ES2568753T3 - Una firma pronóstica y terapéutica para melanoma maligno - Google Patents

Abstract

Un método de predecir el curso de la enfermedad en un paciente que tiene un melanoma maligno, el método comprende determinar en células de melanoma comprendidas en una muestra obtenida de dicho melanoma maligno la presencia o cantidad de al menos cinco biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en MTAP, PTEN, Bax, Bcl-X, ß-catenina, CD20, Cox-2, CD49d y MLH1, en donde la ausencia o cantidad disminuida de MTAP y ß-catenina y/o la presencia o cantidad aumentada de PTEN, Bax, Bcl-X, CD20, Cox-2, CD49d y MLH1 se asocia con un curso desventajoso de la enfermedad.

Description

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El término “Bax”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína X asociada a BCL2, que acelera la muerte celular programada uniéndose a, y antagonizando el represor de apoptosis BCL2 o su homólogo de adenovirus proteína E1B 19k. Bax también induce la liberación de citocromo c, la activación de CASP3, y por tanto apoptosis. Bax humana, por ejemplo, está representada por Entrez Gene ID 581 y UniProt ID Q07812 y se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 5 y 6. Bax se ha descrito en la técnica, por ejemplo, en Lowe et al., 2004.

Como se usa en el presente documento, el término “Bcl-X” se refiere a la proteína 1 similar a Bcl-2, que es un potente inhibidor de muerte celular e inhibe la activación de caspasas. Bcl-X humana, por ejemplo, está representada, por Entrez Gene ID 598 y UniProt ID Q07817 y se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 7 y 8. Bcl-X se ha descrito en la técnica, por ejemplo, en Lowe et al., 2004.

Como se usa en el presente documento, el término “β-catenina” se refiere a CTNNB1, que está implicada en la regulación de la adhesión celular. La mayor parte de β-catenina está localizada en la membrana celular y es parte de los complejos de adhesión E-cadherina/catenina que se propone que acoplan cadherinas al citoesqueleto de actina. También está implicada en la transducción de señales a través de la ruta Wnt y la β-catenina nuclear está implicada en regulación transcripcional por asociación con factores de transcripción de la familia TCF/LEF. La β-catenina humana está representada, por ejemplo, por Entrez Gene ID 1499 y UniProt ID P35222 y se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 9 y 10. β-Catenina se ha descrito en la técnica, por ejemplo, en Delmas et al., 2007.

El término “CD20”, como se usa en el presente documento, se refiere al antígeno de superficie celular de linfocitos B B1, que también tiene el nombre de MS4A1. Se considera que CD20 desempeña un papel importante en la regulación de la activación y proliferación de células B. CD20 humano está representado, por ejemplo, por Entrez Gene ID 931 y UniPOrot ID P11836 y se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 11 y 12. CD20 se ha descrito en la técnica, por ejemplo, en Zabierowski y Herlyn 2008.

Según la presente invención, el término “Cox-2” se refiere a prostaglandina-endoperóxido sintasa 2, también denominada PTGS2. Cox-2 media la formación de prostaglandinas a partir de araquidonato y también puede tener un papel como un mediador principal de inflamación y/o un papel para la señalización prostanoide en plasticidad dependiente de actividad. La proteína Cox-2 está caracterizada por el número EC 1.14.99.1. CD20 humana está representada, por ejemplo, por Entrez Gene ID 5743 y UniProt ID P35354 y se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 13 y 14. Cox-2 se ha descrito en la técnica, por ejemplo, en Meyer et al., 2009.

Como se usa en el presente documento, el término “CD49d” se refiere a integrina alfa 4, también denominada ITGA4, antígeno CD49D o subunidad alfa 4 del receptor VLA-4. Las integrinas alfa-4/beta-1 (VLA-4) y alfa-4/beta-7 son receptores para fibronectina. Reconocen uno o más dominios en las regiones CS-1 y CS-5 de ayuste alternativo de fibronectina. También son receptores para VCAM1. La integrina alfa-4/beta-1 reconoce la secuencia Q-I-D-S en VCAM1. La integrina alfa-4/beta-7 también es un receptor para MADCAM1. Reconoce la secuencia L-D-T en MADCAM1. En células endoteliales activadas la integrina VLA-4 desencadena agregación homotípica para la mayoría de las líneas celulares de leucocitos positivos para VLA-4. También puede participar en las interacciones de células T citolíticas con células diana. CD49d humano está representado, por ejemplo, por Entrez Gene ID 3676 y UniProt ID P13612 y se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 15 y 16. CD49d se ha descrito en la técnica, por ejemplo, en Kuphal et al., 2005.

El término “MLH1”, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína de reparación de mal emparejamiento de ADN Mlh1, que heterodimeriza con PMS2 para formar MutL alfa, un componente del sistema de reparación de mal emparejamiento de ADN post-replicativo. También heterodimeriza con MLH3 para formar MutL γ, que desempeña un papel en meiosis y se ha implicado además en la señalización de daño a ADN, un proceso que induce parada del ciclo celular y que puede producir apoptosis en casos de daños importantes a ADN. MLH1 humana está representada, por ejemplo, por Entrez ID 4292 y UniProt ID P40692 y se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 17 y 18. MHL1 se ha descrito en la técnica, por ejemplo, en Korabiowska et al., 2006.

Según este método de la presente invención, la ausencia o cantidad disminuida de MTAP y/o β-catenina se asocia con un curso desventajoso de la enfermedad, es decir, el melanoma maligno. En otras palabras, cuando se encuentra que uno o ambos de estos marcadores están ausentes o disminuidos en células de melanoma comprendidas en una muestra obtenida de un paciente, entonces esto aumenta la probabilidad de que dicho paciente tenga una recaída de la enfermedad. La presencia de uno o ambos de estos marcadores o niveles elevados de los mismos, sin embargo, hacen más probable que el paciente no tenga una recaída de la enfermedad. Además, según este método de la invención, la presencia o cantidad aumentada de PTEN, Bax, Bcl-X, CD20, Cox2, CD49d y/o MHL1 se asocia con un curso desventajosos de la enfermedad. Por tanto, cuando se encuentra que uno o más de estos marcadores están expresados o elevados en células de melanoma comprendidas en una muestra obtenida de un paciente, entonces esto hace más probable que el paciente tenga una recaída de la enfermedad mientras que la ausencia de uno o más de estos marcadores o niveles disminuidos de los mismos aumenta la probabilidad de que dicho paciente no tenga una recaída de la enfermedad.

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Según la presente invención, se encontró que un conjunto de 9 marcadores específicos permite la caracterización de células de melanoma comprendidas en una muestra de tejido de un melanoma maligno, proporcionando de esta manera un modelo de predicción independiente para el desenlace clínico y opciones de terapia dirigida, individualizada en pacientes con melanoma maligno. Una puntuación pronóstica basada en los niveles de expresión de dicho conjunto limitado de marcadores logró una precisión pronóstica mayor que cualquier otra combinación previamente usada de marcadores pronósticos en melanoma maligno y, por tanto, facilitará mucho la terapia adaptada al riesgo de pacientes de melanoma maligno. En otras palabras, basado en un análisis sencillo y económico de marcadores seleccionados de este conjunto limitado, es posible ahora obtener una evaluación del riesgo de un paciente individual de melanoma maligno para ser un paciente de mal pronóstico (curso desventajoso de la enfermedad), es decir, mostrar un alto riesgo de recaída de la enfermedad o ser un paciente de buen pronóstico (curso ventajoso de la enfermedad), es decir, mostrar un bajo riesgo de recaída de la enfermedad. El conocimiento de estos perfiles de expresión de marcadores permite además el tratamiento adaptado al riesgo, que es de beneficio para pacientes con melanoma maligno. Por ejemplo, un diagnóstico de expresión de MTAP permite a los médicos identificar pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con interferón, proporcionando de esta manera una nueva base para un uso dirigido claro de este caro agente inmunoterapéutico y la prevención de un índice considerable de efectos secundarios.

En particular, usando micromatrices de tejido (TMA), se analizaron retrospectivamente muestras de 364 pacientes con melanoma maligno primario. Se investigó un panel de 70 anticuerpos inmunohistoquímicos (IHC) para proteínas implicadas en ciclo celular, apoptosis, reparación de mal emparejamiento de ADN, diferenciación, proliferación, adhesión celular, señalización y metabolismo. Se empleó un procedimiento de selección de marcadores basado en regresión de Cox univariable y corrección para prueba múltiple para correlacionar los datos de expresión de IHC con el seguimiento clínico (supervivencia global y sin recaída). El modelo se evaluó rigurosamente con dos experimentos diferentes de validación cruzada, una prueba de permutación y un análisis de regresión de Cox multivariable. El poder predictivo de la firma de marcadores identificada se validó en una segunda cohorte de prueba externa independiente (n=225), dando de esta manera un total de 589 pacientes. Este estudio se adhiere a las recomendaciones descritas para estudios pronósticos de marcadores tumorales, es decir, implementa las directrices REMARK (J Natl Cancer Institute 2005; 97:1180-4).

Se evaluó el poder pronóstico de estos 70 marcadores, dando los 11 marcadores MTAP, PTEN, Bax, Bcl-X, βcatenina, CD20, Cox-2, CD49d, MLH1, TOP2A y Frizzled 7, que estaban significativamente asociados con supervivencia global. Mientras que los once marcadores estaban significativamente asociados con supervivencia global, fue posible reducir más el número de marcadores requeridos para una evaluación pronóstica a nueve (MTAP, PTEN, Bax, Bcl-X, β-catenina, CD20, Cox-2, CD49d y MLH1) basado en los coeficientes de regresión de Cox y corrección para prueba múltiple con FDR. Estos nueve marcadores se correlacionaban con muerte por cualquier causa. Dos de estos marcadores eran marcadores protectores (asociados con un cociente de riesgos de menos de 1,00) y siete eran marcadores de riesgo (asociados con un cociente de riesgos de más 1,00) (Fig. 4).

