KR20220061107A - 지질용해 활성의 검출을 위한 조성물, 방법 및 키트 - Google Patents

지질용해 활성의 검출을 위한 조성물, 방법 및 키트 Download PDF

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KR20220061107A
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필립 페도로비츠
미하엘 얀
안드레아스 체어
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Abstract

본 발명은 지질용해 활성을 검출하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 수용성 검정 시료 및 유기 용매를 포함하고, 여기서 유기 용매는 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함한다. 또한, 본원에서는 단백질 제조물의 안정성을 결정하는 방법이 제공된다.

Description

지질용해 활성의 검출을 위한 조성물, 방법 및 키트
본 발명은 지질용해 활성을 검출히고/거나, 정량화하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 또한, 본원에서는 단백질 제조물의 안정성을 결정하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 지질용해 활성을 검출하기 위한 조성물은 수용성 검정 시료 및 유기 용매를 포함하고, 여기서 유기 용매는 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함한다.
세포 배양물은 치료용 단백질과 같은 시판되는 중요한 단백질의 생성에 사용될 수 있다. 표적 단백질 이외에도, 세포는 숙주 세포 단백질 (HCP), 예로 리파제를 생산하고, 이는 표적 단백질의 생산 풀, 예로 세포 배양 상청액 또는 세포 용해물에서 발견될 수 있다. 하류의 정제 공정은 다양한 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있으며 (예로, 단일클론 항체의 생산, 친화 크로마토그래피의 경우), 일반적으로 매우 많은 HCP를 고갈시킨다. 그러나, HCP의 100% 고갈은 평형을 기초로 하는 분리 및 정제 방법의 기본 원리로 인해 가능하지 않다. 산업 및 보건 기관에 의해 인정되는 HCP 한계는 활성 단백질의 양을 기준으로 하여 ~ 1 ppm 내지 100 ppm이다. HCP는 전형적으로, 예로 USP <1132>에서 개략되는 바 효소 결합된 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의한 총합 매개변수로서 측정되어 보고되고, 따라서 이들은 전형적으로 일정 범위의 상이한 숙주 유래 단백질을 다양한 농도로 포함한다. ELISA에 의해 정량화된 바, 총 HCP 함량이 동일한 약물 원료도 상이한 HCP 프로파일을 갖을 수 있다. 이것은 약간의 공정 변화가 낮은 농도의 특이적 HCP, 예로 리파제의 증가를 초래하는 상황을 유도할 수 있으며, 총 HCP 검정을 적용하여 검출되지 않을 수 있다. 따라서, 작은 HCP 백분율이 최종 단백질 산물에 존재할 수 있고, 촉매 활성을 갖을 수 있다. 잔류 촉매 활성은 산물의 품질, 예를 들면 부형제 예로 폴리소르베이트와 같은 계면활성제의 안정성, 궁극적으로 단백질 산물의 안정성, 품질 및 안전성에 유해한 효과를 미칠 수 있다. 이러한 유해한 효과를 최소화하거나 제거하는 것은 단백질이 치료용 단백질, 특히 인간에게 사용되는 치료용 단백질인 경우에 매우 중요할 수 있다.
단백질의 제조에서 잔류 리파제 활성, 예를 들면 표적 단백질의 하류 정제 공정 동안 최적화에 못미치는 고갈로 인해 남은 활성은 일부 부형제, 예로 계면활성제의 가수분해를 유도할 수 있다. 결과로는, 예를 들어 계면활성제로부터 비-극성, 불용성 긴 사슬 지방산 및 기타 분해물의 방출로 인한 보이거나 보이지 않는 입자의 형성, 및 계면활성제에 의해 주어진 안정화의 손실을 포함할 수 있다. 또한, 계면활성제 분해는 단백질 품질에 역효과를 미치고, 예로 과산화물의 생산이 단백질 분해를 유도하거나, 라우르산의 생산이 단백질 응집을 유도할 수 있다. 또한, 계면활성제의 분해는 제형물에서 이들의 농도를 감소시키고, 잠재적으로 예로 경계면 스트레스 (예로, 진탕 및 냉동/해동 등)에 대한 불충분한 단백질 보호를 유도하며, 또한 산물의 안전성 고려 시 잠재적인 차이, 예로 분해된 계면활성제로 인한 상이한 생체내 부담을 발생시킬 수 있다. 따라서, 잔류 리파제 활성은 부형제의 가수분해로 인한 최종 단백질 제조물의 품질 저하를 야기할 수 있다. 예로 솔리소르베이트와 같은 부형제의 분해 산물은 환자에게 주사 부위 반응과 같은 안전성 문제도 유발할 수 있다 (예로, Singh et al., J. Pharm. Sci. 107(11): 2735-2741 (2018) 참조).
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료; 및 (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이고, 수용성 검정 시료는 조성물 중 약 80% 내지 약 99.9%이고, 상기 유기 용매는 조성물 중 약 0.1% 내지 약 20%인, 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 세포 배양 상청액이다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 부분적으로 정제된 단백질 제조물이다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 정제된 단백질 제조물이다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 치료용 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-80 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 추가적인 숙주 세포 단백질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 완충화제, 염 또는 둘 다를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 염은 염화나트륨, 염화칼슘 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 염은 염화나트륨 및 염화칼슘이다. 일부 구현예에서, 염화나트륨은 수용성 검정 시료에서 약 50 mM 내지 약 400 mM이다. 일부 구현예에서, 염화나트륨은 수용성 검정 시료에서 약 100 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 염화칼슘은 수용성 검정 시료에서 약 0.2 mM 내지 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 염화칼슘은 수용성 검정 시료에서 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM이다.
일부 구현예에서, 완충화제는 약 pH 6.0에서 완충화 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 완충화제는 트리스이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 비스-트리스이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 약 2 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 약 10 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 약 40 mM 내지 약 60 mM이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 약 45 mM 내지 약 55 mM이다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올, 설폭사이드, 니트릴 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴을 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴 및 이소프로판올의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 C1 내지 C6 알코올이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 조성물은 리파제 저해제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 (S)-2-포르밀아미노-4-메틸-펜탄산 (S)-1[[(2S,3S)-3-헥실-4-옥소-2-옥세타닐]메틸]-도데실 에스테르 (오를리스타트)이다.
일부 구현예에서, 리파제 저해제는 유기 용매에 있다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 1 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 5 μM 내지 약 25 μM이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) (i) 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; 및 (iii) 염을 포함하는 수용성 검정 시료; 및 (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이고, 수용성 검정 시료는 조성물 중 약 80% 내지 약 99.9%이고, 유기 용매는 조성물 중 약 0.1% 내지 약 20%인, 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 약 90 부피% 내지 약 99.9 부피%의 수용성 검정 시료로서, (i) 단백질 및 지질을 포함하는 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; (iii) 약 0.1 mM 내지 약 2.0 mM 염화칼슘; 및 (iv) 약 100 mM 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 수용성 검정 시료; 및 (b) 약 10 부피% 내지 약 0.1 부피%의 유기 용매로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올, 디메틸 설포옥사이드 (DMSO), 아세토니트릴 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는, 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0인, 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 수용성 검정 시료에서 지질용해 활성을 검출하는 방법으로서, (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하는 단계; 및 (b) 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 수용성 검정 시료에서 지질용해 활성을 검출하는 방법으로서, (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하여 검정 조성물을 형성하는 단계; 및 (b) 단백질 제조물 및 리파제 저해제를 포함하는 대조군 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하여 대조군 조성물을 형성하는 단계; 및 (c) 검정 조성물 및 대조군 조성물에서 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 제조물의 안정성을 결정하는 방법으로서, (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하는 단계; 및 (b) 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계; 및 (c) 측정된 형광을 기준으로 하여 단백질 제조물의 안종성을 결정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 유기 용매는 약 80 : 20 내지 약 98 : 2의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 유기 용매는 약 90 : 10 내지 약 99.9 : 0.1의 비율로 조합된다.
일부 구현예에서, 형광은 330 nm에서의 형광 여기 및 495 nm에서의 형광 방출에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 형광은 최대 24시간 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 형광은 약 24시간 내지 약 400시간 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 형광은 100시간 이상 동안 측정된다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 단계 (a) 이전에 약 10분 내지 약 1시간 동안 리파제 저해제와 함께 배양된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 단계 (a) 이전에 약 30분 동안 리파제 저해제와 함께 배양된다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 (S)-2-포르밀아미노-4-메틸-펜탄산 (S)-1[[(2S,3S)-3-헥실-4-옥소-2-옥세타닐]메틸]-도데실 에스테르 (오를리스타트)이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 약 1 μM 내지 약 50 μM로 첨가된다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 5 μM 내지 약 25 μM로 첨가된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 유기 용매; (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO); 및 (c) 리파제 저해제를 2개 이상의 용기에 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 키트는 완충화제, 염 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 완충액 교환 컬럼을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매; (b) 단백질 제조물의 완충액을 교환하는데 적합한 컬럼; 및 (c) 리파제 저해제를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1a 내지 도 1e는 실시예 1A과 관한 것이다. 도 1a 및 도 1b는 각각 돼지 췌장 리파제 (PPL) 활성 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu) 형광 소광에 미치는 완충액 농도, 및 트리스 및 비스-트리스 pH의 효과를 나타낸다. 도 1c는 리파제 활성 및 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)의 자가-가수분해에 미치는 완충액 농도 및 pH의 효과를 나타낸다. 도 1d는 4Mu 형광이 측정되었던 pH 범위를 나타낸다. 도 1e는 다양한 pH에서의 상이한 4Mu 형태를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 실시예 2A과 관한 것이다. 도 2a 및 도 2b는 각각 리파제 활성 및 4Mu 형광 소광에 미치는 CaCl2 농도의 효과를 나타낸다. 도 2c는 리파제 활성 및 4MuO의 자가-가수분해에 미치는 CaCl2 농도의 효과를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 실시예 3A과 관한 것이다. 도 3a 및 도 3b는 각각 리파제 활성 및 4Mu 형광 소광에 미치는 NaCl 농도의 효과를 나타낸다. 도 3c는 리파제 활성 및 4MuO의 자가-가수분해에 미치는 NaCl 농도의 효과를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 실시예 4A에 관한 것이다. 도 4a 및 도 4b는 각각 리파제 활성 및 4Mu 형광 소광에 미치는 유기 용매의 영향을 나타낸다. 도 4c는 리파제 활성 및 4MuO의 자가-가수분해에 미치는 유기 용매의 영향을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 실시예 5에 관한 것이다. 도 5a 및 도 5b는 각각 리파제 활성 및 4Mu 형광 소광에 미치는 계면활성제의 영향을 나타낸다. 도 5c는 리파제 활성 및 4MuO의 자가-가수분해에 미치는 계면활성제의 영향을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 실시예 6에 관한 것이다. 도 6a 및 도 6b는 각각 리파제 활성 및 4Mu 형광 소광에 미치는 3가지 상이한 농도의 리파제 저해제, 오를리스타트의 영향을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7d는 실시예 7에 관한 것이다. 도 7a 및 도 7c는 리파제 활성 및 4MuO의 자가-가수분해에 미치는 이론적으로 전부 분해된 PS20의 산물 저해 효과를 나타낸다. 도 7b 및 도 7d는 리파제 활성 및 4MuO의 자가-가수분해에 미치는 이론적으로 전부 분해된 PS80의 산물 저해 효과를 나타낸다.
도 8은 실시예 8에 관한 것이다. 도 8은 4Mu 형광 소광에 미치는 PS80의 효과를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9d는 실시예 9에 관한 것이다. 도 9a 및 도 9b는 다양한 농도의 세포 배양물 수확 유체 (CCHF)에서 PS20 (도 9a) 및 PS80 (도 9a) 분해를 테스트하는 HPLC-FMA 검정의 결과를 나타낸다. 도 9c는 4 MuO 리파제 검정의 이론적인 판독 결과를 나타낸다. 도 9d는 폴리소르베이트 분해에 대한 다양한 농도의 CCHF를 테스트하는 4 MuO 리파제 검정의 실제적인 판독 결과를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10h는 실시예 9에 관한 것이다. 도 10a 내지 도 10h는 상이한 CCHF 농도에서 PS80을 사용한 4MuO 리파제 검정의 결과를 나타낸다.
도 11은 실시예 1B에 관한 것이다. 도 11은 PPL 및 CCHF의 지질용해 활성 및 4 Mu 자가-가수분해 (AH)에 미치는 트리스 및 비스-트리스의 효과를 나타낸다.
도 12는 실시예 2B에 관한 것이다. 도 12는 PPL 및 CCHF의 지질용해 활성에 미치는 CaCl2 농도의 효과를 나타낸다.
도 13은 실시예 3B에 관한 것이다. 도 13은 PPL 및 CCHF의 지질용해 활성에 미치는 NaCl 농도의 효과를 나타낸다.
도 14는 실시예 4B에 관한 것이다. 도 12는 PPL 및 CCHF의 지질용해 활성에 미치는 유기 용매의 효과를 나타낸다.
도 15a 및 도 5b는 실시예 5B에 관한 것이다. 도 15a는 PPL 및 CCHF의 지질용해 활성에 미치는 상이한 계면활성제의 효과를 나타낸다. 도 15b는 상이한 계면활성제에 의한 4Mu 형광의 소광을 나타낸다.
도 16는 실시예 6B에 관한 것이다. 도 16은 시료를 3가지 상이한 농도에서 리파제 저해제, 오를리스타트와 함께 사전-배양하거나, 공동-배양하는 것이 PPL 활성에 미치는 효과를 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 실시예 10에 관한 것이다. 도 17a는 다양한 양성 및 음성 대조군 (시료, 검정, 제형물 및 자가분해)과 함께 단백질 포함하는 제형물을 사용하여 수행된 리파제 검정의 역학을 나타낸다. 테스트된 시료는 본원의 표 10에 요약되어 있다. 도 17b는 검정 역학의 확대도이다.
도 18은 실시예 9에 관한 것이다. 도 18은 다양한 농도의 CCHF를 사용하여 수행된 리파제 검정의 요약을 나타낸다.
도 19a 및 도 19b는 실시예 1B에 관한 것이다. 도 19a 및 도 19b는 0.01 mM 내지 5 mM의 농도 범위에서 4Mu 산정 곡선 및 4Mu 산정 곡선의 수적 결과를 각각 나타낸다.
본 발명은 지질용해 활성을 검출하기 위한 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.
본원에 사용된 바, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 바, 단어 "포함하는"과 조합하여 사용될 때, 단어 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 바, "또 다른" 또는 "추가의"는 적어도 제 2 이상을 의미할 수 있다.
