ES2568207T3 - Procedimiento y dispositivo para la identificación de analitos - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la determinación de un analito, que comprende los pasos: (a) puesta a disposición de un elemento de ensayo que comprende (i) una primera zona que está configurada para la absorción de agente eluyente, (ii) una segunda zona, que está configurada para la aplicación de una muestra que contiene los analitos, y comprende un componente de enlace específico para los analitos, (iii) una tercera zona, que está configurada para la detección óptica del analito, (iv) una cuarta zona, que está configurada para la absorción de agente eluyente excedente, y (v) en caso dado una carcasa, (b) absorción de una muestra que contiene los analitos por una superficie de muestra con un elemento de limpieza, (c) puesta en contacto del elemento de limpieza con la segunda zona del elemento de ensayo durante un intervalo de tiempo de al menos 10 segundos, transfiriéndose al menos una parte de la muestra del elemento de limpieza al elemento de ensayo, y efectuándose una incubación de analito con el componente de enlace específico para el analito, (d) puesta en contacto de la primera zona del elemento de ensayo incubado con un agente eluyente, y (e) determinación de la presencia y/o de la cantidad de analito, comprendiendo el elemento de ensayo y/o el elemento de limpieza un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespecífica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una proteína, una mezcla de proteínas, un hidrato de carbono y un alcohol sacárico.
Description
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DESCRIPCION
Procedimiento y dispositivo para la identificacion de analitos
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la determinacion de analitos, asf como a un dispositivo apropiado a tal efecto.
Los ensayos inmunologicos constituyen un componente importante de procedimientos de analisis relevantes desde el punto de vista clmico, que se basan en la formacion de complejos inmunologicos a partir de antfgenos y anticuerpos, y sirven para la identificacion de analitos, a modo de ejemplo en el sector de la analftica medica, medioambiental, alimentaria y agraria, en muestras lfquidas. Debido a las propiedades bioffsicas y bioqmmicas, los ensayos inmunologicos ofrecen en general una alta especificidad y sensibilidad al enlace antfgeno- anticuerpo, con gasto en instalaciones y economico relativamente reducido, y presentan en este sentido ventajas significativas frente a procedimientos de identificacion alternativos.
Otro campo de aplicacion de ensayos inmunologicos significativo en la practica constituye la identificacion de drogas en lfquidos corporales, o en superficies contaminadas con drogas. En el ambito de tales ensayos se toma habitualmente una muestra de analito con un elemento de extraccion de muestras apropiado de una superficie, el elemento de extraccion de muestras humedecido con el analito se pone en contacto con una tira de ensayo, y el analito eliminado a partir del elemento de extraccion de muestras y transferido a la tira de ensayo se detecta por medio de una reaccion de identificacion inmunologica.
Un aspecto que posee un significado destacado especialmente en la identificacion de drogas (por ejemplo anfetamina, metanfetamina, cannabis, cocama, heroma), es la especificidad, sensibilidad y rapidez del ensayo empleado. En este caso existe por una parte la necesidad respecto a procedimientos de identificacion altamente sensibles, para poder identificar la presencia de drogas de manera segura y rapida, incluso en el caso de volumenes de muestra reducidos, o bien en el caso de empleo de materiales de muestra complejos, como saliva. Por otra parte, los formatos de ensayo debfan presentar tambien una alta especificidad para la substancia a identificar en cada caso, para excluir resultados de medida falsos positivos, y proporcionar ademas en este sentido una informacion fiable sobre la droga concreta de que se trata en el caso de la substancia sometida a ensayo.
El documento EP 0 699 906 A2 da a conocer un ensayo rapido de deteccion de drogas, que es adquirible comercialmente como ensayo de superficie, sudor, o bien saliva, bajo la denominacion DrugWipe® (firma Securetec Detektionssysteme AG). El ensayo hace uso de un elemento limpiador constituido esencialmente por material sintetico (“espatula”) con vellon aplicado por soldadura, por medio del cual se toma una muestra de analito (por ejemplo de una superficie o de una disolucion), y a continuacion se transfiere directamente a una tira de ensayo inmunocromatografica, que esta alojada en una carcasa desechable (tecnologfa “Lateral Flow”). El documento US 2005175992 da a conocer procedimientos, elementos de ensayo y kits para la determinacion de un analito. El documento EP 2381258 da a conocer un elemento de ensayo similar. El documento US2005/084855 da a conocer reactivos de transferencia, como BSA, que bloquean puntos de enlace sobre elemento de limpieza. Son conocidas toallitas de xilitol por Zhan et al. Journal of Dental Research, 2012, vol. 91, n° 7 Suppl, 1; pagina 85-pagina 90.