Por viabilidad clínica y ahorro de costes, cualquier conjunto de marcadores adecuados para la evaluación clínica rutinaria debe comprender un número limitado de marcadores. Por tanto, el fin era proporcionar un máximo de información pronóstica y terapéuticamente relevante mediante tan pocos marcadores como fuera posible, combinados en una firma clara. Según esto, se mostró que una reducción adicional de la firma de nueve marcadores aún produce información pronóstica y terapéuticamente relevante. Como prueba de principio, esto se llevó a cabo usando una firma de siete marcadores (Bax, Bcl-X, β-catenina, CD20, Cox-2, MTAP, PTEN), que se encontró que también proporcionaba información pronóstica y terapéuticamente relevante. Las muestras de TMA teñidas inmunohistoquímicamente que ilustran la firma de siete marcadores para un paciente con melanoma de alto riesgo y un paciente de bajo riesgo se muestran en la tabla 3.

Además, la reducción adicional del conjunto de siete marcadores en uno o dos marcador(es), respectivamente, es decir, CD20 y PTEN, produjo un conjunto de seis/cinco marcadores que se correlacionaba significativamente con supervivencia global y sin recaída, como se muestra en los ejemplos 5 y 6, y las figuras 6 y 7 posteriormente.

Los datos obtenidos para la firma de siete marcadores se pueden extender razonablemente a conjuntos de marcadores que comprenden solo cinco marcadores o seis marcadores, debido a la alta coincidencia y correlación de algunos de los marcadores, tal como, por ejemplo, la expresión de Bax y Cox-2 en las muestras de melanoma analizadas (véase la figura 5). En otras palabras, cuando un primer marcador muy correlacionado está comprendido en el conjunto de marcadores analizados, entonces la información proporcionada por un segundo marcador correlacionado a dicho primer marcador podría estar limitada y, consecuentemente, tales marcadores se pueden omitir.

Con un total de 24.674 muestras de sacabocados de melanoma maligno primario analizadas por IHC, este estudio de TMA es más extenso que estudios previos descritos en la técnica (según el conocimiento de los inventores). La firma detectada podría servir como una herramienta pronóstica que permite a los médicos elegir selectivamente, en el momento del diagnóstico y la cirugía inicial, el subconjunto de pacientes en estadio I-II con alto riesgo de recaída para terapia adyuvante. El tratamiento selectivo de esos pacientes que es más probable que desarrollen enfermedad

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0,4*Bax + 0,3*PTEN + 0,3*COX2. En otras palabras, la puntuación obtenida para MTAP se multiplica por -0,6, la puntuación obtenida para β-catenina se multiplica por -0,3, la puntuación obtenida para CD20 se multiplica por 0,5 y así sucesivamente. La suma de todas estas puntuaciones ponderadas proporciona una puntuación de riesgo pronóstico para cada paciente. Por ejemplo, y como se muestra en los ejemplos adjuntos, cuando se empleó un sistema de puntuación de 0 a 4, se encontró que una puntuación de riesgo por debajo de 0,135 era indicativa de un buen pronóstico para dicho paciente mientras que se encontró que una puntuación de riesgo por encima de 0,135 era indicativa de un mal pronóstico para dicho paciente.

En una forma de realización preferida del método de la invención, los al menos cinco marcadores incluyen PTEN y/o MTAP.

Por tanto, el conjunto de biomarcadores empleado según esta forma de realización preferida comprende al menos PTEN o MTAP, más preferiblemente PTEN y MTAP.

Se mostró que la expresión de MTAP según la presente invención era el marcador más fuerte para un desenlace favorable de la enfermedad (coeficiente de -0,621) y es, además, de relevancia terapéutica. En el tratamiento adyuvante de melanoma maligno, interferón alfa es actualmente el único agente terapéutico clínicamente aceptado que proporciona un beneficio de supervivencia (sin recaída) significativo para un porcentaje de pacientes pequeño, pero claro34. Debido a los efectos secundarios graves y el alto coste de la terapia, es ventajoso determinar esos pacientes con una posibilidad realista de beneficiarse del tratamiento con interferón. Se ha mostrado recientemente que hay una clara asociación entre la expresión de MTAP en el melanoma primario y la evolución del melanoma e, incluso de forma más importante, respuesta a tratamiento con interferón13,28,35 . Los biomarcadores como MTAP podrían, por tanto, permitir a los médicos evaluar qué pacientes se pueden beneficiar del tratamiento con interferón y, por tanto, podría proporcionar una nueva base para un uso dirigido claro de este caro agente inmunoterapéutico y prevenir los efectos secundarios graves asociados con el tratamiento con interferón.

La fosfatasa supresora de tumores y homólogo de tensina PTEN se identificó como otra proteína de firma. PTEN contrarresta una de la rutas que fomentan cáncer más críticas28, la ruta se señalización de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/Atk. Una consecuencia establecida de la inactivación de PTEN es la activación anómala constitutiva de la ruta de señalización de PI3K que dirige el crecimiento, proliferación y supervivencia celular incontrolados (Zhang y Yu, 201028). Por tanto, incluir PTEN en el análisis no solo proporciona una herramienta diagnóstica, sino que también puede ser de relevancia predictiva. En general, las células cancerosas contienen múltiples anomalías genéticas y epigenéticas. A pesar de esta complejidad, su crecimiento y supervivencia con frecuencia se puede alterar por la inactivación de un único oncogén. Este fenómeno, llamado “adicción oncogénica”, proporciona un fundamento para la terapia molecular dirigida. La eficacia de esta estrategia requiere métodos novedosos, incluyendo genómica integrante y biología de sistemas, para identificar el estado de la adicción oncogénica (es decir, el “talón de Aquiles”) en cánceres específicos. También se puede requerir terapia de combinación para prevenir el escape de cánceres de un estado determinado de adicción oncogénica (Weinstein y Joe 200847). Por tanto, incluir PTEN en el análisis no solo proporciona una herramienta diagnóstica, sino que también es de relevancia terapéutica.

En otra forma de realización preferida del método de la invención, se determinan al menos siete biomarcadores.

En una forma de realización más preferida, los al menos 7 biomarcadores son MTAP, PTEN, Bax, Bcl-X, β-catenina, CD20 y Cox-2.

Según la presente invención, se ha mostrado que este conjunto de siete biomarcadores está fielmente asociado con el pronóstico de pacientes con melanoma maligno y, por tanto, puede servir como un factor de predicción independiente para supervivencia global y sin recaída en pacientes con melanoma maligno.

Entre los 362 pacientes de la cohorte primaria, los pacientes con dicha firma de siete marcadores de alto riesgo tuvieron una supervivencia global mediana más corta que los pacientes con una firma de siete marcadores de bajo riesgo (88 meses frente a no alcanzada) y la diferencia entre los dos grupos de pacientes era muy significativa (p=0,0000000042) (Fig. 1D). La firma de siete marcadores de alto riesgo se asoció con una supervivencia sin recaída mediana de 33 meses, mientras que la firma de siete marcadores de bajo riesgo se asoció con una supervivencia sin recaída mediana de 88 meses (LTR p=0,00034) (Fig. 1E). Según un análisis de regresión de Cox multivariable, la puntuación de riesgo de siete marcadores, espesor tumoral, sexo, y edad estaban asociados significativamente con muerte por cualquier causa entre los 356 pacientes (6 observaciones se eliminaron debido a valores que faltaban) (Tabla 1). Además, un análisis de subgrupo de 253 pacientes con una profundidad tumoral de ≤2 mm reveló que esos 148 pacientes con una firma de marcadores de alto riesgo tenían una supervivencia global (p=0,0053) (Fig. 3A) y supervivencia sin recaída (p=0,008) más cortas que los 105 pacientes con una firma de marcadores de bajo riesgo (Fig. 3B).

Análisis de regresión de Cox

Valor p:

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Cociente de

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marcadores determinados en el paso (i); y (iii) proporcionar al menos un compuesto farmacéutico basado en la pauta de tratamiento derivada en el paso (ii).

Según esta forma de realización, el curso de la enfermedad se determina para un paciente que tiene un melanoma maligno y, además, los datos obtenidos determinando la presencia o cantidad de al menos cinco biomarcadores seleccionados del grupo que comprende o consiste en MTAP, PTEN, Bax, Bcl-X, β-catenina, CD20, Cox-2, CD49d y MLH1 se emplea para derivar una pauta de tratamiento para el paciente individual, es decir, para preparar una composición farmacéutica a medida.

El término “composición farmacéutica”, como se usa en el presente documento, se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica de la invención comprende un compuesto terapéutico, tal como, por ejemplo, un compuesto seleccionado de los compuestos enumerados posteriormente, solo o en combinación. Puede comprender, opcionalmente, moléculas adicionales capaces de alterar las características de estos compuestos, por ejemplo, estabilizando, modulando y/o activando de esta manera su función. La composición puede estar, por ejemplo, en forma sólida o líquida y puede estar, entre otras, en la forma de (un) polvo(s), (un) comprimido(s), (una) solución(es) o (un) aerosol(es). La composición farmacéutica de la presente invención puede, opcional y adicionalmente, comprender un soporte farmacéuticamente aceptable. Mediante “soporte farmacéuticamente aceptable” se quiere decir un relleno, diluyente, material encapsulante no tóxico, sólido, semisólido o líquido o formulación auxiliar de cualquier tipo. Los ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tal como emulsiones de agua/aceite, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, solventes orgánicos incluyendo DMSO, etc. Las composiciones que contienen tales soportes se pueden formular por métodos convencionales bien conocidos.

Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada. La pauta posológica será determinada por el médico y factores clínicos. Como se sabe bien en las artes médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, edad, el compuesto particular que se va administrar, sexo, tiempo y ruta de administración, salud general, y otros fármacos que se administran al mismo tiempo. La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación determinada se determinará fácilmente por experimentación rutinaria y está dentro de las capacidades y juicio del clínico o médico normal. El experto en la materia sabe que la cantidad eficaz de una composición farmacéutica administrada a un individuo dependerá, entre otros, de la naturaleza del compuesto. Por ejemplo, si dicho compuesto es un polipéptido, la cantidad farmacéuticamente eficaz total de una composición farmacéutica administrada por vía parenteral por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 1 µg de proteína/kg/día hasta 10 mg de proteína/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, como se ha indicado anteriormente, esto será objeto de discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es al menos 0,01 mg/kg/día, y lo más preferiblemente para seres humanos entre aproximadamente 0,01 y 1 mg de proteína/kg/día. Además, si por ejemplo dicho compuesto es un agente de ARNi, tal como un ARNip, la cantidad farmacéuticamente eficaz total de la composición farmacéutica administrada típicamente será menor de aproximadamente 75 mg por kg de peso corporal, tal como, por ejemplo, menos de aproximadamente 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 o 0,0005 mg por kg de peso corporal. Más preferiblemente, la cantidad será menor de 2000 nmol de agente de ARNi (por ejemplo, aproximadamente 4,4 x 1.016 copias) por kg de peso corporal, tal como, por ejemplo, menos de 1.500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075 o 0,00015 nmol de agente de ARNi por kg de peso corporal. La duración del tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo después del tratamiento para que se produzcan respuestas varía dependiendo del efecto deseado. Las cantidades particulares se pueden determinar por pruebas convencionales que conoce bien el experto en la materia.

Las composiciones farmacéuticas como se describen se pueden, por ejemplo, administrar por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intraperitoneal, tópica (mediante polvos, pomadas, gotas o parche transdérmico), yugal, o como un espray nasal. El término “parenteral” como se usa en el presente documento se refiere a modos de administración, que incluyen inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraesternal, subcutánea e intraarticular.

El compuesto terapéutico, como se ha descrito se puede, por ejemplo, seleccionar del grupo que consiste en anticuerpos, aptámeros, ARNip, ARNhc, miARN, ribozimas, moléculas de ácido nucleico antisentido, y una molécula pequeña. Los compuestos terapéuticos incluyen, además, pero no están limitados a, por ejemplo, péptidos tal como péptidos solubles, incluyendo péptidos de fusión con colas de Ig y miembros de bibliotecas de péptidos aleatorios (véase, por ejemplo, Lam et al. (1991) Nature 354: 82-84; Houghten et al. (1991) Nature 354: 84-86) y bibliotecas moleculares derivadas de química combinatoria hechas de aminoácidos en configuración D y/o L o fosfopéptidos (por ejemplo, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos, aleatorios y parcialmente degenerados, véase, por ejemplo, Songyang et al. (1993) Cell 72: 767-778).

El término “anticuerpo” como se usa según la presente invención comprende anticuerpos policlonales y monoclonales, así como derivados o fragmentos de los mismos, que aún retienen la especificidad de unión. Fragmentos o derivados de anticuerpos comprende, entre otros, fragmentos Fab o Fab’ así como fragmentos Fd, F(ab’)2, Fv o scFv; véase, por ejemplo, Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor

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Laboratory Press, 1988 y Harlow y Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. El término “anticuerpo” también incluye formas de realización tal como anticuerpos quiméricos (dominio constante humano, dominio variable no humano), monocatenarios y humanizados (anticuerpo humano con la excepción de CDR no humanas). El término anticuerpos también abarca peptidomiméticos.

Varias técnicas para la producción de anticuerpos se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane (1988) y (1999), loc. cit. Además, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, entre otros, patente en EE UU 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos monocatenarios específicos para la diana de esta invención. Además, se pueden usar animales o plantas transgénicos (véase, por ejemplo, la patente en EE UU 6.080.560) para expresar anticuerpos (humanizados) específicos para la diana de esta invención. Lo más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo humano o humanizado. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuos. Los ejemplos de tales técnicas se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane (1988) y (1999), loc. cit. e incluyen la técnica del hibridoma (Köhler y Milstein Nature 256 (1975), 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Se puede usar resonancia de plasmón de superficie como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de anticuerpos de fagos que se unen a un epítopo de los biomarcadores (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). También se prevé en el contexto de esta invención que el término “anticuerpo” comprenda construcciones de anticuerpos que se pueden expresar en células, por ejemplo, construcciones de anticuerpos que se pueden transfectar y/o transformar a través, entre otros, de virus o vectores plásmidos.

Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico o moléculas de péptido que se unen a una molécula diana específica. Los aptámeros se crean habitualmente seleccionándolos de un gran grupo de secuencias aleatorias, pero también existen aptámeros naturales en ribointerruptores. Los aptámeros se pueden usar tanto para investigación básica como para fines clínicos como fármacos macromoleculares. Los aptámeros se pueden combinar con ribozimas para autocortarse en presencia de su molécula diana. Estas moléculas compuestas tienen aplicaciones en investigación, industriales y clínicas adicionales (Osborne et. al. (1997), Current Opinion in Chemical Biology, 1:5-9; Stull & Szoka (1995), Pharmaceutical Research, 12, 4:465-483).

Más específicamente, los aptámeros se pueden clasificar como aptámeros de ácido nucleico, tal como aptámeros de ADN o ARN, o aptámeros peptídicos. Mientras que los primeros normalmente consisten en hebras (habitualmente cortas) de oligonucleótidos, los últimos preferiblemente consisten en un dominio peptídico variable corto, unido en ambos extremos de una andamiaje proteico.

Los aptámeros de ácido nucleico son especies de ácido nucleico que, como regla, se han manipulado mediante rondas repetidas de selección in vitro o equivalentemente, SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) para unirse a varias dianas moleculares tal como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, e incluso células, tejidos y organismos.

Los aptámeros peptídicos habitualmente son péptidos o proteínas que se diseñan para interferir con otras interacciones de proteínas dentro de las células. Típicamente consisten en un bucle peptídico variable unido en ambos extremos a un andamiaje proteico. Esta restricción estructural doble aumenta mucho la afinidad de unión del aptámero peptídico a niveles comparables a un anticuerpo (intervalo nanomolar). El bucle peptídico variable típicamente comprende de 10 a 20 aminoácidos, y el andamiaje puede ser cualquier proteína que tiene buenas propiedades de solubilidad. Actualmente, la proteína bacteriana tiorredoxina-A es la proteína de andamiaje más comúnmente usada, el bucle peptídico variable se inserta en el sitio redox activo, que es un bucle -Cys-Gly-Pro-Cysen la proteína salvaje, las dos cadenas laterales de cisteína pueden formar un puente disulfuro. La selección de aptámeros peptídicos se puede hacer usando diferentes sistemas, pero el más ampliamente usado actualmente es el sistema del doble híbrido en levaduras.

Los aptámeros ofrecen la utilidad para aplicaciones biotecnológicas y terapéuticas ya que ofrecen propiedades de reconocimiento molecular que rivalizan con las de las biomoléculas comúnmente usadas, en particular anticuerpos. Además de su reconocimiento discriminado, los aptámeros ofrecen ventajas sobre los anticuerpos ya que se pueden manipular por completo en un tubo de ensayo, se producen fácilmente por síntesis química, poseen propiedades de almacenamiento deseables y provocan poca o ninguna inmunogenicidad en aplicaciones terapéuticas. Los aptámeros no modificados se depuran rápidamente del torrente sanguíneo, con una semivida de minutos a horas, principalmente debido a la degradación por nucleasas y depuración del cuerpo por los riñones, un resultado de peso molecular inherentemente bajo del aptámero. Las aplicaciones de aptámeros sin modificar actualmente se enfocan en tratar afecciones transitorias tal como coagulación de la sangre, o tratar órganos tal como el ojo donde el posible la administración local. Esta depuración rápida puede ser una ventaja en aplicaciones tal como imagenología diagnóstica in vivo. Varias modificaciones, tal como pirimidinas sustituidas en 2’ con flúor, enlace con polietilenglicol (PEG), fusión a albúmina u otras proteínas que extienden la semivida, etc., están disponibles para los científicos de modo que la semivida de aptámeros se puede aumentar durante varios días o incluso semanas.

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aplicables en la presente invención se sintetizan convencionalmente y se proporcionan fácilmente en una calidad adecuada para iARN.

Moléculas adicionales que efectúan iARN incluyen, por ejemplo, microARN (miARN), Dichas especies de ARN son moléculas de ARN monocatenario que, como moléculas de ARN endógenas, regulan la expresión génica. Unirse a un transcrito de ARNm complementario desencadena la degradación de dicho transcrito de ARNm mediante un proceso similar a la interferencia de ARN. Según esto, se puede emplear miARN como un inhibidor de los biomarcadores según la presente invención.

Una ribozima (de enzima de ácido ribonucleico, también llamada enzima de ARN o ARN catalítico) es una molécula de ARN que cataliza una reacción química. Muchas ribozimas naturales catalizan su propio corte o el corte de otros ARN, pero también se ha encontrado que catalizan la actividad aminotransferasa del ribosoma. Los ejemplos no limitantes de ARN autocatalítico pequeño bien caracterizados son las ribozimas de cabeza de martillo, horquilla, virus delta de la hepatitis, y las dependientes de plomo seleccionadas in vitro, mientras que el intrón de grupo I es un ejemplo de ribozimas más grandes. El principio del autocorte catalítico se ha convertido en bien establecido en los últimos 10 años. Las ribozimas de cabeza de martillo son las mejor caracterizadas entre las moléculas de ARN con actividad ribozima. Puesto que se mostró que las estructuras de cabeza de martillo se pueden integrar en secuencias de ARN heterólogo y que la actividad de la ribozima se puede transferir de esta manera a estas moléculas, parece que se pueden crear secuencias antisentido catalíticas para casi cada cualquier secuencia diana, siempre que la secuencia diana contenga un potencial sitio de corte coincidente. El principio básico de construir ribozimas de cabeza de martillo es como sigue: se selecciona una región interesante del ARN, que contiene el triplete GUC (o CUC). Se toman dos hebras de oligonucleótidos, cada una habitualmente con 6 a 8 nucleótidos, y la secuencia de cabeza de martillo catalítica se inserta entre ellas. Se sintetizaron moléculas de este tipo para numerosas secuencias diana. Mostraron actividad catalítica in vitro. Los mejores resultados se obtienen habitualmente con ribozimas y secuencias diana cortas.