본 출원 전체를 통해, 용어 "약"은 값 또는 연구 주제에 존재하는 이의 변화를 결정하도록 채용된 방법/장치에 대한 내재한 오차의 변화를 포함함을 나타내는데 사용된다. 전형적으로, 용어 "약"은 상황에 따라, 대략 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 미만 또는 이상의 변화를 포괄하도록 의미한다. 일부 구현예에서, 당업자라면 용어 "약"에 의해 표시되는 변화의 수준을, 이것이 본원에 사용되는 맥락으로 인해 이해할 것이다. 또한, 용어 "약"의 사용이 구체적으로 인용된 값도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 본 발명이 대안만 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 뒷받침하지만, 단지 대안만을 언급하는 것으로 명시되지 않거나, 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" (및 "포함하다" 및 "(단수형) 포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 활용 또는 형태), "갖는" (및 "갖다" 및 "(단수형) 갖다"와 같은 갖는의 임의의 활용 또는 형태), "포함하는 (including)" (및 "포함하다" 및 "(단수형) 포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 활용 또는 형태), 또는 "포함하는 (containing) (및 "포함하다" 및 "(단수형) 포함하다"와 같은 포함하는의 임의의 활용 또는 형태)은 함축적이거나 개방되어 있으며, 추가적인 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 발명의 임의의 방법, 조성물 및/또는 키트와 관련하여 실행될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법 및 키트를 달성하는데 사용될 수 있다.
용어 "예를 들면" 및 이의 상응하는 약어 "예로" (이탤릭체 여부와 상관없음)의 사용은 인용된 구체적인 용어가 달리 명시되지 않는 한 언급되거나 인용된 상세한 실시예에 한정하도록 의도되지 않는 본 발명의 예시적인 실시예 및 구현예임을 의미한다.
본원에 사용된 바, "사이"는 범위의 종점을 포함하는 범위이다. 예를 들면, x 및 y 사이의 수는 숫자 x 및 y, 그리고 x 및 y 내에 속하는 임의의 수를 명시적으로 포함한다.
본원에 사용된 바, "단백질", "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 임의의 길이일 수 있는 중합체 형태의 아미노산을 말한다. 단백질은 예로 항체, 구조 단백질, 효소, 막, 막 관련 및/또는 막통과 단백질, 운반체, 수용체 및 신호전달 단백질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 및/또는 펩티드는 예로 하나 이상의 비-펩티드 물질, 예를 들면 약물, 표적화 모이어티, 영상화 태그와 같은 태그에 컨쥬게이션된 변형된 단백질을 포괄한다. 본 발명의 단백질은 예로 질환 또는 장애의 진단, 치료 및/또는 예방에 사용되는 치료용 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 폴리소르베이트는 약제학적 제형물에서 단백질의 안정성을 개선할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료용 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 치료용 단백질은 항체-약물 컨쥬게이트이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단백질 제조물은 단백질, 예로 치료용 단백질을 포함한다.
단백질 제조물의 맥락에서 본원에 사용된 바, "정제"는 하나 이상의 물질, 예로 단백질이 복합 혼합물, 전형적으로 세포, 조직 또는 유기체로부터 단리되는 공정을 말한다. "정제된" 단백질 시료 또는 단백질 제조물은 세포, 조직 또는 유기체의 하나 이상의 비-물 가용성 구성요소 (예컨대, 세포막, 지질, 응집된 단백질 또는 핵산, 및 기타 소수성 물질)이 감소되거나 제거되어 가용성 구성요소 (예컨대, 가용성 단백질)만을 남긴 시료를 말할 수 있다. 본원에 사용된 바, "가용성"은 물질이 특정 용매, 예로 세포 배양 배지, 완충액, 물 또는 유기 용매에 용해되는 능력을 말할 수 있다. 단백질의 맥락에서, "가용성"은 또한 특정 용매, 예로 세포 배양 배지, 완충액, 물 또는 유기 용매에서 침전되고/거나 응집되지 않는 단백질을 말할 수 있다.
예시적인 정제 공정은 관심있는 단백질, 예로 치료용 단백질을 포함하는 세포 배양물을 배양하는 단계; 세포를 배양 배지로부터 분리하는 단계; 세포를 용해시키고, 용해된 세포를 분리하여 가용성 구성요소를 포함하는 세포 배양 상청액, 및 본원에 기술된 불용성 구성요소를 포함하는 펠렛을 생성하는 단계; 및 세포 배양 상청액으로 완충액 교환, pH 조정, 원심분리, 여과 (예로, 초여과 및/또는 한외여과를 포함함), 크로마토그래피 또는 이들의 임의의 조합에 착수하여 정제된 단백질 제조물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 정제된 단백질 제조물은 본원에 기술된 공정에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 부분적으로 정제된 단백질 제조물은 본원에 기술된 일부 정제 공정이 시행되었다. 예를 들면, 부분적으로 정제된 단백질 제조물은 정제된 단백질 제조물을 생성하는데 사용되는 완충액 교환, pH 조정, 원심분리, 여과 및/또는 크로마토그래피 단계 모두가 시행되지 않았을 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 배양 상청액은 본 발명의 치료용 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 부분적으로 정제된 단백질 제조물은 본 발명의 치료용 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 정제된 단백질 제조물은 본 발명의 치료용 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 지질용해 활성의 검출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 지질용해 활성, 즉 지질용해 (lypolysis)는 일반적으로 지질의 가수분해를 말한다. 지질용해 반응은 에스테라제 효소의 하위부류인 리파제 효소에 의해 촉매될 수 있다. 따라서, "리파제"는 지질, 트리글리세리드, 인지질 및 콜레스테릴 에스테르 등의 에스테르 결합을 가수분해하는 효소를 말한다. 리파제는 예로 트리글리세리드 리파제, 지질단백질 리파제, 췌장 리파제, 간 리파제, 위 리파제, 구강 리파제, 내피 리파제 및 포스파티딜세린 포스포리파제를 포함한다. 리파제는 자연적으로 생산되고, 예로 포유동물에서 췌장, 간, 구강샘, 위, 갑상샘 및/또는 점막에 의해 생산되고/거나, 특정 세균 및 진균에 의해 분비되고/거나, 리소좀에서 발견된다. 일부 구현예에서, 리파제는 단백질 정제 시 단백질이 유래한 세포에 내재한다. 일부 구현예에서, 리파제는 단백질 제조물의 또 다른 생물학적 구성요소, 예로 단백질 제조물에 첨가되는 안정화 단백질을 포함하는 생물학적 구성요소에 내재한다.
일부 구현예에서, 리파제는 세포 배양에서 세포에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, 리파제는 관심있는 단백질의 생산을 위한 세포 배양에서 세포에 의해 생산된다. 관심있는 단백질의 생산에 적합한 세포의 비-제한적인 예는 세균, 곤충, 효모, 포유동물 및/또는 유전자전환 세포를 포함한다. 세포주의 비-제한적인 예는 CHO, HEK 293, HT-1080, PER.C6, CAP, VERO, BHK, HeLa, CV1, Cos, MDCK, 3T3, NS0, NS1, PC12, W138, Sp2/0, HKB-11, TM4, MMT 060562, TR1, MRC 5, FS4, 골수종 세포주, 하이브리도마 세포주 및 간암 세포주를 포함한다. 일부 구현예에서, 관심있는 단백질을 생산하기 위한 세포주는 안정한 세포주, 예로 관심있는 단백질에 대한 유전자가 세포 게놈 내에 안정적으로 혼입된 세포주이다. 일부 구현예에서, 관심있는 단백질을 생산하기 위한 세포주는 일시적 세포주, 예로 세포가 유전자를 발현하기는 하지만, 게놈 내에 혼입시키지 못하는 세포주이다.
일부 구현예에서, 관심있는 단백질은 치료용 단백질이다. 일부 구현예에서, 관심있는 단백질은 세포 배양물로부터 정제되어 정제된 단백질 제조물을 생성한다. 일부 구현예에서, 세포 배양물에서의 리파제는 정제 공정 동안 단백질 제조물로부터 완벽하게 제거되지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서, 리파제는 정제된 단백질 제조물에 존재한다.
본원에 언급된 바, "활성이 있는" 리파제는 지질분해를 수행할 수 있는 (본원에서 "지질분해 활성"을 갖는 것으로서 역시 지칭될 수 있음) 리파제이다. 단백질 제조물에 존재하는 활성이 있는 리파제는 관심있는 단백질, 예로 치료용 단백질이 관여하는 하류 공정을 방해할 수 있다. 일부 구현예에서, 관심있는 단백질, 예로 치료용 단백질 및 리파제를 포함하는 단백질 제조물이 약제학적 제형물에 포함된다. 일부 구현예에서, 부형제가 단백질 제조물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 부형제는 단백질 제조물을 예로 경계면 스트레스를 최소화하고/거나, 단백질 응집을 감소시키고/거나, 단백질 용해도를 개선시킴으로써 안정화한다. 일부 구현예에서, 부형제는 계면활성제이다. 일부 구현예에서, 부형제는 지방산, 에스테르 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 부형제는 활성이 있는 리파제에 의해 가수분해되기 쉽다. 일부 구현예에서, 관심있는 단백질 및 부형제를 포함하는 단백질 제조물에 있는 활성 리파제의 존재는 제조물의 안정성을 감소시킨다. 따라서, 부형제의 리파제 가수분해에 의해 야기되는 입자의 증가, 안전성 문제 (예로, 주사 부위 반응의 증가로 인함) 및 품질 저하와 같은 부정적인 영향을 최소화하기 위하여 단백질 제조물에서 지질분해 활성을 신뢰가능하게 검출하는 것이 유리하다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 제조물에서 지질분해 활성이 검출될 수 있는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료; 및 (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이고, 수용성 검정 시료는 조성물 중 약 80% 내지 약 98%이고, 상기 유기 용매는 조성물 중 약 2% 내지 약 20%인, 조성물을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 (a) (i) 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; 및 (iii) 염을 포함하는 수용성 검정 시료; 및 (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이고, 수용성 검정 시료는 조성물 중 약 80% 내지 약 98%이고, 유기 용매는 조성물 중 약 2% 내지 약 20%인, 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 (a) 약 90 부피% 내지 약 98 부피%의 수용성 검정 시료로서, (i) 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; (iii) 약 0.1 mM 내지 약 2.0 mM 염화칼슘; 및 (iv) 약 100 mM 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 수용성 검정 시료; 및 (b) 약 2 부피% 내지 약 10 부피%의 유기 용매로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올, 디메틸 설포옥사이드 (DMSO), 아세토니트릴 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는, 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0인, 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 바, "수용성" (예로, 수용성 검정 시료)는 물이 용매인 용액 또는 시료를 말한다. 따라서, 본 발명의 수용성 검정 시료는 예로 세포 배양 배지, 완충액 용액 및 단백질 시료 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 수용성 검정 시료는 단백질 제조물을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 세포 배양 상청액이다. 세포 배양 상청액은 본원에 기술되어 있으며, 예로 관심있는 단백질을 생산하기 위한 세포 배양물로부터 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료용 단백질이다. 일부 구현예에서, 세포 배양 상청액은 배양된 세포를 용해시키고, 가용성 및 불용성 구성요소를 예로 원심분리에 의해 분리시킨 이후에 생산된다. 배양 및 단백질 생산에 적합한 세포 및 세포주의 예는 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 배양 상청액은 관심있는 단백질, 예로 치료용 단백질, 및 추가적인 숙주 세포 구성요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 숙주 세포 구성요소는 추가적인 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 숙주 세포 단백질은 리파제를 포함한다. 일부 구현예에서, 리파제는 지질용해 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 부분적으로 정제된 단백질 제조물이다. 부분적으로 정제된 단백질 제조물은 본원에 기술되어 있고, 예로 세포 배양물로부터의 관심있는 단백질에 대한 부분적 정제 절차 (예로, 본원에 기술된 정제 공정)을 진행한 이후에 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료용 단백질이다. 일부 구현예에서, 부분적으로 정제된 단백질 제조물은 세포 배양 상청액과 비교하여 추가적인 정제 단계를 진행하였다. 일부 구현예에서, 부분적으로 정제된 단백질 제조물은 치료용 단백질 및 숙주 세포의 추가적인 구성요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 구성요소는 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 단백질은 리파제를 포함한다. 일부 구현예에서, 리파제는 지질용해 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 치료용 단백질은 부분적으로 정제된 단백질 제조물에서 전체 단백질 중 20 중량% 내지 95 중량% , 30 중량% 내지 90 중량% 또는 40 중량% 내지 80 중량%이다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 정제된 단백질 제조물이다. 정제된 단백질 제조물은 본원에 기술되어 있고, 예로 세포 배양물로부터의 관심있는 단백질에 대한 정제 절차 (예로, 본원에 기술된 정제 공정)을 진행한 이후에 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심있는 단백질은 치료용 단백질이다. 일부 구현예에서, 정제된 단백질 제조물은 치료용 단백질 및 숙주 세포의 추가적인 구성요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포의 구성요소는 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 단백질은 리파제를 포함한다. 일부 구현예에서, 리파제는 지질용해 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 치료용 단백질은 정제된 단백질 제조물에서 전체 단백질 중 70 중량% 이상, 80 중량% 이상, 85 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상 또는 99 중량% 이상이다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 치료용 단백질을 포함한다. 치료용 단백질의 비-제한적인 예는 항체 (예컨대, 단일클론 또는 다중클론 항체) 및 항체 단편; 단백질 기반의 백신 (예컨대, B형 간염 표면 항원); 혈액 인자 (예컨대, 인자Ⅷ 및 인자 Ⅸ); 트롬빈 용해제 (예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자); 호르몬 (예컨대, 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬 및 생식샘 자극호르몬); 조혈 성장인자 (예컨대, 에리트로포이에틴 및 콜로니 자극인자); 인터페론 (예컨대, 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ); 인터류킨 기반의 단백질 (예컨대, 인터류킨-12); 및 기타 단백질, 예컨대 종양 괴사인자 및 치료용 효소를 포함한다. 단백질 기반의 치료제의 추가의 예는 벨리무맙, 이필리무맙, 벨라타셉트, 브렌툭시맙, 베도틴, 아플리베르셉트, 아스파라기나제 어위니아 크라이산테미, 글루카르피다제, 오비누투주맙, 펩브롤리주맙, 블리나투모맙, 니볼루맙, 아다루시주맙, 아소파타제-알파, 다라투무맙, 엘로투주맙, 세베리파제 알파, 아테졸리주맙, 탈리글루세라제 알파, 락시바쿠맙, 엘로설파제 알파, 메트레렙틴, 라무시루맙, 실툭시맙, 펨브로리주맙, 디누툭시맙, 에볼로쿠맙, 네시투무맙, 오빌톡삭시맙, 아바타셉트, 아달리무맙, 알레파셉트, 에타네르셉트, 인플릭시맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 데니류킨 디프티톡스 및 골리무맙을 포함한다. 단백질 치료제의 추가의 예는, 예로 Dimitrov, Methods Mol. Biol. 899: 1-26 (2012); Lagasse et al., F1000Res 6: 113 (2017); 및 Protein Therapeutics, Eds., Vaughan et al., 2017: Wiley-VCH Verlag에 기술되어 있다. 치료용 단백질은 재조합 단백질, 변형된 단백질 및 융합 단백질, 예컨대 항체-약물 컨쥬게이트, 항체-사이토카인 융합, Fc 융합, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 애피체 융합, 글리코실화된 단백질 및 펩티드 및 조작된 수용체 길항제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료용 단백질을 포함하는 단백질 제조물은 약제학적 제형물에 사용된다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 시판되는 중요한 단백질, 예로 산업적 효소를 포함한다. 시판되는 중요한 단백질은 제약, 화학적 생산, 바이오연료, 식품 및 음료, 및 소비자 산물과 같은 다양한 산업에 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 원하는 산물을 생성하는 공정 내에 사용되는 효소이거나, 관심있는 산물일 수 있다. 일부 구현예에서, 시판되는 중요한 단백질은 식품, 약제학적 합성, 바이오연료, 화학물질 또는 제조 산업에 사용된다. 일부 구현예에서, 산업적 효소는 팔라타제 리포자임, 리포판, 자일로스 이소머라제, 브로멜레인 및 노오파자임 (식품 산업에 사용됨), 셀룰라제 및 아밀라제 (바이오연료 산업에 사용됨), 레지나제 (종이 가공 산업에 사용됨), 아미다제 (화학 산업에 사용됨), 노보짐-435 (이소프로필 미리스테이트의 미용적 생산에 사용됨), 또는 섭틸리신 (세제에 사용됨)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 약제학적 부형제를 포함한다. 약제학적 부형제는 예로 제조 과정 이전, 동안 또는 이후에 약물 전달 시스템의 가공을 돕고/거나; 안정성, 생체유용성 또는 환자 용인가능성을 보호하거나, 지원하거나, 증진하고/거나; 산물을 식별하고, 전반적인 안전성을 증진하고/거나; 사용 시 효율성 및/또는 약물의 전달을 지원하고/거나; 보관 동안 약물 산물의 무결성의 유지를 지원하도록 포함된다. 약제학적 부형제의 비-제한적인 예는 계면활성제, 충전제, 희석제, 결합제, 현탁화제, 점성 제제, 코팅제, 향미제, 붕해제, 채색제, 활택제, 글리던트, 보존제 및 감미제 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 부형제는 단백질 제조물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 약제학적 부형제는 정제 이전, 이후 또는 동안 단백질 제조물에 첨가된다.
