CN103167830A - 用于确定皮肤组织的自体荧光值的方法和设备 - Google Patents

Abstract

一种用于确定对象的皮肤组织的自体荧光值的方法，包括以下步骤：用至少一个波长和/或至少一个波长范围中的电磁激发辐射来照射所述皮肤组织的材料；测量由所述材料反应于所述照射而发出的电磁、荧光辐射的量；以及基于所述测量的荧光辐射的量来产生所关注对象的所测量的自体荧光值。所确定的自体荧光值是通过以下而得到的：以使得所确定的自体荧光值对各个不同对象可具有的不同UV皮肤组织反射率的依赖性最小化或者至少减小的方式，针对所述材料反应于这样的照射而来的激发谱和/或发射谱的反射部分的特性和/或针对以不同于所述至少一个波长的和/或不同于所述至少一个范围中的波长的反射率测量结果的特性来校正所测量的自体荧光值。

Description

用于确定皮肤组织的自体荧光值的方法和设备

技术领域

本发明涉及确定对象的皮肤组织的自体荧光（AF）值。

背景技术

测量皮肤AF是用于确定积累的组织晚期糖基化终产物（AGE）的量的无创性方法。皮肤AF和如戊糖素、Nε-羧基-甲基赖氨酸（CML）和Nε-羧基-乙基赖氨酸（CEL）的皮肤AGE的水平之间存在显著相关性，如从皮肤活检获得的那样：在皮肤活检验证研究的组合分析中，皮肤AF中76%的变化由皮肤活检戊糖素水平来解释[Meerwaldt 2004,2005,den Hollander 2007]（参见在详细描述之后参引的列表）。皮肤AF已示出随年龄增加，并且还是糖尿病、肾衰竭和具有增加的心血管风险的其他疾病中的并发症发展和恶化的独立预测指标[Meerwaldt 2005,Mulder 2008,Lutgers2009,Matsumoto 2007,Ueno 2008,Monami2008]。皮肤AF可以从基于UV-A激发的420nm至600nm范围的平均发射（即，在约315nm至400nm的范围内）（峰波长为370nm），例如用光学测量仪如AGE读出器（DiagnOptics Technologies BV，格罗宁根,荷兰，比如国际专利申请WO01/22869的内容通过引用并入本文）来测量。

已示出，与具有浅肤色的对象相比，具有较暗肤色（UV（紫外线）反射率低于10%）的对象中皮肤AF测量值通常导致较低的值[Mulder2006]。未预期这些对象具有基本较低量的AGE。因此，预期较低的AF值是由皮肤化合物的激发光或发射光的不同吸收和散射效应（尤其是在表皮中）以及镜面反射率所引起的。所观察到的肤色依赖性阻碍对具有较暗肤色的对象中皮肤AGE的可靠评价，并且抑制增加的皮肤AF值的识别。

文献提供了一些方法来描述吸收剂和散射剂对肤色的影响[Kollias1987,Nishidate2004,Zonios2006,Sandby-

2003]。

因而，具有较暗肤色的对象的皮肤AF测量结果的问题通常是，与具有相同AGE水平的浅肤色的对象相比，测量了较低的AF值。这意味着，对于不同肤色的人而言，如在已知方法中确定的皮肤AF值不是用于评价人的皮肤AGE水平的可靠基础，并且因而不能用于预测此人的相关健康风险。这使得已知技术一般不适于不同肤色的对象。

如之前由Coremans等[Coremans1997]所建议的那样，为了补偿肤色的不同，开始时将皮肤AF计算为发射范围中的平均光强度除以在激发范围中从组织反射的光的平均光强度。每当更多的黑色素或其他皮肤化合物吸收发射光时，它们也吸收更多的激发光，并且通过使这两个量相除，结果对吸收的依赖性将较低。使用该方法，皮肤AF可以可靠地得自具有Fitzpatrick皮肤分光型I-IV的对象。Stamatas等[Stamatas2006]还使用皮肤的反射率作为AF测量结果的归一化因子。他们还报道该方法是适当的，但是只用于较亮的皮肤类型。在AGE读出器中，使用从皮肤反射的UV-A光的平均强度进行简单的肤色评价。发现如果反射了多于10%的UV-A光，则可以可靠地评价皮肤AF[Mulder2006,Koetsier2010]。如在具有暗肤色的对象中，该方法不能补偿黑色素的强吸收。

在提到的（name）AGE读出器中，激发光源在350nm至410nm的范围中进行辐照，在420nm至600nm的范围中测量发射。在这些范围中的皮肤AF可能不仅仅是由皮肤AGE造成的。同样，其他的荧光团（如角蛋白、维生素D、脂褐质、蜡样质、NADH（还原型辅酶）和吡哆醇）可以增加总荧光信号[Bachmann2006]。此外，一些荧光团具有在上述荧光团（包括卟啉、弹性蛋白交联、FAD、黄素和磷脂）的发射范围内的最大激发。由于吸收和发射谱的重叠性质，如果并非是不可能的，则难以评价特异性荧光团对总荧光信号（尤其是用于AGE读出器中的宽激发峰）的影响。然而，在之前提到的验证研究的合并分析中，已示出即使使用该宽激发峰，特异性AGE的真皮含量也解释了皮肤AF信号变化（多至76%）的主要部分，此外，可以评价糖尿病中慢性并发症的风险[Koetsier2009]。