Un desarrollo reciente, también útil según la presente invención, es la combinación de un aptámero que reconoce un compuesto pequeño con una ribozima de cabeza de martillo. Se supone que el cambio conformacional inducido en el aptámero tras la unión de la molécula diana que regula la función catalítica de la ribozima.

El término “molécula de ácido nucleico antisentido” se conoce en la técnica y se refiere a un ácido nucleico que es complementario a un ácido nucleico diana. Una molécula antisentido según la invención es capaz de interaccionar con el ácido nucleico diana, más específicamente es capaz de hibridar con el ácido nucleico diana. Debido a la formación del híbrido, la transcripción del/de los gen(es) diana y/o la traducción del ARNm diana se reduce o bloquea. Se han descrito método estándar referidos a la tecnología antisentido (véase, por ejemplo, Melani et al., Cancer Res. (1991) 51:2897-2901).

Una “molécula pequeña” según la presente divulgación puede ser, por ejemplo, una molécula orgánica. Moléculas orgánicas se refiere o pertenece a la clase de compuestos químicos que tiene una base de carbono, los átomos de carbono unidos por enlaces carbono-carbono. La definición original de término orgánico se refiere a la fuente de compuesto químicos, siendo compuestos orgánicos esos compuestos que contienen carbono obtenidos de fuentes vegetales, animales o microbianas, mientras que los compuestos inorgánicos se obtenían de fuentes minerales. Los compuestos orgánicos pueden ser naturales o sintéticos. Alternativamente, la “molécula pequeña” según la presente invención puede ser un compuesto inorgánico. Los compuestos inorgánicos derivan de fuentes minerales e incluyen todos los compuestos sin átomos de carbono (excepto dióxido de carbono, monóxido de carbono y carbonatos). Preferiblemente, la molécula pequeña tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2000 uma, o menos de aproximadamente 1000 uma tal como menos de aproximadamente 500 uma, e incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 250 uma. El tamaño de una molécula pequeña se puede determinar por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, espectrometría de masas. Se pueden diseñar las moléculas pequeñas, por ejemplo, basadas en la estructura cristalina de la molécula diana, donde sitios presumiblemente responsables para la actividad biológica, se pueden identificar y verificar en ensayos in vivo tal como ensayos de cribado de alta resolución (HTS) in vivo. Tales moléculas pequeñas pueden ser particularmente adecuadas para inhibir la interacción proteína-proteína bloqueando sitios de unión específicos de la molécula diana. Las moléculas pequeñas adecuadas empleadas actualmente en el tratamiento de cáncer incluyen, sin ser limitantes, inhibidores de molécula pequeña para inhibir la familia del inhibidor de apoptosis Bcl-2 (Azmi y Mohammad, 2009).

También están abarcadas en el presente documento versiones modificadas de estos compuestos terapéuticos.

El término “versiones modificadas de estos compuestos terapéuticos” según la presente invención se refiere a versiones de los compuestos que están modificadas para alcanzar i) espectro modificado de actividad, especificidad de órgano, y/o ii) potencia mejorada, y/o iii) toxicidad disminuida (índice terapéutico mejorado), y/o iv) efectos secundarios disminuidos, y/o v) inicio modificado de la acción terapéutica, duración de efecto, y/o vi) parámetros farmacocinéticos modificados (resorción, distribución, metabolismo y excreción), y/o vii) parámetros fisicoquímicos modificados (solubilidad, higroscopia, color, gusto, olor, estabilidad, estado), y/o viii) especificidad general modificada, especificidad de órgano/tejido, y/o ix) forma y ruta de aplicación optimizada por (a) esterificación de grupos carboxilo, o (b) esterificación de grupos hidroxilo con ácidos carboxílicos, o (c) esterificación de grupos

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hidroxilo a, por ejemplo, fosfatos, pirofosfatos o sulfatos o hemisuccinatos, o (d) formación de sales farmacéuticamente aceptables, o (e) formación de complejos farmacéuticamente aceptables, o (f) síntesis de polímeros farmacológicamente activos, o (g) introducción de fracciones hidrofílicas, o (h) introducción/intercambio de sustituyentes en aromáticos o cadenas laterales, cambios del patrón de sustituyentes, o (i) modificación por introducción fracciones isostéricas o bioisostéricas, o (j) síntesis de compuestos homólogos, o (k) introducción de cadenas laterales ramificadas, o (k) conversión de sustituyentes alquilo a análogos cíclicos, o (l) derivación de grupos hidroxilo a quelatos, acetatos, o (m) N-acetilación a amidas, fenilcarbonatos, o (n) síntesis de bases de Mannich, iminas, o (o) transformación de cetonas o aldehídos a bases de Schiff, oximas, acetales, cetales, enolésteres, oxazolidinas, tiazolidinas; o combinaciones de las mismas.

Los varios pasos enumerados anteriormente generalmente se conocen en la técnica. Incluyen o se basan en análisis de la relación cuantitativa estructura-acción (QSAR) (Kubinyi, "Hausch-Analysis and Related Approaches", VCH Verlag, Weinheim, 1992), bioquímica combinatoria, química clásica y otros (véase, por ejemplo, Holzgrabe y Bechtold, Deutsche Apotheker Zeitung 140(8), 813-823, 2000).

El término “composición farmacéutica a medida” según la presente invención, se refiere a una composición farmacéutica que se ajusta a las necesidades individuales de un paciente particular. En otras palabras, una composición farmacéutica a medida es una medicación específica del paciente. Para el médico, la evaluación de los marcadores según la invención proporciona una herramienta útil para responder a la pregunta esencial “a quién tratar, y cómo tratar”, especialmente en el marco adyuvante después de la recesión quirúrgica de melanoma maligno primario de estadio temprano y localizado (estadio I a IIa).

Se ha mostrado previamente que varios de los marcadores empleados según la presente invención son dianas o indicadores adecuados en el tratamiento de cánceres. Por tanto, compuestos terapéuticos que se dirigen a dichos marcadores o que se dirigen a rutas asociadas con dichos marcadores ya están disponibles en la técnica. Por ejemplo, CD20, COX-2 y MTAP son tres marcadores de la presente invención que ofrecen implicaciones terapéuticas directas, ya que los fármacos correspondientes han sido aprobados por la FDA.

El antígeno CD20 se sabe que es una diana terapéutica eficaz en el tratamiento de pacientes con linfomas no hodgkinianos de células B positivos para CD20. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal quimérico Rituximab se ha descrito para inmunoterapia29. El anticuerpo se une específicamente al antígeno CD20 presentado en la superficie de linfocitos B normales y malignos y causa una muerte citotóxica celular y mediada por complemento de estas células. Según un pequeño ensayo piloto en fase II en pacientes de melanoma de estadio IV recientemente presentado en la reunión de la ASCO (2010), el anticuerpo anti-CD20 Rituximab puede ser potencialmente adecuado para el inmunoataque de subpoblaciones de melanoma positivo para CD20. Consecuentemente, la presencia de CD20 en células de melanoma de un paciente determinado con el método de la presente invención es indicativo para un tratamiento terapéutico de dicho paciente con compuestos que se dirigen a CD20, tal como, por ejemplo, Rituximab. Inhibidores adicionales de CD20 son, por ejemplo, el anticuerpo murino 2138 marcado con itrio

[90] designado Y2B8 (patente en EE UU No. 5.736.137), IgG2a 131 murina opcionalmente marcada con 131I para generar el anticuerpo 131 I-B1 (BEXXAR®) (patente en EE UU No. 5.595.721); anticuerpo monoclonal murino 1F5 (Press et al. Blood 69(2): 584-591 (1987)); anticuerpo quimérico 2H7 (patente en EE UU No. 5.677.180); y anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1 133, B—CI o NU-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., En: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)).

La ciclooxigenasa 2 representa otra diana terapéutica prometedora. Las ciclooxigenasas (COX) catalizan el primer paso limitante de velocidad en la conversión de ácido araquidónico en prostaglandinas. En contraste a COX-1, la isoenzima COX-2 no es detectable en la mayoría de los tejidos normales y se induce rápidamente por varios estímulos tal como reacciones inflamatorias30. También se expresa en varios tipos de tumores y se ha mostrado que los niveles de expresión de COX-2 se correlacionan con invasividad y pronóstico en algunas entidades tumorales, incluyendo cáncer de piel epitelial y melanocítico14,31. Estudios epidemiológicos mostraron que la inhibición prolongada de COX-2 mediante ácido acetilsalicílico u otros fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) podría ofrecer alguna protección contra cáncer de colon y algunas otras neoplasias malignas32. Hasta ahora el beneficio de los inhibidores de COX-2 no se ha estudiado en el tratamiento adyuvante de melanomas de estadio temprano para prevenir metástasis. En el tratamiento de segunda línea de enfermedad de melanoma metastásico avanzado, sin embargo, se mostró un beneficio de supervivencia para terapia combinada dirigida usando inhibidores de COX-2 y agonistas de PPARG para tratamiento antiinflamatorio junto con quimioterapia metronómica de dosis baja33. Considerando esta observación y el hecho de que los pacientes de melanoma con tumores primarios positivos para COX-2 tienen un riesgo significativamente mayor de recaída tumoral14, se concluye que la presencia de COX-2 en células de melanoma de un paciente determinado con el método de la presente invención es indicativo para un tratamiento terapéutico de dicho paciente con compuestos que se dirigen a COX-2, tal como, por ejemplo, inhibidores de COX-2 incluyendo, pero no limitados a, Celecoxib, Etoricoxib o Parecoxib para tratamiento primario adyuvante de estos pacientes.