일부 구현예에서, 약제학적 부형제는 계면활성제이다. 본원에 사용된 바, "계면활성제"는 2가지 액체 사이의 표면 장력 또는 경계면 장력을 저하시키는 제제를 말한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 조성물, 예로 본원에 기술된 단백질 제조물을, 조성물 중 하나 이상의 성분의 응집 및/또는 침전을 최소화하고/거나, 용해도를 개선함으로써 (예로, 표면 장력을 저하시키고, 단백질 표면 흡착을 억제함으로써; Agarkhed et al., AAPS PharmSciTech 14: 1-9 (2013)) 안정화할 수 있다. 또한, 약제학적 조성물에서 계면활성제는 활성이 있는 약제학적 성분 (API)의 생체유용성을 조정하고/거나; API가 바람직한 다형성 형태를 유지하는 것을 지원하고/거나; 응집 또는 해리를 방지하고/거나; 활성 성분의 면역원성 반응을 조정할 수 있다. 계면활성제는 양이온성, 음이온성, 비-이온성, 양성이온성, 양쪽 이온성 및/또는 양성 계면활성제를 포함한다. 계면활성제의 비-제한적인 예는 지방산 (예로, 폴리소르베이트 20의 라우르산 및 폴리소르베이트 80의 올레산)으로 에스테르화된 에톡시화된 소르비탄으로부터 유래한 폴리소르베이트 (예로, 트윈 20 및 트윈 80과 같은 트윈 계면활성제, 이는 각각 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80으로도 알려짐); 타일로옥사폴; 폴록사머 (예로, 플루로닉 F68LF, 플루로닉 L-G2LF, 플루로닉 L62D, 루트롤 F68, 및 콜리퍼 P188); 폴리옥시에틸렌 캐스터 오일 (예로, 콜리퍼 EL) 및 이의 유도체; 스판으로도 알려진 소르비탄 에스테르; 폴리옥실 스테아레이트; 레시틴; 인지질; 예로, 트리톤 (예로, 트리톤 X-100) 및 BRIJ (예로, BRIJ 35)와 같은 폴리에틸렌 계면활성제; 예로 MYRJ S40, MYRJ S100 및 MYRJ 52와 같은 폴리에톡시화된 지방산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 계면활성제는 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트를 포함한다. 폴리소르베이트는 지방산으로 에스테르화된 에톡시화된 소르비탄으로부터 유해한 화합물의 부류이고, 예로 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 21, 폴리소르베이트 61, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 81 및 폴리소르베이트 81을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 단백질 제조물은 폴리소르베이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물의 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.001% w/v 내지 약 2% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.005% w/v 내지 약 2% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.01% w/v 내지 약 2% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.02% w/v 내지 약 1.5% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.03% w/v 내지 약 1.0% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.04% w/v 내지 약 0.8% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.05% w/v 내지 약 0.6% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.06% w/v 내지 약 0.4% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.07% w/v 내지 약 0.2% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.08% w/v 내지 약 0.15% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.09% w/v 내지 약 0.10% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 수용성 검정 시료에서 약 0.01% w/v 내지 약 0.04% w/v이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 추가적인 숙주 세포 단백질을 추가로 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 단백질 제조물은 관심있는 단백질, 예로 치료용 단백질의 세포 배양물, 즉 숙주 세포를 포함하는 배양물로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 하나 이상의 추가적인 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 숙주 세포 단백질은 관심있는 단백질, 예로 치료용 단백질과 실질적으로 동일한 동일한 조건에서 가용성이다. 일부 구현예에서, 추가적인 숙주 세포 단백질은 관심있는 단백질, 예로 치료용 단백질로부터 용이하게 분리가능하지 않다. 일부 구현예에서, 추가적인 숙주 세포 단백질은 리파제를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 숙주 세포 단백질은 지질용해 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료는 완충화제, 염 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 염은 음이온이 OH- 및 O2-이 아닌 이온성 화합물을 말한다. 일부 구현예에서, 염은 조성물에서 하나 이상의 구성요소의 분해를 감소시키고/거나, 방지한다. 수용성 검정 시료에 포함될 수 있는 적합한 염은 예로 소듐 염, 칼슘 염 및 암모늄 염 등을 포함하여, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 염은 염화칼륨 (KCl), 염화나트륨 (NaCl), 탄산나트륨 (Na2CO3), 황산나트륨 (Na2SO4), 염화칼슘 (CaCl2), 염화암모늄 (NH4Cl), 암모늄 아세테이트 (NH4CH3COO), 암모늄 설페이트 ((NH4)2SO4) 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, CaCl2 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl 및 CaCl2 둘 다이다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl의 농도는 시료에서 지질용해 활성의 정확한 및/또는 효율적인 검출을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl는 약 10 mM 내지 약 500 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl는 약 25 mM 내지 약 400 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl는 약 50 mM 내지 약 300 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl는 약 75 mM 내지 약 250 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl는 약 100 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl는 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM 또는 200 mM이다.
일부 구현예에서, 최종 조성물 (수용성 검정 시료 및 유기 용매)에서 NaCl은 약 10 mM 내지 약 500 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 NaCl은 약 25 mM 내지 약 400 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 NaCl은 약 50 mM 내지 약 300 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 NaCl은 약 75 mM 내지 약 250 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 NaCl은 약 100 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 NaCl은 약 100 mM 내지 약 140 mM, 예로 120 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 NaCl은 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM 또는 200 mM이다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 CaCl2의 농도는 시료에서 지질용해 활성의 정확하고/거나 효율적인 검출을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 CaCl2는 약 0.1 mM 내지 약 20 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 CaCl2는 약 0.2 mM 내지 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 CaCl2는 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 CaCl2는 약 0.7 mM 내지 약 3.0 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 CaCl2는 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 CaCl2는 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1.0 mM, 약 1.1 mM, 약 1.2 mM, 약 1.3 mM, 약 1.5 mM, 약 1.5 mM, 약 1.6 mM, 약 1.7 mM, 약 1.8 mM, 약 1.9 mM, 약 2.0 mM, 약 2.5 mM, 약 3.0 mM, 약 3.5 mM, 약 4.0 mM, 약 4.5 mM 또는 약 5.0 mM이다.
일부 구현예에서, 최종 조성물 (수용성 검정 시료 및 유기 용매)에서 CaCl2는 약 0.1 mM 내지 약 20 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 CaCl2는 약 0.2 mM 내지 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 CaCl2는 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 CaCl2는 약 0.7 mM 내지 약 3.0 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 CaCl2는 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 CaCl2는 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 약 1.0 mM, 약 1.1 mM, 약 1.2 mM, 약 1.3 mM, 약 1.5 mM, 약 1.5 mM, 약 1.6 mM, 약 1.7 mM, 약 1.8 mM, 약 1.9 mM, 약 2.0 mM, 약 2.5 mM, 약 3.0 mM, 약 3.5 mM, 약 4.0 mM, 약 4.5 mM 또는 약 5.0 mM이다.
일부 구현예에서, NaCl 및 CaCl2는 수용성 검정 시료에서 하나 이상의 성분의 구성요소의 분해를 감소시키고/거나, 방지한다. 일부 구현예에서, NaCl 및 CaCl2는 단백질, 예로 치료용 단백질의 응집 및/또는 침전을 감소시키고/거나, 방지한다. 일부 구현예에서, NaCl 및 CaCl2는 수용성 검정 시료, 예로 유기 용매에 있지 않은 조성물에서의 하나 이상의 구성요소의 분해를 감소시키고/거나, 방지한다. 일부 구현예에서, NaCl 및 CaCl2는 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)의 자가-가수분해를 감소시키고/거나, 방지한다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 10 mM 내지 약 500 mM이고, CaCl2는 약 0.1 mM 내지 약 20 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 25 mM 내지 약 400 mM이고, CaCl2는 약 0.2 mM 내지 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 50 mM 내지 약 300 mM이고, CaCl2는 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 75 mM 내지 약 250 mM이고, CaCl2는 약 0.7 mM 내지 약 3.0 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 100 mM 내지 약 200 mM이고, CaCl2는 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 150 mM이고, CaCl2는 약 0.3 mM이다.
본원에 사용된 바, "완충화제"는 용액의 pH를 유지하도록 용액에 사용되는 물질을 말한다. 완충화제는 특정 pH 범위에서 용액을 유지하고 (즉, 주어진 범위에서 완충화 능력), 추가적인 구성요소가 용액에 첨가될 때 pH의 신속한 변화를 방지할 수 있다. 일반적으로, 완충화제는 약한 산 또는 약한 염기일 수 있다. 일부 구현예에서, 완충화제는 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5 또는 약 pH 7.0에서 완충화 능력을 갖는다. 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 완충화 능력을 갖는 완충화제는 예로, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, MES, 비스-트리스, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, 비스-트리스 프로판, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, MOBS, TAPSO 및 트리스를 포함한다. 완충화제의 완충화 능력은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 완충화제는 시료에서 지질용해 활성의 정확한 및/또는 효율적인 검출을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 하나 이상의 구성요소의 분해를 감소시키고/거나, 방지한다. 일부 구현예에서, 완충화제는 단백질, 예로 치료용 단백질의 응집을 감소시키고/거나, 방지한다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료, 예로 조성물의 유기 용매에 있지 않은 조성물에서의 하나 이상의 구성요소의 분해를 감소시키고/거나, 방지한다. 일부 구현예에서, 완충화제는 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)의 자가-가수분해를 감소시키고/거나, 방지한다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 완충액 용액으로서 수용성 검정 시료에 제공된다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 완충화제는 약 5 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 완충화제는 약 10 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 완충화제는 약 20 mM 내지 약 80 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 완충화제는 약 30 mM 내지 약 70 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 완충화제는 약 40 mM 내지 약 60 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 완충화제는 약 10 mM, 약 12 mM, 약 15 mM, 약 18 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 32 mM, 약 35 mM, 약 38 mM, 약 40 mM, 약 42 mM, 약 45 mM, 약 48 mM, 약 50 mM, 약 52 mM, 약 55 mM, 약 58 mM, 약 60 mM, 약 62 mM, 약 65 mM, 약 68 mM, 약 70 mM, 약 72 mM, 약 75 mM, 약 78 mM, 약 80 mM, 약 82 mM, 약 85 mM, 약 88 mM, 약 90 mM, 약 92 mM, 약 95 mM, 약 98 mM 또는 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 비스-트리스이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 트리스이다.
일부 구현예에서, 최종 조성물 (수용성 검정 시료 및 유기 용매)에서 완충화제는 약 5 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물 (수용성 검정 시료 및 유기 용매)에서 완충화제는 약 10 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 완충화제는 약 20 mM 내지 약 80 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 완충화제는 약 30 mM 내지 약 70 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 완충화제는 약 40 mM 내지 약 60 mM이다. 일부 구현예에서, 최종 조성물에서 완충화제는 약 10 mM, 약 12 mM, 약 15 mM, 약 18 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 25 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 32 mM, 약 35 mM, 약 38 mM, 약 40 mM, 약 42 mM, 약 45 mM, 약 48 mM, 약 50 mM, 약 52 mM, 약 55 mM, 약 58 mM, 약 60 mM, 약 62 mM, 약 65 mM, 약 68 mM, 약 70 mM, 약 72 mM, 약 75 mM, 약 78 mM, 약 80 mM, 약 82 mM, 약 85 mM, 약 88 mM, 약 90 mM, 약 92 mM, 약 95 mM, 약 98 mM 또는 약 100 mM이다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 NaCl, CaCl2 및 완충화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 10 mM 내지 약 500 mM이고, CaCl2는 약 0.1 mM 내지 약 20 mM이고, 완충화제는 약 5 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 25 mM 내지 약 400 mM이고, CaCl2는 약 0.2 mM 내지 약 10 mM이고, 완충화제는 약 10 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 50 mM 내지 약 300 mM이고, CaCl2는 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM이고, 완충화제는 약 20 mM 내지 약 80 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 75 mM 내지 약 250 mM이고, CaCl2는 약 0.7 mM 내지 약 3.0 mM이고, 완충화제는 약 30 mM 내지 약 70 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 100 mM 내지 약 200 mM이고, CaCl2는 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM이고, 완충화제는 약 40 mM 내지 약 60 mM이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료에서 NaCl은 약 150 mM이고, CaCl2는 약 0.3 mM이고, 완충화제는 약 45 mM 내지 약 55 mM이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 비스-트리스이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 트리스이다. 당업자라면 염 및 완충액이 단백질 제조물에서 공통적으로 발견되고, 따라서 상기 백분율이 단지 예로서 제공됨을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료의 pH는 4Mu의 형광 세기를 최대화하도록 조절된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료의 pH는 수용성 검정 시료 및/또는 유기 용매의 하나 이상의 구성요소를 안정화하도록 조절된다. 일부 구현예에서, 약산성 내지 중성 pH (예로, 약 5.0 내지 7.0)는 수용성 검정 시료에서 구성요소의 분해를 최소화한다. 일부 구현예에서, 약산성 내지 중성 pH (예로, 약 5.0 내지 7.0)는 치료용 단백질의 응집을 최소화한다. 일부 구현예에서, 약산성 내지 중성 pH (예로, 약 5.0 내지 7.0)는 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)의 자가-가수분해를 최소화한다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 산성 pH이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 pH가 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9 또는 약 7.0이다
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 수용성 검정 시료 및 유기 용매를 포함한다. 본원에 사용된 바, "유기 용매"는 하나 이상의 용질을 용해시키는데 사용될 수 있는 탄소 기반의 물질을 말한다. 유기 용매의 예는, 예로 지방족 탄화수소, 고리상 탄화수소, 방향족 탄화수소 및 할로겐화된 탄화수소를 포함하는 탄화수소; 케톤; 아민; 에스테르; 알코올; 알데히드; 에테르; 니트릴; 및 설폭사이드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 용해시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올, 설폭사이드, 니트릴 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴 (ACN)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 C1 내지 C6 알코올이다. 일부 구현예에서, C1 내지 C6 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올, 펜탄올 또는 헥산올이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 터르-부탄올 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴 및 알코올의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴 및 이소프로판올의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 아세토니트릴 및 이소프로판올은 약 5 : 1, 약 4 : 1, 약 3 : 1, 약 2 : 1, 또는 약 1 : 1의 비율로 혼합된다.