除了其他荧光团以外，皮肤中的非荧光发色团可以通过选择性地吸收激发光和/或发射光而对皮肤AF具有作用。UV-A和可见区域中最有贡献的发色团是表皮中的黑色素和真皮中的血红蛋白[Anderson 1981,Sinichkin 2002,Kollias 2002]。在表皮和真皮二者中，还存在胆红素和较小程度的β-胡萝卜素，分别在470nm和450nm处具有吸收峰[Anderson 1981,Bachmann 2006]。此外，广泛地认为黑色素和血红蛋白是主要的吸收剂。

已在体外深入地研究了黑色素的吸收谱[Zonios 2008a]。然而，黑色素存在于细胞器黑色素体的皮肤中，并且对肤色以及对AF的测量结果的作用受到皮肤中这些黑色素体的大小、数目、分布和聚集的影响，这些黑色素体在不同族群的个体之间的变化可以非常大[Alaluf 2002,Barsh 2003]。一般，黑色素从UV、可见光和光谱的近红外范围吸收光，对较低波长的吸收呈指数增加[Zonios 2008a,Zonios 2008b]。

血红蛋白在光谱的可见部分具有宽吸收光谱，具有若干吸收峰，并且因此是肤色中的重要因子[Anderson 1981,Feather 1989,Bachmann2006]。虽然，不预期血红蛋白浓度或分布就多种皮肤光分型而言非常不同，但是由于在皮肤中的光传播过程中与其他发色团（例如，黑色素）的相互作用，血红蛋白的表观光学特性及其对皮肤AF的影响可以不同。此外，血红蛋白在血管内的红细胞中聚集。因为血管中光的受限且波长依赖性的穿透深度，难以评价血红蛋白对皮肤AF的影响。此外，Na等观察了由皮肤发红引起的皮肤AF测量结果的变化，这取决于血红蛋白浓度或氧饱和[Na 2001]。

存在用以描述吸收剂和散射剂对肤色的影响的若干方法。一些方法使用了均质手段[Kollias 1987,Sinichkin 2002,Nishidate 2004,Zonios2006,Sandby-

2003]，而其他限定了皮肤中的许多层，每层具有单独的光学特性，其在对象之间可以不同[Magnain 2007,Nielsen 2008,Katika 2006,Chen 2007]。这些手段中的一些目的在于确定某些发色团的浓度或者识别特定的荧光团。

发明内容

本发明的一个目的是以更独立于皮肤性质的方式评价皮肤荧光以及提供用于使所测量的皮肤AF适于肤色的影响的方案。为了该目的，本发明提供了根据权利要求1所述的方法。本发明还可以体现在根据权利要求20所述的设备，其特别适于实施根据权利要求1所述的方法。

根据本发明，所确定的AF值是通过以下而得到的：以使得所确定的AF值对各个不同对象可具有的不同UV皮肤组织反射率的依赖性最小化或者至少减小的方式，针对所述材料反应于所述照射而来的激发谱和/或发射谱的反射部分的特性和/或针对以不同于所述至少一个波长的和/或不同于所述至少一个波长范围中的波长的反射率测量结果的特性来校正所测量的AF值。所述依赖性的最小化或者至少减小使得根据本发明的技术适用于具有多种皮肤特性的对象。

在从属权利要求中阐述了本发明的特定实施方案。

在以下详述中，通过非限制性实施例描述了本发明的其他考虑、细节、方面和实施方案。

附图说明

图1是用于对对象的皮肤进行辐照的UV黑光管和白色LED的强度谱图；

图2是UV反射率值分别为4.4%、8.0%和11.4%的三名对象的典型反射率谱图；

图3是UV反射率值分别为4.4%、8.0%和11.4%的三名对象的典型发射谱图；

图4示出如用AGE读出器从具有亮肤色和暗肤色的健康对象测量的归一化反射率谱的一部分；

图5是作为UV反射率的函数的经调整皮肤AF图，比较了用于计算皮肤AF的旧方法（a）和优选的新算法（b）；

图6是如用新算法（b）以及未对肤色进行校正（a）而计算的作为对象年龄的函数的AF值图；

图7是根据本发明的设备的第一示例的示意性表示；以及

图8是根据本发明的设备的第二示例的示意性表示。

具体实施方式

介绍

为了获得与较暗肤色的所测量AF的降低相关并因而具有预测性的参数，从光谱制定多种参数。使用这些参数，进行多重线性回归分析以确定所制定的参数如何涉及所测量的AF与为肤色校正的AF值的偏差。基于该模型，已构建用以计算经校正皮肤AF的优选算法和替选，并且然后使用对多种肤色的健康对象的测量结果进行验证。

在下文中，描述了根据本发明的方法和器件的示例，描述了关于AF测量结果的校正的一些实施方案的性能。

材料和方法

测量步骤

如图7所示用AGE读出器测量皮肤AF。图7所示的测量系统1包含测量单元13，测量单元13具有作为光源的荧光灯，荧光灯为UV-A黑光管2（F4T5BLB,Philips,Eindhoven,The Netherlands）的形式，峰波长为370nm。灯2布置在避光壳6的形式的支持结构内。壳6具有接触表面14，对着接触表面14安置有对象的前臂7的掌侧，以辐照前臂掌侧上的皮肤的约4cm²的表面23。光源2的光谱示于图1中。为了确定自体荧光波长范围中（即，激发辐射的波长范围外）的皮肤的反射特性，提供了白色LED的形式的第二光源19。该光源19的光谱也示于图1中。位于临近的照射窗8的边缘是非接触光学纤维3（直径为200μm）的端18，光学纤维3用于从约0.4cm²的皮肤表面以45°的角度α接收自体荧光发射光和反射激发光。通过光学纤维，从皮肤7接收的要检测的辐射以检测器的阵列22传到分光仪15（AvaSpec_2048,Avantes,Eerbeek,The Netherlands）。计算机16编程有用于分析经分析强度谱和用于在显示器17上产生表示皮肤7中的AGE含量的信号的计算机软件。通过显示器17，加载到计算机的软件使得产生表示与施加于皮肤7的辐射的波长范围之外的波长范围中的所测量的电磁辐射的量相一致的所测量的AF的信号。根据该示例，进一步将软件设计成用于处理通过测量窗18在施加于皮肤7的辐射的波长范围内的波长范围中测量的电磁辐射的量，目的是根据下述方法来校正皮肤组织的光学特性。