Además, en el tratamiento adyuvante de melanoma maligno, interferón alfa es actualmente el único agente terapéutico clínicamente aceptado que proporciona un beneficio de supervivencia (sin recaída) significativo para un pequeño pero claro porcentaje de pacientes34. Debido a los graves efectos secundarios y los altos costes de la

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terapia, es ventajoso determinar esos pacientes con una posibilidad relista de beneficiarse del tratamiento con interferón. Se ha mostrado recientemente que hay una clara asociación entre la expresión de MTAP en el melanoma primario y la evolución del melanoma e, incluso de forma más importante, respuesta a tratamiento con interferón13,28,35. Los biomarcadores como MTAP podrían, por tanto, permitir a los médicos evaluar qué pacientes se pueden beneficiar del tratamiento con interferón y podrían, por tanto, proporcionar una nueva base para un uso dirigido claro de este caro agente inmunoterapéutico y prevenir las graves efectos secundarios asociados con el tratamiento con interferón.

También Bcl-X ha sido objetivo en ensayos preclínicos y varios agentes de direccionamiento están en la fase en ensayo clínico ahora36. Bcl-X está relacionado con la familia de proteínas Bcl-2 antiapoptóticas. La sobreexpresión de estas proteínas antiapoptóticas protege las células cancerosas contra señales de muerte por apoptosis. De forma interesante, los tumores que expresan altos niveles de Bcl-2 o Bcl-X con frecuencia se encuentra que son resistentes a agentes quimioterapéuticos o terapia de radiación37. En los últimos años, ha habido un crecimiento exponencial en la identificación y síntesis de “inhibidores de molécula pequeña” (SIM) permeables a células no peptídicos contra proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 o Bcl-X (véase, por ejemplo, Azmi y Mohammad 2009). Los SMI inhiben distintas interacciones proteína-proteína bloqueando sitios de unión específicos de la molécula diana, apoyando de esta manera la maquinaria apoptótica36. La inhibición de Bcl-X puede ejercer un efecto sinérgico con tratamientos convencionales como quimioterapia o terapia de radiación y con respecto a la terapia de melanoma, este efecto podría ser un éxito terapéutico decisivo.

Para PTEN la adicción de la ruta oncogénica, como se ha descrito en el presente documento anteriormente, se ha descrito en detalle en la bibliografía, por ejemplo, en Weinstein y Joe 200847, Zhang y Yu 201028, Mirmohammadsadegh et al. 200643, Lahtz et al. 201044 o Zhou et al. 200045 .

Según la presente invención, la firma de marcadores representa una herramienta clínica muy prometedora para predecir el pronóstico de un paciente. De forma más importante, se espera que la firma de marcadores mejore el tratamiento clínico y el tratamiento adyuvante de melanoma maligno en estadio temprano con un alto riesgo de recaída. En el tratamiento de melanoma metastásico avanzado, las terapias antitumorales inmunitarias novedosas que se dirigen a rutas de transducción de señales o barreras inmunitarias tumorales por anticuerpo monoclonales como inhibidores de BFAR selectivos38 o anticuerpo anti-antígeno de linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4)39 ya han entrado en estudios clínicos. Esta opción terapéutica prometedora en el tratamiento del desarrollo de melanoma maligno metastásico avanzado, junto con el conjunto de marcadores moleculares identificados según la presente invención se espera que proporcionen nuevas indicaciones orientadas al riesgo para una terapia antitumoral dirigida individualizada de melanoma maligno.

En una forma de realización preferida del método de preparar una composición farmacéutica a medida, los al menos cinco biomarcadores incluyen CD20, Cox-2 y/o MTAP.

Por tanto, el conjunto de biomarcadores empleados según esta forma de realización preferida comprende al menos CD20, o Cox-2, o MTAP, o CD20 y Cox-2, o CD20 y MTAP, o Cox-2 y MTAP, o CD20 y Cox-2 y MTAP.

En otra forma de realización preferida del método de preparar una composición farmacéutica a medida, se determinan al menos siete biomarcadores.

En una forma de realización más preferida del método de preparar una composición farmacéutica a medida, los al menos siete biomarcadores son MTAP, PTEN, Bax, Bcl-X, β-catenina, CD20 y Cox-2.

En una forma de realización preferida adicional del método de preparar una composición farmacéutica a medida, se determinan al menos nueve biomarcadores.

Según esta forma de realización del método de preparar una composición farmacéutica a medida, se determinan los nueve biomarcadores MTAP, PTEN, Bax, Bcl-X, β-catenina, CD20, Cox-2 y CD49d y MLH1.

En una forma de realización más preferida adicional del/de los método(s) de la invención, la muestra se obtiene del tumor primario, un ganglio linfático o una metástasis.

El término “tumor primario” según la presente invención se refiere a un tumor maligno (también denominado en el presente documento un cáncer) en un primer sitio, es decir, en un primer órgano o parte del cuerpo. En general, cuando el área de las células cancerosas en el sitio originario se vuelve clínicamente detectable, se denomina un tumor primario. En el presente caso de melanoma maligno, dicho tumor primario es un tumor maligno de melanocitos, que están presentes en la piel (es decir, el tumor primario es cáncer de piel) pero también en la membrana mucosa y el ojo. Algunas células cancerosas también adquieren la capacidad de penetrar e infiltrar tejidos normales circundantes en el área local, formando un tumor nuevo. El tumor “hija” recién formado en el sitio adyacentes en el tejido se llama una metástasis local mientras que la formación de un nuevo tumor en un sitio no adyacente se llama una metástasis distante.

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Según la presente invención, el término “ganglio linfático” se refiere a un pequeño órgano del sistema inmunitario que es importante en el funcionamiento apropiado del sistema inmunitario, ya que actúa como un filtro o trampa para partículas exógenas. Los ganglios linfáticos están ampliamente distribuidos a lo largo del cuerpo incluyendo la axila y estómago/intestino y unidos por vasos linfáticos. Los ganglios linfáticos se inflaman o agrandan en varias afecciones, que varían desde infecciones de garganta a enfermedades potencialmente morales tal como cánceres.

En otra forma de realización más preferida del/de los método(s) de la invención, la muestra es una muestra de tejido, una muestra de sangre o linfa.

En una forma de realización más preferida adicional del/de los método(s) de la invención, la presencia o cantidad de los biomarcadores se analiza por métodos que determinan modificaciones genéticas o epigenéticas o niveles transcripcionales o de proteína o una combinación de los mismos.

Los métodos para determinar modificaciones genéticas o epigenéticas o niveles transcripcionales o de proteína se han definido en el presente documento anteriormente.

En una forma de realización más preferida adicional del/de los método(s) de la invención, la presencia o cantidad de los biomarcadores se determina por inmunohistoquímica, espectrometría de masas, inmunotransferencia, transferencia Northern, PCR, hibridación in situ de ARN o una combinación de los mismos.

Todos los métodos anteriores se conocen bien en la técnica. Preferiblemente, los métodos inmunohistoquímicos incluyen, sin estar limitados, micromatrices de tejido (TMA) como se describe en los ejemplos adjuntos. Preferiblemente, cuando se emplean TMA, el análisis se lleva a cabo en dos áreas representativas por punto de TMA, en donde cada área comprende aproximadamente 100 células, tal como, por ejemplo, exactamente 100 células.

En una forma de realización más preferida del/de los método(s) de la invención, el biomarcador es proteína.

La presente invención se refiere además a un kit para predecir el curso de la enfermedad en un paciente que tiene un melanoma maligno, el kit comprende: (a) medios para determinar la presencia o cantidad del conjunto de biomarcadores como se han definido según los métodos de la presente invención en una muestra obtenida de dicho melanoma maligno, y (b) instrucciones de cómo usar el kit.

En su sentido más amplio, el término “kit” no requiere la presencia de ningún otro compuesto, viales, envases y similares. Preferiblemente, los varios componentes del kit pueden estar embalados en uno o más envases tal como uno o más viales. Consecuentemente, los varios componentes del kit pueden estar presentes en aislamiento o combinación. Los envases o viales pueden, además de los componentes, comprender conservantes o tampones para el almacenamiento.

“Medios para determinar la presencia o cantidad de […] biomarcadores” son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin ser limitantes, anticuerpos que se unen específicamente (es decir, sin reacción cruzada con marcadores no relacionados) a los biomarcadores según la presente invención; sondas de ácido nucleico para la detección de los biomarcadores a nivel de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, sondas de ácido nucleicos que hibridan específicamente con partes o moléculas de ácido nucleico de longitud completa (ADN así como ARN) que codifican dichos biomarcadores; cebadores de secuenciación para el análisis y detección de secuencias específicas del ADN que codifica los biomarcadores, por ejemplo secuencias que contienen mutaciones que se sabe interfieren con la expresión de dichos biomarcadores; cebadores de amplificación para amplificar moléculas de ácido nucleico transcritas de los biomarcadores respectivos; cebadores específicos para ADN metilado para uso en PCR específica de metilación cuantitativa (Q-MSP) (como se describe, por ejemplo, en Current Protocols in Human Genetics, DOI: 10.1002/ 0471142905.hg1006s61); y también enzimas de restricción sensibles a metilación.

El término “comprender” en el contexto del/de los kit(s) de la invención indica que pueden estar presentes componentes adicionales en el kit. Los ejemplos no limitantes de tales componentes adicionales incluyen, como se ha mencionado, conservantes, tampones para almacenamiento, enzimas, etc.

También está abarcado por esta forma de realización que el kit comprenda medios adicionales para determinar la presencia o cantidad de biomarcadores o marcadores de referencia diferentes de los biomarcadores de la presente invención. Tales biomarcadores o marcadores de referencia diferentes de los biomarcadores de la presente invención incluyen, sin ser limitantes, marcadores tumorales adicionales para melanoma maligno, tal como, por ejemplo, proteína S100, HMB45, Melan-A, anticuerpos anti-pan melanoma, así como marcadores de referencia incluyendo, sin ser limitantes, GADPH, RPLP0, PGK1, HSP90AB1, ciclofilina, actina.