일부 구현예에서, 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)는 유기 용매에 존재한다. 4MuO는 하기 구조를 갖는다.
Figure pct00001
일부 구현예에서, 4MuO는 가수분해되어 4-메틸엄벨리페론 (4Mu) 및 올레이트를 형성한다 (반응식 I).
Figure pct00002
일부 구현예에서, 4MuO는 형광성이 아니다. 일부 구현예에서, 4Mu는 형광성이다. 일부 구현예에서, 4Mu의 형광은 리파제에 의한 4MuO의 가수분해를 검출하는데 사용되고, 따라서 지질용해 활성의 지시인자이다. 당업자라면 (4Mu 형광에 의해 측정되는 바) 4MuO의 가수분해가 지질용해 활성이 단백질 제조물에서 발생하였고, 즉 계면활성제가 가수분해되었으며, 가능하게 단백질 제조물을 불안정하게 할 수 있음을 나타낼 것으로 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 4Mu의 형광은 약 330 nm의 여기 파장 및 약 495 nm의 방출 파장에서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 4Mu의 형광은 약 327 nm의 여기 파장 및 약 449 nm의 방출 파장에서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 4Mu의 형광은 약 300 nm 내지 약 350 nm의 여기 파장 및 약 420 nm 내지 약 500 nm의 방출 파장에서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 4Mu의 형광 측정 매개변수 (예로, 여기 및 방출 파장)는 pH가 변경될 때 달라진다. 일부 구현예에서, 4Mu의 형광 측정 매개변수는 염 및/또는 완충화제 농도가 변경될 때 달라진다. 일부 구현예에서, 4MuO는 리파제의 기질이다. 일부 구현예에서, 4MuO는 본원에 기술된 단백질 제조물에서 리파제에 의해 가수분해된다. 일부 구현예에서, 4Mu 형성은 형광에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 단백질 제조물을 포함하는 검정 시료의 지질분해 활성은 4Mu의 형광에 의해 측정된다.
다양한 농도의 4MuO는 본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 일반적으로, 4MuO의 양은 자가-가수분해의 효과를 최소화하도록 최소화되어야 한다. 일부 구현예에서, 유기 용매에서 4MuO는 약 1 μM 내지 약 1 mM, 약 10 μM 내지 약 500 μM, 약 20 μM 내지 약 200 μM, 약 50 μM 내지 약 150 μM, 약 75 μM 내지 약 125 μM 또는 약 100 μM이다.
일부 구현예에서, 조성물은 본원에 기술된 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료; 및 본원에 기술된 4MuO를 포함하는 유기 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 동등한 부피의 수용성 검정 시료 및 유기 용매를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물, 구체적으로 치료용 단백질에 미치는 유기 용매의 잠재적인 역효과를 최소화하기 위하여 조성물에서 유기 용매의 양은 조성물에서 수용성 검정 완충액의 양보다 적다. 예를 들면, 유기 용매의 양이 너무 많은 경우, 치료용 단백질은 응집될 수 있다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 조성물의 부피로 약 70% 내지 약 99.9%이고, 유기 용매는 조성물의 부피로 약 0.1% 내지 약 30%이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 조성물의 부피로 약 70% 내지 약 99.5%이고, 유기 용매는 조성물의 부피로 약 0.5% 내지 약 30%이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 조성물의 부피로 약 70% 내지 약 99%이고, 유기 용매는 조성물의 부피로 약 1% 내지 약 30%이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 조성물의 부피로 약 75% 내지 약 99%이고, 유기 용매는 조성물의 부피로 약 1% 내지 약 25%이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 조성물의 부피로 약 80% 내지 약 98%이고, 유기 용매는 조성물의 부피로 약 2% 내지 약 20%이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 조성물의 부피로 약 90% 내지 약 98%이고, 유기 용매는 조성물의 부피로 약 2% 내지 약 10%이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 조성물의 부피로 약 95% 내지 약 98%이고, 유기 용매는 조성물의 부피로 약 2% 내지 약 5%이다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 조성물의 부피로 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8% 또는 약 99.9%이다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 조성물의 부피로 약 70% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 85% 또는 약 80% 내지 약 85%이고, 수용성 검정 시료의 비-단백질 제조물 구성요소, 예로 완충화제 및/또는 염은 조성물의 부피로 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 25% 또는 약 15% 내지 약 20%이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 조성물의 부피로 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%이다. 당업자라면 염 및 완충액이 단백질 제조물에서 공통적으로 발견되고, 따라서 상기 백분율이 단지 예로서 사용됨을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 조성물은 리파제 저해제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 지질용해 활성을 리파제를 불활성화함으로써 감소시키거나, 제거한다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 지질용해 활성의 검출을 위한 음성 대조군을 제공하도록 조성물에 포함되고, 즉 리파제 저해제를 포함하는 조성물은 지질용해 활성을 갖을 것으로 예상되지 않는다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 지질용해 활성을 예로 4Mu의 형광을 측정함으로써 검출한 이후에 조성물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 수용성 검정 시료에 존재한다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 물 가용성이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 유기 용매에 존재한다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 물 가용성이 아니다.
일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 지질용해 활성을 감소시키거나 제거하기에 충분한 농도이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 지질용해 활성을 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 약 100%로 감소시키기에 충분한 농도이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 1 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 2 μM 내지 약 40 μM이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 3 μM 내지 약 35 μM이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 4 μM 내지 약 30 μM이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 5 μM 내지 약 25 μM이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 1 μM, 약 2 μM, 약 3 μM, 약 4 μM, 약 5 μM, 약 6 μM, 약 7 μM, 약 8 μM, 약 9 μM, 약 10 μM, 약 11 μM, 약 12 μM, 약 13 μM, 약 14 μM, 약 15 μM, 약 16 μM, 약 17 μM, 약 18 μM, 약 19 μM, 약 20 μM, 약 21 μM, 약 22 μM, 약 23 μM, 약 24 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 35 μM, 약 40 μM, 약 45 μM 또는 약 50 μM이다.
일부 구현예에서, 리파제 저해제는 (S)-2-포르밀아미노-4-메틸-펜탄산 (S)-1[[(2S,3S)-3-헥실-4-옥소-2-옥세타닐]메틸]-도데실 에스테르 (오를리스타트)이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 알칼로이드, 예로 카페인, 테오필린 및 테오브로민이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 예로 푸콕산틴과 같은 카로디노이드이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 글리코시드, 예로 악테오시드, 캠프페롤-3-O-루티노시드, 루틴, 캠프페롤, 퀘르세틴 및 루테올린이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 폴리페놀, 예로 갈란진, 헤스페리딘, 리코하콘 A, CT-Ⅱ, 7-플로로에콜 및 이소리퀴리티제닌이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 사포닌, 예로 세실로시드 및 카이아노시드이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 테르펜, 예로 크로신 및 크로세틴이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 세균으로부터 유래하고, 예로 립스타틴, 발리락톤, 퍼사이퀴닌, 판클리신, 에베락톤, 비브라락톤 및 에스테라스틴이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 합성 리파제 저해제, 예로 천연 지방의 유사체이다. 리파제 저해제는 Lunagariya et al., EXCLI. J. 13: 897-921 (2014)에 리뷰되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 약 90 부피% 내지 약 99.9 부피%의 수용성 검정 시료로서, (i) 단백질 및 지질을 포함하는 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; (iii) 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM 염화칼슘; 및 (iv) 약 100 mM 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 수용성 검정 시료; 및 (b) 약 10 부피% 내지 약 0.1 부피%의 유기 용매로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올, 디메틸 설포옥사이드 (DMSO), 아세토니트릴 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는, 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0인, 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 약 90 부피% 내지 약 99.9 부피%의 수용성 검정 시료로서, (i) 단백질 및 폴리소르베이트 계면활성제를 포함하는 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; (iii) 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM 염화칼슘; 및 (iv) 약 100 mM 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 수용성 검정 시료; 및 (b) 약 10 부피% 내지 약 0.1 부피%의 유기 용매로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올, 디메틸 설포옥사이드 (DMSO), 아세토니트릴 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는, 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0인, 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 약 90 부피% 내지 약 99.9 부피%의 수용성 검정 시료로서, (i) 단백질 및 지질을 포함하는 부분적으로 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; (iii) 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM 염화칼슘; 및 (iv) 약 100 mM 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 수용성 검정 시료; 및 (b) 약 10 부피% 내지 약 0.1 부피%의 유기 용매로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올, 디메틸 설포옥사이드 (DMSO), 아세토니트릴 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는, 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0인, 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 약 90 부피% 내지 약 99.9 부피%의 수용성 검정 시료로서, (i) 단백질 및 지질을 포함하는 세포 배양 상청액; (ii) 완충화제; (iii) 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM 염화칼슘; 및 (iv) 약 100 mM 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 수용성 검정 시료; 및 (b) 약 10 부피% 내지 약 0.1 부피%의 유기 용매로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올, 디메틸 설포옥사이드 (DMSO), 아세토니트릴 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는, 유기 용매를 포함하는 조성물로서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0인, 조성물을 제공한다.
추가적인 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 단백질 제조물에서 지질용해 활성을 검출하는 방법에 사용되는데 적합한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 수용성 검정 시료에서 지질용해 활성을 검출하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 수용성 검정 시료에서 지질용해 활성을 검출하는 방법으로서, (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하는 단계; 및 (b) 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 본원에 기술된 수용성 검정 시료이다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 본원에 기술된 바와 같은 완충화제, 염 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 또한, 완충화제 및 염의 예 및 본 발명의 방법에 적합한 이들의 농도는 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 염은 염화나트륨 (NaCl), 염화칼슘 (CaCl2) 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 염은 염화나트륨 및 염화칼슘이다. 일부 구현예에서, 염화나트륨은 수용성 검정 시료에서 약 50 mM 내지 약 400 mM이다. 일부 구현예에서, 염화나트륨은 수용성 검정 시료에서 약 100 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 염화나트륨은 수용성 검정 시료에서 약 0.2 mM 내지 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 염화나트륨은 수용성 검정 시료에서 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM이다.
일부 구현예에서, 완충화제는 약 pH 6.0에서 완충화 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 완충화제는 트리스이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 비스-트리스이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 약 2 mM 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 약 10 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 약 40 mM 내지 약 60 mM이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 수용성 검정 시료에서 약 45 mM 내지 약 55 mM이다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 본원에 기술된 단백질 제조물이다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 세포 배양 상청액이다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 부분적으로 정제된 단백질 제조물이다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 정제된 단백질 제조물이다. 다양한 정도로 정제된 단백질 제조물, 예로 세포 배양 상청액, 부분적으로 정제된 단백질 제조물 및 정제된 단백질 제조물은 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 단백질 제조물은 치료용 단백질, 예로 본원에 기술된 치료용 단백질을 포함한다. 본 발명의 방법은 유리하게 단백질 제조물에서 이의 정제 공정 전체를 통해 지질용해 활성의 단순하고 효율적인 결정을 허용한다. 예를 들면, 세포 배양 상청액 (또는 후속의 정제 공정 산물)의 지질용해 활성은 후속의 정제 단계 동안 리파제를 제거하는 것이 필요한지 여부를 결정하도록 본 발명의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 유리하게, 본 발명의 방법은 단백질 제조물에서 지질용해 활성이 적절하게 제거되는지 여부를 결정하기 위하여 정제 공정 전체를 통해 산물에 대해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 추가적인 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 숙주 세포 단백질은 리파제를 포함한다. 리파제는 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 단백질 제조물은 계면활성제, 예로 본원에 기술된 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 구현예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 본원에 기술된 유기 용매이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올, 설폭사이드, 니트릴 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 이세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 C1 내지 C6 알코올이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 터르-부탄올 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴 및 이소프로판올의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 아세토니트릴 및 이소프로판올은 약 3 : 1의 비율로 혼합된다.
일부 구현예에서, 유기 용매는 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함한다. 4MuO의 구조는 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 4MuO는 예로 반응식 I에 기술된 바와 같이 가수분해되어 올레산 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)을 형성한다. 4Mu의 구조는 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 4Mu는 형광성이다. 일부 구현예에서, 4Mu 형광은 약 330 nm 여기 및 약 495 nm 방출에서 측정된다.
일부 구현예에서, 방법은 최대 24시간 동안 형광을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 형광은 약 24시간 내지 약 400시간 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 형광은 약 24시간 이상 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 형광은 약 100시간 이상 동안 측정된다. 일부 구현예에서, 형광은 약 300시간 이상 동안 측정된다. 형광 측정은 반드시 연속적인 측정일 필요가 없으며, 형광은 선결정된 시점에 측정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 형광은 약 12시간 내지 약 400시간 사이의 선택된 시점에 측정된다. 일부 구현예에서, 형광은 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간, 약 144시간, 약 168시간, 약 192시간, 약 216시간, 약 240시간, 약 264시간, 약 288시간, 약 312시간, 약 336시간, 약 360시간, 약 384시간 또는 약 400시간 중 일정 시점에 측정된다. 형광이 측정되는 기간은 단백질 제조물에서 리파제 활성의 수준과 관련하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 낮은 수준의 지질용해 활성은 4MuO의 더 느린 가수분해로 인해 더 오랜 검출 기간을 요구할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료용 단백질을 포함하는 단백질 제조물은 정제된 다음 일정 기간 동안 (예로, 4시간 미만, 8시간 미만, 1일 미만, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 1주, 1주 이상, 약 2주, 2주 이상, 약 3주, 3주 이상, 약 1개월, 1개월 이상, 약 2개월, 2개월 이상, 약 3개월, 3개월 이상) 보관된다. 다음으로 단백질 제조물은 지질용해 활성을 검출하는 본 발명의 방법에 착수된다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 유기 용매는 약 70 : 30 내지 약 99 : 1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 유기 용매는 약 75 : 25 내지 약 99 : 1의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 유기 용매는 약 80 : 20 내지 약 98 : 2의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 유기 용매는 약 85 : 15 내지 약 98 : 2의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 유기 용매는 약 90 : 10 내지 약 98 : 2의 비율로 조합된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 유기 용매는 약 95 : 5 내지 약 98 : 2의 비율로 조합된다.
