ES2576202T3 - Método y aparato para determinar un valor de autofluorescencia de tejido de piel - Google Patents

Abstract

Método para determinar un valor de autofluorescencia de tejido de piel de un sujeto, que comprende las etapas de: - irradiar material de dicho tejido de piel con radiación de excitación electromagnética de una longitud de onda o rango de longitud de onda dentro del rango de excitación de longitudes de onda de 300-420 nm; - medir una cantidad de radiación fluorescente electromagnética emitida por dicho material en respuesta de dicha irradiación sobre un rango de longitudes de onda de 420-600 nm; y - generar, con base en dicha cantidad medida de radiación fluorescente, un valor de autofluorescencia medido para el sujeto de interés; -medir una primera reflectancia medida a una primera longitud de onda o rango de longitud de onda y una segunda reflectancia medida a una segunda longitud de onda o rango de longitud de onda diferente de dicha primera longitud de onda o rango de longitud de onda, en donde dicha primera y segunda longitudes de onda o rangos de longitudes de onda están ambas dentro del rango de excitación de longitudes de onda con las cuales el tejido de piel es irradiado para excitación, o ambos dentro del rango de longitudes de onda en los cuales la radiación fluorescente emitida se mide, o ambos en un rango de longitudes de onda superiores a 620 nm, o en donde dicha primera longitud de onda o rango de longitud de onda está en un rango de longitudes de onda de 450-525 nm y dicha segunda longitud de onda o rango de longitud de onda está en un rango de longitudes de onda superior a 620 nm; y - generar un valor de autofluorescencia corregido corrigiendo la autofluorescencia medida de acuerdo con una relación entre dicha primera y segunda reflectancias medidas de manera tal que la dependencia del valor de autofluorescencia corregido con diferentes reflectancias de UV en tejidos de piel, que diferentes sujetos puedan tener, es minimizada o al menos disminuida.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Metodo y aparato para determinar un valor de autofluorescencia de tejido de piel.

Campo y antecedentes de la invencion

La invencion se relaciona con un metodo para la determinar un valor de autofluorescencia (AF) de tejido de piel de un sujeto de acuerdo con porcion introductoria de la reivindicacion 1 y con un aparato para determinar un valor de autofluorescencia (AF) de tejido de piel de un sujeto de acuerdo con la porcion introductoria de la reivindicacion 14. Tal metodo y tal aparato son conocidos de la WO01/22869.

La medicion de AF de la piel es un metodo no invasivo para determinar la cantidad de Productos Finales de Glicasion Avanzada de tejido acumulada (AGEs). Existe una correlacion significativa entre la AF de piel y los niveles de AGEs cutaneos tales como pentosidina, Ne-carboxy-methyllysine (CML) and Ne-carboxy-ethyllysine (CEL), tal como se obtiene a partir de biopsias de piel: en un analisis combinado de estudios de validacion de biopsias de piel, 76% de la variacion en AF cuataneo fue explicado por variaciones en los niveles de pentodinia de biopsias de piel [Meerwaldt 2004, 2005, den Hollander 2007] (vease el listado de referencias citadas despues de la descripcion detallada). La AF de piel ha demostrado incrementarse con la edad y tambien es un elemento de prediccion independiente del desarrollo y progresion de complicaciones en diabetes mellitus, fallo renal y otras enfermedades con riesgo cardiovascular incrementado [Meerwaldt 2005, Mulder 2008, Lutgers 2009, Matsumoto 2007, Ueno 2008, Monami 2008]. La AF de piel puede ser medida por ejemplo con un instrumento de medicion optica tal como un AGE Reader (DiagnOptics Technologies BV, Groningen, Paises Bajos, cf. solicitud internacional de patente WO 01/22869 ), de la emision media en el rango de 420 - 600 nm por excitacion UV-A (esto es, dentro de un rango de aproximadamente 315 - 400 nm) con una longitud de onda pico de 370 nm. En la solicitud internacional de patente WO2005/045393 se divulgan metodos adicionales para la determinacion de AF de piel.

Se ha demostrado que las mediciones de AF de piel en sujetos con colores de piel mas oscura (reflectancia a UV por debajo de 10%) da como resultado valores menores que en sujetos con colores de piel mas claros [Mulder 2006]. No se espera que estos sujetos tengan una cantidad sustancialmente inferior de AGEs. Se espera por lo tanto que los valores inferiores de AF sean causados por diferente absorcion de luz excitacion o emision por compuestos en la piel y efectos de dispersion, especialmente en la epidermis, y reflectancia especular. La dependencia del color de la piel observada oculta el establecimiento confiable de AGEs en piel en sujetos con color de piel mas oscuro e inhibe el reconocimiento de valores de AF en piel incrementados.

La literatura provee algunos metodos para describir la influencia de absorbentes y dispersantes sobre el color de la piel [Kollias 1987, Nishidate 2004, Zonios 2006, Sandby-M0ller 2003].

Un problema de las mediciones de AF en la piel en sujetos con colores de piel mas oscuros es que tipicamente se miden valores AF mas bajos en sujetos con colores de piel mas claros que tienen el mismo nivel AGE. Esto significa que, para personas de diferentes colores de piel, los valores de AF de piel tal como se determinan de la manera conocida no son una base confiable para estimar el nivel de la AGE en la piel de una persona y asf tampoco para predecir los riesgos de salud asociados en esa persona. Esto hace que la tecnica conocida no sea aplicable en general a los sujetos de diversos colores de piel.

Para compensar las diferencias en el color de la piel, la AF de la piel fue calculada inicialmente como la intensidad de luz media en el rango de emision dividida por la intensidad de luz media de la luz que es reflejada del tejido en el rango de excitacion, como lo sugirio previamente Coremans et al. [Coremans 1997]. Siempre que mas melanina u otros compuestos de piel estan absorbiendo luz de emision, tambien absorben mas luz de excitacion y al dividir estas dos cantidades, el resultado sera menos dependiente de la absorcion. Utilizando este metodo, la AF piel puede ser obtenida de manera confiable en sujetos con fototipos de piel Fitzpatrick I - IV. Stamatas et al. [Stamatas 2006] tambien utilizaron la reflectancia de la piel como un factor de normalizacion para las mediciones de AF. Tambien reportaron que este metodo es adecuado, pero solamente para tipos de piel mas claros. En el AGE Reader, la determinacion simple del color de una piel se lleva a cabo utilizando la intensidad media de la luz UV-A que se reflejada de la piel. Se encontro que la aF de piel puede ser determinada de manera confiable si mas del 10% de la luz UV-A es reflejada [Mulder 2006, Koetsier 2010]. Este metodo no podna compensar la fuerte absorcion de la melanina, como sucede en sujetos con un color de piel oscuro

En el nombre AGE Reader, la fuente de luz de excitacion ilumina en el rango de 350 - 410 nm la emision se mide en el rango 420 - 600 nm. La AF de la piel en estos rangos puede ser causada no solamente por los AGEs de la piel. Tambien otros fluoroforos, como la queratina, vitamina D, lipofuscina, ceroides, NADH y piridoxina pueden sumar la senal de fluorescencia total [Bachmann 2006]. Adiconalmente, algunos fluoroforos tienen maximos de excitacion que caen dentro del rango de emision de los fluoroforos anteriores, incluyendo porfirinas, entrecruzamientos de elastina, FAD, flavinas y fosfolfpidos. Debido a la naturaleza superpuesta de los espectros de absorcion y emision, es diffcil, si no imposible, establecer la influencia de fluoroforos espedficos sobre la senal de fluorescencia total, especialmente con el pico de excitacion ancho que se utiliza en el aGe Reader. Sin embargo, se ha demostrado que incluso con este pico de excitacion amplio, el contenido dermico de AGEs espedficos explica la parte principal de la varianza

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

(hasta 76%) en la senal AF de la piel en un analisis agrupado de los estudios de validaciones mencionados anteriormente, y, ademas, que puede establecerse el riesgo de complicaciones cronicas en diabetes [Koetsier 2009].

Aparte de otros fluoroforos, los cromoforos no fluorescentes en la piel pueden tener un efecto sobre la AF de la piel absorbiendo selectivamente luz de excitacion y/o emision. Los cromoforos que mas contribuyen en la region UV-A y visible son melanina en la epidermis y la hemoglobina en la dermis [Anderson 1981, Sinichkin 2002, Kollias 2002]. Tanto en la epidermis y como en la dermis, tambien la bilirrubina y en un menor grado el beta-caroteno estan presentes, con picos de absorcion a 470 nm y 450 nm respectivamente Anderson 1981, Bachmann 2006]. No obstante, la melanina y la hemoglobina son aceptadas ampliamente como los absorbentes principales.

El espectro de absorcion de melanina ha sido estudiado extensamente in vitro [Zonios 2008a]. Sin embargo, la melanina reside en la piel en organelos celulares, melanosomas, y el efecto sobre el color de la piel y ademas sobre la medicion de la AF esta influenciado por el tamano, numero, distribucion y agregacion de estos melanosomas en la piel, los que pueden variar grandemente entre individuos de diferentes grupos etnicos [Alaluf 2002, Barsh 2003]. En general, la melanina absorbe luz del rango UV, visible e infrarrojo cercano del espectro, con un incremento exponencial de absorcion hacia longitudes de onda mas bajas [Zonios 2008a, Zonios 2008b].