Si el kit comprende tales medios adicionales para determinar la presencia o cantidad de biomarcadores o marcadores de referencia diferentes de los marcadores según la presente invención, se prefiere que como mucho

10.000 de tales marcadores adicionales estén comprendidos en el kit de la invención. Más preferiblemente, como mucho 5.000, tal como por ejemplo como mucho 2.000 y más preferiblemente como mucho 1.000 marcadores

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Además, se puede realizar la determinación de la unión de potenciales inhibidores en, por ejemplo, cualquier ensayo de unión, preferiblemente ensayo de unión biofísico, que se puede usar para identificar la unión de moléculas de prueba antes de realizar el ensayo funcional/de actividad con el inhibidor. Los ensayos de unión biofísicos adecuados se conocen en la técnica y comprenden ensayo de polarización de fluorescencia (FP), ensayo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y ensayo de resonancia plasmón de superficie (SPR).

En casos donde el inhibidor actúa afectando el nivel de expresión de la proteína diana, la determinación del nivel de expresión de la proteína se puede, por ejemplo, llevar a cabo a nivel de ácido nucleico o a nivel de aminoácido, como se ha descrito en el presente documento anteriormente.

También se describe en el presente documento que el inhibidor es un anticuerpo, un aptámero, un ARNip, un ARNhc, un miARN, una ribozima, una molécula de ácido nucleico antisentido o una molécula pequeña.

El término “agentes que afectan las rutas de señalización de MTAP” se refiere a agentes que no se unen necesariamente directamente a MTAP, pero interfieren con la actividad de señalización de MTAP, por ejemplo, uniéndose a y/o inhibiendo la función o expresión de miembros de la ruta de MTAP. Por ejemplo, Wild et al. 200613 describen que la expresión de MTAP se correlaciona con sensibilidad a terapia de interferón, haciendo de esta manera el interferón un agente terapéutico adecuado en melanomas malignos que expresan MTAP. Se han descrito detalles adicionales, por ejemplo, en Behmann et al. 2003.

Los inhibidores de CD20, Cox-2 y/o agentes que afectan las rutas de señalización de MTAP y/o la adicción de la ruta oncogénica de PTEN se conocen bien en la técnica e incluyen, sin ser limitantes, cualquiera de los compuestos enumerados en el presente documento anteriormente.

En el presente documento se describe además que la composición farmacéutica comprende Rituximab, Colecoxib o interferón alfa.

Rituximab es un anticuerpo también vendido bajo los nombres comerciales MabThera® (por Roche) o Rituxan® (por Biogen Idec/Genentech) que tiene el número de acceso del DrugBank DB00073 y el código ATC (sistema de clasificación anatómica terapéutica química) L01XC02.

Celecoxib, también conocido como Celebrex, Celebra u Onsenal (vendido por Pfizer), es un fármaco antiinflamatorio no esteroideo sulfa y tiene el número de acceso a DrugBank APRD00373, así como el código ATC L01XX33 M01AH01. Celecoxib tiene la fórmula estructural:

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A menos que se defina de ora manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente el experto en la materia a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, la especificación de patente, incluyendo las definiciones, prevalecerá.

Las figuras muestran:

Figura 1: La firma de siete marcadores y supervivencia de 362 pacientes con melanoma maligno primario. El panel A muestra los perfiles de expresión por IHC de 362 muestras de tumores de la cohorte primaria ordenados por su puntuación de riego predicha. Cada columna representa un paciente individual que consiste en los valores de expresión de la firma de siete marcadores (5 marcadores de riesgo y 2 marcadores protectores). La magnitud de la puntuación de riesgo correspondiente se representa debajo para 181 pacientes de bajo riesgo (gris claro; parte izquierda del perfil de expresión) y 181 pacientes de alto riesgo (gris oscuro; lado derecho del perfil de expresión). Los valores de expresión por IHC se escalaron entre 0 (gris claro) y 1 (gris oscuro) para representación solo. Las células blancas representan valores que faltan (n.a.). Los paneles B-E muestran estimaciones de Kaplan-Meier de supervivencia global y sin recaída para pacientes de alto riesgo y pacientes de bajo riesgo de la cohorte primaria según la firma de nueve marcadores (paneles B, C) y su versión reducida, la firma de siete marcadores (paneles D, E), respectivamente. La igualdad en la esperanza de supervivencia de los subgrupos se evalúa por la prueba del orden logarítmico. Eliminar los dos marcadores “menos específicos” (MLH1 y CD49d) de la firma no reduce el poder

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estadístico de la puntuación de riesgo predicha. La diferencia entre pacientes de alto riesgo y pacientes de bajo riesgo es muy significativa (p < 0,001) para la firma de siete marcadores.

Figura 2: Validación de la firma de siete marcadores y el procedimiento de selección de marcadores FDR. Las estimaciones de Kaplan-Meier de supervivencia global (panel A) y sin recaída (panel B) para la cohorte de prueba externa independiente de 225 pacientes (TMA 2) confirma el poder pronóstico predictivo de la firma (p<0,001). Además, el procedimiento de selección de marcadores FDR se probó mediante un experimento de validación cruzada de 10 veces en los 362 pacientes de la cohorte primaria (TMA 1) produciendo aún estimaciones significativas para supervivencia global (p<0,001; panel C) y supervivencia sin recaída (p=0,013, panel D).

Figura 3: La firma de siete marcadores y supervivencia de pacientes con un espesor tumoral ≤2,0 mm. Las estimaciones de Kaplan-Meier muestran una supervivencia global (p=0,0053, panel A) y sin recaída (p=0,008, panel B) significativamente menores para pacientes con un espesor tumoral comparativamente bajo ≤2,0 mm, pero alta puntuación de riesgo. C, D. Validación cruzada dejando uno fuera. Para investigar el error de generalización de los modelos producidos por el procedimiento de aprendizaje de la firma FDR se realizó un experimento de validación cruzada que deja uno fuera en la cohorte primaria de 362 pacientes de MM. La puntuación de riesgo resultante pudo diferenciar significativamente (p<0,001) entre pacientes con esperanza de supervivencia global mayor o menor. Los dos grupos de pacientes también se diferencian significativamente (p=0,0057) en la supervivencia sin recaída. E. Prueba de permutación. Además de los experimentos de validación cruzada se realizó una prueba de permutación para evaluar si el procedimiento de aprendizaje de la firma está sobreajustando el conjunto de datos. La firma resultante, que se aprendió sobre datos de supervivencia global permutados, no era capaz de distinguir (p=1) entre pacientes con esperanza de supervivencia diferente. Este resultado indica que el procedimiento de aprendizaje propuesto no sobreajusta los datos. F. Coeficientes e intervalos de confianza de la firma de siete marcadores. Los coeficientes de los modelos de riesgos proporcionales de Cox univariables se usan en una combinación lineal ponderada para predecir la puntuación de riesgo para cada paciente. Los marcadores con coeficientes negativos representan marcadores protectores (MTAP, β-catenina); esos con coeficientes positivos marcadores de riesgo (Bax, CD20, Bcl-X, PTEN y COX-2).

Figura 4. Cocientes de riesgos de la firma de nueve marcadores aprendida por el procedimiento de selección FDR. Los marcadores con un cociente de riesgos menor de 1,00 representan marcadores protectores (MTAP, βcatenina): esos con cocientes de riesgos mayores de 1,00 representan marcadores de riesgo (Bax, CD20, Bcl-X, PTEN, COX-2, MHL1 y PTEN).

Figura 5. Correlación entre marcadores de la invención.

Figura 6: La firma de seis marcadores y supervivencia de 362 pacientes con melanoma maligno primario. Las figuras 6A y 6B muestran estimaciones de Kaplan-Meier de supervivencia global (Fig. 6A) y sin recaída (Fig. 6B) para pacientes de alto riesgo y pacientes de bajo riesgo de la cohorte primaria según una firma de seis marcadores reducida adicionalmente. Se eliminó CD20 de la firma de siete marcadores y se probó el poder estadístico de la puntuación de riesgo de seis marcadores (por Bax, Bcl-X, β-catenina, COX-2, MTAP, PTEN). Entre los 362 pacientes de la cohorte primaria, pacientes con una firma de alto riesgo de seis marcadores tenían una supervivencia global (Fig. 6A) y sin recaída (Fig. 6B) mediana significativamente más cortas que los pacientes con una firma de seis marcadores de bajo riesgo. La diferencia entre los dos grupos de pacientes era muy significativa para la supervivencia global (p=0,000000047; Fig. 6A) y sin recaída (p=0,0013; Fig. 6B), respectivamente. Esta observación apoya el fuerte poder estadístico y valor predictivo de este conjunto de biomarcadores con el curso de la enfermedad de melanoma. La figura 6 se refiere a la cohorte primaria de pacientes caracterizados en la figura 1.

Figura 7: La firma de cinco marcadores y supervivencia de 362 pacientes con melanoma maligno primario.

