadamente 20% [p/p] o superior, y en el que la primera solucion comprende (i) una sal de tampon capaz de mantener un pH en el intervalo de pH entre 4,5 y 9, (ii) una o mas sales, y (iii) termolisina, y en la primera solucion de la concentracion de la preparacion que comprende la termolisina en el disolvente acuoso esta en el intervalo de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentracion total de una o mas sales incluyendo la(s) sal(es) del tampon esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y 500 mM, y en el que el metodo comprende ademas la posterior etapa (Q) de anadir a la primera solucion una cantidad medida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos, y disolver la sal adicional, y cuando la concentracion total de la sal adicional en la solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 5 M, en la que la turbidez se determina por

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inspeccion visual de atenuacion de la luz, o midiendo la densidad optica con un fotometro o por la medicion de la luz dispersada con un fotometro de dispersion de luz, en el que la solucion de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados en las mismas concentraciones que en la composicion, y en el que la solucion de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma.

Un segundo aspecto de la presente invencion es una composicion lfquida que comprende la termolisina en una forma disociada y a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 10 mg/ml y aproximadamente 23 mg/ml, en el que a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C y al menos cinco horas despues de la formacion de la composicion, la turbidez de la composicion es igual a la turbidez de una solucion de referencia, siendo la composicion obtenible por un metodo que comprende la primera etapa (P) de mezclar una preparacion solida que comprende la termolisina con un disolvente acuoso y produciendo una primera solucion, en la que la preparacion solida comprende la termolisina a una concentracion de aproximadamente 20% [p/p] o superior, y en el que la primera solucion comprende (i) una sal de tampon capaz de mantener un pH en el intervalo de pH entre 4,5 y 9, (ii) una o mas sales, y (iii) termolisina, y en la primera solucion de la concentracion de la preparacion que comprende la termolisina en el disolvente acuoso esta en el intervalo de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentracion total de una o mas sales incluyendo la(s) sal(es) del tampon esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y 500 mM, y en el que el metodo comprende ademas la posterior etapa (Q) de anadir a la primera solucion una cantidad medida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos, y disolver la sal adicional, y cuando la concentracion total de la sal adicional en la solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 5 M, en la que la turbidez se determina por inspeccion visual de atenuacion de la luz, o midiendo la densidad optica con un fotometro o por la medicion de la luz dispersada con un fotometro de dispersion de luz, en el que la solucion de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados en las mismas concentraciones que en la composicion, y en el que la solucion de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma.

Un tercer aspecto de la presente invencion es una composicion lfquida que comprende agua, termolisina en una forma disociada, una sal de tampon disociada capaz de mantener un pH en el intervalo de pH 4,5 y pH 9, y NaCl disociado con una concentracion de iones de sodio disociados en el rango de 100 mM y por debajo de 500 mM en la composicion, y en el que la composicion contiene termolisina a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, en el que a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C y al menos cinco horas despues de la formacion de la composicion, la turbidez de la composicion es igual a la turbidez de una solucion de referencia, siendo la composicion obtenible por un metodo que comprende la primera etapa (P) de mezclar una preparacion solida que comprende la termolisina con un disolvente acuoso y produciendo una primera solucion, en la que la preparacion solida comprende la termolisina a una concentracion de aproximadamente 20% [p/p] o superior, y en el que la primera solucion comprende (i) una sal de tampon capaz de mantener un pH en el intervalo de pH entre 4,5 y 9, (ii) una o mas sales, y (iii) termolisina, y en la primera solucion de la concentracion de la preparacion que comprende la termolisina en el disolvente acuoso esta en el intervalo de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentracion total de una o mas sales incluyendo la(s) sal(es) del tampon esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y 500 mM, y en el que el metodo comprende ademas la posterior etapa (Q) de anadir a la primera solucion una cantidad medida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos, y disolver la sal adicional, y cuando la concentracion total de la sal adicional en la solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 5 M, seguido de la etapa de diafiltracion de la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) frente a un tampon de diafiltracion que contiene una sal de tampon disociada capaz de mantener un pH en el intervalo de pH 4,5 y pH 9, y NaCl disociado a una concentracion por debajo de 500 mM, en la que la turbidez se determina por inspeccion visual de atenuacion de la luz, o midiendo la densidad optica con un fotometro o por la medicion de la luz dispersada con un fotometro de dispersion de luz, en el que la solucion de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados en las mismas concentraciones que en la composicion, y en el que la solucion de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma

Un cuarto aspecto de la presente invencion es el uso de una composicion lfquida de acuerdo con la invencion para el almacenamiento, el transporte, o dispensacion de termolisina, en el que la termolisina esta en forma disociada.

Tambien se describe un metodo para preparar una solucion de termolisina (EC 3.4.24.27) en el que la termolisina disuelta esta en forma estabilizada, el metodo que comprende la primera etapa (P) de mezclar una preparacion solida que comprende la termolisina con una disolvente acuoso y produciendo una primera solucion, en la que la primera solucion comprende (i) una sal tampon capaz de mantener un pH en el intervalo de pH 4,5 y pH 9, (ii) una o mas sales, y (iii) termolisina, y en la primera solucion la concentracion total de las una o mas sales incluyendo la sal o sales tampon esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 150 mM, en el que el metodo comprende ademas la posterior etapa (Q) de anadir a la primera solucion una cantidad medida de una sal adicional, por lo que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos, y disolver la sal adicional, preparando de este modo una segunda solucion en la que la termolisina disuelta esta en una forma estabilizada.

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Descripcion detallada de la invencion

Ciertos terminos se utilizan con un significado especial, o se definen por primera vez en esta descripcion de la presente invencion. Para los fines de la presente invencion, los terminos utilizados se definen por sus definiciones aceptadas en la tecnica, cuando existen, excepto cuando las definiciones entren en conflicto o parcialmente en conflicto con las definiciones que figuran a continuacion. En el caso de un conflicto en la definicion, el significado de un termino se define en primer lugar por cualquiera de las definiciones establecidas a continuacion.

El termino "que comprende" se utiliza en la descripcion de la invencion y en las reivindicaciones para definir "que incluye, pero no necesariamente se limita a".

Los artfculos "un" y "una" se utilizan aqm para referirse a uno o a mas de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artfculo. A modo de ejemplo, "un compuesto" significa un compuesto o mas de un compuesto.

Cuando se designa un intervalo de valores numericos, tales como, pero sin limitarse a, un intervalo de concentracion, el rango se indica mediante un primer valor n1 y un segundo valor n2 (por ejemplo, "un rango de n1 y n2"). El lfmite inferior del rango designado se entiende como un valor igual o mayor al primer valor. El lfmite superior del rango designado se entiende como un valor igual a o inferior al segundo valor. Por lo tanto, un valor de x en el intervalo designado esta dada por n1 < x < n2. Cuando un rango se indica usando la palabra "entre", el lfmite superior y el lfmite inferior se entienden como incluidos en el intervalo. Por lo tanto, la expresion "un valor x entre n1 y n2" se entiende como n1 < x < n2.

Si no se indica lo contrario, se entiende que el termino "aproximadamente" y el caracter "~" en combinacion con un valor numerico n ("aproximadamente n", "~ n") indica un valor de x en el intervalo dado por el valor numerico ±5% del valor, es decir, n - 0,05 * n < x < n + 0,05 * n. En caso de que el termino "aproximadamente" o el caracter "~" en combinacion con un valor numerico n describe una realizacion preferida de la invencion, el valor de n es el mas preferido, si no se indica lo contrario.

Una "mezcla" es una sustancia producida por la combinacion de dos o mas materiales diferentes que aparece sin ninguna reaccion qmmica. Los objetos no se unen juntos en una mezcla. Una mezcla por lo general se puede separar de nuevo en sus componentes originales. Las mezclas son el producto de una combinacion o la mezcla mecanica de sustancias qmmicas como los elementos y los compuestos, sin union qmmica u otro cambio qmmico, de manera que cada sustancia ingrediente conserva sus propias propiedades qmmicas y composicion. Si bien no hay cambios qmmicos en una mezcla, las propiedades ffsicas de una mezcla, tales como su punto de fusion, pueden diferir de las de sus componentes. Las mezclas pueden ser homogeneas o heterogeneas.

Las mezclas homogeneas son mezclas que tienen propiedades definidas y consistentes. Las partfculas se distribuyen uniformemente. Por ejemplo, cualquier cantidad de una mezcla dada tiene la misma composicion y propiedades. Una mezcla homogenea es una mezcla uniforme que consta de una sola fase. Para el proposito de la invencion, las soluciones de una o mas sales disociadas son ejemplos no limitativos de mezclas homogeneas.

Una solucion es una mezcla homogenea de uno o mas sustancias (los solutos) disueltas (es decir, disociadas) en otra sustancia (el disolvente). Un ejemplo comun sena una disolucion solida en un lfquido (es decir, sal o protema disuelta en agua). La solubilidad es una propiedad del compuesto. Dependiendo de las condiciones, la cantidad de una sustancia que puede disolverse en un disolvente o una solucion puede ser variable.