La hemoglobina tiene un espectro de absorcion amplio sobre la parte visual del espectro con varios picos de absorcion y por lo tanto es un factor importante en el color de la piel [Anderson 1981, Feather 1989, Bachmann 2006]. Aunque no se espera que la concentracion o distribucion de hemoglobina sea muy diferente para los diversos fototipos de piel, las propiedades opticas aparentes de hemoglobina y su influencia sobre la AF de la piel puede variar debido a las interacciones con otros cromoforos (por ejemplo, melanina) durante la propagacion de la luz dentro de la piel. Ademas, la hemoglobina esta concentra en celulas de globulos rojos dentro de los vasos sangumeos. Debido a una profundidad de penetracion de la luz limitada y dependiente de la longitud de onda en los vasos sangumeos, la influencia de la hemoglobina sobre la AF de la piel es diffcil de establecer. No obstante, Na et al. observaron una variacion de la AF en la piel en sus mediciones como funcion del enrojecimiento de la piel, lo cual depende de la concentracion de hemoglobina o la saturacion de oxfgeno [Na 2001].

Existen diversas metodologfas para describir la influencia de los absorbentes y dispersantes sobre el color de la piel. Algunos metodos han utilizado un metodologfa homogenea [Kollias 1987, Sinichkin 2002, Nishidate 2004, Zonios 2006, Sandby-M0ller 2003], mientras que otros han definido muchas capas en la piel, con propiedades opticas separadas en cada capa, que pueden variar entre sujetos [Magnain 2007, Nielsen 2008, Katika 2006, Chen 2007]. Algunas de estas metodologfas pretenden determinar la concentracion de ciertos cromoforos o identificar fluoroforos espedficos.

Resumen de la invencion

Es un objeto de la invencion establecer la fluorescencia de la piel mas independiente de las caractensticas de la piel y proveer una solucion para adaptar la AF de la piel medida a la influencia del color de la piel. Para es proposito la invencion provee un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1. La invencion tambien puede ser realizada en un aparato de acuerdo con la reivindicacion 14, el cual esta adaptado espedficamente para llevar a cabo un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1.

De acuerdo con la invencion, el valor de AF determinado se obtiene corrigiendo el valor AF medido, de manera tal que la dependencia del valor de AF determinado con base en diferentes reflectancias de UV-tejido de piel, que pueden tener diferentes sujetos respectivos, se minimiza o al menos se disminuye. Esta minimizacion o al menos disminucion de dicha dependencia hace que la tecnica de acuerdo con la invencion sea aplicable a sujetos de diversas caractensticas de piel.

En las reivindicaciones dependientes se establecen realizaciones particulares de la invencion.

Se describen consideraciones, detalles, aspectos y realizaciones adicionales de la invencion, a manera de ejemplos no limitantes solamente en siguiente descripcion detallada.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 es una grafica de espectro de intensidad de un tubo de luz negra UV y un tubo LED blanco utilizados para iluminar la piel de sujetos;

La figura 2 es una grafica de espectros de reflectancia tfpicos de tres sujetos con valores de reflectancia UV de 4,4%, 8,0% y 11,4%, respectivamente;

La figura 3 es una grafica de espectros de emision tfpicos de tres sujetos con valores de reflectancia de UV de 4,4%, 8,0% y 11,4%, respectivamente;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La figura 4 muestra parte de los espectros de reflectancia normalizados medidos con el AGE Reader a partir de sujetos saludables con color de piel claro y oscuro;

La figura 5 es una grafica de una AF de piel ajustada como funcion de la reflectancia de UV comparando el nuevo algoritmo preferido (b) y el viejo metodo para calcular la AF de la piel (a);

La figura 6 es una grafica de los valores de AF como funcion de la edad del sujeto, calculados con el nuevo algoritmo (b) asf como sin correccion para el color de la piel (a);

La figura 7 es una representacion esquematica de un primer ejemplo de un aparato de acuerdo con la invencion; y La figura 8 es una representacion esquematica de un segundo ejemplo de un aparato de acuerdo con la invencion. Descripcion detallada Introduccion

Se han formulado diversos parametros de los espectros para el proposito de obtener parametros que se correlacionen con y sean asf predictivos para el descenso de la AF medida para colores de piel mas oscuros. Con estos parametros, se llevo a cabo un analisis de regresion lineal multiple para determinar como los parametros formulados se relacionan con la desviacion de la AF medida a partir de un valor de AF corregido para el color de la piel. Con base en este modelo, se han construido y consecuentemente validado un algoritmo preferido y alternativas para calcular AF de piel corregida utilizando mediciones sobre sujetos saludables de diversos colores de piel.

Mas adelante, se describen ejemplos de un metodo y un dispositivo de acuerdo con la invencion y se describe el rendimiento de algunas realizaciones con respecto a la correccion de las mediciones de AF.

Materiales y metodos

Definicion de las medidas

La AF de piel fue medica con un AGE Reader como se muestra en la figura 7. El sistema 1 de medicion mostrado en la figura 7 comprende una unidad de 13 de medicion que tiene como fuente de luz una lampara fluorescente en la forma de un tubo 2 de luz negra UV-A (F4T5BLB, Philips, Eindhoven, Pafses Bajos), con una longitud de onda pico de 370 nm. La lampara 2 esta dispuesta dentro de una estructura de soporte en la forma de un alojamiento 6 de escudo de luz. EL alojamiento 6 tiene una superficie 14 de contacto contra la cual se coloca el lado volar del antebrazo 7 del sujeto para iluminar una superficie 23 de ~4 cm2 de la piel sobre el lado volar del antebrazo. En la figura 1 se muestra un espectro de la fuente 2 de luz. Para determinar las propiedades reflectivas de la piel en el rengo de longitud de onda autofluorescente (esto es por fuera del rango de longitud de onda de la radiacion de excitacion), se provee una segunda fuente 19 de luz en la forma de un LED blanco. Un espectro de esta fuente 19 de luz se muestra en la figura 1 tambien. La localizacion adyacente a un borde de la ventana 8 de irradiacion es un extremo 18 de una fibra 3 optica sin contacto (200 mm de diametro) para recibir la luz de emision autofluorescente y de excitacion reflejada de una superficie de piel de ~0.4 cm2 a un angulo a de 45°. A traves de la fibra optica, la radiacion que va a ser afectada, recibida de la piel 7, pasa a un espectrometro 15 (AvaSpec_2048, Avantes, Eerbeek, Pafses Bajos) con un arreglo 22 de detectores. Un ordenador 16 es programado con software de ordenador para analizar el espectro de intensidad analizado y para generar senales que representan un contenido de AGE en la piel 7 sobre una pantalla 17. El software cargado en el ordenador provee, por medio de la pantalla 17, la generacion de una senal que representa una AF medida de acuerdo con la cantidad medida de radiacion electromagnetica en el rango de longitud de onda por fuera del rango de longitud de onda de la radiacion aplicada a la piel 7. De acuerdo con este ejemplo, el software esta disenado adicionalmente para procesar la cantidad de radiacion electromagnetica, a medida a traves de una ventana 18 de medicion, en el rango de longitud de onda dentro del rango de longitud de onda de la radiacion aplicada a la piel 7, con el proposito de corregir las propiedades opticas del tejido de piel de acuerdo con los metodos descritos mas adelante.

Hay que anotar que el uso de un espectrometro provee la ventaja de que puede ser determinada con exactitud por banda de longitud de onda estrecha hasta el grado en que es tomada en cuenta como un indicador de la presencia de AGE. Sin embargo, un aparato mas compacto y mas facilmente portable que tambien es mas adecuado para sostener contra el cuerpo de un paciente en diferentes localizaciones tambien puede ser provisto. En la unidad 113 de medicion considerablemente mas pequena de acuerdo con el ejemplo mostrado en la figura 8, como una fuente de radiacion de excitacion, se provee un LED 102 el cual, de acuerdo con este ejemplo, emite radiacion de una longitud de onda de aproximadamente 370 nm, o al menos en un rango de 300-420 nm, preferiblemente solo en una banda estrecha (anchura a la mitad de la intensidad mas alta, por ejemplo, 10 nm).

Un segundo LED 125 esta dispuesto para emitir solamente luz de longitud de onda en un rango superior a 620 nm o 625 nm y preferiblemente no mayor a 900 u 880 nm a la piel 7. Un tercer LED 126 esta dispuesto para emitir

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

solamente luz de longitud de onda en un rango de 450 nm a 525 nm y preferiblemente alrededor de 500 nm a la piel 7.

Los LEDs son faciles de controlar en una forma pulsada o modulada, lo cual es ventajoso para corregir, por ejemplo, una corriente oscura debida al detector 122 o la luz ambiental. La unidad 113 de medicion tiene una rejilla l06 para filtrar la luz ambiente y una ventana 108 de radiacion que tiene un borde 119 limitante para ser colocado contra la piel 7.

Para detectar la radiacion que viene de la piel 7, se utilizan dos detectores 120, 122 los cuales pueden detectar simultaneamente la radiacion que viene de la piel 7 y estan dispuestos para ser acoplados con un ordenador para analisis. Dispuesto entre el detector 122 y la piel 7 hay un filtro 121 de paso largo, el cual deja pasar solamente radiacion de una longitud de onda mayor que, por ejemplo, 400 nm, de tal manera que el detector 122 solamente recibe radiacion de la piel 7 en el rango de longitud de onda inducida por fluorescencia. El detector 120 esta dispuesto preferiblemente para detectar la cantidad total de luz que llega de la piel 7 en los rangos de longitud de onda acumulados de los lEds 102, 125, 126.