注意到分光仪的使用提供了这样的优点：其可以精确地确定在多大程度上窄波长带被视为AGE存在的指示。但是，也可以提供更紧凑且更易于携带的设备，其也更适于在患者的身体的不同部位携带。在图8所示的根据示例的显著较小的测量单元113中，作为激发辐射源，根据该示例，提供了LED102，其发出约370nm或者至少在300nm至420nm的范围中、优选为仅在窄带中（宽度为最高强度的一半，例如，10nm）的波长的辐射。

第二LED125布置为用于向皮肤7只发出波长为高于620nm或625nm并且优选地不高于900nm或880nm的范围的光。第三LED126布置为用于向皮肤7只发出波长为450nm至525nm的范围并且优选地为约500nm的光。

LED易于以脉冲形式或者调制形式控制，其有利地用于校正例如检测器122或环境光导致的暗电流。测量单元113具有用于屏蔽掉环境光的屏蔽件106和要对着皮肤7放置的具有限制边缘119的照射窗108。

为了检测来自皮肤7的辐射，使用可以同时检测来自皮肤7的辐射的两个检测器120、122，并且它们布置为与用于分析的计算机联接。布置在检测器122与皮肤7之间的是长通滤片121，其只通过波长大于例如400nm的辐射，使得检测器122只接收来自皮肤7的荧光诱导的波长范围中的辐射。检测器120优选地布置为用于检测来自皮肤7在LED102、125、126的积累的波长范围处的光的总量。

LED102、125、126和检测器120、122连接至与具有显示器117的计算机116联接的控制单元124。控制单元124布置为用以激活和去激活LED以及用以在计算机116的控制下输出从检测器120、122接收的检测辐射值。

可以连续激活LED以相继产生不同波长或波长范围和在不同波长或波长范围测量反射率和AF而不使用分光仪。将在下文的根据本发明方法的所述示例的上下文中讨论LED的操作。

代替两个检测器，还可以提供例如单一检测器和交替通过所有波长的辐射和仅高于特定波长的辐射的斩波器。这提供了防止了由两个检测器之间的差异引起的测量错误的优点，但引起测量单元的尺寸和机械复杂度的增加。

代替用于在不同波长或波长范围测量反射率的不同光源，还可以提供用于在不同波长或波长范围测量反射率的不同检测器。还可以使用在相同波长范围中检测光的多个检测器，例如，放置为与皮肤和（平行于皮肤）辐射源的距离不同。

在如上所示的示例中，检测器和光捕获光学纤维布置为与皮肤隔开。但是，当拾取单元对着皮肤放置时，检测器和/或光学纤维还可以布置为与皮肤接触。

所测量的皮肤AF的值计算为总发射强度（420nm至600nm）与总激发强度（300nm至420nm）之比乘以100，并且以任意单位（AU）表示。除了皮肤AF测量结果以外，UV反射率计算为来自皮肤的300nm至420nm的范围中的反射光的强度的总和除以相同范围中来自白色参考标准的强度的总和，其嵌入AGE读出器中并且针对外部反射率标准而被原位校准。此外，使用白色LED作为可见范围中的辐照源，得到了完全漫反射谱。该LED直接位于检测纤维下。LED的光谱也示于图1中。全部光谱被针对暗电流校准并贮存于文件中用于之后的分析。

对象

在该研究中使用了三组健康对象。第一组由居住于荷兰的具有黑人的暗肤色的加勒比黑人血统的61名对象组成。第二组是居住于中国的具有中间肤色的120名中国南方人对象组。第三组由全部居住于荷兰的60名亚洲血统和非洲血统的对象组成。通过临床评价（第一组和第二组）或者使用自行实施的问卷（第三组）获得健康状态。对于所有这些组，只包括UV反射率低于12%的对象和年龄为20岁至70岁的对象。如果未获得全部正确的光谱，则剔除对象。

为了评价年龄校正的皮肤AF和在UV-A和可见范围中得自反射率谱的多种参数之间的相关，从全部组中选择99名对象的子团体（每组33名对象）。选择集中于在全部年龄范围（20岁至70岁）和UV反射率值范围（约3%至12%）获得对象组，或者是随机的。对于验证而言，使用所有其他对象（N=142）。

模型概要

将使用根据本发明的新校正方法和优选的新算法获得的经校正AF值与描述所测量AF与预期值的偏差的现有模型进行比较。个体的预期AF可以描述为以岁计的对象年龄的函数，AF=0.024×年龄+0.83。该关系基于较大组的UV反射率值高于10%的高加索健康人[Koetsier2010]。这样，特定个体的皮肤AF的偏差计算为

ΔAF=AF_m–AF(年龄)=AF_m–0.024×年龄–0.83,     (1)