일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 (a) 수용성 검정 시료 및 유기 용매를 포함하는 수용성 검정 시료를 조합하는 단계 이전에 약 10분 내지 약 1시간 동안 리파제 저해제와 함께 배양된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료는 단계 (a) 이전에 약 15분 내지 약 45분 동안, 약 20분 내지 약 40분 동안 또는 약 30분 동안 리파제 저해제와 함께 배양된다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제와 수용성 검정 시료의 배양은 지질용해 활성을 감소시키거나, 제거한다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제와 수용성 검정 시료의 배양은 지질용해 활성의 검출을 위한 음성 대조군을 제공한다. 수용성 검정 시료가 단계 (a) 이전에 리파제 저해제와 함께 배양되는 구현예에서, 측정된 형광은 낮을 것으로 예상되고, 즉 지질용해 활성이 낮음 또는 결여를 나타낸다. 리파제 저해제는 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 (S)-2-포르밀아미노-4-메틸-펜탄산 (S)-1[[(2S,3S)-3-헥실-4-옥소-2-옥세타닐]메틸]-도데실 에스테르 (오를리스타트)이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 1 μM 내지 약 50 μM이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 조성물에서 약 5 μM 내지 약 25 μM이다.
일부 구현예에서, 대조군 시료는 지질용해 활성을 위한 수용성 검정 시료와 비교하여 측정된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 수용성 검정 시료에서 지질용해 활성을 검출하는 방법으로서, (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하여 검정 조성물을 형성하는 단계; 및 (b) 단백질 제조물 및 리파제 저해제를 포함하는 대조군 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하여 대조군 조성물을 형성하는 단계; 및 (c) 검정 조성물 및 대조군 조성물에서 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 단백질 제조물 및 단계 (b)의 단백질 제조물은 동일한 단백질 제조물로부터 제공된다. 예를 들면, 세포 배양물로부터의 단백질 제조물은 2개의 분량이 수집될 수 있는 배양물로부터 획득된다. 하나의 분량은 수용성 검정 시료의 단백질 제조물이 될 수 있고, 나머지 분량은 대조군 시료의 단백질 제조물이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 단백질 제조물 및 단계 (b)의 단백질 제조물은 실질적으로 동일한 구성요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)의 단백질 제조물 및 단계 (b)의 단백질 제조물은 동일한 수준의 지질용해 활성을 갖을 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, 수용성 검정 시료 및 대조군 시료는 대조군 시료에서의 리파제 저해제를 제외하고는 실질적으로 동일한 구성요소를 갖는다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제를 포함하는 대조군 시료는 음성 대조군 시료이고, 즉 형광이 검출될 것으로 전혀 예상되지 않는다. 일부 구현예에서, 방법은 양성 대조군 시료, 즉 형광이 예상되는 시료를 추가로 사용한다. 일부 구현예에서, 양성 대조군 시료는 알려진 정량의 4Mu를 포함한다. 일부 구현예에서, 양성 대조군 시료는 알려진 정량의 4Mu 및 알려진 정량의 활성이 있는 리파제를 포함한다.
본원에 논의된 바, 지질용해 활성을 갖는 리파제는 단백질 제조물의 구성요소를 간섭한다. 일부 구현예에서, 지질용해 활성을 갖는 리파제는 단백질 제조물에 존재하는 지방산 및/또는 에스테르를 가수분해한다. 일부 구현예에서, 지질용해 활성을 갖는 리파제는 단백질 제조물에 존재하는 계면활성제를 가수분해한다. 일부 구현예에서, 계면활성제의 가수분해는 단백질 제조물의 안정성을 감소시킨다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 지질용해 활성의 양을 측정하여, 단백질 제조물에서 발생하였던 가수분해의 양이 다음으로 지질용해 활성의 측정된 양을 기준으로 하여 결정되고, 이로써 단백질 제조물의 안정성을 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 제조물의 안정성을 결정하는 방법으로서, (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하는 단계; (b) 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계; 및 (c) 측정된 형광을 기준으로 하여 단백질 제조물의 안정성을 결정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 예를 들면, 대조준과 비교하여 증가된 형광은 리파제의 존재를 나타내고, 부형제 예로 폴리소르베이트와 같은 계면활성제가 가수분해되어, 단백질 제조물에서 단백질을 불안정화할 수 있는 비-극성, 결과적인 불용성, 긴 사슬 지방산을 형성함을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 제공하는데 적합한 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 유기 용매; (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO); 및 (c) 리파제 저해제를 2개 이상의 용기에 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
임의의 적합한 용기는 본원에 기술된 키트에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 바이알이다. 일부 구현예에서, 용기는 병이다. 일부 구현예에서, 각각의 용기는 다중-구획 용기의 구획이다. 일부 구현예에서, 유기 용매 및 리파제 저해제는 제 1 용기에 있고, 4MuO는 제 2 용기에 있다. 일부 구현예에서, 유기 용매 및 4MuO는 제 1 용기에 있고, 리파제 저해제는 제 2 용기에 있다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제 및 4MuO는 제 1 용기에 있고, 유기 용매는 제 2 용기에 있다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제 및 유기 용매는 제 1 용기에 있고, 4MuO 및 유기 용매는 제 2 용기에 있다. 일부 구현예에서, 4MuO는 고체, 예로 분말로서 제공된다. 일부 구현예에서, 4MuO는 용액, 예로 유기 용매에 제공된다. 일부 구현예에서, 라파제 저해제는 고체, 예로 동결건조된 분말과 같은 분말로서 제공된다. 일부 구현예에서, 라파제 저해제는 용액, 예로 유기 용매에 제공된다. 임의의 상기 구현예에서, (a) 유기 용매; (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO); 및/또는 (c) 리파제 저해제는 단백질 제조물의 선결정된 특정한 양을 수용하도록 이들 각각의 용기에 포함될 수 있고, 여기서 각 구성요소의 양은 본원에 기술된 지질용해 활성을 결정하는 방법을 실행하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 방법과 같이 지질용해 활성을 결정하는 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 완충화제, 염 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 적합한 완충제 및 염은 본원에 기술된다. 일부 구현예에서, 키트의 사용자는 키트와 함께 사용되는 단백질 제조물을 제공한다. 일부 구현예에서, 사용자의 단백질 제조물은 키트와 함께 사용되기에 적합하지 않은 완충액, 예로 4MuO의 자가-가수분해 및/또는 리파제 저해제의 분해를 촉진하는 완충액에 있다. 일부 구현예에서, 키트는 완충액 교환 컬럼을 제공한다. 일부 구현예에서, 완충액 교환 컬럼은 사용자의 단백질 제조물의 완충액을 본원에 제공된 키트와 함께 사용되기에 적합한 완충액으로 교환시킨다. 완충액 교환 컬럼의 예는 써모피셔사로부터의 ZEBA 컬럼, GE 헬스케어사로부터의 PD-10, 세파덱스, HIPREP 및 HITRAP 컬럼, 사토리우스사로부터의 비바플로우 및 비바스핀, 바이오래드사로부터의 바이오스핀 및 ECONO 컬럼, 그리고 G-바이오사이언사로터의 스핀아웃을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 기술된 키트의 컬럼은 완충액 시스템을 교환하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 컬럼은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 컬럼은 단백질 제조물의 완충액을 본원에 기술된 바와 같이 지질용해 활성을 결정하는 방법을 실행하는데 더욱 적합한 완충액으로 교환하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매; (b) 단백질 제조물의 완충액을 교환하는데 적합한 컬럼; 및 (c) 리파제 저해제를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 적합한 유기 용매는 본원에 기술된 용기 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올, 설폭사이드, 니트릴 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 이세토니트릴이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 알코올을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 C1 내지 C6 알코올이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 아세토니트릴 및 이소프로필 알코올의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 키트에 적합한 리파제 제해제는 본원에 기술된 리파제 저해제를 포함한다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 (S)-2-포르밀아미노-4-메틸-펜탄산 (S)-1[[(2S,3S)-3-헥실-4-옥소-2-옥세타닐]메틸]-도데실 에스테르 (오를리스타트)이다. 일부 구현예에서, 리파제 저해제는 본원에 기술된 바와 같이 지질용해 활성을 결정하는 방법을 시행할 때 대조군으로서 사용된다.
본 발명의 키트에 적합한 염은 본원에 기술된 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 염화나트륨, 염화칼슘 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 염은 염화나트륨 및 염화칼슘이다.
본 발명의 키트에 적합한 완충화제는 본원에 기술된 완충화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충화제는 트리스이다. 일부 구현예에서, 완충화제는 비스-트리스이다.
일부 구현예에서, 키트는 지질용해 활성을 결정하는 검정법을 수행하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 검정법은 본원에 기술된 방법을 포함한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 특허, 특허출원, 논문, 교과서 등, 및 본원에 인용된 참고문헌을 포함하여, 이들이 존재하지 않았던 정도로 이들의 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다.
실시예
본원에 기술된 실험을 위한 화학물질 및 시약은 다음과 같다.
2-프로판올 (IPA, 99.9%), 아세토니트릴 (ACN, HPLC 플러스, ≥ 99.9%), 염화칼슘 (≥ 97%), 트리톤 X-100 (연구실 등급), 소듐 포스페이트 이염기 일수화물 (ACS 시약, ≥ 95%), 디메틸 설폭사이드 (DMSO, 시약 플러스, ≥ 99.5%)는 시그마 알드리치사 (현 마크 KGaA)로부터 구입하였다. 4-메틸엄벨리페론 (4Mu, ≥ 98%) 및 N-페닐-1-나프틸아민 (NPN, 시약 등급, 98%)은 알드리치사로부터 구입하였다. 염화나트륨 (생체시약, ≥ 99%), TRIZMA® 염산화물 (시약 등급, 99.0%), TRIZMA® 염기 (일차 표준 및 완충액, ≥ 99.9%), 돼지 췌장으로부터의 리파제 (PPL, 제 Ⅱ형, 100-500 U/mg), 비스-트리스 염산화물 (≥ 99.0% (적정)), 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO, 형광에 적합함, ≥ 95% (HPCE)) 및 콜리퍼® P 188 (세포 배양에 적합함)은 시그마사로부터 구입하였다. 아세토니트릴 (LC-MS 등급)은 써모피셔사로부터 구입하였다. 에탄올 (EtOH, 액체 크로마토그래피용 등급) 및 염산 25% v/v는 머크사로부터 구입하였다. 슈크로스 (USP/NF, EP, JP, 고순도)는 판스티엘사로부터 구입하였다. 수산화나트륨 1 M 용액은 허니웰사 플루카TM으로부터 획득하였다. 염화나트륨 (USP, 다회용), L-히스티딘 (USP, 다회용), L-히스티딘 일염산화물 (FCC, 다회용), PS20 (NF) 및 PS80 (NF)은 J. T. 베이커로부터 획득하였다. 하기 "물"로 명명된 정제수는 물 정제 시스템 (반스테드TM 젠퓨어TM 프로, 써모피셔사)을 사용하여 제조하였다. pH는 pH 측정기 (780 pH 미터, 메트롬사) 및 Pt pH 전극 (유니트로드 Pt1000, 메트롬사)를 사용하여 측정하였다. 비-치료용 단일클론 항체 (mAb 1)를 발현하는 특허받은 CHO 세포주로부터 생산되는, HCP의 일부로서 리파제 혼합물을 포함하는 세포 배양물 수확 유체 (CCHF), 뿐만 아니라 mAb 1은 영국 슬로시 소재의 론자 바이오로직스사로부터 구입하였다.
실시예 1A. 리파제 검정법 개발 I: pH
리파제 검정법은 쿠리하라 등 (Kurihara et al., Biol. Pharm. Bull. 26: 383-385 (2003)에 기술된 방법을 기반으로 하여, 리파제 효소의 기질로서 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 사용하여 개발하였다.
돼지 췌장 리파제 (PPL)를 검정법의 개발에 사용하였다. 본 실험에서는, 500 nM PPL 및 4MuO을 4가지 상이한 완충액 시스템, (a) 10.4 mM 트리스 pH 8.1, (b) 10.4 mM 비스-트리스 pH 6, (c) 41.6 mM 비스-트리스 pH 6, 및 (d) 104 mM 비스-트리스 pH 6 중 하나에서 22시간 동안 배양하고, 4 MuO 형광의 소광 및 자가-가수분해에 대해 테스트하였다.
도 1a, 도 1b 및 표 1에서 결과는 4MuO의 자가-가수분해가 pH 6에서 도 8과 비교하여 감소되는 것을 나타낸다. 도 1c는 pH 8에서 자가-가수분해가 pH 6의 결과를 거의 배가하는 것을 나타낸다. 리파제는 pH 6과 비교하여 pH 8에서 약간 더 큰 (< 20%) 활성을 갖는다. 완충액 농도는 자가-가수분해 및 리파제 활성에 강한 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 지질용해 활성은 41.6 mM 비스-트리스 완충액에서 가장 높은 것으로 보인다. 형광의 소광은 104 mM 비스-트리스 완충액에서 관찰하였다.
Figure pct00003
4MuO의 자가-가수분해는 추가로 조사하였다. 4Mu의 pKa는 대략 7.7이다. 도 1d는 4Mu가 측정되는 pH 범위를 나타낸다 (자이 등으로부터 재생된 그래프 (Zhi et al., J. Spectrosc. 1 (2013) doi:10.1155/2013/147128)). 도 1e는 다양한 pH 범위에서 4가지 형태의 4Mu를 보여준다 (자이 등으로부터 재생됨 (Zhi et al., 2013)). 형태 Ⅱ가 흔하고, λex 320 nm 및 λem 445 nm에서 여기 및 방출을 나타낸다.
실시예 1B. 리파제 검정법 개발 I: pH.
추가의 연구는 다양한 완충화제 및 리파제 검정 완충액의 pH를 평가하도록 수행하였다. 다음의 부피비, 시료 (75%), 고농도 기질 완충액 (HCMB) (20%), 유기 용매 (5%)를 적용하였다 (모두 v/v). 혼합물은 약 24시간 내지 약 300시간의 시간범위로 배양하였다. 검정 구성요소를 96-웰 플레이트 내에 옮기고, 형광 세기에 대해 분석하였다. 4Mu 산정 곡선의 경우, 참조 표준 4Mu는 유기 용매 중 0 μM, 0.2 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM 및 100 μM의 농도로 제조하고, 나머지 검정 구성요소에 대해 0 μM, 0.01 μM, 0.05 μM, 0.1 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2.5 μM 및 5 μM의 최종 농도까지 5% (v/v)에서 급상승되었다. 산정 곡선의 경사도가 낮은 산정 범위 (0.01 μM 내지 0.5 μM)부터 높은 산정 범위 (최대 5 μM)까지 이동하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 최대 5 μM의 농도 범위에서 4Mu의 정량적 결과를 0.01 μM 내지 0.5 μM 범위의 감소된 산정 곡선으로 계산하였다. 4Mu 산정 곡선은 도 19a 및 도 19b에 나타낸다.