Los ejemplos no limitantes de las mezclas no homogeneas (heterogeneos) son un coloide y una suspension. En el contexto de la invencion, una suspension se entiende como un fluido heterogeneo que contiene partfculas solidas que son suficientemente grandes para la sedimentacion. A diferencia de los coloides, las partfculas en suspension se depositan con el tiempo si se dejan. Esto distingue a una suspension de un coloide en el que las partfculas en suspension son mas pequenas y no se depositan.

En una solucion, la sustancia disuelta no existe como un solido, y el soluto(s) y el disolvente se mezclan homogeneamente. El termino "estabilidad" de una solucion se refiere a la tendencia de la sustancia disuelta a permanecer en el estado disuelto. Es decir, el termino se refiere a la capacidad de que la solucion permanezca homogenea durante un intervalo de tiempo dado. Por lo tanto, la estabilidad se puede caracterizar de manera cuantificable mediante la determinacion de dicho intervalo de tiempo. Por lo tanto, la sustancia disuelta en una primera solucion caracterizada por una estabilidad inferior presenta una mayor tendencia a precipitar o formar un coloide o una suspension, en oposicion a una segunda solucion que se caracteriza por una mayor estabilidad en el que dicha tendencia es menor. Como consecuencia de ello, despues de una cierta cantidad de tiempo dicha primera solucion se convierte en una mezcla heterogenea mientras que dicha segunda solucion sigue siendo una mezcla homogenea.

Bajo ciertas condiciones la estabilidad de una solucion se puede aumentar, es decir, la tendencia de una sustancia disuelta a precipitar se reduce. Para el proposito de la presente invencion, una sustancia con una tendencia reducida a precipitar se refiere como estar en "una forma estabilizada".

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La turbidez es una medida de turbidez del agua causada por la presencia de partmulas en una suspension o un coloide. Hay varias formas practicas para determinar la turbidez, la mas directa es medir la atenuacion (es decir, reduccion de la resistencia) de la luz a medida que pasa a traves de una muestra de la columna de agua. Por lo tanto, una manera de determinar la turbidez es la inspeccion visual, es decir, la inspeccion a simple vista.

Otra forma de determinacion es la medicion de la atenuacion de la luz con un fotometro. En este sentido, el termino "densidad optica" (tambien referido como "DO") denota una medida sin unidades de la transmitancia de un elemento optico para una longitud dada en una longitud de onda A dada:

imagen1

por lo que

0 = la opacidad por unidad

T = la transmitancia por unidad

Io = la intensidad del haz de luz incidente

1 = la intensidad del haz de luz transmitido.

Cuanto mayor sea la densidad optica, menor es la transmitancia. Debido a la dispersion de un haz de luz centrado en las partmulas, la densidad optica de una suspension o un coloide aumenta en comparacion con una solucion clara.

Un modo preferido para determinar la turbidez es medir la luz dispersada. Con este fin, se utiliza frecuentemente un fotometro de dispersion de la luz. Dependiendo de la direccion en la que se detecta y se cuantifica la dispersion de la luz, hay varios tipos de fotometros de dispersion conocidos en la tecnica. En principio, todos se pueden utilizar para la evaluacion cuantitativa de la turbidez en muestras lfquidas. El termino "dispersion de la luz" incluye colectivamente tanto la dispersion de las ondas de luz por partmulas en la muestra, como la reflexion por la materia en partmulas en la muestra. La retrodispersion se define como menos de 90 °, hacia la fuente de luz. La dispersion hacia adelante se define como menos de 90 °, o en la misma direccion general o en direccion contraria de la fuente de luz. La mayona de las unidades de medida de turbidez utilizadas en la actualidad se basan en tecnicas de medicion de dispersion lateral de 90 °.

La intensidad de la luz dispersada depende de la cantidad de materia no disuelta (en partmulas) en la mezcla heterogenea y se puede describir por la Formula I:

F = I(J- 0) • (2.303 • t - c - d) (Formula I)

por lo que

F es la intensidad de la luz dispersada I0 es la intensidad de haz de luz entrante

O es la relacion entre fotones emitidos frente a fotones absorbidos £ es el coeficiente de absorcion molar de la sustancia en partmulas en la mezcla

C es la cantidad de la sustancia en partmulas por volumen de la muestra lfquida (mezcla heterogenea) en la cubeta d es el espesor del espacio en la cubeta

Para los fines de la invencion, las mediciones de dispersion lateral de 90 ° se hacen con un fotometro de fluorescencia para determinar la nubosidad de las mezclas heterogeneas que contienen termolisina como material particulado. Tfpicamente, tales mezclas son coloides.

La "termolisina en bruto" en el sentido de la invencion es una mezcla de protemas que consiste principalmente de termolisina sustancialmente no degradada (= intacta) y, ademas de productos de degradacion, por lo general como resultado de un ataque autoproteolftica. Por lo general, alrededor del 70% de la termolisina en bruto se encontro sustancialmente no degradada, mientras que alrededor del 24% de la termolisina en bruto se compone de diferentes productos de degradacion que retienen la actividad proteolftica (en diferentes grados), y aproximadamente el 6% son fragmentos proteoltticamente inactivos y otras impurezas. Thermoase es una preparacion de termolisina en bruto que se utiliza para ejemplificar los efectos ventajosos de la presente invencion. Sin embargo, la presente invencion no se limita a la utilizacion de preparados de Thermoase, y se puede utilizar otras preparaciones de la enzima para practicar la invencion.

Thermoase es un liofilizado con un contenido de protema que se encuentra en el intervalo entre aproximadamente 30% [p/p] y alrededor de 35% p/p]. La protema en el liofilizado consiste de "termolisina en bruto".

Desde el estado de la tecnica se sabe que la solubilidad de la termolisina aumenta si una sal, preferiblemente una sal neutra disociada esta presente en el tampon acuoso a utilizar como disolvente de termolisina seca, o de una

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composicion seca que contiene termolisina. Sin embargo, las soluciones acuosas de termolisina son inestables porque la termolisina disuelta sufre una transicion que reduce su solubilidad. La naturaleza precisa de la transicion no esta clara, pero se puede especular razonablemente que los residuos de aminoacidos de uno o mas dominios hidrofobos de la termolisina desempenan un papel en este proceso. Debido a la transicion, la solubilidad de la termolisina disminuye. Como resultado, una solucion clara recien preparada de la enzima se vuelve opaca y una porcion sustancial de la protema finalmente precipita. Un ejemplo de la falta de estabilidad se proporciona en el Ejemplo 6, Tablas 13 y 14, N° 1-3. Incluso a concentraciones reducidas del liofilizado y en presencia de aproximadamente 1,1 M de NaCl, la termolisina tiene una fuerte tendencia a precipitar tras ser puesta en solucion.

Los inventores han encontrado sorprendentemente que la transicion se puede suprimir y la termolisina se puede estabilizar en solucion. Con este fin, la termolisina, la termolisina en bruto o un liofilizado que contiene la termolisina y una o mas sales se ponen en contacto con un tampon acuoso con una baja concentracion de sal para formar una solucion que es estable solo durante un corto intervalo de tiempo. Posteriormente, se anade una sal adicional en forma solida y se disocia despues en la solucion. Despues de este paso la termolisina en solucion esta en una forma estabilizada, que se caracteriza por una tendencia significativamente reducida a precipitar.

De acuerdo con la invencion, antes de que el tampon acuoso con la baja concentracion de sal entre en contacto con la termolisina, termolisina en bruto o un liofilizado que contiene termolisina, la concentracion de sales disociadas, incluyendo la sal de tampon, en el tampon es preferiblemente inferior a 150 mM, preferiblemente en el intervalo de

0. 1 mM y 150 mM. Dependiendo de la preparacion de la termolisina, la concentracion de sal del tampon acuoso aumenta en la medida que la sal presente en la preparacion solido que contiene termolisina esta disociada en el tampon.

La sal en forma solida es preferiblemente una sal neutra con la excepcion de una sal de sulfato inorganica. Una sal solida preferida se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de las mismas.

El primer paso principal es la formacion de una solucion transparente que contiene termolisina. En el caso que la preparacion de termolisina no permita formar una solucion homogenea clara, es necesario un paso de aclaramiento adicional. Por ejemplo, la solucion se puede aclarar por medio de filtracion, centrifugacion u otros medios equivalentes.

Como segundo paso principal, la sal en forma solida tiene que anadirse a la solucion clara recien preparada de termolisina. A una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C la sal en forma solida se anade preferiblemente no mas de 30 min. despues de que se obtiene la solucion clara de termolisina. Son mas preferidos penodos mas cortos, tales como no mas de 15 min., 10 min., y 5 min.