其中，AF_m是如所测量的皮肤AF。在拟合模型中，ΔAF被用作因变量。信号和数据处理

描述肤色并且可以使用AGE读出器测量的参数可以涉及两种类型的可以使用的光谱。第一，在用UV光源照明的过程中，直接从皮肤测量的光谱。该光谱包括从皮肤反射的UV光的大峰和小发射峰，这是因为AGE的AF以及可能还有具有相同波长区域中的荧光发射的其他皮肤化合物，如NADH和脂褐质。第二，可以得到表示与白色参考标准相比的相对皮肤反射率的反射率谱。该光谱由两部分组成，一部分用UV光源（约350nm至410nm）测量，一部分用白色光源（约415nm至675nm）测量。参数基于文献研究和自己的观察结果。

不知道如从光谱计算的参数是否独立于对象年龄。因此，对象年龄也包括于该模型中，以补偿可能的相互作用。

使用SPSS（16版，SPSS Inc.,Chicago,IL）评价参数的正态性和共线性。如果柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验（Kolmogorov–Smirnovtest）导致ｐ值高于0.05，则认为参数正态分布。如果容许水平超过0.01，则认为参数是独立的。对于向后多变量分析而言，认为p-值的阈值为0.01和0.05.

算法的原理

用制定的参数，使用向后多重线性回归分析得到ΔAF的预测模型。因为假设任意组健康对象的平均预期ΔAF为零，所以将预测的ΔAF即ΔAF_预测用作对于AF_m的校正：

AF_经校正=AF_m–ΔAF_预测          （2）

验证

因为首先在UV反射率低于10%的对象中观察到的低皮肤AF值，因此可以通过将皮肤AF描述作为UV反射率的函数来验证用于计算皮肤AF的导出算法。对于此，使用了年龄校正的皮肤AF（年龄），ΔAF_经校正=AF_经校正–AF(年龄)。要求是ΔAF_经校正不应当取决于UV反射率，并且平均ΔAF_经校正应当接近于零。此外，具有对象年龄的皮肤AF值的增加应当匹配见于早期发现的参考值[Koetsier2010]。

结果

对象

表1分别地和总体地（分别为模型发展组和验证组）总结了三组的组大小、肤色和年龄特征。UV反射率被用作肤色的测量结果。在第一组（加勒比黑人血统对象）中，一个对象因光谱之一的假象而被剔除。

表1.所使用的数据集的组特性

组由加勒比黑人（AC）和中国南方人（SC）对象和多种来源（VO）的对象组成。

用于预测ΔAF的参数

在下文中描述了可以预测AF与预期值的偏差ΔAF的提议参数。大多数参数与黑色素、血红蛋白或胆红素相关，因为这些是皮肤中的最强吸收剂。分析参数用于使用99个对象的数据集进行相关。表2总结了所分析的参数的预测性特性。

图2和3分别示出典型的反射率，三名对象的发射谱的UV反射率值分别为4.4%、8.0%和11.4%。反射率谱示出一些特殊特征，认为这些特征是由黑色素、血红蛋白和其他发色团的吸收引起的。在对象之间，这些特征的强度不同，该信息用于制定在下文中描述的多种参数。如所预期的，具有暗肤色的对象的平均反射率较低。图3也示出所测量的发射强度对于具有较暗肤色的对象而言较低。

UV范围中的反射率

自从AGE读出器开始发展以来，UV反射率就被用作肤色的指示。使用该值，发现在具有较暗肤色的对象中，皮肤AF低于预期，但没有发现与ΔAF的线性相关性[Mulder2006]。提出了UV反射率的逆值（InvRefl），并且发现其与ΔAF线性相关。InvRefl而非UV反射率本身被用作模型中的参数。

黑色素相关参数

黑色素的量可以表示为指标。Sinichkin等[Sinichkin2002]提供了三个波长范围，其中在两个波长处的反射率之比（或者对数谱的斜率）可用于确定该指标。

第一，UV-A波长，因为UV中黑色素的吸收高。建议的波长范围为365nm至395nm。在AGE读出器中，UV光源在该范围中照明。

但是，在我们的测量结果中，发现使用低出5nm的波长产生了较佳的与ΔAF的相关。该波长范围以所使用光源的峰波长为中心。第一黑色素指标（MI）参数定义为

MI₁=R₃₉₀/R₃₆₀,    （3）

其中，R是反射率，下标表示以nm计的波长。

MI还可以得自近红外区域，其中血红蛋白吸收相对小。Kollias和Baqer使用多至720nm的波长[Kollias1985]。但是，AGE读出器中的白色光源不允许该范围，因此，使用了多至675nm的波长。因为两个参考[Kollias1985,Dawson1980]使用不同的初始波长，所以在我们的研究中使用了两对620nm至675nm和650nm至675nm：

MI₂=100×(OD₆₅₀–OD₆₇₅)    (4)

MI₃=100×(OD₆₂₀–OD₆₇₅)    (5)

其中，OD_λ是在波长λ时的表观光学密度，定义为–logR_λ。

虽然Sinichkin等提出这些波长对作为OD光谱中的比，但是Kollias和Baqer代替采用通过光谱的回归。该方法不那么倾向于假象，因为其不只依赖于反射率谱中的两个值。因此，我们引入了另一参数，RedLnSlope，其表示通过630nm至675nm的范围中Ln（R）的光谱的回归线的斜率乘以100。