Mediante inmersion de la tira de ensayo en una disolucion acuosa (agua o tampon con diversos reactivos) se inicia la cromatograffa, pudiendose leer el resultado de la determinacion a simple vista o bajo empleo de un dispositivo de medida apropiado. La identificacion del analito se efectua ligandose a una lmea de ensayo anticuerpos enlazados con la molecula de droga (antfgeno), y formando una lmea de color debido a su marcaje dorado, que se puede detectar opticamente en la ventana de lectura. Anticuerpos que no estan cargados con moleculas de droga se capturan por medio de haptenos, que se presentan en la tira de ensayo en forma inmovilizada, antes de alcanzar la lmea de ensayo.
En comparacion con todos los demas ensayos rapidos de deteccion de drogas que se encuentran en el mercado, DrugWipe® y Triage® (firma Biosite) son los unicos productos que forman una lmea de color en el caso de presencia de un analito determinado en una muestra, y presentan en este sentido la denominada indicacion positiva. Todos los demas productos comerciales disponen de un indicador negativo, en el que la no aparicion de una lmea se valora como identificacion positiva para el respectivo analito. Otra ventaja de DrugWipe® es el volumen de muestra reducido, que se requiere para la identificacion de drogas y otras substancias. Mientras que en el caso de DrugWipe® es suficiente un volumen de muestra de aproximadamente 1 - 50 pl, otros ensayos comerciales requieren un volumen de muestra de al menos 100 pl hasta varios mililitros.
El volumen de muestra reducido, que se requiere para la puesta en practica del ensayo de deteccion rapida de drogas DrugWipe®, constituye una ventaja decisiva frente a otros sistemas de ensayo disponibles
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comercialmente, ya que los consumidores de drogas, debido a la accion fisiologica de las drogas, tienen frecuentemente una boca muy seca, y solo pueden producir activamente poca saliva. Por consiguiente, en el caso de consumidores de drogas se dispone habitualmente de volumenes de muestra muy reducidos, que no son suficientes generalmente, con excepcion del ensayo de deteccion rapida de drogas DrugWipe®, para obtener un resultado fiable, o bien exento de errores. En tanto la puesta en practica de un ensayo rapido de deteccion de drogas sea posible en tales casos, la toma de muestra dura frecuentemente varios minutos, lo que no es practicable en ultimo termino para el voluntario.
El ensayo rapido desarrollado por la firma Varian OraLab® sirve para la identificacion de drogas a partir de muestras de saliva, y se basa igualmente en la tecnologfa Lateral Flow. Mientras que la especificidad del ensayo se situa en aproximadamente un 90-100 %, la sensibilidad en el caso de anfetaminas y opiaceos se situa unicamente entre un 50 y un 90 %, en el caso de A9-tetrahidrocannabinol y cocama se situa en parte incluso claramente por debajo de un 50 % (vease estudio DRUID, publicado en TIAFT 2009 en Genf). Un gran inconveniente de este ensayo se situa ademas en que se requieren volumenes de muestra relativamente grandes, que no se encuentran disponibles en el caso de consumidores de drogas agudos.
El ensayo rapido DrugCheck® 5000 de la firma Drager, que se basa igualmente en la tecnologfa Lateral-Flow, constituye un sistema de ensayo util para la identificacion de drogas segun los datos del estudio DRUID (TIAFT 2009, Genf). Sin embargo, este formato de ensayo posee el inconveniente significativo de que los resultados en una tira de ensayo se pueden valorar solo por medio de un aparato de lectura, que es muy caro en su adquisicion, y es solo parcialmente apropiado para el duro campo de empleo en exterior. En este sentido, para este ensayo resultan problemas considerables respecto a la economfa y al facil manejo.
El kit de ensayo Rapid STAT®, ofrecido por la firma Mavand, representa otro ensayo rapido de deteccion de drogas adquirible comercialmente, en el que una muestra de saliva diluida con tampon se incuba en una tira de ensayo inmunocromatografica con componentes de enlace marcados, y que, segun datos del fabricante, posibilita una identificacion hasta un ffmite inferior de 15 ng/ml en A9-tetrahidrocannabinol.