Las figuras 7A y 7B muestran estimaciones de Kaplan-Meier de supervivencia global (Fig. 7A) y sin recaída (Fig. 7B) para pacientes de alto riesgo y pacientes de bajo riesgo de la cohorte primaria según una firma de cinco marcadores reducida adicionalmente. Se eliminaron CD20 y PTEN de la firma de siete marcadores y se probó el poder estadístico de la puntuación de riesgo de cinco marcadores (por Bax, Bcl-X, β-catenina, COX-2, MTAP). Entre los 362 pacientes de la cohorte primaria, pacientes con una firma de alto riesgo de seis marcadores tenían una supervivencia global (Fig. 6A) y sin recaída (Fig. 6B) mediana significativamente más cortas que los pacientes con una firma de seis marcadores de bajo riesgo. La diferencia entre los dos grupos de pacientes era muy significativa para la supervivencia global (p=0,00000066; Fig. 7A) y sin recaída (p=0,0024; Fig. 7B), respectivamente. Esta observación apoya el fuerte poder estadístico y valor predictivo de este conjunto de biomarcadores con el curso de la enfermedad de melanoma. La figura 7 se refiere a la cohorte primaria de pacientes caracterizados en la figura 1.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

Micromatrices de tejidos (TMA)

Se construyeron las TMA como se ha descrito previamente12-14 y basadas en material de melanoma primario, recogido entre 1994 y 2006. TMA 1, la cohorte primaria, contenía muestras de sacabocados de tejidos de 364 melanomas malignos consecutivos (no seleccionados), fijados en formalina, incluidos en parafina de 364 pacientes diferentes y eran del Departamento de Dermatología, Hospital Universitario de Ratisbona, Alemania. TMA 2, la 5 cohorte secundaria, que se usó como cohorte de validación externa independiente, consistía en muestras de melanoma consecutivas (no seleccionadas) de 235 pacientes del Departamento de Dermatología, Hospital Universitario de Hamburgo, Alemania. Para pacientes con neoplasias posteriores múltiples, solo se incluyeron los melanomas malignos primarios iniciales y únicos. Secciones teñidas con H&E de todos los melanomas malignos fueron evaluadas por dos histopatólogos. Las características clinicopatológicas de las dos cohortes independientes 10 de pacientes de melanoma se dan en la tabla 4. Los datos de seguimiento clínico proporcionados por los registros locales de tumores, estuvieron disponibles para todos los pacientes de la cohorte primaria (n=364) y 231 pacientes de la cohorte secundaria. Los pacientes se censuraron a los 120 meses, si su seguimiento superaba el ámbito de 10 años del estudio. El estudio para ambas cohortes fue aprobado por los comités de ética científica locales (No. de aprobación 07/093 para Ratisbona y MC-028/08 para Hamburgo). El estudio retrospectivo se realizó según la

15 Declaración de los Principios de Helsinki.

Tabla 4

Primaria

Prueba de Ext.

Características de TMA

N % N %

Origen Pacientes

Ratisbona Hamburgo

No. de pacientes

364 235

No. de seguimiento

364 100,0 231 98,3

No. de pacientes con al menos 1 marcador de firma Manchas de TMA

362 99,5 225 95,7

No. de biomarcadores

70 7

Manchas válidas

23106 90,7 1541 93,7

Manchas que faltan

2374 9,3 104 6,3

Clinopatológico

N % N %

Edad

<=60

180 49,5 139 59,1

>60

184 50,5 92 39,1

desconocido

4 1,7

Sexo

Hombre

195 53,6 126 53,6

Mujer

169 46,4 105 44,7

desconocido

4 1,7

Espesor tumoral

<= 1mm

163 44,8 110 46,8

1,01-

92 25,3 47 20,0

2,01-

61 16,8 36 15,3

>4 mm

42 11,5 36 15,3

desconocido

6 1,6 6 2,6

Nivel de Clark

1

2 0,5 1 0,4

2

75 20,6 39 16,6

3

106 29,1 80 34,0

4

149 40,9 90 38,3

5

14 3,8 19 8,1

desconocido

18 4,9 6 2,6

Patrón de crecimiento

SSM

170 46,7 146 62,1

NMM

56 15,4 49 20,9

LMM

42 11,5 12 5,1

ALM

28 7,7 8 3,4

NOS

68 18,7 20 8,5

Datos inmunohistoquímicos

N % N %

Bax

0

5 1,4 5 2,1

1

60 16,5 49 20,9

2

95 26,1 81 34,5

3

88 24,2 56 23,8

4

88 24,2 29 12,3

desconocido

28 7,7 15 6,4

b-catenina

0

10 2,7 4 1,7

1

121 33,2 43 18,3

2

106 29,1 108 46,0

3

71 19,5 53 22,6

4

17 4,7 11 4,7

desconocido

39 10,7 16 6,8

CD20

0

333 91,5 154 65,5

1

12 3,3 48 20,4

2

4 1,1 16 6,8

3

1 0,3 1 0,4

desconocido

14 3,8 16 6,8

BCL-X 0

151 41,5 66 28,1

5

10

15

20

25

1

167 45,9 117 49,8

2

26 7,1 38 16,2

3

1 0,3 4 1,7

desconocido

19 5,2 10 4,3

MTAP

0

56 15,4 103 43,8

1

245 67,3 101 43,0

2

16 6,8

desconocido

63 17,3 15 6,4

PTEN

0

57 15,7 23 9,8

1

140 38,5 87 37,0

2

116 31,9 76 32,3

3

28 7,7 25 10,6

4

4

1,1 8 3,4

desconocido

19 5,2 16 6,8

Cox-2

0

121 33,2 20 8,5

1

188 51,6 103 43,8

2

39 10,7 73 31,1

3

5 1,4 21 8,9

4

2 0,9

desconocido

11 3,0 16 6,8

CD49d

n.a.

0

63 17,3

1

137 37,6

2

78 21,4

3

33 9,1

4

3 0,8

desconocido

50 13,7

MLH1

n.a.

0

65 17,9

1

130 35,7

2

99 27,2

3

37 10,2

4

13 3,6

desconocido

20 5,5

Tabla 4: Caracterización y comparación de la cohorte primaria (TMA 1) y la cohorte de prueba externa (TMA 2). Se describen el número de cuentas y los porcentajes asociados para todas las muestras en las micromatrices de tejido. CD49d y MLH1 no están contenidos en la firma de siete marcadores final y por tanto no se analizaron en la TMA 2 de prueba externa. Los valores que faltan se enumeran como “desconocido”.

Análisis inmunohistoquímico

Se cribaron preparaciones incluidas en parafina de tejidos de melanoma para expresión de proteínas según protocolos de inmunohistoquímica (IHC) estandarizados como se ha descrito previamente12-14 . Los anticuerpos primarios usados en este estudio se seleccionaron para indicar en aspectos claves de apoptosis, ciclo celular, transducción de señales, adhesión celular, diferenciación y proliferación de melanoma, y metabolismo tumoral.

Todas las investigaciones de IHC se basaron en un método de avidina-biotina peroxidasa con un cromógeno 3amino-9-etilcarbazol (AEC). Después de la recuperación de antígeno (hervidor de vapor con tampón citrato, pH 6,0 o con tampón Tris-EDTA, pH 9,0 durante 20 minutos), se llevó a cabo la inmunohistoquímica aplicando el kit ZytoChemPlus HRP Broad Spectrum (Zytomed Systems, Berlín, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las tinciones de IHC se realizaron para 70 anticuerpos primarios diferentes (la fuente y concentración se enumeran en la tabla 5). Los marcadores citoplásmicos y nucleares se visualizaron con solución de AEC (Cromógeno sustrato de alta sensibilidad ACE+, listo para usar, DAKO, Glostrup, Dinamarca). El color rojo del cromógeno sustrato AEC (3-amino-9-etilcarbazol) es muy beneficioso para descartar la posibilidad de un papel de melanina endógena en la reactividad observada. Todas las secciones se contratiñeron con hematoxilina (DAKO). Se obtuvieron controles negativos omitiendo el anticuerpo primario. Dos dermatohistopatólogos realizaron una evaluación enmascarada de las secciones teñidas sin conocimiento de los datos clínicos. La especificidad de los anticuerpos comerciales se ha probado minuciosamente por inmunotransferencia usando melanocitos y una variedad de líneas celulares humanas incluyendo varias líneas celulares de melanoma.

imagen12

aprobado

Akt 3

AKT3 Señalización, apoptosis Abgent Conejo, policlonal 1:100 Citoplásmica Cáncer de mama

Fosfo-Akt (Thr308)

Fosfo-AKT3 Señalización, apoptosis Cell Signalling Conejo, 244F9H2 1:10 Citoplásmica Cáncer de mama

Bax

BAX Apoptosis Cell Signalling Conejo, policlonal 1:10 Citoplásmica Cáncer de pulmón

Bcl2

BCL2 Apoptosis Dako Ratón, 124 1:100 Citoplásmica Riñón

Bcl-X

BCL2L1 Apoptosis Diagnostic Biosystems Ratón, 2H12 1:10 Citoplásmica, membrana celular Amígdalas

Bcl2L1

BCL2L1 Apoptosis Abcam Ratón, SPM165 1:200 perinuclear Melanoma

BMI1

BMI1

Transcripción Abgent Conejo, policlonal 1:25 Citoplásmica Cáncer de mama

B-Raf

BRAF Señalización, apoptosis Epitomics Conejo, EP152Y 1:50 Citoplásmica Cáncer de próstata

E-cadherina

CDH1 Contacto célula-célula Chemicon Ratón, 36B5 r-t-u Membrana celular Cáncer de mama

P-cadherina

CDH3 Contacto célula-célula BD Biosciences Ratón, 56 1:20 Membrana celular Placenta

β-catenina

CTNNB1 Contacto célula-célula Cell Signalling Conejo, policlonal 1:250 citoplásmica, nuclear, membrana celular Cáncer de mama

Fosfo-βcatenina

fosfo-CTNNB1 Contacto célula-célula Cell Signalling Conejo, policlonal 1:50 Nuclear Cáncer de mama

Caveolina

CAV1 Contacto célula-célula BD Biosciences Conejo, policlonal 1:1000 Membrana celular Placenta

CD20

MS4A1 Diferenciación, cand. marcador de células madre Zytomed Ratón, L26 r-t-u Membrana celular, citoplásmica Amígdalas

CD44

CD44

Contacto célula-célula, cand. marcador de células madre Lab Vision Ratón, 156-3C11 1:2000 Membrana celular Amígdalas

CD49d

ITGA4 Contacto célula-célula, cand. marcador de células madre Acris Conejo, policlonal 1:50 Membrana celular Cáncer de mama

CD117 (ckit)

KIT Proliferación, cand. marcador de células madre Dako Conejo, policlonal 1:600 Membrana celular, citoplásmica Cáncer colorrectal