对于更多黑色素，黑色素吸收引起总反射率谱更强的降低，尤其是在其中黑色素是最重要的吸收剂的UV范围中。图4示出如用AGE读出器从具有亮肤色和暗肤色的健康对象测量的一部分归一化反射率谱。两条线都表示六名对象的平均反射率，该六名对象选择为具有相似的UV反射率值（就亮肤色而言为约18%，就暗肤色而言为约6%）。具有亮肤色的对象的谱形状示出凸状，而具有暗肤色的对象的谱形状示出凹状。可以通过在谱中假设一条从360nm处的反射率至390nm处的反射率的线，然后观察在375nm处反射率与线的偏差来对该形状进行量化。形状与直线的偏差UV_形状定义为

UV_形状=（R₃₆₀+R₃₉₀）/（2×R₃₇₅）。    （6）

对于具有较暗肤色的对象（R²=0.077）而言，在UV_形状与ΔAF之间未发现相关。但是，在UV_形状与在390nm处的反射率R₃₉₀之间发现了线性相关，示出UV_形状在事实上取决于肤色。对于该相关（R²=0.35），针对每个测量结果计算偏差，作为UV_形状与R₃₉₀的函数：

dUV_形状=UV_形状+0.407×R₃₉₀–1.036。    （7）

发现该偏差值dUV_形状与ΔAF线性相关，偏差值dUV_形状被用作参数。

此外，绝对反射率值可以与ΔAF相关。为了避免与血红蛋白相互作用，必须使用血红蛋白吸收较低处的波长。虽然在健康对象中不预期大差异的氧饱和，但是通过使用等消光点，可以容易地避免氧饱和的影响，其中，氧合血红蛋白和去氧合血红蛋白具有等吸收。

首先评价了在血红蛋白吸收最小和约500nm的等消光点处的反射率。在对数转换后发现了与ΔAF的线性相关。转换参数称为LnR₅₀₀。

最后，引入RedRefl作为620nm至675nm范围中的平均反射率。

血红蛋白相关的参数

红斑是其中皮肤中血红蛋白的表观影响增加的病症。Sinichkin等[Sinichkin2002]采用反射率谱总结了作为指标（EI）评价红斑的最常使用的参数。这些指标可用于描述血红蛋白对皮肤AF值的影响。使用了用以描述红斑的两种不同的方法。第一种基于在510nm至610nm的范围中表观光学密度（OD）的谱曲线下方的区域，计算为

EI₁=100×(OD₅₆₀+1.5×[OD₅₄₅+OD₅₇₅]-2.0×[OD₅₁₀+OD₆₁₀])，     (8)

其中，该波长范围选择为包括特定血红蛋白吸收峰。

第二种方法是基于以其中血红蛋白吸收率高的波长（560nm）与以其中血红蛋白吸收率低的波长（650nm）的反射率之比较的简化版本[Zijlstra2000]。因而，红斑指标定义为

EI₂=100×(OD₅₆₀–OD₆₅₀)。    （9）

两个参数均与ΔAF线性相关，并且用于该模型中。

虽然未预期红斑因肤色而不同，但是预期如用两种建议方法所计算的红斑指标的组合将产生黑色素影响的良好评估，因为简化的EI₂方法忽略了黑色素吸收的贡献，而第一方法（EI₁）应当独立于黑色素吸收。

此外，Feather等[Feather1989]基于等消光点处的测量结果，开发了描述血红蛋白浓度和氧合作用作为指标的等式。这些指标作为参数包含于模型中

HI=100×([OD₅₄₄–OD_527.5]/16.5–[OD₅₇₃–OD₅₄₄]/29)   （10）

和

OI=(5100/HI)×([OD₅₇₃–OD_558.5]/14.5–[OD_558.5–OD₅₄₄]/14.5)+42。  (11)

胆红素相关参数

胆红素具有在皮肤AF测量的发射范围内的470nm左右的吸收峰，并且在500nm处几乎没有吸收[Anderson1981]。为了评价胆红素吸收的可能的额外影响，在470nm和500nm的反射率之比作为胆红素指标包含于模型中：

BI=R₄₇₀/R₅₀₀。   （12）

发射相关参数

预期除反射率谱以外，发射谱也可包含与ΔAF相关的信息。因为绝对强度与荧光团含量相关，所以只可以使用相对强度。包含波长对470nm和500nm（Em₁）、470nm和570nm（Em₂）以及600nm和650nm（Em₃）处的发射强度之比作为参数。包含470nm至500nm范围和600nm至650nm范围的平均发射之比作为参数Em₄。

单变量分析

在99名对象的数据集中，如上所述的参数评价为与年龄校正的AF、ΔAF线性相关。表2总结了用于发现ΔAF与多种参数之间的相关的单变量线性相关系数（Pearson's R²）。因为所有的参数均如此设计或转换，所以只存在线性相关性。使用柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验来针对每个参数评价正态。正态（p）的显著性值也示于表2中。应当注意，并非所有参数都具有正态分布。

表2.单变量线性相关的结果。对于该模型中的每个参数，示出了Pearson相关系数的平方R²）。使用单样本柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验评价正态。p值大于0.05表示正态分布。