Los LEDs 102, 125, 126 y los detectores 120, 122 estan conectados a una unidad 124 de control acoplada a un ordenador 116 con una pantalla 117. La unidad 124 de control esta dispuesta para activar y desactivar los LEDs y para generar valores de radiacion detectados recibidos de los detectores 120, 122 bajo control del ordenador 116.

Los LEDs pueden ser activados secuencialmente para generar sucesivamente a diferentes longitudes de onda o rangos de longitud de onda y para medir la reflectancia a diferentes longitudes de onda o rangos de longitud de onda asf como la AF sin utilizar un espectrometro. La operacion de los LEDs sera discutida mas adelante en el contexto de los ejemplos descritos de los metodos de acuerdo con la invencion.

En vez de dos detectores, tambien es posible proveer, por ejemplo, un detector individual y un disco cortador el cual deja pasar alternativamente radiacion de todas las longitudes de onda y radiacion solamente por encima de una longitud de onda particular. Esto provee la ventaja de que se previene la medicion de errores como resultado de diferencias entre los dos detectores, pero lleva a un incremento en las dimensiones y en la complejidad mecanica de la unidad de medicion.

En ves de diferentes fuentes de luz para medir la reflectancia a diferentes longitudes de onda o rangos de longitud de onda tambien es posible proveer diferentes detectores para medir la reflectancia a diferentes longitudes de onda o rangos de longitud de onda. Tambien, puede utilizarse una pluralidad de detectores para detectar la luz al mismo rango de longitud de onda, por ejemplo, colocados a diferentes distancias de la piel y (paralelos a la piel) de la fuente de radiacion.

En los ejemplos mostrados mas arriba, los detectores y la fibra optica que captura la luz estan dispuestos separados de la piel. Sin embargo, los detectores y/o fibras opticas tambien pueden ser dispuestos de manera que esten en contacto con la piel cuando la unidad de toma esta colocada contra la piel.

El valor de la AF de piel medido se calcula como la relacion entre la intensidad de emision total (420 - 600 nm) y la intensidad de excitacion total (300 - 420 nm), multiplicada por 100 y se expresa en unidades arbitrarias (AU). Ademas de la medicion de AF de la piel, se calcula la reflectancia UV como la suma de las intensidades de la luz reflejada desde la piel en el rango de 300-420 nm, dividida por la suma de intensidades en el mismo rango a partir de un estandar de referencia blanco, el cual esta incorporado en el AGE Reader y ha sido calibrado in situ contra el estandar de reflectancia externo. Ademas, se obtiene un espectro de reflectancia difusa completo, utilizando un LED blanco como fuente de iluminacion en el rango visible. Este LED esta localizado directamente bajo de la fibra de deteccion. El espectro del LED tambien se muestra en la Figura 1. Todos los espectros fueron corregidos en cuanto a corriente oscura y almacenados en un archivo para analisis posterior.

Sujetos

Se utilizaron tres cohortes de sujetos saludables en este estudio. El primer grupo consistio de 61 sujetos de ascendencia afrocaribena con un color de piel oscuro negroide, que viven en los Pafses Bajos. El segundo grupo fue un grupo de 120 sujetos del sur de China con color de piel intermedio, que viven en China. El tercer grupo consistio de 60 sujetos de ascendencia asiatica y africana, que vivfan todos en los Pafses Bajos. El estatus de salud fue obtenido por determinacion clmica (primera y segunda cohortes) o utilizando un cuestionario autoadministrado (tercera cohorte). Para todas estas cohortes, se incluyeron solamente sujetos con una reflectancia UV por debajo de 12% y con una edad de sujeto entre 20 y 70 anos. Se excluyeron sujetos si no todos los espectros se obtuvieron correctamente.

Para establecer correlaciones entre la AF de la piel corregida segun la edad y diversos parametros que fueron derivados de los espectros de reflectancia del rango UV-A y visible, se selecciono un subconjunto de 99 sujetos (33 sujetos de cada cohorte) del grupo total. La seleccion se enfoco en la obtencion de un grupo de sujetos por encima

del rango completo de edad (20 - 70 anos) y valores de reflectancia UV (~3% -12%), y de otra manera fue aleatoria. Para la validacion, se utilizaron todos los otros sujetos (N = 142).

Delineacion del modelo

Los valores de AF corregidos utilizando los nuevos metodos de correccion de acuerdo con la invencion y el nuevo 5 algoritmo preferido han comparados con un modelo existente que describe la desviacion de la AF medida a partir de un valor esperado. La AF esperada de un individuo puede ser descrita como funcion de la edad del sujeto en anos, siendo AF = 0.024 x edad + 0.83. Esta relacion esta basada en un conjunto grande de personas caucasicas saludables con un valor de reflectancia UV por encima de 10% [Koetsier 2010]. Con esto, la desviacion de AF de la piel para un individuo particular se calcula como

10 AAF = AFm - AF(edad) = AFm-0.024 x edad -0.83, (1)

donde AFm es la AF de piel como se midio. AAF se utilizo como variable dependiente en el modelo de ajuste.

Senales y procesamiento de datos

Los parametros que describen el color de la piel y que pueden medidos con el AGE Reader pueden relacionarse con dos tipos de espectros que son disponibles. Primero, el espectro que es medido directamente de la piel durante la 15 iluminacion con la fuente de luz UV. Este espectro incluye un largo pico de luz UV que es reflejado desde la piel y un pequeno pico de emision debido a la AF de los AGEs y posiblemente tambien a otros compuestos de la piel con la emision de fluorescencia en la misma region de longitud de onda, tales como NADH y lipofuscina. En segundo lugar, esta disponible un espectro de reflectancia que representa la reflectancia relativa de la piel en comparacion con un estandar de referencia blanco. Este espectro consiste de dos partes, una medida con la fuente de luz UV, ~ 350 - 20 410 nm, y uno medido con una fuente de luz blanca, ~ 415 - 675 nm. Los parametros estan basados en estudios de

la literatura y observaciones propias.

No se sabe si los parametros tal como se calculan a partir de los espectros son independientes de la edad del sujeto. Por lo tanto, tambien la edad del sujeto fue incluida en el modelo, para compensar posibles interacciones.

Los parametros fueron establecidos para normalidad y colinealidad utilizando SPSS (version 16, SPSS Inc., 25 Chicago, IL). Los parametros fueron considerados como normalmente distribuidos si la prueba de Kolmogorov- Smirnov dio como resultado un valor de p por encima de 0.05. Los parametros fueron considerados independientes si el nivel de tolerancia excedio de 0.01. Para analisis multivariado en retroceso, se consideraron los valores de p de umbral de 0.01 y 0.05.

Principio del algoritmo

30 Con los parametros formulados, se obtuvo un modelo de prediccion para AAF, utilizando un analisis por regresion lineal multiple en retroceso. Puesto que el AAF promedio esperado de cualquier grupo de sujetos saludables se asume como cero, el AAF predicho, AAFpred, fue utilizado entonces como una correccion para AFm como

AFcorr = AFm - AAFpred. (2)

Validacion

35 Puesto que los valores de AF de la piel bajos fueron observados primero en sujetos que teman una reflectancia UV por debajo de 10%, el algoritmo derivado para calcular el AF de la piel puede ser validado describiendo la AF de la piel como una funcion de la reflectancia UV. Para esto, se utilizo AF(edad) de piel corregido por la edad, AAFcorr = AFcorr - AF(edad). Los requerimientos son que AAFcorr no podna ser dependiente de la reflectancia UV y que la AAFcorr media debena ser cercana a cero. Adicionalmente, el incremento de los valores de AF de la piel con la edad 40 del sujeto debenan coincidir con los valores de referencia que se encontranan mas temprano [Koetsier 2010].

Resultados

Sujetos

La Tabla 1 resume el tamano de grupo, color de la piel y caractensticas de edad de las tres cohortes separadamente y como un todo, para el grupo de desarrollo de modelo y el grupo de validacion separadamente. Se utilizo la 45 reflectancia UV como una medida del color de la piel. En el primer grupo (sujetos de ascendencia afro-caribena), se excluyo un sujeto debido a un artefacto en uno de los espectros.

Tabla 1. Caractensticas de grupo de los conjuntos de datos usados.

[Reflectancia UV (%) |Edad (anos) |

5

10

15

20

25

30

35

grupo

tamanojmedia ± desviacion estandarjrango media ± desviacion estandarjrango

Mediciones usadas para desarrollo de modelo

grupo 1 (AC)

33 4.59 6 1.36 2.55 -7.99 41.5 6 11.5 20 -69

grupo 2 (SC)

33 9.16 6 1.54 6.69 -11.79 OO LO CO "3 0 21 -70

grupo 3 (VO)

33 8.49 6 2.21 4.13 -11.53 OO c\i CO CT> 0 Ty> CO 0 CM

Total

99 7.41 6 2.66 2.55 -11.79 40.9 6 13.3 20 -70

Mediciones usadas para validacion

grupo 1 (AC)

27 5.32 6 1.68 3.20 -10.40 LO CO CO CO 20 -70

grupo 2 (SC)

87 8.61 6 1.84 4.30 -11.55 CO CO OO cd Ty> CO "3 CM

grupo 3 (VO)

27 9.03 6 2.23 4.20 -11.68 33.7 6 10.4 20 -58

Total

141 8.06 6 2.31 3.20 -11.68 CO c\i CO CO cd 20 -70

Grupos considerados de sujetos afrocaribenos (AC) y Chinos del sur (SC) y sujetos de diversos ongenes (VO). Parametros para la prediccion de AAF

Los parametros propuestos que pueden predecir la desviacion de AF a partir de un valor esperado, AAF, se describe a continuacion. La mayona de los parametros estan relacionados con la melanina, hemoglobina o bilirrubina, puesto que estos son los absorbentes mas fuertes en la piel. Los parametros fueron analizados en cuanto correlaciones utilizando el conjunto de datos de 99 sujetos. La Tabla 2 resume las propiedades predictivas de los parametros analizados.