Un inconveniente significativo de este ensayo es su manejo extremadamente complejo y complicado, que lo hace inapropiado precisamente para una aplicacion en la polida de trafico, asf como la especificidad relativamente reducida para A9-tetrahidrocannabinol, de un 80-90 % (vease estudio DRUID, TIAFT 2009, Genf). Segun un estudio de la universidad de Mainz, el mdice de resultados de ensayo falsos positivos para A9- tetrahidrocannabinol se situa en mas de un 10 %, y la especificidad total se situa en un 84 % (publicado por GTFCH 2009, Mosbach,
http://www.gtfch.org/cms/images/stories/media/tk/tk76_2/abstractsposter.pdf).
http://www.gtfch.org/cms/images/stories/media/tk/tk76_2/abstractsposter.pdf).
El documento US 2005/0084855 A1 da a conocer un procedimiento para la determinacion de un analito en una muestra, que comprende la puesta en contacto de la muestra con un soporte apto para enlace del analito, la puesta en contacto del soporte que contiene analito con un sello que contiene una sonda apropiada para enlace del analito, asf como la verificacion de la cantidad unida al soporte en sonda. Un inconveniente esencial del procedimiento de identificacion consiste en que el sello no es apropiado para la absorcion de una muestra de analito de una superficie a investigar, y ademas se requieren agentes auxiliares tecnicos (como por ejemplo un scanner de fluorescencia) para la valoracion de los resultados.
Los documentos WO 2005/075982 A2 y US 2005/0175992 A1 dan a conocer respectivamente un procedimiento para la determinacion de un analito a partir de patogenos y/o substancias asociadas a alergia en un fluido corporal. En el ambito del procedimiento, el fluido corporal se absorbe por medio de un elemento de limpieza separado o integrado en el elemento de ensayo, y este se pone en contacto con el elemento de ensayo durante un intervalo de tiempo preferentemente de 0,1 a 10 segundos, transfiriendose al menos una parte de muestra del elemento de limpieza al elemento de ensayo, y analizandose el analito tras comienzo de la cromatograffa y enlace a un componente de enlace espedfico para el analito. Ademas se describe un kit para la deteccion de adenovirus, que comprende una tira de ensayo cromatografica en combinacion con un elemento de limpieza.
Un inconveniente decisivo del procedimiento de identificacion descrito en los documentos WO 2005/075982 A2 y US 2005/0175992 A1 consiste en que, antes del comienzo de la cromatograffa, no se realiza un contacto directo entre el analito y el componente de enlace espedfico para el analito, con lo cual la formacion de un complejo a partir de analito y componente de enlace espedfico para el analito se puede realizar solo en el transcurso de la cromatograffa. Ademas, el fluido corporal que contiene los analitos no se elabora de ningun modo antes del enlace al componente enlazante que se efectua en el elemento de ensayo, a modo de ejemplo mediante tratamiento previo qdmico y/o mecanico de la muestra, por lo cual no se puede conseguir de hecho un enlace optimo entre analito y componente de enlace espedfico para el analito.
Sin embargo, en especial muestras biologicas con composicion qdmica compleja (por ejemplo sangre, saliva o sudor) estan sujetas a una margen de oscilacion dependiente de la persona, a modo de ejemplo en relacion con consistencia, viscosidad, contenido en sales y/o contenido en protemas. Si una muestra biologica no se trata
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previamente antes del comienzo de la cromatograffa, esto ocasiona resultados poco reproducibles, as^ como perdidas respecto a la sensibilidad del procedimiento, ya que el analito, debido al enlace en puntos de enlace inespedficos en la matriz de muestra, ya no se encuentra disponible para la verdadera identificacion de analito.
Los documentos EP 0 811 842 A2 y EP 0 699 906 A2 dan a conocer un procedimiento para la identificacion de un analito en un lfquido corporal, o bien en una superficie contaminada. En este caso, para la puesta en practica del procedimiento se emplea respectivamente un kit de ensayo, que comprende una tira de ensayo constituida por uno o varios materiales con actividad capilar aptos para cromatograffa, un elemento de extraccion de muestras separado a de la superficie de la tira de ensayo, asf como un dispositivo de presion para la puesta en contacto de la superficie de la tira de ensayo y el elemento de extraccion de muestras, pudiendo estar humedecido el elemento de extraccion de muestras con un tampon acuoso, un detergente y/o un disolvente organico con el fin de una mayor absorcion de analito.
El documento EP 2 381 258 A1 da a conocer un procedimiento para la determinacion de un analito, que comprende la puesta a disposicion de un dispositivo de analisis microflmdico, la absorcion de una muestra que contiene el analito por una superficie de muestra con un elemento de limpieza, la introduccion del elemento de limpieza que contiene el analito en el dispositivo de analisis microflmdico, la elucion de analito del elemento de limpieza dentro del dispositivo de analisis microflmdico con un agente eluyente, asf como la determinacion del analito en un elemento de ensayo alojado en el dispositivo de analisis microflmdico. En una variante preferente, el elemento de limpieza comprende un reactivo de transferencia, que contiene al menos una protema, al menos un hidrato de carbono, al menos un alcohol sacarico y/o al menos una sal.