Al utilizar en la solucion de termolisina una concentracion total en el intervalo de aproximadamente 1,5 M y 3,5 M de la sal disociada, la termolisina en solucion se estabiliza y la solucion sigue siendo una mezcla homogenea clara durante un maximo de 16 h o incluso mas.

Sorprendentemente, esta solucion se puede incluso diafiltrar con un tampon con una concentracion de sal inferior; en tal proceso la concentracion de la sal disociada que se anadio previamente se puede bajar (vease el Ejemplo 2). La diafiltracion a este respecto es un proceso de filtracion de flujo cruzado que permite la transferencia de especies de bajo peso molecular, agua y/o disolventes a traves de una membrana sin cambiar el volumen de la solucion. Este proceso se utiliza para purificar especies retenidas de peso molecular grande (es decir, termolisina sustancialmente intacta), mientras que las especies de bajo peso molecular, incluyendo fragmentos proteolfticos de termolisina, se eliminan. El procedimiento de diafiltracion permite al mismo tiempo el intercambio de tampon, permitiendo asf un cambio simple de las propiedades de una solucion dada antes del proceso de diafiltracion.

Incluso en estas condiciones (es decir, durante un proceso de diafiltracion) la termolisina se mantiene en una forma estabilizada, es decir la termolisina se mantiene de forma estable en solucion. El mismo efecto se observo para las soluciones de termolisina congelada de acuerdo con la invencion despues de la descongelacion.

Por lo tanto, la invencion proporciona en particular los medios; composiciones y condiciones para manipular soluciones homogeneas de termolisina durante una cantidad de tiempo prolongado en condiciones reproducibles. Esto es particularmente util cuando la termolisina se mezcla con otras enzimas o cuando las soluciones de termolisina se dispensan en forma de alfcuotas, por ejemplo, al utilizar dispositivos automatizados.

Ademas, en mas detalle, la presente descripcion comprende los siguientes elementos:

1. Un metodo para preparar una solucion de termolisina (EC 3.4.24.27) en el que la termolisina esta disuelta en una forma estabilizada, el metodo comprende el primer paso (P) de mezclar una preparacion solida que comprende la termolisina con un disolvente acuoso y proporcionando una primera solucion, en el que la primera solucion comprende

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(i) una sal de tampon capaz de mantener el pH en el intervalo de pH 4,5 y pH 9,

(ii) una o mas sales, y

(iii) la termolisina,

y en la primera solucion de la concentracion agregada de una o mas sales incluyendo la sal o sales de tampon esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y 500 mM, y en el que el metodo comprende ademas la etapa posterior (Q) de anadir a la primera solucion una cantidad medida de una sal adicional, por lo que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCh, CaCh, y una mezcla de las mismos, y la disolucion de la sal adicional, preparando de este modo una segunda solucion en la que la termolisina esta disuelta en una forma estabilizada.

2. El metodo de acuerdo con el punto 1, en el que la primera solucion obtenida en el paso (P) es una solucion homogenea.

3. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 y 2, en el que en el paso (P), el disolvente acuoso comprende agua y una sal de tampon.

4. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 y 2, en el que en el paso (P) la preparacion solida que comprende la termolisina comprende adicionalmente una o mas sales.

5. El metodo de acuerdo con el punto 4, en el que en el paso (P) el disolvente acuoso es agua.

6. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que en el paso (P) la preparacion solida

comprende la termolisina a una concentracion de aproximadamente 20% [p/p] o superior.

7. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que en el paso (P) la preparacion solida

comprende la termolisina a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 20% [p/p] y 100% [p/p], mas

preferentemente en el intervalo de aproximadamente el 20% [p/p] y alrededor del 80% [p/p], e incluso mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 20% [p/p] y alrededor del 60% [p/p].

8. El metodo de acuerdo con el punto 6 o el artfculo 7, en donde en el paso (P) la preparacion solida comprende la termolisina a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 20% [p/p] y alrededor del 50% [p/p], mas preferible en el intervalo de aproximadamente 20% [p/p] y alrededor del 40% [p/p], e incluso mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 20% [p/p] y alrededor del 30% [p/p].

9. El metodo de acuerdo con el punto 8, en el que en el paso (P) la preparacion solida comprende la termolisina a una concentracion de aproximadamente 20% [p/p].

10. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 9, en el que en el paso (P) la concentracion de la preparacion que comprende la termolisina en el disolvente acuoso esta en el intervalo de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml.

11. El metodo de acuerdo con el punto 10, en el que en el paso (P), la concentracion de la preparacion solida esta en el intervalo de aproximadamente 20 mg/ml y aproximadamente 60 mg/ml, y mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 25 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml, y aun mas preferible de aproximadamente 30 mg/ml.

12. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 11, en el que en el paso (P) una o mas sales de (ii) en la primera solucion comprende una sal seleccionada del grupo que consiste en NaCl, Na2SO4, y una combinacion de los mismos.

13. El metodo de acuerdo con el punto 4, en el que en el paso (P) una o mas sales en la preparacion solida que comprende la termolisina se seleccionan del grupo que consiste en NaCl, Na2SO4, y una combinacion de los mismos.

14. El metodo de acuerdo con el punto 13, en el que en el paso (P) la preparacion solida contiene NaCl en el intervalo de aproximadamente 50% [p/p] y alrededor de 70% [p/p], y/o Na2SO4 en el rango de aproximadamente el 0,5% [p/p] y alrededor de 7,5% [p/p], y mas preferiblemente la preparacion solida contiene NaCl en el intervalo de aproximadamente 60% [p/p] y alrededor del 65% [p/p], y/o Na2SO4 en el intervalo de aproximadamente 3% [p/p] y aproximadamente el 6% [p/p].

15. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 12 a 14, en el que en la etapa (P) la preparacion solida contiene termolisina en bruto.

16. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 15, en el que en la etapa (P) la concentracion de iones sulfato en la primera solucion esta en el intervalo de aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM, mas preferible, la concentracion de iones sulfato en la primera solucion es de aproximadamente 5 mM.

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17. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 16, en el que en la etapa posterior (Q) se anade la sal adicional en forma solida.

18. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 17, en el que la concentracion total de la sal adicional en la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 5 M.

19. El metodo de acuerdo con el punto 18, en el que la concentracion total de la sal adicional en la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el intervalo de aproximadamente 2 M y aproximadamente 3,5 M.

20. El metodo de acuerdo con el punto 19, en el que la concentracion total de la sal adicional en la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el intervalo de aproximadamente 2 M y aproximadamente 2,5 M.

21. El metodo de acuerdo con el punto 19, en el que la concentracion total de la sal adicional en la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) es de aproximadamente 2,3 M.

22. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 17 a 21, en el que la concentracion de iones sulfato en la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) es menor de aproximadamente 10 mM.

23. El metodo de acuerdo con el punto 22, en el que la concentracion de iones sulfato en la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM, mas preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1 mm y aproximadamente 5 mM.

24. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 23, en el que en la primera solucion obtenida en la etapa (P), la concentracion total de las una o mas sales incluyendo la sal o sales de tampon esta en el intervalo de aproximadamente 100 mM y 500 mM, mas preferentemente en el intervalo de aproximadamente 300 mM y 400 mM.

25. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 24, en el que en la etapa (P), el disolvente acuoso comprende iones Ca2+.

26. El metodo de acuerdo con el punto 25, en el que en el disolvente acuoso, la concentracion de iones de Ca2+ se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 10 mM, incluso mas preferido en el intervalo de aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM.

27. El metodo de acuerdo con el punto 26, en el que en el disolvente acuoso, la concentracion de iones de Ca2+ es de aproximadamente 5 mM.

28. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 27, en el que en el paso (P) el disolvente acuoso comprende una sal tampon a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 100 mM, y mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 mM.

29. El metodo de acuerdo con el punto 28, en el que en el disolvente acuoso de la concentracion de la sal de tampon esta en el intervalo de aproximadamente 5 mM y aproximadamente 50 mM.

30. El metodo de acuerdo con el punto 29, en el que en el disolvente acuoso de la concentracion de la sal de tampon esta en el intervalo de aproximadamente 15 mM y aproximadamente 25 mM.

31. El metodo de acuerdo con el punto 30, en el que en el disolvente acuoso de la concentracion de la sal de tampon es de aproximadamente 20 mM.

32. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 28 a 31, en el que la sal de tampon se selecciona del grupo que consiste de BES (N,N-Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico), Tris (tris(hidroximetil)aminometano), BisTris (bis (2-hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano), BisTris propano (1,3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano), HEPES (acido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-2-etanosulfonico), MES (acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico), MOPS (acido 3- (N-morfolino)propanosulfonico), MOPSO (acido 3-morfolino-2-hidroxipropanosulfonico), PIPES (acido piperazina-1,4- bis (2-etanosulfonico)), TAPS (acido N-Tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfonico), TES (acido N- Tris(hidroximetil) metil-2-aminoetanosulfonico), TEA (trietanolamina), y Tricina (N-(2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil) glicina).

33. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 32, en el que en la etapa (P) el pH de la primera solucion esta en el intervalo de aproximadamente pH 5,5 y aproximadamente pH 8,5.

34. El metodo de acuerdo con el punto 33, en el que el pH es de aproximadamente pH 7,5.

35. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 34, en el que en la segunda solucion obtenida despues

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de la etapa (Q) la concentracion de termolisina sustancialmente intacta es de aproximadamente 5 mg/ml o superior, y en el que la termolisina en solucion esta en forma estabilizada.

36. El metodo de acuerdo con el punto 35, en el que en la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) la concentracion de termolisina sustancialmente intacta es de aproximadamente 5 mg/ml o mayor, y menor que aproximadamente 35 mg/ml.

37. El metodo de acuerdo con el punto 35, en el que la sal adicional se selecciona del grupo que consiste de KCl, LiCl, NaCl, NaBr, NaJ, NaNO3, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos.

38. El metodo de acuerdo con el punto 37, en el que la concentracion de termolisina en una forma estabilizada es de aproximadamente 10 mg/ml o mayor, y menor que aproximadamente 35 mg/ml.

39. El metodo de acuerdo con el punto 38, en el que la concentracion de termolisina en una forma estabilizada es de aproximadamente 20 mg/ml.

40. Una composicion lfquida que comprende agua, termolisina en una forma disociada, un tampon de disociacion de sal capaz de mantener un pH en el intervalo de pH 4,5 y pH 9, y una sal disociada seleccionada del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos, en el que la composicion contiene termolisina a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente l0 mg/ml.

41. Una composicion lfquida que comprende agua, termolisina en una forma disociada, un tampon de disociacion de sal capaz de mantener un pH en el intervalo de pH 4,5 y pH 9, y una sal disociada se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ , LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos, en el que la composicion es una solucion homogenea durante cinco horas o mas, y la composicion contiene termolisina a una concentracion en el rango de aproximadamente 10 mg/ml y aproximadamente 23 mg/ml.

42. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 40 o 41, obteniendo la composicion lfquida mediante un metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 39.

43. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 40 a 42, en el que la termolisina disociada esta en una forma estabilizada.

44. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 40 a 43, en el que a una temperatura en el rango de aproximadamente 2 °C y aproximadamente de 8 °C y al menos cinco horas despues de la formacion de la composicion, la turbidez de la composicion es igual aproximadamente a la turbidez de una solucion de referencia, por lo que dicha solucion de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados a las mismas concentraciones respectivas que en la composicion de acuerdo con cualquiera de los puntos 41 y 42, y en el que la solucion de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma.

45. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 40 a 44, se obtiene mediante un metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 39 y se incuba a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C, dicha composicion es una solucion homogenea en un intervalo de incubacion de 0-5 horas, aun mas preferible en un intervalo de incubacion de mas de 5 horas.

46. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 44 y 45, en el que la termolisina disociada esta sustancialmente intacta.

47. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 44 a 46, en el que a una temperatura en el rango de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C durante al menos cinco horas despues de la formacion de la composicion, la turbidez de la composicion es igual aproximadamente a la turbidez de una solucion de referencia, por lo que dicha solucion de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados a las mismas concentraciones respectivas que en la composicion de acuerdo con cualquiera de los puntos 44 a 46, y en el que la solucion de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma.

48. Una composicion lfquida que comprende agua, termolisina en una forma disociada, una sal de tampon disociada capaz de mantener un pH en el intervalo de pH 4,5 y pH 9, y NaCl disociado a una concentracion por debajo de 500 mM, y en el que la composicion contiene termolisina en una concentracion en el rango de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml.

49. La composicion lfquida de acuerdo con el punto 48, en el que el pH de la composicion esta en el intervalo de pH 7 y pH 8, incluso mas preferido en alrededor de pH 7,5.

50. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 48 y 49, en el que la composicion comprende iones de Ca2+, mas preferible los iones de Ca2+ a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 10 mM, y aun mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 mM y aproximadamente

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51. La composicion Kquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 48 a 50, en el que en la composicion la concentracion agregada de las sales disociadas incluyendo la sal o sales de tampon esta en el rango de aproximadamente 400 mM y aproximadamente 200 mM, y mas preferiblemente la concentracion agregada de las sales disociadas incluyendo la sal o sales de tampon es de aproximadamente 200 mM.

52. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 48 a 51, en el que en la composicion la concentracion de iones de sodio disociados esta en el rango de 100 mM y 250 mM, mas preferible, la concentracion de iones de sodio disociados esta en el rango de 150 mM y 200 mM, y aun mas preferible la concentracion de iones de sodio disociados es de aproximadamente 170 mM.

53. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 48 a 52, en el que la conductividad de la composicion es de aproximadamente 20 mS/cm.

54. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 48 a 53, en el que en la composicion de la concentracion de termolisina sustancialmente intacta esta en el intervalo de 0,1 mg/ml y 10 mg/ml, mas preferiblemente en el intervalo de 1 mg/ml y 7,5 mg/ml, e incluso mas preferido entre 1 mg/ml y 5 mg/ml, incluso mas preferido 2,5 mg/ml o 5 mg/ml.

55. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 48 a 54, la composicion de lfquido se puede obtener por el metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 39, seguido de una posterior etapa de diafiltracion de la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) contra un tampon de diafiltracion que contiene una sal de tampon disociada capaz de mantener un pH en el intervalo de pH 4,5 y pH 9, y NaCl disociado a una concentracion inferior a 500 mM.

56. La composicion lfquida de acuerdo el punto 55, en el que el tampon de diafiltracion comprende iones de Ca2 + a una concentracion en el intervalo de aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 10 mM.

57. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 55 y 56, en el que en el tampon de diafiltracion la concentracion total de sales disociadas incluyendo la sal o sales de tampon esta en el intervalo de aproximadamente 400 mM y aproximadamente 200 mM, y mas preferible la concentracion agregada de las sales disociadas incluyendo la sal o sales de tampon es de aproximadamente 200 mM.

58. El uso de una composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de los puntos 40 a 57 para el almacenamiento, el transporte, o dispensacion de termolisina, con lo que la termolisina esta en forma disociada.

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar a la comprension de la presente invencion, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos indicados sin apartarse del espmtu de la invencion.

Descripcion de las Figuras

Figura 1 Resultados de una exploracion de longitud de onda como se describe en el Ejemplo 8. La ordenada indica la intenstidad de luz en unidades arbitrarias (UA) medida por el detector a 800 nm. El eje de abscisas indica la longitud de onda de la luz incidente. (A) muestra lfquida que contiene el tampon acuoso; (B) muestra lfquida que contiene el coloide de termolisina en el tampon acuoso.

Figura 2 Resultado ejemplar de un analisis cromatografico de una solucion que contiene Thermoase liofilizada obtenida de la primera etapa descrita en el Ejemplo 2, es decir, sin/antes de un paso adicional de diafiltracion. La Thermoase liofilizada se disolvio en un tampon acuoso que contema NaCl 2,3 M, CaCl2 5 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5; el contenido de protema de la solucion fue de 8,2 mg/ml determinado fotometricamente a 280 nm. La Figura muestra un cromatograma HPLC de una muestra de 50 |il de la solucion homogenea. Cinco areas de picos indicadas de (i) a (v) estan marcados. Las condiciones y parametros de HPLC se describen en el Ejemplo 2. Ordenadas: mUA; abscisas: tiempo de retencion en [min].

Figura 3 Resultado ejemplar de un analisis cromatografico de una solucion que contiene Thermoase liofilizada obtenida de la segunda etapa descrita en el Ejemplo 2, es decir, sin/antes de un paso adicional de diafiltracion. Despues de la diafiltracion, Thermoase era en un tampon acuoso que contema NaCl 170 mM, CaCl2 5 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5; el contenido de protema de la solucion despues de la diafiltracion fue de 4,9 mg/ml determinado fotometricamente a 280 nm. La Figura muestra un cromatograma HPLC de una muestra de 50 |il de la solucion homogenea. Tres areas de picos indicadas de (vi) a (viii) estan marcados. Las condiciones y parametros de HPLC se describen en el Ejemplo 2. Ordenadas: mUA; abscisas: tiempo de retencion en [min].

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Ejemplo 1

Preparacion de mezclas de un tampon acuoso y termolisina partir de una preparacion de Thermoase

De acuerdo a la informacion proporcionada por el fabricante, aproximadamente el 60-65% [p/p] del liofilizado fue NaCl. Ademas, el liofilizado contema aproximadamente 5% [p/p] Na2SO4 (decahidrato). Una cantidad en el intervalo de aproximadamente 30% [p/p] y aproximadamente de 35% [p/p] de Thermoase liofilizada que se utiliza aqu y tambien en los Ejemplos mas adelante, consiste de termolisina en bruto (vease tambien el Ejemplo 2). Todos los pasos de trabajo descritos a continuacion se llevaron a cabo a una temperatura en el rango de 2 °Cy 8 °C, si no se indica lo contrario.