Las figuras 2 y 3 muestran reflectancia tfpica y, respectivamente, los espectros de emision de tres sujetos con valores de reflectancia UV de 4.4%, 8.0% y 11.4%, respectivamente. Los espectros de reflectancia muestran algunas caractensticas distintivas, que se consideran causadas por la absorcion de la melanina, hemoglobina y otros cromoforos. La intensidad de estas caractensticas vana entre sujetos y esta informacion se utiliza para formular los diversos parametros descritos mas abajo. Como se esperaba, la reflectancia promedio de un sujeto con un color de piel oscuro es inferior. La Figura 3 muestra que la intensidad de emision medida es inferior para sujetos con color de piel mas oscura tambien.

Reflectancia en el rango UV

Desde el inicio del desarrollo del AGE Reader, la reflectancia UV ha sido utilizada como una indicacion del color de la piel. Con este valor, se encontro que la AF de la piel es inferior que la esperada en sujetos con colores de piel mas oscuros, pero no se encontro relacion lineal con AAF [Mulder 2006]. Se propuse el valor inverso de UV reflectancia (InvRef1) y se encontro linealmente relacionado con AAF. InvRef1 como parametro en el modelo, no la reflectancia Uv en sf misma.

Parametros relacionados con la melanina

La cantidad de melanina puede ser expresada como un mdice. Sinichkin et al. [Sinichkin 2002] proveyeron tres rangos de longitud de onda en los cuales la relacion entre la reflectancia en dos longitudes de onda (o la pendiente en un espectro logantmico) pueden ser utilizadas para determinar este mdice.

Primero, la longitud de onda UV-A, debido al uso de la alta absorcion de la melanina en UV. El rango de longitud de onda sugerido va de 365 - 395 nm. En AGE Reader, la fuente de luz UV es iluminante en este rango.

Sin embargo, en nuestras mediciones se encontro que utilizando longitudes de onda 5 nm inferiores se obtema una mejor correlacion con AAF. Este rango de longitud de onda esta centrado alrededor de longitud de onda pico de la fuente de luz usada. El primer parametro de mdice de melanina (MI) fue definido como

M11 = R390 / R360, (3)

en donde R es reflectancia y los submdices denotan la longitud de onda en nm.

MI tambien puede ser derivada de la region del infrarrojo cercano, en donde la absorcion de hemoglobina es relativamente pequena. Kollias y Baqer utilizaron longitudes de onda de hasta 720 nm [Kollias 1985]. Sin embargo, la fuente de luz blanca en el aGe Reader no permite este rango, por lo tanto, se utilizaron longitudes de onda de hasta 675 nm. Puesto que las dos referencias [Kollias 1985, Dawson 1980] utilizaron diferentes longitudes de onda de partida, se utilizaron ambos pares 620 - 675 nm y 650 - 675 nm en nuestro estudio:

MI2 = 100 x (OD650 - OD675) (4)

MI3 = 100 x (OD620 - OD675) (5)

donde ODa es la densidad optica aparente a la longitud de onda A, definida como - log Ra.

Mientras que Sinichkin et al. propusieron estos pares de longitud de onda como relaciones en los espectros OD, Kollias y Baqer utilizaron una regresion a traves del espectro a cambio de ello. Este metodo es menos susceptible de artefactos puesto que no se basa sobre solamente dos valores en el espectro de reflectancia. Por lo tanto, 5 introdujimos otro parametro, RedLnSlope, que representa la pendiente de la lmea de regresion a traves del espectro de Ln(R) en la rango de 630 - 675 nm, multiplicada por 100.

Con mas melanina, la absorcion de melanina produce un descenso mas fuerte en el espectro de reflectancia total, especialmente en el rango UV donde la melanina es el absorbente mas importante. La figura 4 muestra parte del espectro de reflectancia normalizado medido con el AGE Reader en sujetos saludables con color de piel claro y 10 oscuro. Ambas lmeas representan la reflectancia promedio de seis sujetos, los cuales fueron seleccionados por tener valores de reflectancia UV similares (aproximadamente 18% para color de piel claro y aproximadamente 6% para color de piel oscuro). La forma del espectro de los sujetos con color de piel claro aparece convexa, mientras que la de los sujetos con color de piel oscuro se mostro concava. Esta forma puede ser cuantificada asumiendo una lmea en el espectro a partir de la reflectancia de 360 nm hasta la reflectancia de 390 nm y luego observando la 15 desviacion de la reflectancia de 375 nm desde la lmea. La desviacion UVforma de la forma a partir de una lmea recta fue definida como

UVforma = (R360 + R390) / (2 X R375) (6)

No se encontro correlacion entre UVforma y AAF para sujetos con colores de piel mas oscuros (R2 = 0.077). Sin embargo, se encontro una correlacion lineal entre UVforma y R390, la reflectancia de 390 nm, mostrando que UVforma es 20 en efecto dependiente del color de la piel. Con esta correlacion (R2 = 0.35), calculo una desviacion por medicion, como funcion de UVforma y R390:

dUVf orma = UVf orma + 0. 407 x R390- 1.036. (7)

Este valor de desviacion dUVforma fue encontrado correlacionado linealmente con AAF y fue utilizado como parametro.

25 Adicionalmente, los valores de reflectancia absolutos pueden ser correlacionados con AAF. Con el fin de evitar la interaccion con la hemoglobina, se tuvieron que utilizar longitudes de onda en donde la absorcion de la hemoglobina es relativamente baja. Aunque no se esperaban diferencias grandes en la saturacion de oxfgeno en sujetos saludables, la influencia de la saturacion de oxfgeno puede evitarse facilmente utilizando puntos isobestico, en donde la hemoglobina oxigenada y desoxigenada tiene igual absorcion.

30 La reflectancia en el mmimo de absorcion de hemoglobina y el punto isobestico alrededor de 500 nm fue establecida primeramente. Se encontro unna correlacion lineal con AAF despues de una transformacion logantmica. El parametro transformado se denomina como LnR500.

Finalmente, se introdujo RedRefl como reflectancia media en el rango de 620-675 nm.

Parametros relacionados con la hemoglobina

35 El eritema es una condicion en donde la influencia aparente de hemoglobina en la piel se incrementa. Sinichkin et al. [Sinichkin 2002] han resumido los parametros principalmente utilizados que establecen eritema como un mdice (EI), utilizando espectros de reflectancia. Estos indices pueden ser utilizados para describir la influencia de la hemoglobina sobre valores de AF de la piel. Se han utilizado dos metodos diferentes para describir el eritema. El primero esta basaba en el area bajo la curva espectral de la densidad optica aparente (OD) en el rango de 510 - 610 40 nm, calculado como

E11 = 100 x (OD560 + 1.5 x [OD545 + OD575] — 2.0 x [OD510 + OD610]), (8)

en donde este rango de longitud de onda fue escogido para incluir los picos de absorcion de hemoglobina espedficos.

El segundo metodo fue una version simplificada basada en la comparacion de la reflectancia a una longitud de onda 45 donde la absortividad de la hemoglobina es alta (560 nm) y a una longitud de onda donde la absortividad de la hemoglobina es baja (650 nm) [Zijlstra 2000]. El fndice de Eritema fue defino entonces como

EI2 = 100 x (OD560 — OD650) (9)

Ambos parametros se correlacionaron linealmente con AAF y fueron utilizaron en este modelo.

5

10

15

20

25

30

35

Aunque no se esperaba que el eritema fuera diferente como funcion del color de piel, se esperaba que una combinacion de mdice de eritema como calculado con los dos metodos sugeridos produciria un buen estimado de la influencia de la melanina, puesto que el metodo EI2 simplificado ignora la contribucion de la absorcion de la melanina, mientras que el primer metodo (EI1) seria independiente de la absorcion de melanina.

Adicionalmente, Feather et al. [Feather 1989] desarrollaron formulas que describen la concentracion de hemoglobina y la oxigenacion como indices, con base en las mediciones en puntos isobesticos. Estos indices fueron incluidos en el modelo como parametros

HI = 100 x ([OD544 - OD527.5] / 16.5 - [OD573 - OD544] / 29) (10)

y

OI = (5100 / HI) x ([OD573 - OD558.5] / 14.5 - [OD558.5 - OD544] / 14.5) + 42. (11)

Parametros relacionados con la bilirrubina

La bilirrubina tiene un pico de absorcion alrededor de 470 nm, el cual esta dentro del rango de emision de la medicion AF de la piel, y casi no tiene absorcion a 500 nm [Anderson 1981]. Para establecer la posible influencia adicional de la absorcion de bilirrubina, se incluyo la relacion de la reflectancia a 470 y 500 nm en el modelo como indice de bilirrubina:

BI = R470 / R500. (12)

Parametros relacionados con la emision

Se esperaba que ademas de los espectros de reflectancia, tambien los espectros de emision contenian informacion que podria ser correlacionada con AAF. Debido a que las intensidades absolutas estan relacionadas con el contenido de fluoroforos, solamente las intensidades relativas pueden ser utilizadas. Las relaciones de intensidades de emision en los pares de longitudes de onda 470 y 500 nm (Em1), 470 y 570 nm (Em2), asi como 600 y 650 nm (Em3) fueron incluidos como parametros. La relacion entre la emision media en los rangos de 470-500 nm y 600 - 650 nm fue incluida como parametro Emu.