El documento WO 2005/121793 A2 da a conocer un procedimiento para la identificacion de una metanfetamina en una muestra lfquida. Para la puesta en practica del procedimiento se emplea preferentemente un kit, que comprende una tira de ensayo cromatografica, y en caso dado un elemento de extraccion de muestras. La tira de ensayo comprende por su parte (a) un material seco poroso, sobre el cual esta inmovilizado un conjugado de pseudoefedrina/soporte o un anticuerpo, que se puede enlazar tanto a la metanfetamina, como tambien al conjugado, en una zona de deteccion, y (b) una zona de liberacion de marcador separada de la misma, que contiene el anticuerpo en forma marcada, en tanto la zona de deteccion contenga conjugado de pseudoefedrina/soporte inmovilizado, o puede liberar en el lfquido conjugado de pseudoefedrina/soporte detectable, en tanto la zona de deteccion contenga anticuerpo inmovilizado.
Tambien los procedimientos de identificacion descritos en los documentos EP 0 699 906 A2, EP 811 842 A2, EP 2 381 258 A1 y WO 2005/121793 A2 tienen el inconveniente de que no se efectua un tratamiento previo de la muestra antes del comienzo de la cromatograffa, y/o no tiene lugar una incubacion directa, o bien definida, entre el analito y el componente de enlace espedfico para el analito. El analito y el componente de enlace espedfico para el analito entran en contacto entre sf mas bien en el transcurso de la cromatograffa, debido a lo cual no se puede realizar un enlace optimo entre el analito y el componente de enlace espedfico para el analito, y en ultimo termino se influye negativamente en la sensibilidad y la especificidad del procedimiento, en especial en la identificacion de analitos poco hidrosolubles. Esto conduce al menos parcialmente a que no se alcancen los lfmites de identificacion mmimos requeridos legalmente para moleculas de drogas.
Por consiguiente, partiendo de sistemas de ensayo descritos anteriormente, la presente invencion tomaba como base la tarea de poner a disposicion un procedimiento para la determinacion de un analito, en especial para la determinacion de drogas, en el que se eliminen al menos en parte los inconvenientes del estado de la tecnica. En especial, el procedimiento debfa presentar una alta sensibilidad y especificidad para todos los analitos a analizar, ser facilmente manejable, y posibilitar una determinacion rapida de analitos sin el empleo de agentes auxiliares tecnicos adicionales.
Este problema se soluciona segun la invencion mediante un procedimiento para la determinacion de un analito, que comprende los pasos:
(a) puesta a disposicion de un elemento de ensayo que comprende
(i) una primera zona que esta configurada para la absorcion de agente eluyente,
(ii) una segunda zona, que esta configurada para la aplicacion de una muestra que contiene los
analitos, y comprende un componente de enlace espedfico para los analitos,
(iii) una tercera zona, que esta configurada para la deteccion optica del analito,
(iv) una cuarta zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente excedente, y
(v) en caso dado una carcasa,
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(b) absorcion de una muestra que contiene los analitos por una superficie de muestra con un elemento de limpieza,
(c) puesta en contacto del elemento de limpieza con la segunda zona del elemento de ensayo durante un intervalo de tiempo de al menos 10 segundos, transfiriendose al menos una parte de la muestra del elemento de limpieza al elemento de ensayo, y efectuandose una incubacion de analito con el componente de enlace espedfico para el analito,
(d) puesta en contacto de la primera zona del elemento de ensayo incubado con un agente eluyente, y
(e) determinacion de la presencia y/o de la cantidad de analito, comprendiendo el elemento de ensayo y/o el elemento de limpieza un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato de carbono y un alcohol sacarico.
Sorprendentemente, en el ambito de la presente invencion se verifico que, por medio del procedimiento segun la invencion, se pueden identificar analitos de manera sencilla y reproducible, con sensibilidad y especificidad elevadas, sin que sean necesarias a tal efecto grandes cantidades de muestra ni agentes auxiliares tecnicos complejos, a modo de ejemplo para la lectura de resultados de medida.