最优选算法的确定

如上所述的所制定的参数用于向后多重线性回归分析中以找到用以描述ΔAF的模型。当使用p=0.05阈值时，四个参数作出了贡献（dUV_形状和如表3所列出的3个参数）。具有最低相对贡献的参数dUV_形状的β值小于MI1参数和RedLnSlope参数的β值的一半。在本文中，标准相关系数β表示特定参数的贡献相对于其他参数的贡献。经调整的R²为0.814，并不在实质上不同于p<0.01阈值水平的三参数模型的经调整的R²水平0.804，其示于表3中。还可以提供这样的合理预测：可以将其他参数剔除在外。如果例如，不包括参数对象年龄，则经调整的R²是0.731。因而，ΔAF可以在很大程度上从表3中参数的优选线性组合来预测，并且用于计算皮肤AF的优选新算法基于这些参数。注意到根据可用的测量仪器，在实践中可以优选地使用其他的制定参数。例如，通过用例如630nm和675nm（或者例如接近这些值或这些值左右5nm、10nm或20nm的范围）处的反射率之比来代替RedLnSlope，或者用通过360nm至390nm的反射率的ln的线的斜率来代替MI₁。

还评价了共线性。虽然发现了一些参数之间的共线性，但是模型中的重要参数是独立的（容许度大于0.01）。

表3.多重回归分析所得到的参数。三参数模型（p<0.01阈值）的经调整的

R²为0.804。

如从表2可见，实质性的可预测贡献也可得自500nm处的反射率的对数。可以从在450nm至525nm的范围中的波长或波长范围的反射率来预期类似的预测性贡献，因为在该范围，亮皮肤的反射率与暗肤色的反射率之间的相对差（比如图2）相对于其他波长范围较高。还可以通过将在450nm至525nm的范围中的第一波长或波长范围的反射率与在620nm以上或625nm以上的范围中的第二波长或波长范围的反射率之比用作为在肤色的所测量的AF的校正中的参数来使用在450nm至520nm的波长范围中的亮皮肤的反射率与暗肤色的反射率之间的较大的差。

根据在450nm至525nm和620nm以上的波长范围中测量的反射率来校正的特殊优点是因镜面反射的差异引起的干扰小于350nm至400nm的波长范围，其中漫反射的水平较低。

在根据图8所示示例的设备中，可以以简单的方式通过顺次导通LED102、125和126，每次在前一LED关断之后导通下一LED，并且当UV-A LED102激活时从检测器120、122二者读取所检测的光强度、以及当450nm至525nm和620nm以上的LED激活时从检测器120和122之一或二者读取所检测的光强度，来得到425nm至525nm以及620nm以上的波长范围的激发波长的AF和反射率的连续确定。

从安全点出发，优选避免来自辐射源的UV-A辐射经用于辐射皮肤的开口而无意中辐射入对象或设备操作者的眼睛。采用UV-A辐射的这样的辐射至少辐射眼睛以及使眼睛面临健康危险，特别是当频繁发生时。为了避免眼睛对来自激发辐射源2、102的UV-A辐射的这样的无意暴露，设备优选地布置用于防止激发辐射源2、102导通，除非开口8、108由要分析的皮肤表面覆盖。这是通过如下来完成的：当设备导通时首先测量反射率，并且如果未检测到光或者只检测到非常少的光，则只给出用于导通UV-A光源2、102的间隙（clearance），而其他光源未激活，后者的情况表示开口8、108被充分覆盖。

该事件中剩余的风险是在没有环境光的情况下设备被置为“开”或者如果人将具有开口8、108的设备对着眼放置。为了避免这样的剩余风险，如果反射率特性在对要辐射的皮肤表面而言具有代表性的范围中，则可以在UV光源2、102的激活的间隙之前激活其他光源19、125、126，仅在例如小于1秒、2秒或10秒的限定的时间区间仅给出间隙。观察到这些安全特征对于未布置用于不同肤色的所测量的皮肤AF的校正的装置也是有利的，但是与用于分析不同肤色的校正的反射率特性的装置组合特别有利。

验证

使用如上所得到的优选算法，采用下式来计算皮肤AF的经校正值AF_经校正：

AF_经校正=AF_m+α₁MI₁+α₂RedLnSlope+α₃Age     （13）

其中，AF_m是所测量的未校正的皮肤AF，α₁至α₃是使用多重回归分析推导出的乘常数。针对验证组中的每名个体计算皮肤AF（AF_经校正）和年龄调整的皮肤AF（ΔAF_经校正）。使用AF_经校正代替AF_m来用等式（1）计算ΔAF_经校正。该组由来自加勒比黑人组的27名对象、来自中国南方组的87名对象和来自多种来源的对象组的27名对象组成。在图5中，年龄调整的皮肤AF表示为UV反射率值的函数，同时比较新算法（b）和用于计算皮肤AF的旧方法（a）。使用新算法，作为皮肤AF的百分数的平均标准偏差ΔAF_经校正是14.8%。

图6示出如用新算法（b）以及未对肤色进行校正（a）计算的、作为对象年龄的函数的AF值。将值与如从高加索人对象获得的标准参考线进行比较[Koetsier2010]。

讨论

本发明提供了用于皮肤AF的新计算方法，它使得可靠地确定具有不同肤色的对象中增加的皮肤AF。就该算法而言，参数被制定并如在皮肤上测量应用于反射率谱。所选择的组的小数目的制定参数与起初观察到的具有暗肤色之对象的皮肤AF值的减少非常相关。

本发明使得通过以下来校正不同肤色的所测量的AF值：使用在UV-A和可见范围（例如，350nm至675nm）内单独地测量的谱，因此，使用用于测量反射率和荧光的相同传感器来得到这些值之间的比，以及用于产生激发辐射的相同辐射源和用于在荧光的波长范围测量反射率的发射。对于制定该校正而言，只有最强的贡献吸收剂即黑色素、血红蛋白和胆红素的主要特性在开始时被用作用于制定如下重要谱特性的基础，该重要谱特性可预测具有暗肤色的对象中较低的皮肤AF值。