Analisis univariado

En el conjunto de datos de 99 sujetos, los parametros tal como se describieron mas arriba fueron establecidos en cuanto a la correlacion lineal con AF corregido con la edad, AAF. La tabla 2 resume los coeficientes de correlation lineal univariados (R2 de Pearson) que fueron encontrados para las correlaciones entre AAF y los diversos parametros. Puesto que todos los parametros fueron disenados o transformados como tales, solamente existieron correlaciones lineales. La normalidad fue establecida utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov para cada parametro. Los valores de significado de la normalidad (p) tambien se muestran en la Tabla 2. Debe anotarse que no todos los parametros tuvieron una distribution normal.

Tabla 2. Resultados de correlaciones lineales invariadas. Para cada parametro en el modelo, se presenta el cuadrado del coeficiente correlacion de Pearson (R2). La normalidad se establece utilizando una prueba de Kolmogorov-Smirnov de una muestra.

Valores de p por encima de 0.05 indican una distribucion normal.

parametro

description R2 normalidad (P)

MI1

Radio de reflectancia a 390 y 360 nm 0.701 0.27

RedLnSlope

Pendiente de la linea a traves de ln reflectancia en 630 - 675 nm 0.681 < 0.01

MI3

Diferencia de OD a 620 y 675 nm 0.676 < 0.01

MI2

Diferencia de OD a 650 y 675 nm 0.651 < 0.01

LnR500

Logaritmo natural de reflectancia a 500 nm 0.638 < 0.01

RedRefl

Reflectancia media en el rango de 620 - 675 nm 0.564 < 0.01

dUVforma

Desviacion de reflectancia UV de la linea recta 0.541 0.65

EI2

Diferencia de OD a 560 and 650 nm 0.471 0.47

InvRef1

Inverso de reflectancia en rango UV 0.452 < 0.01

EI1

Area bajo la curva de espectro OD aparente en el rango de 510-610 nm 0.202 0.65

HI

Absorcion Hben puntos isobesticos 0.174 0.91

"T E LU

Relacion de emision en rangos 470 - 500 y 600 - 650nm 0.115 < 0.01

Edad

Edad del sujeto 0.105 0.60

CO E LU

Relacion de emision a 600 y 650 nm 0.082 < 0.01

BI

Relacion de reflectancia a 470 y 500 nm 0.080 0.88

Em1

Relacion de emision a 470 y 500 nm 0.029 < 0.01

Em2

Relacion de emision a 470 y 570 nm 0.004 0.20

OI

Indice de oxigenacion con base en la relacion de pico de absorcion sencillo/doble Hb 0.001 0.04

OD es definido como - log R^.

Determinacion del algoritmo mas preferido

Los parametros formulados tal como describio mas arriba fueron utilizados en un analisis por regresion lineal multiple en retroceso para encontrar un modelo para describir AAF. Cuando se utilizo un umbral p = 0.05, 5 contribuyeron cuatro parametros (dUVforma y los tres parametros que aparecen en la lista de la Tabla 3). El parametro con la contribucion relativa mas baja, dUVforma, tenia un valor p menor de la mitad del correspondiente a los parametros MI1 y RedLnSlope. Aqul, el coeficiente p de correlacion estandarizado representa la contribucion a un parametro especlfico con respecto a la contribucion de otros. R2 ajustado fue 0.814, no sustancialmente diferente del nivel R2 ajustado de 0.804 con el modelo de tres parametros, con un nivel de umbral de p < 0.01, el cual se muestra 10 en la Tabla 3. Tambien es posible proveer una prediccion razonable de otros parametros pendientes. Si por ejemplo el parametro de edad del sujeto no fue incluido, el R2 ajustado fue 0.731.

As! AAF puede ser predicho hasta un grado sustancial a partir de la combination lineal preferida de los parametros de la Tabla 3, y el nuevo algoritmo preferido para calcular la AF de la piel ha sido basado en estos parametros. Hay que anotar que, dependiendo de los instrumentos de medicion disponibles, puede ser en la practica preferible utilizar 15 otros de los parametros formulados. Por ejemplo mediante remplazando RedLnSlope por una relation de reflectancias por ejemplo a 630 nm y 675 nm (o rangos de por ejemplo 5, 10 o 20 nm adyacentes o alrededor de estos valores) o remplazar MI1 por la pendiente de la llnea a traves de ln en reflectancia entre 360-390 nm.

Tambien se establecio la colinealidad. Aunque la colinealidad se encontraba entre algunos parametros, los parametros significativos en el modelo son independientes (tolerancia por encima de 0.01).

20 Tabla 3. Parametros resultantes del analisis de regresion multiple. El modelo de tres parametros (umbral p < 0.01) ha sido un R2 ajustado de 0.804.

Parametro

P p Colinealidad

(contante)

0.007

MI1

0.406 0.000 0.226

RedLnSlope

-0.463 0.000 0.228

Edad

-0.274 0.000 0.977

Como puede verse en la Tabla 2, puede obtenerse tambien una contribucion predictiva sustancial a partir del logaritmo de la reflectancia 500 nm. Puede esperarse una contribucion predictiva similar a partir de la reflectancia a 25 una longitud de onda o rango de longitud de onda en un rango 450 a 525 nm, puesto que en ese rango la diferencia relativa entre la reflectancia de una piel clara y la reflectancia de una piel oscura (figura 2) es superior a la de otros rangos de longitud de onda. Tambien es posible utilizar la diferencia relativamente grande entre la reflectancia de una piel clara y la reflectancia de una piel oscura en el rango de longitud de onda de 450-525 nm utilizando la relacion entre la reflectancia en una primera longitud de onda o rango de longitud de onda en un rango de 450-525 30 nm y la reflectancia en una segunda longitud de onda o rango de longitud de onda en un rango superior a 620 o 625 nm como parametro en la correction de la AF medida para el color de la piel.

Una ventaja particular de la correccion de acuerdo con las reflectancias medidas en los rangos de 450-525 nm y por encima de 620 nm es que la perturbation debida a diferencias en la reflexion especular es menor que en el rango de 350-400 nm, donde el nivel de reflexion difusa es relativamente bajo.

35 En el aparato de acuerdo con el ejemplo mostrado en la figura 8, la determinacion sucesiva de AF y de reflectancias a las longitudes de onda de excitation, los rangos de longitud de onda de 450-525 nm y por encima de 620 nm pueden lograrse de manera sencilla conmutando secuencialmente encendiendo los LEDs 102, 125 y 126, siendo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

encendido cada LED siguiente despues del LED previo que ha sido apagado, y leyendo las intensidades de luz detectadas en ambos detectores 120, 122 cuando el LED 102 de UV-A esta activo y ningun detector 120 o 122 o ambos cuando los LEDs de 450-525 nm y por encima 620 nm estan activos.

Desde el punto de seguridad, se prefiere evitar que la radiacion inadvertida de radiacion UV-A desde la fuente de radiacion a traves de la abertura para irradiar la piel hacia los ojos de un sujeto u operador en el aparato. Tal irradiacion con radiacion UV-A tambien es al menos irritante y plantea un riesgo de salud para los ojos en particular cuando ocurre frecuentemente. Para evitar tal exposicion inadvertida de los ojos a la radiacion UV-A desde la fuente 2, 102 de radiacion de excitancion, los aparatos estan dispuestos preferiblemente para evitar que la fuente 2, 102 de radiacion de excitacion sea encendida a menos que la abertura 8, 108 sea cubierta por una superficie de piel que va a ser analizada. Esto se logra midiendo primero la reflectancia cuando el aparato es encendido y luego dando pasos solamente para encender la fuente 2, 102 de luz UV-A si ninguna o muy poca luz es detectada mientras que las otras fuentes de luz estan inactivas tambien - indicando esta ultima situacion que la abertura 8, 108 esta cubierta adecuadamente.

Se mantiene un riesgo residual en el evento de que el aparato se deje "ENCENDIDO" en una situacion sin luz ambiente o si una persona coloca el aparato con la abertura 8, 108 contra un ojo. Para evitar tales riesgos residuales tambien, las otras fuentes 19, 125, 126 de luz pueden ser activadas antes que permitir la activacion de la fuente 2, 102 de luz UV, permitiendo esto solamente por un intervalo de tiempo limitado de por ejemplo menos de 1, 2 o 10 segundos, si las caractensticas de reflectancia estan dentro de un representativo para una superficie de piel que va a ser irradiar. Se observa que estas caractensticas de seguridad son ventajosa tambien para un aparato que no esta dispuesto para la correccion de la AF de piel medida para diferencias en color de la piel, pero es de ventaja particular en combinacion con medios para analizar las caractensticas de reflectancia para la correccion por diferencias en el color de piel.