Se preparo un volumen de 8 l de tampon acuoso (A) que contiene NaCl 2 M, CaCl2 5 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5. Una cantidad de 200 g de liofilizado de Thermoase seco se mezclo con el tampon acuoso y la mezcla se agito de forma continuada. Sin embargo, no se obtuvo una mezcla homogenea, la mezcla permanecio turbia y nunca llego a ser del todo clara. Cerca de 60 min despues de la adicion del liofilizado, la mezcla se volvio cada vez mas opaco y la termolisina comenzo a precipitar.

Sorprendentemente, la formacion de una mezcla no homogenea como la obtenida con tampon (A) podna evitarse disolviendo primero la preparacion Thermoase en un tampon con fuerza ionica baja y anadiendo despues la sal sola. Por lo tanto, en un primer paso se preparo un volumen de 6,51 del tampon acuoso (B) que contiene CaCl2 5 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5. Una cantidad de 200 g de liofilizado Thermoase seco se disolvio en tampon (B) y se obtuvo una solucion clara. Posteriormente, en una segunda etapa, se anadio 935 g NaCl solido y se disolvio en la solucion. Como tercera etapa, el volumen de la solucion se ajusto a 8 mediante la adicion de un volumen adicional de tampon acuoso (B) y se mezclo por agitacion. Se obtuvo una solucion homogenea.

Teniendo en cuenta que alrededor del 60-65% [p/p] del liofilizado consiste en NaCl, la concentracion final de NaCl en la solucion era aproximadamente 2,3 M. La concentracion final de termolisina en bruto en solucion estaba en el intervalo de aproximadamente 7,5 mg/ml y 8,8 mg/ml que corresponde a una concentracion de termolisina sustancialmente no degradada de aproximadamente 5,7 mg/ml (en el rango de aproximadamente 5,2 mg/ml y 6,1 mg/ml).

Tabla 5

Concentraciones de ingredientes de Thermoase calculadas en el proceso de solubilizacion; primer paso: liofilizado de Thermoase disuelto en un volumen de 6,51, antes de la adicion de NaCl solido

Ingrediente: Concentracion

CaCl2: 5 mM,

HEPES pH 7,5: 20 mM

NaCl: ~329 mM

Na2SO4: ~ 5 mM

Sales y sales de tampon: ~359 mM

Termolisina en bruto: ~ 10 mg/ml

Termolisina intacta: ~ 7 mg/ml

Tabla 6

Concentraciones calculadas de sales, incluyendo sales de tampon en el proceso de solubilizacion; segundo paso: 6,5 1 de volumen, despues de la adicion de NaCl solido

Ingrediente: Concentracion

CaCl2: ~ 5 mM

HEPES, pH 7,5: ~ 20 mM

NaCl: ~2790 mM

Na2SO4: ~ 5 mM

Sales y sales de tampon: ~2820 mM

Tabla 7

Concentraciones finales de Thermoase calculadas e ingredientes de sales en el proceso de solubilizacion; tercer paso: volumen ajustado a 81

Ingrediente: Concentracion

CaCl2: 5 mM

HEPES, pH 7,5: 20 mM

NaCl: ~2267 mM

Na2SO4: ~4 mM

Sales y sales de tampon: ~2296 mM

5

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30

35

40

45

Termolisina en bruto: ~8,1 mg/ml

Termolisina intacta: ~5,7 mg/ml

Ejemplo 2

Estabilidad de las soluciones de termolisina con una concentracion reducida de NaCI

En primer lugar, una solucion de Thermoase liofilizado se preparo usando tampon (B) y el procedimiento de tres pasos como se describe en el Ejemplo 1. En una etapa posterior, la solucion se somete a diafiltracion, en el que el tampon de la composicion lfquida se cambio a hEpES 20 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 170 mM, pH 7,5. Sorprendentemente, la termolisina permanecio estabilizada, es decir, la solucion diafiltrada se mantuvo homogenea durante 5 horas e incluso mas de 5 horas.

Se realizo el analisis por HPLC de la solucion del liofilizado de Thermoase antes y despues de la diafiltracion usando HPLC con una columna GL SUPERDEX ™ 75pg de 10 mm/300 mm (GE Bioscience) como fase estacionaria. La fase movil fue un tampon acuoso que contiene NaCl 200 mM, CaCl2 1 mM, HEPES 50 mM, pH 7,5. Los volumenes de muestra fueron de 50 |il cada una. El caudal fue de 0,5 ml/min, cada ejecucion de HPLC se realizo durante 80 min. La unidad de deteccion era un detector de absorbancia UV-Vis operado a 280 nm.

En cada muestra el pico principal se eluyo con un tiempo de retencion medio de aproximadamente 27 min 34 seg (ver los picos en el area (I) mostrada en la Figura 2 y en el area (vi) mostrado en la Figura 3).

Las muestras analizadas despues del primer paso (sin diafiltracion) tfpicamente mostraron picos que podnan ser agrupados en cinco areas diferentes, como se muestra en la Figura 2. El area bajo el pico principal (denotado (i)) refleja sustancialmente termolisina no degradada (= intacta). El hombro del pico correspondiente a la elucion despues de un tiempo de retencion de aproximadamente 20 min 15 seg se asumio que reflejaba dfmeros de termolisina. Los picos bajo las areas denotadas (ii), (iii) y (iv) correspondfan principalmente a productos de degradacion de la termolisina. Los picos bajo el area denotada (v) reflejan principalmente fragmentos de termolisina mas fuertemente degradada (en distintos grados), asf como impurezas.

Las muestras se analizaron despues de la segunda etapa, es decir, despues de la diafiltracion se mostraron resultados como se muestra a modo de ejemplo en la figura 3. En particular, la cantidad relativa de fragmentos de degradacion e impurezas correspondientes a las areas de los picos denotados (vii) y (viii) se redujeron en preparaciones diafiltradas. Ademas, el pico principal en el area designada (vi) por lo general era mucho mas claro cuando se compara con su homologo en la figura 2. Por lo tanto, el cromatograma despues de la diafiltracion indico una separacion sustancial y purificacion de termolisina no degradada.

Tabla 8

Caracterizacion de los picos y la cuantificacion de las areas de los picos de la figura 2

Area de pico n°: Tiempo de retencion [mini Altura [mUA] Area [mUA * min] Area de pico relativa [%]

(i): 27,56 42,381 88,655 72,19

(ii): 31.33 0,679 2,658 2,16

(iii): 33,59 2,810 11,595 9,44

(iv): 38,60 3,074 7,692 6,26

(v): 41,27 2,479 12,201 9,94

: I 51,423 122,801 100,00

Tabla 9

Caracterizacion de los picos y la cuantificacion de las areas de los picos de la figura 3

(vi): 27,57 33,257 71,322 95,01

(vii): 31,61 0,460 2,906 3,87

(viii): 50,39 0,418 0,837 1,11

: I 34,135 75,065 100,00

Para analisis adicionales, se prepararon dos soluciones madre diferentes de termolisina (i) 5 mg/ml y (ii) 2,5 mg/ml, por lo tanto en ambas concentraciones, el tampon acuoso se ajusto a HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 170 mM, pH 7,5 a modo de diafiltracion; la conductividad del tampon con la termolisina disuelta fue de aproximadamente 20 mS/cm. Ambas soluciones se esterilizaron por filtracion esteril y se dispensaronn en alfcuotas.

Desde el punto de tiempo cuando el liofilizado se disolvio en el primer tampon acuoso hasta que se obtuvieron las

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50

aftcuotas de las dos soluciones madre, la termolisina permanecio disociada en solucion durante aproximadamente 6 h. Ambas soluciones madre permanecieron transparentes durante todo el proceso.

Ademas, una cantidad de 5 mg de Thermoase liofilizado se disolvio en 1 ml de un tampon acuoso que contema CaCl2 1 mM y HEPES 5 mM, pH 7,5. Una aftcuota de 50 |il de la solucion se analizo por HPLC bajo las condiciones estandar (ver mas arriba) utilizando una columna de Superdex® 75 10/300, una velocidad de bomba de 0,5 ml/min y deteccion de UV/Vis a 280 nm. La fase movil fue CaCl2 1 mM, NaCl 200 mM, HEPES 50 mM, pH 7,5 en agua. El pico de termolisina se cuantifico en relacion con los otros picos obtenidos. El uso de este enfoque de la cantidad relativa de termolisina sustancialmente intacta se determino en varios lotes de Thermoase. Cuatro determinaciones independientes indicaron que en promedio el 70% de la fraccion de protema de Thermoase era termolisina intacta. Los valores individuales encontrados fueron 59%, 72%, 71% y 76%.