본 연구에서, "시료"는 20 mM L-히스티딘, pH 6 (pH 조절이 25% (w/v) HCl 또는 1 M NaOH의 첨가에 의해 수행됨), 250 mM 슈크로스, 0.5% 세포 배양물 수확 유체 (CCHF) 또는 대략 0.0025 mg/mL 돼지 췌장 리파제 (PPL)를 포함하는 위약 제형물 완충액이었다. HCMB는 트리스 (208 mM) pH 7 및 8 또는 비스-트리스 (208 mM) pH 6 (pH 조절이 25% (w/v) HCl 또는 1 M NaOH의 첨가에 의해 수행됨), NaCl (200 mM, 600 mM 또는 1800 mM), CaCl2 (0.52 mM, 5.2 mM 또는 52 mM)를 포함하였다. 유기 용매는 100 μM의 4MuO를 포함하는 메탄올 (MeOH), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 또는 이소로판올 (IPA) 중 하나이었으며, 5% (v/v) 유기 용매 / 기질을 첨가하였다. 검정 구성요소는 96-웰 플레이트 내에 옮기고, 형광 세기에 대해 분석하였다.
형광 분석을 위해, 시료를 96-웰 마이크로플레이트 (써모 사이언티픽TM 눈크TM F96 마이크로웰TM 검정색 폴리스티렌 플레이트) 내에 옮겼다. 형광 측정은 분자 장치 스펙트라맥스 iD3 마이크로플레이트 판독기 및 SMP 7.1 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 최대 여기 파장 (λex) 및 방출 파장 (λem)은 4Mu의 중간 농도에 대해 소프트맥스 프로 7.1 (SMP 7.1) 파장 최적화 모드를 사용한 최적화 이후에 각각 330 nm 및 495 nm이었다. 형광 신호는 대략 24시간 내지 대략 300시간의 배양 기간에서 판독하였고, 각 판독에 대해 신선한 96-웰 마이크로플레이트를 200 μL의 액체 (시료, HCMB 및 유기 용매를 포함함)를 각각의 웰 내에 옮겨서 준비하였다. 형광 측정을 상온에서 수행하였다.
2가지 상이한 완충액 (트리스 또는 비스-트리스) pH 6, pH 7 또는 pH 8의 평가에 대한 결과는 도 11에 나타낸다. 4MuO의 4Mu로 전환은 4Mu의 형광 세기를 모니터링하여 측정하였다. PPL 또는 CCHF 둘 중 하나를 포함하는 시료 및 4MuO 자가-가수분해를 평가하였다. pH 변화의 가장 중요한 영향은 자가-가수분해 (AH)의 경우에 관찰되었으며, 이는 pH가 8부터 6으로 하강할 때 팩터 ~ 5로 감소하였다. 상이한 pH의 시료에서의 4Mu 농도를 동일한 pH의 참조 시료에서의 4Mu의 산정 곡선과 대비하여 측정하였으며, 즉 관찰된 경향성은 상이한 pH에서 4Mu 형광의 상이한 반응 때문이 아니고, 상이한 반응 속도 때문이다. PPL 활성은 pH가 8부터 6으로 감소될 때 거의 팩터 2로 증가한 반면, CCHF 지질용해 활성은 영향받지 않았다. PPL의 pH 의존성은 리 등 (Li et al., "Adsorption and catalytic activity of Porcine pancreatic lipase on rod-like SBA-15 mesoporous material," Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 2009, 341: 79-85)에서 이전에 보고되었다. 그러나, 이러한 pH 의존성은 DS 풀에 포함된 HCP에 존재할 수 있는 임의의 다른 유형의 리파제의 경우 일치하지 않을 수 있다. 또한, 폴리소르베이트 분해가 관찰되고 보고되는 많은 치료용 단백질 제형물이 전형적으로 약산성 pH에서 유지되고, 따라서 ~ pH 6의 검정 pH 적용이 리파제 매개된 가수분해성 폴리소르베이트 분해를 유발하는 원인 (예로, 리파제)을 극복하도록 가정하는 관점에서, pH 6을 가장 적합한 것으로 고려하였다. 따라서, 200 mM 농도의 비스-트리스가 HCMB에 첨가하여 pH 6에서 40 mM의 최종 검정 농도를 수득하도록 선택되었다.
실시예 2A. 리파제 검정법 개발 Ⅱ: CaCl 2
리파제 검정 완충액에서 염화칼슘 농도를 조사하였다. 500 nM PPL 및 4MuO를 사용한 리파제 검정법은 3가지 상이한 CaCl2 농도, (a) 0.104 mM CaCl2; (b) 1.04 mM CaCl2; 및 (c) 10.4 mM CaCl2에서 4MuO 형광 소광 및 자가-가수분해를 조사하도록 수행하였다.
도 2a 내지 도 2c 및 표 2에서 결과는 4MuO 자가-가수분해가 발생하지 않고, 염화물 음이온에 의한 형광 소광이 관찰되지 않음을 나타낸다. 리파제 활성은 1.3 mM CaCl2에서 가장 높았다.
Figure pct00004
실시예 2B. 리파제 검정법 개발 Ⅱ: CaCl 2
리파제 검정 완충액에서 염화칼슘 농도를 추가의 실험에서 조사하였다. 시료, HCBM 조성물 및 실험적 절차는 실시예 1B에 기술되어 있으며, 실시예 1B에 설명된 바와 같이 CaCl2가 HCMB 중 0.52 mM, 5.2 mM 또는 52 mM로 포함되었다.
PPL 또는 CCHF 둘 중 하나를 포함한 시료를 사용한 HCMB 중 상이한 CaCl2 농도의 평가에 대한 결과는 도 12에 나타낸다. CaCl2의 가장 높은 농도에서 PPL 활성이 약간 감소하는 것으로 관찰되었다. 다양한 약물 원료/약물 산물 기질을 위한 유사한 검정 조건을 확립하는 HCMB의 요구사항을 고려하여, 5 mM CaCl2가 HCMB에 첨가되어 1 mM CaCl2의 최종 검정 농도를 수득하도록 선택되었다.
실시예 3A. 리파제 검정법 개발 Ⅲ: NaCl
리파제 검정 완충액에서 염화나트륨 농도를 조사하였다. 500 nM PPL 및 4MuO를 사용한 리파제 검정법은 3가지 상이한 NaCl 농도, (a) 40 mM NaCl; (b) 120 mM NaCl; 및 (c) 360 mM NaCl에서 4MuO 형광 소광 및 자가-가수분해를 조사하도록 수행하였다.
도 3a 내지 도 3c 및 표 3에서 결과는 4MuO 자가-가수분해가 발생하지 않고, 염화물 음이온에 의한 형광 소광이 관찰되지 않음을 나타낸다. 리파제 활성은 120 mM NaCl에서 가장 높았다.
Figure pct00005
실시예 3B. 리파제 검정법 개발 Ⅲ: NaCl
리파제 검정 완충액에서 염화나트륨 농도를 추가의 실험에서 조사하였다. 시료, HCBM 조성물 및 실험적 절차는 실시예 1B에 기술되어 있다. 실시예 1B에 설명된 바와 같이, NaCl은 HCMB에서 200 mM, 600 mM 또는 1,800 mM로 포함되었다.
PPL 또는 CCHF 둘 중 하나를 포함한 시료를 사용한 HCMB 중 상이한 NaCl 농도의 평가에 대한 결과는 도 13에 나타낸다. NaCl의 가장 높은 농도에서 PPL 활성이 약간 감소하는 것으로 관찰되었다. 다양한 약물 원료/약물 산물 기질을 위한 유사한 검정 조건을 확립하는 HCMB의 요구사항을 고려하여, 600 mM NaCl이 HCMB에 첨가되어 120 mM NaCl의 최종 검정 농도를 수득하도록 선택되었다.
실시예 4A. 리파제 검정법 개발 Ⅳ: 유기 용매
리파제 검정 완충액에서 유기 용매를 조사하였다. 500 nM PPL 및 4MuO를 사용한 리파제 검정법은 3가지 상이한 유기 용매, (a) DMSO; (b) 이소프로판올 (IPA); 및 (c) 메탄올 (MeOH)을 사용하여 4MuO 형광 소광 및 자가-가수분해를 조사하도록 수행하였다.
도 4a 내지 도 4c 및 표 4에서 결과는 3가지 유기 용매 중 이소프로판을 사용하여 가장 낮은 자가-가수분해이지만 약간의 형광 소광이 관찰되는 것을 나타낸다. 그러나, 메탄올이 비슷한 결과를 보인다. 또한, 글로가우어 등 (Glogauer et al., Microb. Cell Fact. 10: 54 (2011))은 메탄올이 활성 증진 능력을 갖을 수 있음을 지적하고 있다.
Figure pct00006
실시예 4B. 리파제 검정법 개발 Ⅳ: 유기 용매
리파제 검정 완충액에서 유기 용매를 추가의 실험에서 조사하였다. 시료, HCBM 조성물 및 실험적 절차는 실시예 1B에 기술되어 있다. 실시예 1B에 설명된 바와 같이, 100 μM 4MuO를 포함하는 유기 용매, 메탄올 (MeOH), 디메틸설폭사이드 (DMSO) 또는 이소프로판올 (IPA)이 실시예 1B에 기술된 바와 같이 검정 반응에 포함되었다.
PPL 또는 CCHF 둘 중 하나를 포함한 시료를 사용한 유기 용매의 평가에 대한 결과는 도 14에 나타낸다. 글로가우어 등이 보고한 이전의 결과와는 달리 (Glogauer et al., "Identification and characterization of a new true lipase isolated through metagenomic approach," Microb. Cell Fact. 2011; 10: 54), 이는 대장균으로부터 메타게놈 접근법에 의해 단리된 LipC12 리파제에 미치는 상이한 용매의 강력한 영향을 보고하였다. 글로가우어 등에서, MeOH 및, 낮은 정도로 IPA는 활성화 효과를 나타내었고, LipC12 리파제 활성을 팩터 > 10으로 증가시켰다. 그러나, 연구된 세균 효소는 실시예 1B의 결과와 비교하여, 매우 상이한 성질을, 예로 활성에 대한 상이한 최적 pH에 의해 입증되는 바와 같이 갖는 것 같다. 도 14의 결과를 기초로 하여, MeOH가 HCMB에 첨가되도록 선택되었다.
실시예 5A. 리파제 검정법 개발 Ⅴ: 계면활성제
계면활성제의 존재 하에 리파제 검정 완충액 성능을 조사하였다. 500 nM PPL 및 4MuO를 사용한 리파제 검정법은 2가지 상이한 농도의 2가지 계면활성제, (a) 트리톤 X-100 0.012% w/v; (b) 트리톤 X-100 0.06% w/v; (c) 콜리퍼 P188 0.032% w/v; 및 (d) 콜리퍼 P188 0.16% w/v를 사용하여 4MuO 형광 소광 및 자가-가수분해를 조사하도록 수행하였다.
도 5a 내지 도 5c 및 표 5에서 결과는 계면활성제가 있는 시료가 가장 낮은 자가-가수분해이지만 형광 소광이 관찰되는 것을 나타낸다. 또한, 지질용해 활성은 계면활성제를 사용하여 감소되는 것으로 보인다.
Figure pct00007
실시예 5B. 리파제 검정법 개발 Ⅴ: 계면활성제
추가의 연구는 PPL 및 CCHF의 지질용해 활성에 미치는 계면활성제의 효과를 평가하도록 수행하였다. 생체약제학적 약물 산물 제형물에서 발견될 수 있는 계면활성제, 폴리소르베이트-20 (PS20) 및 폴리소르베이트-80 (PS80)을 평가하였다. 또한, 이전 연구 (Gupta et al., "Simplified para-nitrophenyl palmitate assay for lipases and esterases," Anal. Biochem. 2002, 311: 98-99)에서 계면활성제가 파라-니트로페닐 팔미테이트와 같은 빈약한 가용성 기질을 용해시킴을 제시하기 때문에, 폴록사머를 테스트하였다.
시료는 20 mM L-히스티딘 pH 6, 250 mM 슈크로스, 계면활성제 (0.02% 또는 0.06% (모두 w/v)의 폴리소르베이트-20 (PS20), 폴리소르베이트-80 (PS80) 또는 폴록사머, 또는 계면활성제를 포함하지 않은 대조군), 0.5% CCHF 또는 0.0025 mg/mL PPL을 포함하였다. HCMB는 208 mM 비스-트리스 pH 6, 600 mM NaCl, 5.2 mM CaCl2를 포함하였다. 100 μM 4MeO를 포함하는 5% (v/v)의 유기 용매 MeOH를 검정 시 첨가하였다. 검정 구성요소를 96-웰 플레이트 내로 옮기고, 실시예 1B에 상기 설명된 바와 같이 형광 세기에 대해 분석하였다.
지질용해 활성에 미치는 계면활성제 효과의 결과를 도 15에 나타낸다. 계면활성제의 존재는 지질용해 활성에 주목가능하게 영향을 주었다. 폴리소르베이트는 PPL의 경우 > 90% 및 CCHF의 경우 ~ 80%로 4Mu 형성을 극적으로 감소시키고, PS80는 PS20과 비교하여 약간 더 현저하게 4Mu 형성을 감소시켰다.
이러한 관찰에 대한 여러 가지 가능한 이유가 있다. (1) 지방상 에스테르로 구성된 폴리소르베이트가 리파제의 경쟁 물질/저해제이고/거나; (2) 비-극성 기질 4MuO가 폴리소르베이트의 미셀 구조 내로 혼입되어, 수용성 배지에서 농도가 감소되고, 따라서 기질 농도와 상관되는 효소 속도 상수에 부정적인 영향을 주고/거나 (예로, 미켈리스-멘턴 역학의 개념에 따름); (3) 리파제 효소가 구조적으로 영향을 받아, 잠재적으로 풀림 및 이에 의한 활성 감소를 유도하는 것이다.
흥미롭게도, 폴리소르베이트의 농도는 CCHF 지질용해 활성에 효과를 미치는 것으로 보이는데, 더 높은 폴리소르베이트 농도가 더 낮은 활성을 수득하는 반면, 폴리소르베이트 둘 다의 2가지 상이한 선택된 농도에서 PPL은 유사한 활성이 있었다. 다른 한편, 폴록사머는 매우 상이한 방식으로 PPL 및 CCHF의 지질용해 활성에 영향을 주었다. PPL의 활성은 대조군과 비교하여 ~ 50% 감소되었고, 폴리소르베이트를 사용하여 이미 관찰된 바와 같이, 계면활성제의 선택된 농도는 효소적 활성에서 구별된 다양성을 나타내지 않았다. CCHF의 지질용해 활성은 폴록사머에 의해 적어도 0.02%의 계면활성제 농도에서 긍정적으로 영향을 받았으며, 외관상으로 0.06%에서는 영향을 받지 않았다. 특정한 이론에 구애받지 않고도, 계면활성제의 존재 하에 효소적 행동, 뿐만 아니라 농도 의존성의 한 가지 이유는 하나 이상의 원인의 조합일 수 있다. 예를 들면, 리파제 역학 및 메커니즘 조사는 어려운데, 효소가 물에 빈약한 가용성을 갖는 기질, 예로 트리글리세리드 및 기타 지방 에 대한 반응을 촉매하는 점 때문이다. 물/지방 경계면에서 효소는 가장자리 도메인의 운동에 의해 활성화되고, 이는 폐쇄 형태에서 활성 부위를 보호하는 반면, 개방 형태에서 활성 부위로 기질의 접근을 허용한다. 예로, Lowe, "The triglyceride lipases of the pancreas," J. Lipid Res. 2002, 43(12): 2007-2016 참조.