Validacion

Usando el algoritmo preferido como se obtuvo mas arriba, el valor corregido de AF de la piel, AFcorr como fue calculado utilizando

AFcorr = AFm + a1 MI1 + a2 RedLnSlope + a3 Edad, (13)

donde AFm es la AF de piel no corregida a medida, y a1 a 013 son constantes de multiplicacion que fueron derivadas utilizando el analisis de regresion multiple. El AF de piel (AFcorr) y el AF de piel ajustado con la edad (AAFcorr) fueron calculados para cada individuo en el grupo de validacion. AAFcorr fue calculado utilizando la ecuacion 1, utilizando AFcorr en vez de AFm. Este grupo consistfa de 27 sujetos de la cohorte afro-caribena, 87 sujetos de la cohorte del China del sur y 27 de la cohorte de sujetos de diversos ongenes. El AF de piel ajustado con la edad se muestra como una funcion de los valores de reflectancia UV en la figura 5, comparando tambien el nuevo algoritmo (b) y el viejo metodo para el calculo AF de piel (a). Con el nuevo algoritmo, la desviacion estandar media de AAFcorr como porcentaje de la AF de piel es 14.8%.

La figura 6 muestra los valores AF como una funcion de la edad del sujeto, calculados con el nuevo algoritmo (b) asf como sin correccion para el color de la piel (a). Los valores son comparados con la lmea de referencia estandar obtenida de sujetos de caucasicos [Koetsier 2010].

Discusion

La presente invencion provee un nuevo algoritmo de calculo para AF de piel, que permite una determinacion confiable de AF incrementado en piel en sujetos que tienen diferentes colores de piel. Para este algoritmo, se formularon parametros y se aplicaron a los espectros de reflectancia medidos sobre la piel. Conjuntos seleccionados de un numero pequeno de los parametros formulados se correlacionan con el descenso originalmente observado en los valores de Af de piel en sujetos con un color de piel oscuro muy bien.

La presente invencion permite corregir los valores de AF medidos con respecto al color de la piel utilizando espectros que son medidos individualmente en el rango UV-A y visible (por ejemplo 350 - 675 nm) y utilizando por lo tanto los mismos sensores que se utilizan para medir la reflectancia y la fluorescencia para obtener la relacion entre estos valores, asf como las mismas fuentes de radiacion que se utilizan para generar la radiacion de excitacion y la emision para medir reflectancia en el rango de longitud de onda de la fluorescencia. Para formular esta correccion, las principales caractensticas de solamente los absorbentes contribuyentes mas fuertes, melanina, hemoglobina y bilirrubina, han sido utilizados inicialmente como base para formular propiedades espectrales significativas que pueden predecir los valores de AF de piel mas bajos en sujetos con un color de piel oscuro.

El modelo preferido, que utiliza la edad del sujeto y dos parametros del espectro de reflectancia, invluye en mas del 80% del cambio relativo en los valores de AF de la piel en el conjunto de sujetos a los cuales se aplico el modelo preferido. El nuevo algoritmo de calculo, basado en este modelo, genera valores de AF de piel que son casi

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

independientes del color de la piel, incluso sin saber la composicion exacta de los cromoforos, fluoroforos y partfculas dispersantes en la piel.

] Si se utilizo un umbral de 0.05, el parametro dUVforma estana incluido, el cual tendna un valor p de menos de la mitad de aquel de los dos otros parametros MI1 y RedLnSlope. R2 ajustado no fue mejor que para el modelo preferido con solamente dos parametros espectrales. Por lo tanto, en este estudio, el umbral bajo de 0.01 fue escogido para excluir parametros del modelo.

En el estudio actual, solamente la edad y los parametros de MI1 y RedLnSlope de la Tabla 1 fueron necesarios para describir la influencia del color de la piel sobre la AF de la piel. Todos los otros parametros, incluyendo los parametros de los espectros de emision, podnan ser descartados del modelo. Un parametro relacionado con la bilirrubina aparecio como prometedor tambien, porque inicialmente se asumio que pequenos cambios podnan tambien tener influencias sobre la AF de piel medida, pero se encontro que tema poca influencia. No obstante, una influencia significativa de este parametro sobre la AF de la piel puede estar presente en condiciones tales como ictericia. De manera similar, los resultados presentes pueden no excluir que el eritema fuerte pueda tambien tener influencias sobre la AF de la piel.

La edad del sujeto es un elemento de prediccion importante para los valores de AF de la piel. Por lo tanto, un valor corregido por la edad, con base en valores de referencia de AF de piel en sujetos caucasicos [Koetsier 2010], fue utilizado en el modelo. Sin embargo, la dependencia en la edad de la AF de la piel puede ser diferente dependiendo de las diferencias raciales o culturales, por ejemplo, variaciones en la dieta o habitos de fumar. Aplicando la misma relacion de la AF de piel corregida y la edad a todos los sujetos, pueden utilizarse valores de referencia iguales, permitiendo la deteccion de la AF de la piel incrementada independiente del color de la piel. Nuestros resultados muestran que la AF corregida tiene el mismo incremento con la edad del sujeto para el grupo completo de sujetos de diferentes ascendencias.

La figura 5 muestra algunos sujetos que tienen valores de AF de piel mas altos que otros sujetos de la misma edad, incluso despues de la correccion (valor de AAF por encima de 1). Se asume que estos sujetos pueden haber desarrollado un riesgo cardiovascular incrementado, sin smtomas clmicos inmediatos. Debe anotarse que en la cohorte que fue utilizada para desarrollar el modelo, no se observaron valores incrementados de AF de la piel (no mostrados).

La inclusion de la edad del sujeto en el modelo puede parecer innecesaria al principio, puesto que el modelo fue disenado para predecir AAF, el cual refleja un valor independiente de la edad. Sin embargo, se asume que la edad podna tener un efecto sobre otros parametros. Aunque la edad no se correlaciono con ninguno de los parametros, se convirtio en un elemento de prediccion significativo en el modelo. Si la edad se deja fuera del modelo, el R2 ajustado desciende a 0.731.

Aunque no se ha intentado aun explicar ffsicamente estas observaciones, el estudio presente sugiere que para el proposito de establecer las AGEs de la piel, la influencia del color de la piel sobre las mediciones de AF puede ser descritas suficientemente utilizando la edad y los parametros MI1 y RedLnSlope, esto es, la relacion de dos valores de reflectancia en el rango de 360 - 390 nm y la pendiente de la reflectancia en el rango de 620 - 675 nm o parametros correspondientes que describen la relacion entre las reflectancias a longitudes de onda o rangos de longitud de onda en los extremos opuestos del rango de longitud de onda de excitacion y la relacion entre las reflectancias a diferentes longitudes de onda o rangos de longitud de onda en un rango por encima 620 nm o por encima de 625 nm, por ejemplo hasta 675 o hasta 880 o 900 nm nivel en el cual la pendiente de la curva de reflectancia difiere significativamente entre la piel coloreada clara y oscura. En el modelo preferido actualmente, esto da como resultado una desviacion estandar media de 14.8% de los valores AF, la cual es incluso inferior al 20% que se observo en el grupo caucasico de un estudio anterior [Koetsier 2010]. Por lo tanto, la presente invencion provee una tecnica para reconocer valores incrementados de AF de piel independientes del color de la piel, con una confiabilidad que es al menos similar a la confiabilidad alcanzable previamente para sujetos de color de piel claro solamente. Hay que anotar que es posible aplicar combinaciones de valores de AF medidos y valores de AF corregidos. Por ejemplo, es posible utilizar un valor de AF de la forma:

AF = x AF m + (1 — x) AFcorr ;

donde AFm es un valor de AF medido, esto es no corregido, AFcorr es un valor de AF corregido y x cuyo valor esta entre cero y uno, es una funcion de la reflectancia UV de un sujeto, de tal manera que por ejemplo x = 1 cuando la reflectancia UV de un sujeto excede (por decir algo) 10% y por ejemplo x = 0 cuando la reflectancia UV de un sujeto es menor de (por decir algo) 3%. Entonces, si x = 1, AF = AFm, y si x = 0, AF = AFcorr. En este caso, no se aplica correccion para sujetos con una reflectancia alta UV, mientras que la correccion completa es aplicada a sujetos con una reflectancia UV muy baja, mientras que en dicho ejemplo una correccion se aplica proporcionalmente a sujetos que tienen un reflectancia UV intermedia.

Hay que anotar adicionalmente que la solucion propuesta para corregir la AF medida es particularmente adecuada para la implementacion de una manera sencilla, pero no se requiere ninguno o muy poco hardware adicional. Si el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

instrumento esta equipado con un espectrometro, una fuente de luz blanca u otra que tenga un espectro de emision suficientemente amplio es suficiente para permitir el analisis del espectro de reflexion para obtener los parametros propuestos. Alternativamente, el aparato necesita solamente estar dispuesto para emitir y/o detectar selectivamente luz de longitudes de onda o rangos de longitudes de onda espedficos solamente, tales como los aparatos de acuerdo con el ejemplo mostrado en la figura 8.

Esto hace que la medicion de la AF de la piel para la determinacion no invasiva de niveles incrementados de AGEs en piel sean aplicables de manera mas general.