CD166

ALCAM Contacto célula-célula, cand. marcador de células madre Abcam Ratón, MOG/07 1:50 Membrana celular Cáncer de próstata

CD171

L1CAM Contacto célula-célula Sigma Conejo 1:350 Citoplásmica Cáncer de mama

CDK2

CDK2

Ciclo celular Thermo Scientific Ratón 2B6 + 8D4 1:200 Citoplásmica, nuclear Amígdalas

c-Myc

MYC Ciclo celular, proliferación Santa Cruz Ratón, monoclonal 1:500 Citoplásmica, nuclear Cáncer colorrectal

Cox-2

MT-CO2 Metabolismo Cayman Ratón, monoclonal 1:200 Citoplásmica Cáncer colorrectal

CXCR4

CXCR4

Contacto célula-célula, cand. marcador de células madre Acris Conejo, policlonal 1:750 Citoplásmica, membrana celular Cáncer de mama

Ciclina A

CCNA1 Ciclo celular Novo Castra Ratón, 6E6 1:50 nuclear Amígdalas

Ciclina D1

CCND1 Ciclo celular Novo Castra Ratón, DCS-6 1:20 Nuclear, citoplásmica Cáncer de mama

Eph B2

EPHB2 Contacto célula-célula Abcam Conejo, policlonal 1:100 Membrana celular, citoplásmica Cáncer de mama

efrina-B2

EFNB2 Contacto célula-célula Santa Cruz Conejo, policlonal 1:50 Membrana celular, citoplásmica Melanoma

Ezrina

EZR Señalización Abcam Ratón, 3C12 1:100 Membrana celular Cáncer de pulmón

Fas

FAS Apoptosis Cell Signalling Conejo, C18C12 1:10 Citoplásmica Cáncer colorrectal

FZD-7

FZD7 Señalización Acris Conejo, policlonal 1:250 Citoplásmica Placenta

Glut-1

SLC2A1 Metabolismo Acris Ratón, SPM498 1:200 Membrana celular Cáncer de mama

HIF-1α

HIF1A Metabolismo R+D Ratón, 241812 1:20 Citoplásmica, nuclear Cáncer de mama

Antimelanosoma HMB45

-/- Diferenciación Dako Ratón, MHB45 1:50 Citoplásmica Melanoma

IGF-2

IGF2 Proliferación Abcam Conejo, policlonal 1:200 Citoplásmica Placenta

iNOS

ISYNA1 Metabolismo Abcam Conejo, policlonal 1:200 Citoplásmica Cáncer de pulmón

Ki-67

MKI67 Ciclo celular, proliferación Dako Ratón, MIB-1 1:100 Nuclear Piel

MHC1

MYH11 Contacto célula-célula Abcam Ratón, 3F8 1:100 Membrana celular Riñón

Melan A

MLANA Diferenciación Novo Castra Ratón, A103 1:50 Citoplásmica Piel

MITF

MITF

Diferenciación Dako Ratón, D5 1:50 Nuclear Melanoma

MLH1

MLH1

Reparación de ADN BD Pharmingen Ratón, G168-15 1:50 Nuclear, citoplásmica Cáncer colorrectal

MSH2

MSH2

Reparación de ADN Calbiochem Ratón, FE11 1:40 Nuclear, citoplásmica Cáncer colorrectal

MTAP

MTAP

Metabolismo ProteinTech Group Conejo, policlonal 1:500 Citoplásmica Cáncer de mama

MTSS1

MTSS1

Remodelado citoesqueleto Abnova Ratón, 2G9 1:500 Nuclear, citoplásmica Cáncer colorrectal

MUM1p

IRF4 Transcripción Santa Cruz Ratón, monoclonal 1:10 Nuclear, citoplásmica Cáncer de mama

NF-κB

RELA Transcripción Santa Cruz Ratón, F-6 1:500 Nuclear, citoplásmica Cáncer de mama

N-Ras

NRAS Señalización Santa Cruz Ratón, F155 1:50 Citoplásmica Ganglio linfático

N-Ras

NRAS Señalización Santa Cruz Ratón, F155 1:50 Citoplásmica Ganglio linfático

p14

CDKN2A Ciclo celular Cell Signalling Ratón, 4C6/4 1:10 Nuclear, citoplásmica Cáncer de mama

p15

CDKN2B Ciclo celular Acris Ratón, 15P06 1:25 Nuclear Cáncer colorrectal

p16

CDKN2A Ciclo celular Santa Cruz Ratón, F12 1:50 Nuclear Cáncer colorrectal

p21

CDKN1A Ciclo celular Dako Ratón, SX118 1:50 Nuclear Cáncer colorrectal

p27

CDKN1B Ciclo celular Dako Ratón, SX53G8 1:50 Nuclear Ganglio linfático

p53

TP53 Ciclo celular, apoptosis Dako Ratón, DO7 1:25 Nuclear, citoplásmica Cáncer de mama

p75 (NGFR)

NGFR Diferenciación Abcam Conejo, EP1039Y 1:100 Membrana celular Placenta

PGF

PGF

Proliferación ProteinTech Group Conejo, policlonal 1:50 Citoplásmica Cáncer de mama

PMP2

PMP2

Diferenciación ProteinTech Group Conejo, policlonal 1:100 Citoplásmica Glioma

PPAR α

PPARA Señalización Abcam Conejo, policlonal 1:500 Citoplásmica, nuclear Cáncer de mama

PTEN

PTEN

Señalización Cell Signalling Conejo, 138G6 1:100 Citoplásmica, nuclear Cáncer colorrectal

Rb

RB1 Ciclo celular Calbiochem Ratón, LM95.1 1:50 Nuclear Cáncer colorrectal

Fosfo-Rb

Fosfo-RB1 Ciclo celular Cell Signalling Conejo, policlonal 1:50 Nuclear Cáncer colorrectal

Ro-52

TRIM21 Autoinmunidad Santa Cruz Ratón, D12 1:200 Nuclear n.d.

Survivina

BIRC5 Apoptosis Cell Signalling Conejo, 71G4 1:100 Nuclear Cáncer colorrectal

SKP2

SKP2

Ciclo celular Zytomed Conejo, policlonal 1:200 Nuclear, citoplásmica Cáncer de próstata

STAT1

STAT1

Señalización Cell Signalling Conejo, 42H3 1:200 Citoplásmica, nuclear Cáncer colorrectal

Fosfo-STAT1 (S727)

Señalización Abcam Conejo, policlonal 1:100 Citoplásmica, nuclear Cáncer de mama

S1P1

S1PR1 Ciclo celular Cayman Conejo, policlonal 1:50 Citoplásmica Cáncer de mama

TGF-β1

TGFB1 Proliferación Zytomed Conejo, policlonal 1:25 Citoplásmica, membrana celular Cáncer colorrectal

Topoisomerasa IIa

TOP2A Reparación de ADN Dako Ratón, Ki-S1 1:100 Nuclear, citoplásmica Placenta

VEGFR-2

KDR Proliferación Cell Signalling Conejo, 55B11 1:200 Citoplásmica Cáncer colorrectal

XIAP (Birc4)

XIAP Apoptosis Lifespan Conejo, policlonal 1:1000 Citoplásmica Placenta

Tabla 5: Propiedades de los 70 candidatos a biomarcador para analizar inmunohistoquímicamente melanoma maligno en este estudio. Todos los anticuerpos investigados se enumeran indicando la fuente, dilución, patrón de reactividad y control positivo. La firma descrita se aprendió estadísticamente por el procedimiento de selección FDR de este conjunto de 70 biomarcadores.

5 Un dermatohistopatólogo y un patólogo quirúrgico realizaron una evaluación enmascarada, rigurosa de las secciones teñidas como se ha descrito previamente13,14. Se evaluaron la inmunorreactividad citoplásmica y nuclear usando un sistema de puntuación escalonada (de 0 a 4+): 0 (negativo): sin tinción citoplásmica o el 0% de núcleos celulares teñidos; 1+: tinción citoplásmica débil o menos del 20% de núcleos celulares teñidos; 2+: tinción

10 citoplásmica moderada o del 21 al 50% de núcleos celulares teñidos; 3+: tinción citoplásmica fuerte o del 51 al 90% de núcleos celulares teñidos; 4+: tinción citoplásmica muy fuerte o tinción nuclear mayor del 90%. Este sistema de puntuación semicuantitativa se usó consistentemente para los 70 marcadores analizados. Se estimaron los marcadores citoplásmicos según la intensidad de tinción encontrada en las células de melanoma de la mancha de TMA individual. Para los marcadores nucleares, se evaluó el porcentaje de núcleos de células de melanoma con

15 tinción positiva. Las manchas de TMA con una falta de tejido tumoral o presencia de necrosis o artefacto aplastado se excluyeron del análisis.

Análisis estadístico

20 Se realizó una estimación del poder estadístico frente al tamaño de muestra total N para diferentes cocientes de riesgos. Según esto, el tamaño de muestra disponible de 364 pacientes analizables en TMA1 sería suficiente para detectar una diferencia respecto a supervivencia con una significación de p<0,05 y un poder de casi el 100%. Se realizaron cálculos usando los modelos respectivos del software PASS 2008 (NCSS, Kaysville, UT).

25 Uno de los principales problemas estadísticos en estudios de IHC a gran escala son los valores que faltan en la matriz de diseño debido a manchas que faltan o corruptas en la TMA. Cuantos más marcadores se investigan, mayor es la probabilidad de que al menos falte un valor por paciente. Con frecuencia, este problema se aborda bien sacrificando un gran número de historias clínicas o empleando técnicas de imputación múltiple volátil. En este estudio el 9,3% de los valores faltan lo que reduciría el conjunto de pacientes con todas las medidas de IHC de 364

30 a 170. Algoritmos como bosques aleatorios de supervivencia15 y aprendizaje ensemble con potenciación de gradiente16 son capaces de ocuparse de los valores que faltan, pero producen modelos, que no son intuitivamente

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Claims (1)

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