在向其施加了优选模型的对象组中，使用对象年龄和来自反射率谱的两个参数，优选模型确实说明了皮肤AF值的80%以上的相对变化。基于该模型，新的计算算法产生几乎独立于肤色的皮肤AF值，即使在未知皮肤中发色团、荧光团和散射颗粒的准确组成的情况下也是如此。

如果使用了0.05的阈值，则将包括额外的dUV_形状参数，其β值小于其他两个参数（MI₁和RedLnSlope）的β值的一半。调整的R²不比只具有两个谱参数的优选模型好。因此，在本研究中，选择了低阈值0.01用于从模型中剔除参数。

在本研究中，只有表1的MI₁和RedLnSlope参数和年龄有必要用以描述肤色对皮肤AF的影响。所有其他参数（包括来自发射谱的参数）将从模型中舍弃。胆红素相关参数也貌似理想，因为我们在开始时假设小的变化也可能影响所测量的皮肤AF，但发现影响很小。然而，在病症如黄疸中可以存在该参数对皮肤AF的显著影响。类似地，本结果不能剔除强红斑也可以影响皮肤AF。

对象年龄是皮肤AF值的重要指示。因此，基于高加索对象中皮肤AF的参考值[Koetsier2010]，年龄校正值用于该模型中。但是，皮肤AF的年龄依赖性可根据种族差异或文化差异（例如，饮食不同或者吸烟习惯）而不同。通过向所有对象施用经校正皮肤AF和年龄的相同关联，可以使用相等的参考值，使得能够检测独立于肤色的增加的皮肤AF。我们的结果表明，对于来自多种血统的对象的全部组，经校正AF随对象年龄具有相同的增加。

图5示出与相同年龄的其他对象相比，一些对象具有较高的皮肤AF值，即使在校正后也是如此（ΔAF值高于1）。我们假设这些对象可能已发展出增加的心血管风险，而没有立即的临床症状。应当注意，在用于开发模型的组中，未观察到增加的皮肤AF值（未示出）。

起初，在模型中包含对象年龄可能看起来没有必要，因为设计模型是用以预测反映独立于年龄的值的ΔAF。但是，假设年龄可对其他参数具有影响。虽然年龄不与任意参数相关，但是结果证实它是模型中的重要指示。如果从模型中剔除年龄，则调整的R²降低至0.731。

虽然我们尚未尝试在物理上解释我们的观察结果，但是本研究表明，为了评价皮肤AGE的目的，使用年龄和MI₁以及RedLnSlope参数（即，在360nm至390nm的范围中两个反射率值之比和在620nm至675nm的范围中反射率的斜率）、或者描述在激发波长范围的对端的波长或波长范围的反射率之间的关系和在大于620nm或大于625nm的范围中（例如，多至675nm或多至880nm或900nm或多至亮肤色和暗肤色之间反射率曲线的斜率显著不同的水平）的不同波长或波长范围的反射率之间的关系的相应参数可以充分描述肤色对AF测量结果的影响。在目前优选的模型中，这导致AF值的14.8%的平均标准偏差，其甚至低于从早期研究中在高加索组中观察到的20%[Koetsier2010]。因此，本发明提供了用于识别独立于肤色的增加的皮肤AF值的技术，可靠性至少类似于之前只对于亮肤色的对象可得到的可靠性。注意到可以施加所测量的AF值和经校正的AF值的组合。例如，可以使用以下形式的AF值：

AF=x AF_m+(1–x)AF_经校正；

其中，AF_m是测量的（即，未校正的）AF值，AF_经校正是经校正的AF值，x的值为0至1，它是对象的UV反射率的函数，使得例如当对象的UV反射率超过（比如（say））10%时，x=1，并且例如，当对象的UV反射率小于（比如）3%时，x=0。于是，如果x=1，则AF=AF_m，如果x=0，则AF=AF_经校正。在该情况下，对于具有高UV反射率的对象没有施加校正，而对于具有非常低的UV反射率的对象施加全校正，而在所述示例中，校正成正比地施加于具有中间UV反射率的对象。

还注意到，用于校正所测量AF的建议方案特别适于以简单的方式实施，因为不需要其他硬件或者需要非常少的其他硬件。如果仪器装配有分光仪，则具有充分地宽的发射谱的白色光源或其他光源足以使得分析反射谱以得到提议的参数。可替选地，设备只需要布置为用于选择性地只发射和/或检测特定波长或波长范围的光，如根据图8所示的示例的设备。

这使得增加水平的皮肤AGE的无创评价的皮肤AF的测量更一般地适用。

上述描述部分地基于M.Koetsier等的、由Optics Express(

2010Optical Society of America,Inc.)接受的出版物“Skin color independentassessment of aging using skin autofluorescence.”。

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Claims (24)