Una cantidad ejemplar de 100 g de Thermoase liofilizada contema aproximadamente 33 g de termolisina en bruto, alrededor de 65 g de NaCl, y alrededor de 2 g de Na2SO4. Se observo variacion del contenido de protema en las preparaciones de Thermoase en el intervalo de 30 g y 35 g por cada 100 g de liofilizado. Tfpicamente, la fraccion de termolisina sustancialmente no degradado y enzimaticamente activa con un peso molecular de aproximadamente 34.600 Da (tambien referido como "termolisina") fue aproximadamente del 23% en el liofilizado seco. La cantidad restante de aproximadamente el 10% de protema en el liofilizado seco consistio principalmente de productos de degradacion de la termolisina de los cuales aproximadamente el 80% mantema la actividad proteolftica. El resto comprendfa fragmentos de termolisina mas fuertemente degradada y otras impurezas. Por lo tanto, la "termolisina en bruto" en el sentido de la invencion se entiende como una mezcla de protemas que consiste en (a) aproximadamente 70% de termolisina sustancialmente no degradada, (b) aproximadamente 24% de productos de degradacion de termolisina que retienen la actividad proteolftica (en diferentes grados) y (c) aproximadamente el 6% de los fragmentos proteolfticamente inactivos y otras impurezas.

Ejemplo 3

Estabilidad de las soluciones madre de termolisina con una concentracion reducida de NaCl a diferentes temperaturas

Las aftcuotas de las dos soluciones madre de termolisina con las concentraciones de (i) 5 mg/ml y (ii) 2,5 mg/ml obtenidas de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 2 (es decir, incluyendo diafiltracion) se incubaron a diferentes temperaturas. En intervalos de 30 min. se evaluo la turbidez mediante inspeccion visual y mediciones tal como se describe en el Ejemplo 9. Se registro el tiempo de exposicion a la correspondiente temperatura antes de que una solucion se volviera turbia. Los resultados se resumen en la Tabla 10.

Hasta el momento, todos los pasos de trabajo se realizaron a 8 °Co inferior, es decir a temperaturas en el intervalo entre 2 °C y 8 °C. Ambas soluciones madre permanecieron transparentes durante todo el proceso.

Tabla 10

Concentraciones de termolisina, temperaturas y tiempo durante el cual la solucion de termolisina se mantuvo clara

Temp.: Concentracion de termolisina en HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 170 mM, pH 7,5

2,5 mg/ml | 5 mg/ ml

Tiempo de permanencia de la solucion homogenea (clara)

0 °C: 21 h 8 h

2 °C: 21 h 8 h

4 °C: 21 h 8 h

6 °C: 21 h 8 h

8 °C: 21 h 8 h

10 °C: 21 h 4 h

Ejemplo 4

Estabilidad de las soluciones con una concentracion de termolisina de 2,5 mg/ml despues de la congelacion y descongelacion

Despues de una incubacion durante 21 horas a 4, 6, 8, y 10 °C, las aftcuotas que contienen 2,5 mg/ml (vease el Ejemplo 3) se congelaron a -20 °C y se almacenaron a esa temperatura durante 6 dfas. Despues de descongelar las aftcuotas se incubaron a 8 °C. Se registro el tiempo de exposicion a la temperatura antes de que la solucion se volviera turbia. Los resultados se resumen en la Tabla 11.

5

10

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20

25

Tabla 11

Temperaturas de incubacion antes de la congelacion y tiempo despues de la descongelacion, durante el cual la solucion de termolisina permanecio clara

Temp. antes de la congelacion: Tiempo de permanencia de la solucion homogenea (claro) despues de la descongelacion

4 °C: 7 h

6 °C: 6 h

8 °C: 4 h

10 °C: 1 h

Ejemplo 5

Estabilidad de soluciones con diferentes concentraciones de termolisina despues de la congelacion y descongelacion

Las soluciones madre con soluciones de termolisina en el intervalo de 1 mg/ml y 5 mg/ml se prepararon de manera similar como se describe en el Ejemplo 2. Las alfcuotas de las soluciones madre se congelaron a -20 °C y se almacenaron a esa temperatura durante 7 dfas . Despues de descongelar, las alfcuotas se incubaron a 8 °C. Se registro el tiempo de exposicion a la temperatura antes de que la solucion se volviera turbia. Los resultados se resumen en la Tabla 12.

Tabla 12

Concentraciones de termolisina y tiempo despues de la descongelacion en el que la solucion de termolisina

____________________________________permanece clara____________________________________

_________Concentracion de termolisina en HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 170 mM, pH ^ 7,5_________

___________________Tiempo de permanencia de la solucion homogenea (clara)___________________

27 h | 27 h | 27 h | 27 h | 7 h | 3,5 h~

Ejemplo 6

Estabilidad de las soluciones que contienen termolisina en presencia de diferentes sales

El liofilizado de Thermoase se disolvio en concentraciones de 100, 50, y 25 mg/ml en HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM pH 7,5. Directamente despues, se anadio una sal seleccionada del grupo que consiste en Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, y NaJ y se disolvio. Como control, no se anadio ninguna sal. La Tabla 13 indica las concentraciones de los iones correspondientes en las soluciones, teniendo en cuenta las cantidades presentes en el liofilizado. Hay que tener en cuenta que los iones presentes en el tampon HEPES no se contabilizan en la tabla.

Tabla 13

Soluciones de termolisina con diferentes sales anadidas

N°: Sal anadida conc. de liofilizado en [mg/ml] termolisina en bruto en [mg/ml] termolisina en [mg/ml] Na+ ~ [M] cr ~ [M] SO42- ~ [M] CH3CO O-, Cl-, Br-, NO3-, J- [M]

1: - 100 ~ 33 ~ 23 1,125 1,122 0,006 0

2: 50 ~16,5 ~11,5 0,562 0,566 0,003 0

3: 25 ~8,3 ~5,8 0,281 0,288 0,002 0

4: Na2SO4 100 ~ 33 ~ 23 5,125 1,122 2,006 0

5: 50 ~16,5 ~11,5 4,562 0,566 2,003 0

6: 25 ~8,3 ~5,8 4,281 0,288 2,002 0

7: NaCH3COO 100 ~ 33 ~ 23 3,125 1,122 0,006 2,0

8: 50 ~16,5 ~11,5 2,562 0,566 0,003 2,0

9: 25 ~8,3 ~5,8 2,281 0,288 0,002 2,0

10: NaCl 100 ~ 33 ~ 23 3,125 3,122 0,006 2,0

11: 50 ~16,5 ~11,5 2,562 2,566 0,003 2,0

12: 25 ~8,3 ~5,8 2,281 2,288 0,002 2,0

13: NaBr 100 ~ 33 ~ 23 3,125 1,122 0,006 2,0

14: 50 ~16,5 ~11,5 2,562 0,566 0,003 2,0

15: 25 ~8,3 ~5,8 2,281 0,288 0,002 2,0

16: NaNO3 100 ~ 33 ~ 23 3,125 1,122 0,006 2,0

5

10

15

20

25

17: 50 ~16,5 ~11,5 2,562 0,566 0,003 2,0

18: 25 ~8,3 ~5,8 2,281 0,288 0,002 2,0

N°: Sal anadida conc. de liofilizado en [mg/ml] termolisina en bruto en [mg/ml] termolisina en [mg/ml] Na+ ~ [M] cr ~ [M] SO42" ~ [M] CH3CO O', Cl", Br-, NO3-, J- [M]

19: NaJ 100 ~ 33 ~ 23 3,125 1,122 0,006 2,0

20: 50 ~16,5 ~11,5 2,562 0,566 0,003 2,0

21: 25 ~8,3 ~5,8 2,281 0,288 0,002 2,0

La Tabla 14 indica, con respecto de las mezclas dadas en la Tabla 13, si y por cuanto tiempo se obtuvo una solucion homogenea estable (es decir clara). La turbidez se evaluo mediante inspeccion visual y mediciones como se describe en el Ejemplo 9. Los sfmbolos presentados en la tabla indican lo siguiente:

Valoracion mediante inspeccion visual {# # #} opaco {o 0} nublado {o} ligeramente nublado

{ } claro

UA 90 ° medicion de dispersion lateral 901 -> 1000 (desbordamiento)

401 - 900 131 -400 0-130

Tabla 14

Estabilidad de las soluciones de termolisina en presencia de diferentes sales anadidas

N°: sal anadida [0,1 h] [1 h] [5 h] [10 h] [15 h] [20 h]

1: {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

2: {###}> 1000 {# ##}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

3: {###}> 1000 {###}> 1000 {# ##}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

4: Na2SO4 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 { ###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

5: {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 { ###}> 1000 {###}> 1000