명확하게, 폴리소르베이트는 모델 리파제 PPL 및 CCHF에 대한 지질용해 활성에 부정적인 영향을 준다. 4Mu 가수분해 산물의 형광 세기도 계면활성제의 존재 하에 영향을 받고 (~ 20% 감소됨) (도 15b 참조), 도 15a에 나타낸 바와 같이 이는 4Mu 산물의 신호 세기의 감소에도 기여한다.
실시예 6A. 리파제 검정법 개발 Ⅵ: 리파제 저해제
리파제 저해제 오를리스타트는 리파제 검정법 대조군 실험에 선택되었으며, 따라서 검정 성능은 상이한 농도의 저해제를 사용하여 평가하였다. 오를리스타트는 췌장 리파제의 활성 부위 세린에 공유 결합하여 효소를 저해하는, 메커니즘 기반의 저해제로서 개발되었다. 이러한 작용 방식은 경구 투여된 의약이 위창자 지방 가수분해를 기초로 하는 비만 및 관련 증상을 치료하도록 한다. 오를리스타트에 의해 억제될 수 있는 리파제 부류를 체계적으로 조사한 연구 발표는 없다. 그러나, 포유동물 리파제와는 별도로, 예전에 세균 리파제 예로 스트렙토마이세스 리모서스로부터의 리파제가 밀리몰 농도의 오를리스타트에서 억제될 수 있는 것으로 보고되었다. 예로, Hadvary et al., "The lipase inhibitor tetrahydrolipstatin binds covalently to the putative active site serine of pancreatic lipase," J. Biol. Chem. 1991, 266(4): 2021-2027; Heck et al., "Orlistat, a new lipase inhibitor for the management of obesity. Pharmacotherapy 2000, 20(3): 270-279; Asler et al., "Mass spectrometric evidence of covalently-bound tetrahydrolipstatin at the catalytic serine of Streptomyces rimosus lipase," Biochim. Biophys. Acta. 2007, 1770: 163-170 참조. 이러한 이전의 연구에서, 총종 검정에서 큰 부피비의 50% (v/v) 유기 용매는 높은 농도의 소수성 저해제를 도입하는데 필요하였다. 이러한 높은 농도의 유기 용매는 기타 검정 구성요소로의 가능한 손상, 예로 약제학적 활성 단백질의 침전으로 인해 최신의 리파제 검정법에서 예견되지 않기 때문에서, 더 적은 용매 및 저해제 농도를 사용하는 것을 선택하였다. 포유동물 리파제가 훨씬 더 낮은, 즉 나노몰 오를리스타트 농도에서 억제되됨이 확인되기 때문에, 이것으로 검정 판독 결과에 부정적인 영향을 줄 필요는 없다. 예로, Lewis et al., "Direct measurement of lipase inhibition by Orlistat using a dissolution linked in vitro assay," Clin. Pharmacol. Biopharm. 2012, 1(3): 1-3 참조.
리파제 활성은 500 nM PPL을 포함하는 시료의 보조-처리 및 전처리 이후에 3가지 농도의 오를리스타트 (리파제 저해제), (a) 25 μM 오를리스타트의 보조-처리; (b) 15 μM 오를리스타트의 보조-처리; (c) 5 μM 오를리스타트의 보조-처리; (d) 25 μM 오를리스타트의 전처리; (e) 15 μM 오를리스타트의 전처리; 및 (f) 5 μM 오를리스타트의 전처리를 사용하여 4MuO 형광 소광 및 자가-가수분해를 조사하도록 테스트하였다. 오를리스타트가 없는 대조군 시료도 테스트하였다.
도 6a 및 도 6b, 및 표 6에서 결과는 25 μM 오를리스타트로의 전처리 (30분)가 지질용해 활성을 제거하는 것을 나타낸다. 더 낮은 오를리스타트 농도를 사용하여 잔류 활성을 관찰되었다. 형광 소광은 전혀 관찰되지 않았다.
Figure pct00008
실시예 6B. 리파제 검정법 개발 Ⅵ: 리파제 저해제
리파제 저해제 오를리스타트의 농도는 추가의 실험에서 평가하였다. 시료, HCMB 조성물 및 실험적 절차는 실시예 1B와 같이 수행하였다. 저해제는 MeOH 에서 200 μM, 600 μM 및 1000 μM의 농도로 준비하였다. 사전-배양 실험을 위해, 저해제 용액을 검정 시 2.5% (v/v)로 보충하고, 사전-배양을 30분 동안 수행하였다. 다음으로 200 μM의 4MuO를 포함하는 MeOH를 검정 시 2.5% (v/v)로 첨가하였다. 보조-배양 실험을 위해, 100 μM 4MuO 및 오를리스타트 (100 μM, 300 μM 및 500 μM)을 포함하는 MeOH를 5% (v/v)로 첨가하였다. 0.0335 mg/mL의 높은 PPL 농도를 사용하였다.
3가지 농도의 오를리스타트, 즉 (최종 검정 부피와 대비하여) 5 μM, 15 μM 및 25 μM를 "최악의 경우", 즉 0.0335 mg/mL PPL의 매우 높은 리파제 농도를 사용하여 테스트하였다. 이들 농도에서, 최종 검정 용액은 맑고, 저해제의 가능한 불용성에 의한 혼탁을 보이지 않았다. 추가적으로, 2.5% (v/v)의 MeOH 중 효소를 포함하는 시료에 오를리스타트의 사전 첨가, 및 또 다른 2.5% (v/v) 부피 분획의 MeOH 중 기질의 첨가 이전에 30분 동안 배양과 대비하여, 오를리스타트가 MeOH 중 5% (v/v)로 직접 검정에 적용될 때 리파제 활성에 미치는 효과를 연구하였다.
리파제 저해제 평가의 결과는 도 16에 나타낸다. 상기 기술된 바와 같이 높은 PPL 농도로 인해, 4MuO는 오를리스타트의 부재 하에 24시간 이내에 거의 완벽하게 가수분해되었다. 또한, 오를리스타트가 PPL을 억제하고, 저해 효과는 오를리스타트와 상관되고, 즉 가장 높은 저해 효과가 25 μM 오를리스타트로 관찰됨을 알 수 있었다. 저해제와 효소의 사전 배양은 유익한 효과가 있었으며, 즉 25 μM 오를리스타트의 테스트된 최고 농도의 효소 활성은 기질 및 저해제가 동시에 첨가된 시료와 비교하여 전처리된 시료에서 ~ 50% 감소되었다. 따라서, 오를리스타트는 음성 대조군에서 높은 농도, 즉 25 μM로 보충되도록 선택되었으며, 음성 대조군은 기질을 첨가하기 이전에 저해제와 함께 ~ 30분 동안 사전 배양될 것이다.
실시예 7. 리파제 검정법 개발 Ⅶ: 지방산 산물 억제
지방산 산물 억제는 올레산 및 라우르산을 사용한 리파제 검정법으로 이론적으로 분해된 PS20 및 PS80의 2가지 농도, (a) 0.1%; 및 (b) 0.001%에서 테스트하였다. 본 실험에서 PPL의 농도는 800 nM이었다.
도 7a 내지 도 7d, 및 표 7에서 결과는 8.5 μM 초과의 라우르산이 8.5 μM 내지 850 μM 범위와 차이가 없이 리파제 활성을 억제하는 것을 나타낸다. 올레산의 경우 유의한 산물 억제가 780 μM에서 관찰되었다.
Figure pct00009
실시예 8. 리파제 검정법 개발 Ⅷ: 소광 효과
폴리소르베이트 80의 소광 효과를 조사하였다. PS80이 없이 800 nM PPL을 갖는 대조군과 대비하여, 800 nM PPL 및 신선한 PS80을 포함하는 시료를 테스트하였다. 도 8에서 결과는 PS80이 각 표준의 RFU 값을 감소시키면서, 완만한 소광 효과를 사사하는 것을 나타낸다.
실시예 9. 리파제 검정 평가: CCHF
약물 원료/약물 산물에서 지질용해 활성을 연구하는데 실시예 1 내지 실시예 8에서 개발된 검정에 적용을 평가하기 위하여, 폴리소르베이트 분해를 유도할 리파제 농도에서 이러한 분해가 약물 산물에서 관찰될 수 있는 시간대 내에, 예로 1개월 이내에서 검정법을 평가하였다.
본 연구를 위한 시료는 20 mM L-히스티딘 pH 6, 250 mM 슈크로스, 0.02% (w/v)의 계면활성제 PS20 또는 PS80, 다양한 농도의 CCHF (0%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 모두 v/v)를 포함하였다. 시료를 실온 및 2℃ 내지 8℃에서 1개월 동안 보관하였다. 시료는 하기에 기술된 바와 같은 HPLC-FMA 및 본원에서의 리파제 검정법으로 분석하였다. 검정 양성 대조군의 경우, 시료에 0.055 mg/mL PPL을 보충하였다. HCMB는 208 mM 비스-트리스 pH 6, 600 mM NaCl, 5.2 mM CaCl2를 포함하였다. 100 μM의 4MuO를 포함하는 5% (v/v)의 유기 용매 MeOH를 검정 시 첨가하였다. 오를리스타트를 포함하는 음성 대조군의 경우, 저해제를 1000 μM로 MeOH에서 준비하고, 검정 시 2.5% (v/v)로 보충하였으며, 30분 동안 사전 배양을 수행하였다. 다음으로 200 μM의 4MuO를 포함하는 MeOH를 2.5% (v/v)로 검정 시 첨가하였다. 검정 구성요소를 96-웰 플레이트에 옮기고, 실시예 1B에 기술된 바와 같이 형광 세기를 분석하였다.
온전한 PS20 및 PS80의 정량적 분석은 동용매 펌프, 자동 시료수집기, 직조된 반응기 코일 (1 mL; 수펠코사 #57410-U) 및 형광 검출기 (워터스사 2475 FLR 검출기)가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템 (워터스 얼라이언스사 e2695)를 사용하여 수행하였다. 시료를 150 mM NaCl, 50 mM 트리스, 5% (v/v) ACN pH 8의 용액에 용해된 5 μM N-페닐-1-나프틸아민 (NPN), 15 ppm (w/v) 브리즈® 35를 포함하는 이동상 내에 주입하였다. 형광은 λex = 350 nm 및 λem = 420 nm에서 측정하였다. 엠파워 3 크로마토그래피 데이터 시스템 (CDS)을 피크 적분 및 분석에 사용하였다.
표 9는 테스트된 시료를 요약하고 있다.
Figure pct00010
HPLC-FMA로부터의 결과는 도 9a 및 도 9b에 나타내고, 폴리소르베이트 분해가 0.10% 이상의 CCHF 농도에서 관찰되었음을 표시하고 있다. PS20 시료는 분해되는 성향이 더 크고. ~ 0.10% CCHF에서 효과가 관찰된다. 더 높은 농도는 명백하게 폴리소르베이트 농도의 감소를 나타내었다. 경향성은 2℃ 내지 8℃와 비교하여 25℃에서 더욱 현저하였다. PS20 포함하는 시료는 PS80 포함하는 시료보다 외관상 더욱 분해되는 성향이 있고, 여기서 신호 세기의 감소는 단지 0.5% CCHF에서 검출될 수 있었다. 계면활성제 평가에 관한 이전에 기술된 실험에서, PS80은 CCHF 포함하는 시료에서 PS20과 비교하여 지질용해 활성에 약간 증진된 부정적 효과를 미치는 것으로 관찰되었으며, 따라서 최악의 경우로서 HPLC-FMA 검정으로부터 나온 PS80 포함하는 시료가 리파제 검정에 적용되었다.
본원에서 개발된 리파제 검정법의 이론적인 판독 결과는 도 9c에 나타내고, 실제 결과는 도 9d에 나타낸다. 실제 결과는 예상된 판독 결과와 비슷하다. 상이한 농도의 CCHF를 사용한 결과는 CCHF와 상관되는 4Mu 형성을 나타내었다. 이러한 효소적 활성은 3가지 음성 대조군의 결과보다 더 높았으며, 즉 자가-가수분해 및 2가지 CCHF 시료는 오를리스타트를 사용하여 급상승되었다. 검정법은 HPLC-FMA 방법이 폴리소르베이트 분해를 아직 검출하지 못하는 농도, 즉 < 0.1%의 CCHF 농도에서 리파제 활성을 검출하기에 충분히 민감하였다.
0.001% 내지 2% 범위의 상이한 농도의 CCHF에서 PS80을 사용한 추가적인 리파제 검정 측정은 도 10a 내지 도 10h에 나타낸다. CCHF 및 폴리소르베이트의 표시된 농도는 4MuO 및 완충액의 첨가 이전이었다.
리파제 검정 결과는 도 18에 요약되어 있다. PPL을 사용하여 급상승된 1% CCHF 시료 (검정 양성 대조군)는 PPL을 사용하여 급상승되지 않은 동일한 CCHF 농도의 시료보다 더 높은 활성을 나타낸다. 4Mu 형성은 CCHF 농도와 상관되었고, 이 지질분해 활성은 자가-가수분해 및 오를리스타트로 급상승된 다른 음성 대조군의 활성보다 더 높았다. 가장 명확하게, 검정법은 HPLC-FMA 방법이 폴리소르베이트 분해를 아직 검출하지 못하는 < 0.1%의 CCHF 농도에서 리파제 활성을 자가-가수분해 및 음성 대조군과 구별하기에 충분히 민감하였으며, 즉 지질용해 활성이 리파제 검정법으로 0.01% 및 0.05% CCHF 농도에서 검출될 수 있다.
실시예 10. 리파제 검정 평가: 단백질 포함하는 제형물
지질분해 활성에 의해 부정적으로 영향을 받을 수 있는 생체약제학적 약물 산물 제형물은 생체치료용 단백질을 포함한다. 실시예 1 내지 실시예 8에서 개발된 리파제 검정법은 단백질 포함하는 제형물을 사용하여 테스트되었다.
시료는 20 mM L-히스티딘 pH 6, 250 mM 슈크로스, 0.02% PS80, 10 mg/mL mAb1 (재산권 보호된 IgG1), 0.5% CCHF 또는 0.025 mg/mL PPL을 포함하였다. HCMB는 208 mM 비스-트리스 pH 6, 600 mM NaCl, 5.2 mM CaCl2를 포함하였다. 100 μM의 4MuO를 포함하는 5% (v/v)의 유기 용매 MeOH를 검정 시 첨가하였다. 오를리스타트를 포함하는 음성 대조군의 경우, 저해제를 1000 μM로 MeOH에서 준비하고, 검정 시 2.5% (v/v)로 보충하였으며, 30분 동안 사전 배양을 수행하였다. 다음으로 200 μM의 4MuO를 포함하는 MeOH를 2.5% (v/v)로 검정 시 첨가하였다. 검정 구성요소를 96-웰 플레이트에 옮기고, 실시예 1B에 기술된 바와 같이 형광 세기를 분석하였다. 표 10은 테스트된 시료를 요약하고 있다.