1.一种用于确定对象的皮肤组织的自体荧光值的方法，包括以下步骤：

-用至少一个波长和/或至少一个波长范围中的电磁激发辐射来照射所述皮肤组织的材料；

-测量由所述材料反应于所述照射而发出的电磁、荧光辐射的量；以及

-基于所述测量的荧光辐射的量来产生用于关注对象的所测量的自体荧光值；

其中，所确定的自体荧光值是通过以下而得到的：以使得所述所确定的自体荧光值对各个不同对象可具有的不同UV紫外线皮肤组织反射率的依赖性最小化或者至少减小的方式，针对所述材料反应于所述照射而来的激发谱和/或发射谱的反射部分的特性和/或针对以不同于所述至少一个波长的和/或不同于所述至少一个波长范围中的波长的反射率测量结果的特性来校正所述所测量的自体荧光值。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述所确定的自体荧光值是通过以下而得到的：根据以第一波长或波长范围的第一测量强度或反射率与以不同于所述第一波长或波长范围的第二波长或波长范围测量的第二测量强度或反射率之间的关系来校正所述所测量的自体荧光。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一波长或波长范围和所述第二波长或波长范围在所述皮肤组织被照射而激发的波长范围内。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述第一波长或波长范围在360nm至365nm的范围中，并且其中所述第二波长或波长范围在390nm至395nm的范围中。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述第一波长或波长范围和所述第二波长或波长范围在发出的荧光辐射被测量到的波长范围内。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述第一波长或波长范围在620nm至650nm的范围中，并且其中所述第二波长或波长范围在高于675nm的范围中。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述第一波长或波长范围在450nm至525nm的范围中，并且其中所述第二波长或波长范围在高于620nm或625nm的范围中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述第二波长或波长范围在900nm以下。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述校正针对以所述第一波长或波长范围与以所述第二波长或波长范围的反射率之比。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中通过对表示以所述第一波长或波长范围的所述第一测量强度或反射率至以所述第二波长或波长范围的所述第二测量强度或反射率的对数的图的斜率进行确定，得到以所述第一波长或波长范围的所述第一测量强度或反射率与以所述第二波长或波长范围的所述第二测量强度或反射率之间的关系。

11.根据权利要求10所述的方法，其中其斜率被确定的所述图表示以620nm以上的波长从所述对象得到的反射谱的对数。

12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中根据表示对象的年龄对反射率特性与所测量的自体荧光之间的关系的影响的因子来进一步校正所述所测量的自体荧光，并且其中随后将经校正的自体荧光值与所述年龄的人的参考自体荧光值进行比较。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述所确定的自体荧光值是通过下式得到的：

AF_经校正=AF_m+α₁MI₁+α₂RedLnSlope+α₃Age

其中：

-AF_经校正是所确定的即经校正的自体荧光值；

-AF_m是所测量的即未校正的自体荧光值；

-MI₁是以所述激发辐射的300nm至420nm的范围中的两个不同波长的所述皮肤组织的反射率值之比、或者是相关值诸如在所述300nm至420nm的范围中反射谱的对数的斜率。

-RedLnSlope是以620nm以上的波长的反射谱的对数的斜率、或者是相关值诸如以620nm以上的波长的反射率值之比；

-Age是所述关注对象的年龄；以及

-α₁、α₂和α₃是例如通过对象的数据集的回归分析所确定的系数。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过以下来得到所述所确定的自体荧光值：根据以波长或波长范围的反射率或者所述反射率的对数来校正所述所测量的自体荧光。

15.根据权利要求11所述的方法，其中通过根据所述反射率的对数校正所述所测量的自体荧光来得到所述所确定的自体荧光值，并且其中所述波长或波长范围在450至525的范围中。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过以下来得到所述所确定的自体荧光值：根据在UV波长范围（300nm至420nm）内反射率与直线的偏差来校正所述所测量的自体荧光。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于所述所确定的自体荧光值来估计所述关注对象的所述（皮肤）组织中积累的晚期糖基化终产物AGE的含量。

18.根据权利要求17所述的方法，其中基于所测量的自体荧光值与经校正的自体荧光值的组合来估计晚期糖基化终产物AGE的含量或对象的健康风险。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述组合为以下形式：

AF=x AF_m+(1–x)AF_经校正

其中，AF_m是所测量的自体荧光值，AF_经校正是经校正的自体荧光值，x的值在0至1之间并且为例如对象的UV反射率的函数，使得例如当对象的UV反射率超过在5%至20%之间的百分数时，x=1，并且当对象的UV反射率小于在1%至5%之间的百分数时，x=0。

20.一种用于确定对象的皮肤组织的自体荧光值的设备，包括：

具有辐射源的拾取单元，用于用电磁激发辐射入体并且无创地照射特定照射窗之后的完整皮肤组织；

用于测量来自所述皮肤组织的电磁荧光辐射的检测器；和

用于产生与来自所述组织的所述测量的荧光辐射的量相一致的所述组织的自体荧光值的装置；

所述装置被布置为用于针对所述材料反应于所述照射而来的激发谱和/或发射谱的反射部分的特性和/或针对以不同于所述至少一个波长的和/或不同于所述至少一个波长范围中的波长的反射率测量结果的特性来校正所测量的自体荧光值。

21.根据权利要求20所述的设备，其中所述辐射装置被布置为用于选择性地发射在高于420nm的范围中的至少两个彼此不同的波长或波长范围中的辐射。

22.根据权利要求20所述的设备，其中所述检测装置被布置为用于选择性地检测在高于420nm的范围中的至少两个彼此不同的波长或波长范围中的反射。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的设备，被布置为用于防止所述辐射源的激活，除非所述检测器基本检测不到辐射。

24.根据权利要求23所述的设备，还包括用基本只在高于420nm的至少一个波长范围中的电磁辐射来照射所述照射窗之后的皮肤组织的辐射源，

其中，所述设备被布置为用于防止所述辐射源的激活，除非在用基本只在高于420nm的至少一个波长范围中的所述电磁辐射来照射要被照射的皮肤时由所述检测器检测到满足所述皮肤的参考特性的反射率。

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