La descripcion anterior esta basa parcialmente en una publicacion de M. Koetsier et al., "Skin color independent assessment of aging using skin autofluorescence.", aceptada por Optica Express (© 2010 Optical Society of America, Inc.).

Literatura citada

[Alaluf 2002] S. Alaluf, D. Atkins, K. Barrett, M. Blount, N. Carter, and A. Heath, "Ethnic variation in melanin content and composition in photoexposed and photoprotected human skin.," Pigment cell research / sponsored by the European Society for Pigment Cell Research and the International Pigment Cell Society, vol. 15, 2002, pp. 112-8.

[Anderson 1981] R.R. Anderson and J.A. Parrish, "The optics of human skin.," J Invest Dermatol, vol. 77, 1981, pp. 13-19.

[Bachmann 2006] L. Bachmann, D. Zezell, A. Ribeiro, L. Gomes, and A. Ito, "Fluorescence spectroscopy of biological tissues-A review," Applied Spectroscopy Reviews, vol. 41, 2006, p. 575-590.

[Barsh 2003] G.S. Barsh, "What controls variation in human skin color?," PLoS Biol, vol. 1, 2003, p. E27.

[Chen 2007] R. Chen, Z. Huang, H. Lui, I. Hamzavi, D.I. McLean, S. Xie, and H. Zeng, "Monte Carlo simulation of cutaneous reflectance and fluorescence measurements--the effect of melanin contents and localization.," J Photochem Photobiol B, vol. 86, 2007, pp. 219-226.

[Coremans 1997] J.M. Coremans, C. Ince, H.A. Bruining, and G.J. Puppels, "(Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart.," Biophys J, vol. 72, 1997, pp. 1849-1860.

[Dawson 1980] J.B. Dawson, D.J. Barker, D.J. Ellis, E. Grassam, J.A. Cotterill, G.W. Fisher, and J.W. Feather, "A theoretical and experimental study of light absorption and scattering by in vivo skin.," Phys Med Biol, vol. 25, 1980, pp. 695-709.

[den Hollander 2007] N.C. den Hollander, D.J. Mulder, R. Graaff, S.R. Thorpe, J.W. Baynes, G.P. Smit, and A.J. Smit, "Advanced glycation end products and the absence of premature atherosclerosis in glycogen storage disease Ia.," J Inherit Metab Dis, vol. 30, 2007, pp. 916-923.

[Feather 1989] J.W. Feather, M. Hajizadeh-Saffar, G. Leslie, and J.B. Dawson, "A portable scanning reflectance spectrophotometer using visible wavelengths for the rapid measurement of skin pigments.," Phys Med Biol, vol. 34, 1989, pp. 807-820.

[Katika 2006] K.M. Katika and L. Pilon, "Steady-state directional diffuse reflectance and fluorescence of human skin.," Appl Opt, vol. 45, 2006, pp. 4174-4183.

[Koetsier 2009] M. Koetsier, H.L. Lutgers, A.J. Smit, T.P. Links, R.D. Vries, R.O. Gans, G. Rakhorst, and R. Graaff, "Skin autofluorescence for the risk assessment of chronic complications in diabetes: a broad excitation range is sufficient.," Opt Express, vol. 17, 2009, pp. 509-519. [Koetsier 2010] M. Koetsier, H.L. Lutgers, C. de Jonge, T.P. Links, A.J. Smit, and R. Graaff, "Reference values of skin autofluorescence.," Diabetes Technol Ther, vol. 12, 2010, pp. 399-403.

[Kollias 1985] N. Kollias and A. Baqer, "Spectroscopic characteristics of human melanin in vivo.," J Invest Dermatol, vol. 85, 1985, pp. 38-42.

[Kollias 1987] N. Kollias and A.H. Baqer, "Absorption mechanisms of human melanin in the visible, 400-720 nm.," J Invest Dermatol, vol. 89, 1987, pp. 384-388.

[Kollias 2002] N. Kollias, G. Zonios, and G.N. Stamatas, "Fluorescence spectroscopy of skin.," Vib Spectrosc, vol. 28, 2002, pp. 17-23.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[Lutgers 2009] H.L. Lutgers, E.G. Gerrits, R. Graaff, T.P. Links, W.J. Sluiter, R.O. Gans, H.J. Bilo, and A.J. Smit, "Skin autofluorescence provides additional information to the UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) risk score for the estimation of cardiovascular prognosis in type 2 diabetes mellitus.," Diabetologia, vol. 52, 2009, pp. 789-797.

[Magnain 2007] C. Magnain, M. Elias, and J. Frigerio, "Skin color modeling using the radiative transfer equation solved by the auxiliary function method.," Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision, vol. 24, 2007, pp. 2196-205.

[Matsumoto 2007] T. Matsumoto, T. Tsurumoto, H. Baba, M. Osaki, H. Enomoto, A. Yonekura, H. Shindo, and T. Miyata, "Measurement of advanced glycation endproducts in skin of patients with rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and dialysis-related spondyloarthropathy using non-invasive methods.," Rheumatol Int, vol. 28, 2007, pp. 157-160.

[Meerwaldt 2004] R. Meerwaldt, R. Graaff, P.H. Oomen, T.P. Links, J.J. Jager, N.L. Alderson, S.R. Thorpe, J.W. Baynes, R.O. Gans, and A.J. Smit, "Simple non-invasive assessment of advanced glycation endproduct accumulation.," Diabetologia, vol. 47, 2004, pp. 1324-1330.

[Meerwaldt 2005] R. Meerwaldt, J.W. Hartog, R. Graaff, R.J. Huisman, T.P. Links, N.C. den Hollander, S.R. Thorpe, J.W. Baynes, G. Navis, R.O. Gans, and A.J. Smit, "Skin autofluorescence, a measure of cumulative metabolic stress and advanced glycation end products, predicts mortality in hemodialysis patients.," J Am Soc Nephrol, vol. 16, 2005, pp. 3687-3693.

[Monami 2008] M. Monami, C. Lamanna, F. Gori, F. Bartalucci, N. Marchionni, and E. Mannucci, "Skin autofluorescence in type 2 diabetes: beyond blood glucose.," Diabetes Res Clin Pract, vol. 79, 2008, pp. 56-60.

[Mulder 2008] D.J. Mulder, P.L. van Haelst, S. Gross, K. de Leeuw, J. Bijzet, R. Graaff, R.O. Gans, F. Zijlstra, and A.J. Smit, "Skin autofluorescence is elevated in patients with stable coronary artery disease and is associated with serum levels of neopterin and the soluble receptor for advanced glycation end products.," Atherosclerosis, vol. 197, 2008, pp. 217-223.

[Mulder 2006] D.J. Mulder, T.V. Water, H.L. Lutgers, R. Graaff, R.O. Gans, F. Zijlstra, and A.J. Smit, "Skin autofluorescence, a novel marker for glycemic and oxidative stress-derived advanced glycation endproducts: an overview of current clinical studies, evidence, and limitations.," Diabetes Technol Ther, vol. 8, 2006, pp. 523-535.

[Na 2001] R. Na, I.M. Stender, M. Henriksen, and H.C. Wulf, "Autofluorescence of human skin is age-related after correction for skin pigmentation and redness.," J Invest Dermatol, vol. 116, 2001, pp. 536-540.

[Nielsen 2008] K.P. Nielsen, L. Zhao, G.A. Ryzhikov, M.S. Biryulina, E.R. Sommersten, J.J. Stamnes, K. Stamnes, and J. Moan, "Retrieval of the physiological state of human skin from UV-Vis reflectance spectra - a feasibility study.," J Photochem Photobiol B, vol. 93, 2008, pp. 23-31.

[Nishidate 2004] I. Nishidate, Y. Aizu, and H. Mishina, "Estimation of melanin and hemoglobin in skin tissue using multiple regression analysis aided by Monte Carlo simulation.," Journal of biomedical optics, vol. 9, 2004, pp. 700-10.

[Sandby-M0ller 2003] J. Sandby-M0ller, T. Poulsen, and H.C. Wulf, "Influence of epidermal thickness, pigmentation and redness on skin autofluorescence.," Photochem Photobiol, vol. 77, 2003, pp. 616-620.

[Sinichkin 2002] Y.P. Sinichkin, N. Kollias, G.I. Zonios, S.R. Utz, and V.V. Tuchin, "Reflectance and fluorescence spectroscopy of human skin in vivo," Handbook of optical biomedical diagnostics, V.V. Tuchin, Bellingham, WA, USA: SPIE Press, 2002, pp. 725-785.

[Stamatas 2006] G.N. Stamatas, R.B. Estanislao, M. Suero, Z.S. Rivera, J. Li, A. Khaiat, and N. Kollias, "Facial skin fluorescence as a marker of the skin's response to chronic environmental insults and its dependence on age.," Br J Dermatol, vol. 154, 2006, pp. 125-132.

[Ueno 2008] H. Ueno, H. Koyama, S. Tanaka, S. Fukumoto, K. Shinohara, T. Shoji, M. Emoto, H. Tahara, R. Kakiya, T. Tabata, T. Miyata, and Y. Nishizawa, "Skin autofluorescence, a marker for advanced glycation end product accumulation, is associated with arterial stiffness in patients with end-stage renal disease.," Metabolism, vol. 57, 2008, pp. 1452-1457.

[Zijlstra 2000] W.G. Zijlstra, A. Buursma, and O.W. van Assendelft, Visible and near infrared absorption spectra of human and animal haemoglobin, Zeist, The Netherlands: VSP BV, 2000.