Figure pct00011
상이한 시점 (1시간, 24시간, 72시간, 168시간 및 336시간)에서 검정 결과는 도 17a에 나타낸다. 예상된 바와 같이 CCHF 및 PPL 둘 다를 포함하는 검정 양성 대조군은 가장 높은 4Mu 방출을 보여주었다. 검정 음성 대조군은 강하게 감소된 활성을 나타내고, PPL 및 CCHF 리파제가 둘 다 오를리스타트에 의해 억제됨을 가리킨다. 동일한 경향성이 시료 및 제형물 양성 대조군의 경우에 관찰될 수 있는 반면 (높은 활성), 시료 음성 대조군 및 제형물 음성 대조군은 오를리스타트에 의해 억제되었다 (낮은 활성). 자가-가수분해 대조군 및 제형물 음성 대조군은 도 17a에서 구별될 수 없는 유사한 판독 결과를 모든 시점에 나타낸다. 음성 대조군의 확대를 보여주는 도 17b는 음성 대조군 둘 다의 활성이 유사한 것을 입증하고 있다.
자가-가수분해 / 제형물 음성 대조군과 비교하여 검정 / 시료 음성 대조군의 외관상 활성에서 상쇄가 관찰될 수 있다. 동일한 상쇄가 기질을 포함하지 않는 공시료에서 관찰되었으며 (데이터 미도시), 단백질을 포함하는 시료가 4Mu와 독립적인 형광 반응을 이미 갖고 있음을 나타낸다. 지질용해 활성을 연구하는 기간 동안, 즉 336시간 이내에 상쇄는 증가되었으며, CCHF 및 PPL에서 처음에 억제된 리파제가 음성 제형물에서 외관상 없지만, 느리게 재활성화되었음을 나타낸다.
루켄 등은 오를리스타트가 메커니즘 기반의 저해제일뿐만 아니라, 신속한 억제, 즉 활성 부위 세린에서 공유적 효소 - 오를리스타트 - 복합체의 형성 및 이러한 복합체의 느린 가수분해와 함께 지질단백질 리파제의 진정한 기질임을 보고하였다 (예로, Lookene et al., "Interactions of lipoprotein lipase with the active-site inhibitor tetrahydrolipstatin (Orlistat)R," Eur. J. Biochem. 1994, 222: 395-403 참조). 약물 원료 / 약물 산물에서 지질용해 활성의 평가를 위한 본 검정법 및 이의 적용은 매우 적절하다. 약물 원료 / 약물 산물에서 HCP의 잔류 분획의 일부이고, 폴리소르베이트의 분해를 유발하는 원인 (예로, 지질용해 효소)이 오를리스타트에 의해 억제될 수 있는 경우, 이들은 재활성화될 수 있다. 시료 및 시료 음성 대조군 사이에 지질용해 활성이 구별되지 않은 경우, 이것은 시료의 낮은 지질용해 활성, 또는 오를리스타트에 의해 억제되지 않는 지질용해 활성의 존재 둘 중 하나를 나타낼 수 있다. 첫 번째 경우에, 4Mu 형성이 자가-가수분해 대조군과 비교하여 많이 증가되지 않으면, 이것은 약물 원료 / 약물 산물에서 낮은 지질용해 활성 및 폴리소르베이트 분해의 낮은 위험성을 나타낸다. 시료에서 자가-가수분해와 비교하여 높은 4Mu 형성이 관찰되는 경우, 이것은 지질용해 활성이 존재하지만 오를리스타트에 의해 억제되지 않을 수 있음을 나타낸다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 특허 특허출원, 논문 및 교과서 등, 및 본원에 인용된 참고문헌을 포함하여, 이들이 이전에 존재하지 않았던 정도로 이들의 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다.

Claims (95)

  1. (a) 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료; 및
    (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는 유기 용매
    를 포함하는 조성물로서,
    상기 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이고,
    상기 수용성 검정 시료는 상기 조성물 중 약 80% 내지 약 99.9%이고, 상기 유기 용매는 상기 조성물 중 약 0.1% 내지 약 20%인, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 세포 배양 상청액인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 부분적으로 정제된 단백질 제조물인, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 정제된 단백질 제조물인, 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 치료용 단백질을 포함하는, 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 계면활성제를 포함하는, 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 계면활성제는 폴리소르베이트인, 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-80 또는 이들의 조합인, 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 추가적인 숙주 세포 단백질을 추가로 포함하는, 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용성 검정 시료는 완충화제, 염 또는 둘 다를 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨, 염화칼슘 또는 이들의 조합인, 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨 및 염화칼슘인, 조성물.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 상기 수용성 검정 시료에서 약 50 mM 내지 약 400 mM인, 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 상기 수용성 검정 시료에서 약 100 mM 내지 약 200 mM인, 조성물.
  15. 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염화칼슘은 상기 수용성 검정 시료에서 약 0.2 mM 내지 약 10 mM인, 조성물.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 염화칼슘은 상기 수용성 검정 시료에서 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM인, 조성물.
  17. 제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 약 pH 6.0에서 완충화 능력을 갖는, 조성물.
  18. 제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 트리스인, 조성물.
  19. 제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 비스-트리스인, 조성물.
  20. 제 10항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 상기 수용성 검정 시료에서 약 2 mM 내지 약 200 mM인, 조성물.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 완충화제는 상기 수용성 검정 시료에서 약 10 mM 내지 약 100 mM인, 조성물.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 완충화제는 상기 수용성 검정 시료에서 약 40 mM 내지 약 60 mM인, 조성물.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 알코올, 설폭사이드, 니트릴 또는 이들의 조합인, 조성물.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 유기 용매는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)인, 조성물.
  25. 제 23항에 있어서,
    상기 유기 용매는 아세토니트릴을 포함하는, 조성물.
  26. 제 23항에 있어서,
    상기 유기 용매는 알코올을 포함하는, 조성물.
  27. 제 23항에 있어서,
    상기 유기 용매는 아세토니트릴 및 이소프로판올의 혼합물을 포함하는, 조성물.
  28. 제 23항에 있어서,
    상기 유기 용매는 C1 내지 C6 알코올인, 조성물.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올 또는 이들의 조합인, 조성물.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 리파제 저해제를 추가로 포함하는, 조성물.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 리파제 저해제는 (S)-2-포르밀아미노-4-메틸-펜탄산 (S)-1[[(2S,3S)-3헥실-4-옥소-2-옥세타닐]메틸]-도데실 에스테르 (오를리스타트)인, 조성물.
  32. 제 30항 또는 제 31항에 있어서,
    상기 리파제 저해제는 유기 용매에 있는, 조성물.
  33. 제 30항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리파제 저해제는 상기 조성물에서 약 1 μM 내지 약 50 μM인, 조성물.
  34. 제 33항에 있어서,
    상기 리파제 저해제는 상기 조성물에서 약 5 μM 내지 약 25 μM인, 조성물.
  35. (a) (i) 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; 및 (iii) 염을 포함하는 수용성 검정 시료; 및
    (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는 유기 용매
    를 포함하는 조성물로서,
    상기 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0이고,
    상기 수용성 검정 시료는 상기 조성물 중 약 80% 내지 약 99.9%이고, 상기 유기 용매는 상기 조성물 중 약 0.1% 내지 약 20%인, 조성물.
  36. (a) 약 90 부피% 내지 약 99.9 부피%의 수용성 검정 시료로서, (i) 단백질 및 지질을 포함하는 정제된 단백질 제조물; (ii) 완충화제; (iii) 약 0.1 mM 내지 약 2.0 mM 염화칼슘; 및 (iv) 약 100 mM 내지 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는, 수용성 검정 시료; 및
    (b) 약 10 부피% 내지 약 0.1 부피%의 유기 용매로서, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올, 디메틸 설포옥사이드 (DMSO), 아세토니트릴 또는 이들의 조합으로부터 선택되고, 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 추가로 포함하는, 유기 용매
    를 포함하는 조성물로서,
    상기 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0인, 조성물.
  37. 수용성 검정 시료에서 지질용해 활성을 검출하는 방법으로서,
    (a) 단백질 제조물을 포함하는 상기 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하는 단계; 및
    (b) 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  38. 수용성 검정 시료에서 지질용해 활성을 검출하는 방법으로서,
    (a) 단백질 제조물을 포함하는 상기 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하여 검정 조성물을 형성하는 단계; 및
    (b) 단백질 제조물 및 리파제 저해제를 포함하는 대조군 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하여 대조군 조성물을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 검정 조성물 및 상기 대조군 조성물에서 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  39. 단백질 제조물의 안정성을 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 단백질 제조물을 포함하는 수용성 검정 시료를 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매와 조합하는 단계;
    (b) 올레이트 및 4-메틸엄벨리페론 (4Mu)의 형성을 형광으로 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 측정된 형광을 기준으로 하여 상기 단백질 제조물의 안정성을 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  40. 제 37항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용성 검정 시료는 pH 5.0 내지 7.0인, 방법.
  41. 제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용성 검정 시료 및 상기 유기 용매는 약 80 : 20 내지 약 99.9 : 0.1의 비율로 조합되는, 방법.
  42. 제 41항에 있어서,
    상기 수용성 검정 시료 및 상기 유기 용매는 약 90 : 10 내지 약 98 : 2의 비율로 조합되는, 방법.
  43. 제 37항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광은 330 nm에서의 형광 여기 및 495 nm에서의 형광 방출에 의해 측정되는, 방법.
  44. 제 37항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광은 최대 24시간 동안 측정되는, 방법.
  45. 제 37항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광은 약 24시간 내지 약 400시간 동안 측정되는, 방법.
  46. 제 37항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광은 100시간 이상 동안 측정되는, 방법.
  47. 제 37항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 세포 배양 상청액인, 방법.
  48. 제 37항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 부분적으로 정제된 단백질 제조물인, 방법.
  49. 제 37항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 정제된 단백질 제조물인, 방법.
  50. 제 37항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 치료용 단백질을 포함하는, 방법.
  51. 제 37항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 계면활성제를 포함하는, 방법.
  52. 제 51항에 있어서,
    상기 계면활성제는 폴리소르베이트인, 방법.
  53. 제 52항에 있어서,
    상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-80 또는 이들의 조합인, 방법.
  54. 제 37항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제조물은 추가적인 숙주 세포 단백질을 포함하는, 방법.
  55. 제 37항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용성 검정 시료는 완충화제, 염 또는 둘 다를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제 55항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨, 염화칼슘 또는 이들의 조합인, 방법.
  57. 제 55항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨 및 염화칼슘인, 방법.
  58. 제 56항 또는 제 57항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 상기 수용성 검정 시료에서 약 50 mM 내지 약 400 mM인, 방법.
  59. 제 58항에 있어서,
    상기 염화나트륨은 상기 수용성 검정 시료에서 약 100 mM 내지 약 200 mM인, 방법.
  60. 제 56항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염화칼슘은 상기 수용성 검정 시료에서 약 0.2 mM 내지 약 10 mM인, 방법.
  61. 제 60항에 있어서,
    상기 염화칼슘은 상기 수용성 검정 시료에서 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM인, 방법.
  62. 제 55항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 약 pH 6.0에서 완충화 능력을 갖는, 방법.
  63. 제 55항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 트리스인, 방법.
  64. 제 55항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 비스-트리스인, 방법.
  65. 제 55항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 상기 수용성 검정 시료에서 약 2 mM 내지 약 200 mM인, 방법.
  66. 제 65항에 있어서,
    상기 완충화제는 상기 수용성 검정 시료에서 약 10 mM 내지 약 100 mM인, 방법.
  67. 제 66항에 있어서,
    상기 완충화제는 상기 수용성 검정 시료에서 약 40 mM 내지 약 60 mM인, 방법.
  68. 제 37항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 알코올, 설폭사이드, 니트릴 또는 이들의 조합인, 방법.
  69. 제 68항에 있어서,
    상기 유기 용매는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)인, 방법.
  70. 제 68항에 있어서,
    상기 유기 용매는 아세토니트릴을 포함하는, 방법.
  71. 제 68항에 있어서,
    상기 유기 용매는 알코올을 포함하는, 방법.
  72. 제 68항에 있어서,
    상기 유기 용매는 아세토니트릴 및 이소프로판올을 포함하는, 방법.
  73. 제 68항에 있어서,
    상기 유기 용매는 C1 내지 C6 알코올인, 방법.
  74. 제 73항에 있어서,
    상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올 또는 이들의 조합인, 방법.
  75. 제 37항 또는 제 40항 내지 제 74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용성 검정 시료는 단계 (a) 이전에 약 10분 내지 약 1시간 동안 리파제 저해제와 함께 배양되는, 방법.
  76. 제 75항에 있어서,
    상기 수용성 검정 시료는 단계 (a) 이전에 약 30분 동안 리파제 저해제와 함께 배양되는, 방법.
  77. 제 37항, 제 38항 또는 제 40항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리파제 저해제는 (S)-2-포르밀아미노-4-메틸-펜탄산 (S)-1[[(2S,3S)-3헥실-4-옥소-2-옥세타닐]메틸]-도데실 에스테르 (오를리스타트)인, 방법.
  78. 제 38항 또는 제 40항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리파제 저해제는 약 1 μM 내지 약 50 μM로 첨가되는, 방법.
  79. 제 78항에 있어서,
    상기 리파제 저해제는 상기 조성물 중 약 5 μM 내지 약 25 μM로 첨가되는, 방법.
  80. (a) 유기 용매;
    (b) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO); 및
    (c) 리파제 저해제
    를 2개 이상의 용기에 포함하는 키트.
  81. 제 80항에 있어서,
    완충화제, 염 또는 둘 다를 추가로 포함하는, 키트.
  82. 제 80항 또는 제 81항에 있어서,
    완충액 교환 컬럼을 추가로 포함하는, 키트.
  83. (a) 4-메틸엄벨리페릴 올레이트 (4MuO)를 포함하는 유기 용매;
    (b) 단백질 제조물의 완충액을 교환하는데 적합한 컬럼; 및
    (c) 리파제 저해제
    를 포함하는 키트.
  84. 제 80항 내지 제 83항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 알코올, 설폭사이드, 니트릴 또는 이들의 조합인, 키트.
  85. 제 84항에 있어서,
    상기 유기 용매는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)인, 키트.
  86. 제 84항에 있어서,
    상기 유기 용매는 아세토니트릴을 포함하는, 키트.
  87. 제 84항에 있어서,
    상기 유기 용매는 알코올을 포함하는, 키트.
  88. 제 84항에 있어서,
    상기 유기 용매는 아세토니트릴 및 이소프로필 알코올의 혼합물을 포함하는, 키트.
  89. 제 84항에 있어서,
    상기 유기 용매는 C1 내지 C6 알코올인, 키트.
  90. 제 89항에 있어서,
    상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 세크-부탄올, 이소부탄올, 터르-부탄올 또는 이들의 조합인, 키트.
  91. 제 80항 내지 제 90항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리파제 저해제는 (S)-2-포르밀아미노-4-메틸-펜탄산 (S)-1[[(2S,3S)-3헥실-4-옥소-2-옥세타닐]메틸]-도데실 에스테르인, 키트.
  92. 제 81항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨, 염화칼슘 또는 이들의 조합인, 키트.
  93. 제 81항에 있어서,
    상기 염은 염화나트륨 및 염화칼슘인, 키트.
  94. 제 81항, 제 92항 또는 제 93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 트리스인, 키트.
  95. 제 81항, 제 92항 또는 제 93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충화제는 비스-트리스인, 키트.
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