6: {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

7: NaCHsCOO {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

8: {0} 150 {0} 329 {00} 680 {###} 958 {###}> 1000 {###}> 1000

9: {} 82 {} 85 {} 113 {0} 268 {00} 479 {00} 520

10: NaCl {###} 912 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

11: {} 110 {} 120 {} 126 {0} 189 {0} 302 {00}/507

12: {} 85 {} 87 {} 81 {} 92 {} 102 {} 83

13: NaBr {} 110 {} 116 {} 114 {} 95 {} 104 {} 112

14: {} 95 {} 110 {} 125 {} 85 {} 93 {} 85

15: {} 88 {} 100 {} 79 {} 87 {} 106 {} 102

16: NaNOa {} 75 {} 85 {} 103 {} 102 {} 88 {} 86

17: {} 68 {} 65 {} 73 {} 69 {} 100 {} 79

18: {} 88 {} 59 {} 100 {} 67 {} 95 {} 86

19: NaJ {} 78 {} 93 {} 112 {} 85 {} 96 {} 79

20: {} 112 {} 105 {} 126 {} 102 {} 98 {} 115

21: {} 109 ______096_____ ______1LZ5_____ _____0112_____ ______087_____ ______f!83______

Los resultados se tabulan como {evaluacion visual } y "valor numerico" (UA, 90 ° medicion de dispersion lateral)

Ejemplo 7

Estabilidad de soluciones que contienen termolisina en presencia de diferentes sales

El liofilizado de Thermoase se disolvio en concentraciones de 100, 50, y 25 mg/ml en HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM pH 7,5. Directamente despues, se anadio una sal seleccionada del grupo que consiste en KCl, NaCl, LiCl, MgCh, CaCl2 y y se disolvio. Como control, no se anadio ninguna sal. La Tabla 15 indica las concentraciones de los iones correspondientes en las soluciones, teniendo en cuenta las cantidades presentes en el liofilizado. Hay que tener en cuenta que los iones presentes en el tampon HEPES no se contabilizan en la tabla.

Tabla 15

Soluciones de termolisina con diferentes sales anadidas

22: - 100 33 23 1,125 1,122 0,006 0

5

10

15

20

25

23: 50 16,5 11,5 0,562 0,566 0,003 0

24: 25 8,3 5,8 0,281 0,288 0,002 0

25: KCl 100 33 23 1,125 3,122 0,006 2,0

26: 50 16,5 11,5 0,562 2,566 0,003 2,0

27: 25 8,3 5,8 0,281 2,288 0,002 2,0

28: NaCl 100 33 23 3,125 3,122 0,006 2,0

29: 50 16,5 11,5 2,562 2,566 0,003 2,0

30: 25 8,3 5,8 2,281 2,288 0,002 2,0

31: LiCl 100 33 23 1,125 3,122 0,006 2,0

32: 50 16,5 11,5 0,562 2,566 0,003 2,0

33: 25 8,3 5,8 0,281 2,288 0,002 2,0

34: MgCl2 100 33 23 1,125 5,122 0,006 2,0

35: 50 16,5 11,5 0,562 4,566 0,003 2,0

36: 25 8,3 5,8 0,281 4,288 0,002 2,0

37: CaCl2 100 33 23 1,125 5,122 0,006 2,0

38: 50 16,5 11,5 0,562 4,566 0,003 2,0

39: 25 8,3 5,8 0,281 4,288 0,002 2,0

La Tabla 16 indica, respecto a las mezclas proporcionadas en la Tabla 15, si y durante cuanto tiempo se obtiene una solucion de termolisina homogenea estable (es decir, clara, no turbia). La turbidez se evaluo mediante inspeccion visual y mediciones como se describe en el Ejemplo 9. Los sfmbolos presentados en la tabla indican lo siguiente:

{# # #}: Valoracion mediante inspeccion visual opaco UA 90 ° medicion de dispersion 901 -> 1000 (desbordamiento)

{0 0}: nublado 401 - 900

{o}: ligeramente nublado 131 -400

{}: claro 0-130

Tabla 16

lateral

N°: sal anadida [0,1 h] [1 h] [5 h] [10 h] [15 h] [20 h]

22: - {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

23: {###}> 1000 {# ##}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

24: {###}> 1000 {###}> 1000 {# ##}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

25: KCl {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 { ###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

26: {0} 250 {0} 394 {00} 599 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

27: {} 82 {} 95 {}119 {0} 269 {00} 708 {###} 988

28: NaCl {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000 {###}> 1000

29: {} 85 {} 115 {} 129 {0} 189 {0} 350 {00} 487

30: {} 98 {} 102 {} 115 {} 78 {} 95 {} 105

31: LiCl {} 78 {} 85 {} 76 {} 115 {} 104 {} 126

32: {} 69 {} 78 {} 103 {} 78 {} 75 {} 86

33: {} 88 {} 96 {} 84 {} 109 {} 83 {} 87

34: MgCl2 {} 102 {} 85 {} 78 {} 96 {} 109 {} 76

35: {} 96 {} 86 {} 87 {} 79 {} 115 {} 78

36: {} 84 {} 76 {} 95 {} 88 {} 94 {} 117

37: CaCl2 {} 102 {} 115 {} 123 {} 100 {} 99 {} 114

38: {}85 {} 78 {} 95 {} 86 {} 112 {} 79

39: ______OZ8_____ ______079_____ ______072_____ ______005_____ {} 110 _____095_____

Los resultados se tabulan como {evaluacion visual} y "valor numerico" (UA, 90 ° medicion de dispersion lateral) Ejemplo 8

Determinacion de la turbidez

Para la presente invencion, se realizaron observaciones de turbidez basadas en instrumentos con un instrumento CARY ECLIPSE (Varian, Inc. Palo Alto, CA, EE.UU.).

Se proporcionaron dos muestras lfquidas, siendo la primera un tampon acuoso homogeneo con CaCl2 5 mM, NaCl 170 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5 como ingredientes disueltos; la segunda muestra fue un coloide que consiste en el mismo tampon y, ademas, aproximadamente 5 mg/ml de termolisina (ver tambien los Ejemplos 2 y 3). Antes de que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

se tomaran las mediciones, el coloide se dejo formar toda la noche a 10 °C. Los valores de los parametros del instrumento fueron los siguientes:

Instrumento:

Numero de serie del instrumento Modo de datos:

Modo de exploracion Modo X Inicio (nm)

Parada (nm)

Ex. longitud de onda (nm)

Ex. Hendidura (nm)

Em. Hendidura (nm)

Tasa de lectura (nm/min) Intervalo de datos (nm)

Tiempo promedio (s)

Filtro de excitacion Filtro de emisiones Voltaje PMT (V)

Espectro corregido Suspensor multicelda Multi cero

Cary Eclipse EL06033429 fluorescencia emision

longitud de onda (nm) 200 1000 800 5 5

600

1

0,1

automatico

abierto

Medio

Apagado

Multicelda

Apagado

Las muestras lfquidas se analizaron en cubetas de cuarzo estandar. Ambas muestras se caracterizaron por medio de un escaner de longitud de onda, por lo que la longitud de onda de la luz entrante se aumento de 200 nm a 1000 nm. La longitud de onda de deteccion se mantuvo constante a 800 nm. No se detecto fluorescencia ni opalescencia. La luz dispersada se detecto a la longitud de onda de la luz incidente. Los resultados se representan en la Figura 1 (A) y (B). Para la muestra de tampon clara la intensidad medida de la luz dispersada fue de alrededor de 100 unidades arbitrarias (UA). Para el coloide de la segunda muestra la luz dispersada creo un desbordamiento en el detector.

Ejemplo 9

Mediciones visuales de inspeccion y de turbidez

Para la demostracion de los efectos de la presente invencion, se realizaron observaciones de turbidez basadas en instrumentos con un instrumento CARY ECLIPSE (Varian, Inc. Palo Alto, CA, EE.UU.). La longitud de onda de la luz incidente fue de 800 nm; la dispersion lateral a 90 ° se midio en la misma longitud de onda (es decir, 800 nm). Los ajustes de los parametros del instrumento fueron los siguientes:

Instrumento:

Numero de serie del instrumento Modo de datos:

Em. longitud de onda (nm)

Ex. longitud de onda (nm)

Ex. Hendidura (nm)

Em. Hendidura (nm)

Tiempo promedio (s)

Filtro de excitacion Filtro de emisiones Voltaje PMT (V)

Suspensor multicelda Multi cero Replicas

Promedio de muestras

Las muestras lfquidas se analizai

Cary Eclipse EL06033429 fluorescencia 800 800 5 5

0,1

automatico

abierto

Medio

Multicelda

Apagado

1

Apagado

t en cubetas de cuarzo estandar.

La inspeccion visual de muestras de lfquido que contienen termolisina en tubos de ensayo se llevo a cabo mediante la agrupacion de las muestras en cuatro categonas: (i) "claro", (ii) "parcialmente nublado", (iii) “nublado”, (iv) "opaco". Por lo tanto, las categonas (ii) a (iv) reflejan el aumento del grado de turbidez. Las categonas se correlacionaron con la lectura de unidades arbitrarias (UA) como se indica en la Tabla 17.