[Zonios 2006] G. Zonios and A. Dimou, "Modeling diffuse reflectance from semi-infinite turbid media: application to the study of skin optical properties," Opt Express, vol. 14, 2006, pp. 8661-8674.

[Zonios 2008a] G. Zonios, A. Dimou, I. Bassukas, D. Galaris, A. Tsolakidis and E. Kaxiras, "Melanin absorption spectroscopy: new method for noninvasive skin investigation and melanoma detection," J Biomed Opt, vol. 13, 2008, 14017.

[Zonios 2008b] G. Zonios and A. Dimou, "Melanin optical properties provide evidence for chemical and structural 5 disorder in vivo.," Opt Express, vol. 16, 2008, pp. 8263-8268.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   Reivindicaciones

   1. Metodo para determinar un valor de autofluorescencia de tejido de piel de un sujeto, que comprende las etapas de:

   - irradiar material de dicho tejido de piel con radiacion de excitacion electromagnetica de una longitud de onda o rango de longitud de onda dentro del rango de excitacion de longitudes de onda de 300-420 nm;

   - medir una cantidad de radiacion fluorescente electromagnetica emitida por dicho material en respuesta de dicha irradiacion sobre un rango de longitudes de onda de 420-600 nm; y

   - generar, con base en dicha cantidad medida de radiacion fluorescente, un valor de autofluorescencia medido para el sujeto de interes;

   -medir una primera reflectancia medida a una primera longitud de onda o rango de longitud de onda y una segunda reflectancia medida a una segunda longitud de onda o rango de longitud de onda diferente de dicha primera longitud de onda o rango de longitud de onda, en donde dicha primera y segunda longitudes de onda o rangos de longitudes de onda estan ambas dentro del rango de excitacion de longitudes de onda con las cuales el tejido de piel es irradiado para excitacion, o ambos dentro del rango de longitudes de onda en los cuales la radiacion fluorescente emitida se mide, o ambos en un rango de longitudes de onda superiores a 620 nm, o en donde dicha primera longitud de onda o rango de longitud de onda esta en un rango de longitudes de onda de 450-525 nm y dicha segunda longitud de onda o rango de longitud de onda esta en un rango de longitudes de onda superior a 620 nm; y

   - generar un valor de autofluorescencia corregido corrigiendo la autofluorescencia medida de acuerdo con una relacion entre dicha primera y segunda reflectancias medidas de manera tal que la dependencia del valor de autofluorescencia corregido con diferentes reflectancias de UV en tejidos de piel, que diferentes sujetos puedan tener, es minimizada o al menos disminuida.
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la primera longitud de onda o rango de longitud onda esta en un rango de 360-365 nm y en donde la segunda longitud de onda o rango de longitud de onda esta en un rango de 390-395 nm.
3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la primera longitud de onda o rango de longitud esta en un rango de 620-650 nm y en donde la segunda longitud de onda o rango de longitud de onda esta en un rango superior a 675 nm.
4. 4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha primera longitud de onda o rango de longitud de onda esta en dicho rango de 450-525 nm, en donde dicha segunda longitud de onda o rango de longitud de onda esta en un rango superior 620 o 625 nm.
5. 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, estando dicha primera longitud de onda o rango de longitud de onda en dicho rango de longitudes de onda de 450-525 nm y estando dicha segunda longitud de onda o rango de longitud de onda en dicho rango de longitudes de onda superior a 620 nm, o de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, en donde la segunda longitud de onda o rango de longitud de onda esta por debajo de 900 nm.
6. 6. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la correccion es para una relacion entre reflectancia en la primera longitud de onda o rango de longitud de onda y en la segunda longitud de onda o rango de longitud de onda.
7. 7. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relacion entre la primera reflectancia medida a la primera longitud de onda o rango de longitud de onda y la segunda reflectancia medida a la segunda longitud de onda o rango de longitud de onda se obtiene determinando una pendiente de una grafica a partir de un logaritmo de una primera reflectancia medida a la primera longitud de onda o rango de longitud de onda con respecto a un logaritmo de la segunda reflectancia medida a la segunda longitud de onda o rango de longitud de onda.
8. 8. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde la grafica de la cual se determina una pendiente representa, en una escala logantmica, un espectro de reflexion obtenido del sujeto a longitudes de onda por encima de 620 nm.
9. 9. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el valor de autofluorescencia corregido es obtenido mediante la formula:

   AFcorr = AFm + a1 MI1 + a2 RedLnSlope + a3 Edad en la cual:

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   - AFcorr es el calor de autofluorescencia corregido;

   - AFm es el valor de autofluorescencia medido, esto es no corregido;

   - MI1 es una relacion de valores de reflectancia contra dicho tejido de piel en dos longitudes de onda diferentes en un rango de 300 nm - 420 nm de dicha radiacion de excitacion, o una pendiente en una escala logarftmica de un espectro de reflexion en dicho rango de 300 nm - 420 nm;

   - RedLnSlope es una pendiente en una escala logarftmica de un espectro de reflexion a longitudes de onda por encima de 620 nm, o a una relacion entre valores de reflectancia a longitudes de onda por encima de 620 nm;

   - Edad es la edad del sujetos de interes; y

   - ai, a2 y a3 son coeficientes determinados, por ejemplo, por analisis por regresion sobre un conjunto de datos de sujetos.
10. 10. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el valor de autofluorescencia corregido es obtenido corrigiendo la autofluorescencia medida de acuerdo con la desviacion de reflectancia sobre el rango de longitud de onda UV (300 - 420 nm) a partir de una lrnea recta.
11. 11. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un estimado de un contenido de Productos Finales de Glicacion Avanzada (AGEs) en dicho tejido (piel) del sujeto de interes se hace con base en el valor de autofluorescencia corregido.
12. 12. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde un estimado del contenido de Productos Finales de Glicacion Avanzada (AGEs) o del riesgo de salud del sujeto se hace con base en una combinacion del valor de autofluorescencia medido y el valor de autofluorescencia corregido.
13. 13. Un aparato para determinar un valor de autofluorescencia de tejido de piel de un sujeto, que comprende:

    una unidad de toma que comprende medios de radiacion, para irradiar in vivo y de manera no invasiva tejido de piel intacto tras una ventana de irradiacion particular con radiacion de excitacion electromagnetica de una longitud de onda o rango de longitud de onda dentro del rango de excitacion de longitudes de onda de 300-420 nm,

    medios de deteccion para medir radiacion fluorescente electromagnetica proveniente de dicho tejido de piel sobre un rango de longitudes de onda de 420-600 nm; y

    medios de generacion para generar un valor de autofluorescencia medida para dicho tejido de acuerdo con dicha cantidad medida de radiacion fluorescente que se origina a partir de dicho tejido;

    estando dispuestos dichos medios de deteccion y generacion de dicha radiacion adicionalmente para obtener una primera reflectancia medida a una primera longitud de onda o rango de longitud de onda y una segunda reflectancia medida a una segunda longitud de onda o rango de longitud de onda diferente de dicha primera longitud de onda o rango de dicha longitud de onda y dicha primera y segunda longitudes de onda o rangos de longitud de onda estan ambos dentro del rango de excitacion de longitudes de onda con los cuales el tejido de la piel es irradiado para excitacion, ambos dentro del rango de longitudes de onda en el cual la radiacion fluorescente emitida es medida, o ambos en un rango de longitudes de onda superior a 620 nm, o dicha primera longitud de onda o rango de longitud de onda esta en un rango de longitudes de onda de 450-525 nm y dicha segunda longitud de onda o rango de longitud de onda esta en un rango de longitudes de onda superior a 620 nm; y

    estando dispuestos dichos medios de generacion para corregir la autofluorescencia medida de acuerdo con una relacion entre dicha primera y segunda reflectancias medidas de manera tal que la dependencia del valor de autofluorescencia corregido con respecto a diferentes reflectancias de UV-tejido de piel que puedan tener diferentes sujetos respectivos, es minimizada o al menos disminuida.
14. 14. Aparato de acuerdo con la reivindicacion 13, en donde los medios de radiacion estan dispuestos para emitir selectivamente radiacion en al menos dos longitudes de onda o rangos de longitud de onda mutuamente distintos en un rango de longitudes de onda superior a 420 nm; y en donde los medios de deteccion estan dispuestos para detectar selectivamente la reflexion en al menos dos longitudes de onda o rangos de longitud de onda mutuamente distintos en el rango de longitudes de onda superiores a 420 nm.
15. 15. Un aparato de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, dispuesto para prevenir la activacion de los medios de radiacion para emitir la radiacion de excitacion electromagnetica a menos que no se detecte radiacion por los medios de deteccion.
16. 16. Un aparato de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde los medios de radiacion estan adaptados adicionalmente para irradiar tejido de piel tras la ventana de radiacion con radiacion electromagnetica en al menos un rango de longitudes de onda superior a 420 nm, y

    en donde dicho aparato esta dispuesto para evitar la activacion de los medios de radiacion para emitir la radiacion 5 de excitacion electromagnetica a menos que una reflectancia que satisfaga una caractenstica de referencia para una piel que va a ser irradiada sea detectada por los medios de deteccion cuando la piel es irradiada por los medios de radiacion con dicha radiacion electromagnetica en al menos el rango de longitudes de onda superior a 420 nm.