5

10

15

20

25

30

Tabla 17

Turbidez de muestras lfquidas, categonas

Categona: Ejemplos de valores medidos Rango de valores para la categona

claro: 114; 85; 95 0-130

ligeramente nublado: 182; 188; 236; 248; 304; 297 131-400

nublado: 760; 783; 810; 815; 847 401-900

opaco: ~ 1000; > 1000 901 -> 1000 (= desbordamiento)

Para los fines de la presente invencion, una solucion "clara" que contiene termolisina se caracteriza por una turbidez (determinado como mas arriba) que es aproximadamente equivalente a (es decir, aproximadamente igual a) la turbidez de una solucion sin la termolisina pero por lo demas con la misma composicion y las concentraciones de los correspondientes ingredientes. De acuerdo con la invencion y como se muestra arriba, esto corresponde al rango de 0 UA y 130 UA, mas preferiblemente al rango de 50 UA y 130 UA, determinado como dispersion lateral a 90 ° utilizando luz con una longitud de onda de 800 nm en las condiciones descritas anteriormente.

Ejemplo 10

Deteccion espectrofotometrica de la protema de la preparacion de Thermoase

Todos los procedimientos anteriores a la fotometna se realizaron a temperatura enfriada con hielo. Se proporciono Thermoase como polvo liofilizado amorfo (Daiwa Kasei K. K.). Una cantidad de Thermoase liofilizada se disolvio en tampon Tris acuoso que contiene CaCh 10 mM, Tris HCl 40 mM, pH 7,5 para proporcionar una solucion de Thermoase liofilizada con una concentracion de 1 mg/ml.

En cuanto se obtuvo una solucion clara (evaluado mediante inspeccion visual), se tomaron lecturas fotometricas a 277 nm y a 25 °C.

Se analizaron varias veces tres lotes diferentes de Thermoase. Las lecturas fotometricas variaron de 0,57 a 0,61. El impacto potencial de las diferencias entre los valores de A (1 mg/ml) se determinaron a 277 nm y 280 nm se asumio que es insignificante y mas pequeno que otras fuentes potenciales de error.

Tabla 18

Porcentaje [p/p] de protema (termolisina en bruto) en preparaciones de Thermoase utilizando diferentes valores de

A (1 mg/ml) como referencia

A (1 mg/ml)

Lote de Thermoase: extincion a 277 nm (rango) 1,765 1,83

1: 0,60-0,61 34% - 35% 33%

2: 0,57-0,59 32% - 33% 31% -32%

3: 0,58-0,60 33% - 34% 32% - 33%

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Una composicion Kquida que comprende la termolisina en una forma disociada y a una concentracion en el rango de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, en el que a una temperatura en el rango de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C y al menos cinco horas despues de la formacion de la composicion, la turbidez de la composicion es igual a la turbidez de una solucion de referencia, siendo la composicion obtenible por un metodo que comprende la primera etapa (P) de mezclar una preparacion solida que comprende la termolisina con un disolvente acuoso y obteniendo una primera solucion, en el que la preparacion solida comprende la termolisina a una concentracion de aproximadamente 20% [p/p] o superior,

y en el que la primera solucion comprende

(i) una sal de tampon capaz de mantener un pH en el rango de pH 4,5 y pH 9,

(ii) una o mas sales, y

(iii) termolisina,

y en la primera solucion, la concentracion de la preparacion que comprende la termolisina en el disolvente acuoso esta en el rango de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentracion agregada de una o mas sales incluyendo las sales de tampon esta en el rango de aproximadamente 0,1 mM y 500 mM, y en el que el metodo comprende ademas la etapa posterior (Q) de anadir a la primera solucion una cantidad medida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, KCl, LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos,

y disolver la sal adicional, y en el que la concentracion total de la sal adicional en la solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el rango de aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 5 M,

en la que la turbidez se determina mediante inspeccion visual de atenuacion de la luz, o midiendo la densidad optica con un fotometro o por medicion de la dispersion de la luz con un fotometro de dispersion de luz, en el que la solucion de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados a las mismas concentraciones correspondientes que en la composicion, y en el que la solucion de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma.
2. Una composicion lfquida que comprende la termolisina en una forma disociada y a una concentracion en el rango de aproximadamente 10 mg/ml y aproximadamente 23 mg/ml, en el que a una temperatura en el rango de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C y al menos cinco horas despues de la formacion de la composicion la turbidez de la composicion es igual a la turbidez de una solucion de referencia, siendo la composicion obtenible por un metodo que comprende la primera etapa (P) de mezclar una preparacion solida que comprende la termolisina con un disolvente acuoso y obteniendo una primera solucion, en el que la preparacion solida comprende la termolisina a una concentracion de aproximadamente 20% [p/p] o superior,

y en el que la primera solucion comprende

(i) una sal tampon capaz de mantener un pH en el rango de pH 4,5 y pH 9,

(ii) una o mas sales, y

(iii) termolisina,

y en la primera solucion, la concentracion de la preparacion que comprende la termolisina en el disolvente acuoso esta en el rango de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentracion agregada de una o mas sales incluyendo las sales de tampon esta en el rango de aproximadamente 0,1 mM y 500 mM, y en el que el metodo comprende ademas la etapa posterior (Q) de anadir a la primera solucion una cantidad medida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, LiCl, MgCh, CaCl2, y una mezcla de los mismos,

y disolver la sal adicional, y en el que la concentracion total de la sal adicional en la solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el rango de aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 5 M,

en la que la turbidez se determina mediante inspeccion visual de atenuacion de la luz, o midiendo la densidad optica con un fotometro o por medicion de la dispersion de la luz con un fotometro de dispersion de luz, en el que la solucion de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados a las mismas concentraciones correspondientes que en la composicion, y en el que la solucion de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma.
3. Una composicion lfquida que comprende agua, termolisina en una forma disociada, una sal de tampon disociada capaz de mantener un pH en el rango de pH 4,5 y pH 9, y NaCl disociado con una concentracion de iones de sodio disociados en el rango de 100 mM y por debajo de 500 mM en la composicion, y en el que la composicion contiene termolisina a una concentracion en el rango de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml, en el que a una temperatura en el rango de aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C y al menos cinco horas despues de la formacion de la composicion de la turbidez de la composicion es igual a la turbidez de una solucion de referencia, siendo la composicion obtenible por un metodo que comprende la primera etapa (P) de mezclar una preparacion solida que comprende la termolisina con un disolvente acuoso y obteniendo una primera solucion, en el que la preparacion solida comprende la termolisina a una concentracion de aproximadamente 20% [p/p] o superior,

y en el que la primera solucion comprende

5

10

15

20

25

30

35

(i) una sal tampon capaz de mantener un pH en el rango de pH 4,5 y pH 9,

(ii) una o mas sales, y

(iii) termolisina,

y en la primera solucion, la concentracion de la preparacion que comprende la termolisina en el disolvente acuoso esta en el rango de aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml, y la concentracion agregada de una o mas sales incluyendo las sales de tampon esta en el rango de aproximadamente 0,1 mM y 500 mM, y en el que el metodo comprende ademas la etapa posterior (Q) de anadir a la primera solucion una cantidad medida de una sal adicional, en el que la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, NaBr, NaNO3, NaJ, LiCl, MgCh, CaCh, y una mezcla de los mismos,

y disolver la sal adicional, y en el que la concentracion total de la sal adicional en la solucion obtenida despues de la etapa (Q) se encuentra en el rango de aproximadamente 1,5 M y aproximadamente 5 M,

seguido de la etapa de diafiltrar la segunda solucion obtenida despues de la etapa (Q) frente a un tampon de diafiltracion que contiene una sal de tampon disociada capaz de mantener un pH en el rango de pH 4,5 y pH 9, y NaCl disociado a una concentracion por debajo de 500 mM,

en el que la turbidez se determina por inspeccion visual de la atenuacion de la luz, o midiendo la densidad optica con un fotometro o por medicion de la luz dispersada con un fotometro de dispersion de luz, en el que la solucion de referencia se compone de los mismos ingredientes disociados en las mismas concentraciones correspondientes que en la composicion, y en el que la solucion de referencia carece de termolisina o fragmentos de la misma.
4. La composicion lfquida segun la reivindicacion 3, en donde la sal adicional es NaCl.
5. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, en el que la composicion contiene termolisina a una concentracion en el rango de aproximadamente 2,5 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml.
6. La composicion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que en la composicion, la concentracion agregada de las sales disociadas incluyendo la sal o sales de tampon esta en el rango de aproximadamente 400 mM y aproximadamente 200 mM.
7. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, en el que en la composicion de la concentracion de iones de sodio disociados esta en el rango de 100 mM y 250 mM.
8. La composicion lfquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en el que la conductividad de la composicion es de aproximadamente 20 mS/cm.
9. El uso de una composicion lfquida de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para el almacenamiento, el transporte, o dispensacion de termolisina, en el que la termolisina esta en forma disociada.