El primer paso del procedimiento segun la invencion requiere la puesta a disposicion de un elemento de ensayo apropiado para la determinacion del analito, que comprende un componente de enlace espedfico para los analitos. Los elementos de ensayo empleados con este fin comprenden en principio cualquier forma ffsica de uso comun para el especialista, que sea apropiada para la determinacion de la presencia y/o de la cantidad de un analito en una muestra. En este caso, el elemento de ensayo esta configurado preferentemente de tal manera que, en presencia del analito a determinar, genera una serial detectable opticamente, que posibilita una determinacion cualitativa y/o cuantitativa del analito. Los ejemplos de elementos de ensayo en el sentido de la presente invencion comprenden, entre otras, tiras de ensayo, bandas de ensayo y pads de ensayo, sobre los que se puede aplicar el analito, a modo de ejemplo en forma de disolucion acuosa o no acuosa.
En una forma de ejecucion preferente, en el caso del elemento de ensayo se trata de una tira de ensayo cromatografica, que puede estar constituida por un unico material apto para cromatograffa, en caso dado en forma de tira, en una variante de la invencion. Sin embargo, la tira de ensayo cromatografica comprende preferentemente varias superficies con actividad capilar dispuestas de manera solapante sobre una capa soporte, constituidas por materiales cromatograficos iguales o diferentes, que estan en comunicacion fluida entre sf, y de este modo forman un tramo de transporte, a lo largo del cual puede circular un fluido, impulsado por fuerzas capilares, a traves de todas las zonas del elemento de ensayo. En este caso se puede emplear como material cromatografico cualquier material absorbente de lfquido, poroso o con actividad capilar conocido, como por ejemplo celulosa o derivados de la misma, fibras de vidrio, asf como vellones y tejidos de materiales sinteticos o naturales. Las tiras de ensayo cromatograficas que se pueden aplicar en el ambito de la presente invencion se describen, a modo de ejemplo, en el documento EP 0 699 906 A2, a cuya manifestacion se hace referencia expresamente en este caso.
El componente de enlace espedfico para el analito puede ser cualquier substancia qdmica que se enlace al analito a analizar, pero que no forme ningun tipo de enlace con otras substancias, presentes eventualmente en la muestra y/o en el elemento de ensayo. Las substancias qdmicas que corresponden a este perfil de requisitos son generalmente conocidas por el especialista, o se pueden obtener correspondientemente a los requisitos en el respectivo elemento de ensayo por medio de experimentos rutinarios, y bajo aplicacion de tecnicas conocidas. Preferentemente, el componente de enlace espedfico para el analito es movil en los elementos de ensayo descritos en este caso, y se puede inmovilizar en el elemento de ensayo, a modo de ejemplo, por medio de un reactivo de captura posicionado de modo apropiado en una posicion predeterminable. Se describen componentes de enlace espedficos para el analito, cuyo empleo se ha mostrado especialmente ventajoso, a modo de ejemplo en el documento EP 1 579 222 B1, a cuya manifestacion se hace referencia expresamente.
En una forma de ejecucion preferente, en el caso del componente de enlace espedfico para el analito se trata de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo funcional, que puede presentar, en caso dado, adicionalmente un punto de enlace o varios puntos de enlace para un reactivo de captura, como se describe anteriormente. El concepto “fragmento de anticuerpo funcional”, como se emplea en el ambito de la presente solicitud, designa en este caso un fragmento de anticuerpo que puede cumplir la funcion de un enlace espedfico a los analitos, asignada para el mismo. Un “fragmento de anticuerpo no funcional” designa, por consiguiente, un fragmento de anticuerpo que no forma un enlace o un enlace espedfico con el analito, y en este aspecto no cumple la funcion de un enlace espedfico a los analitos, asignada para el mismo.
Para facilitar la identificacion de analitos por medio de los elementos de ensayo descritos en este caso, el
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componente de enlace espedfico para el analito puede comprender, en caso dado, un marcaje detectable, como por ejemplo un marcaje enzimatico, un marcaje de colorante, un marcaje fluorescente, un marcaje metalico o un marcaje de partmulas. Para los fines de la presente invencion se ha mostrado ventajoso el empleo de componentes de enlace espedficos para el analito, que comprenden un marcaje detectable opticamente, en especial un marcaje metalico. De modo especialmente preferente, en el caso del marcaje se trata de un marcaje de oro, que posee la ventaja de que el resultado de ensayo se puede registrar y valorar de manera optica-visual directamente por el usuario. Las tecnicas por medio de las cuales se pueden introducir los marcajes descritos anteriormente en una molecula a marcar, son conocidas por el especialista y no se explican mas detalladamente en este sentido.
Para la determinacion del analito bajo empleo de los elementos de ensayo descritos en este caso, en un paso adicional se absorbe una muestra que contiene los analitos por una superficie a analizar (por ejemplo lengua, piel, otras superficies) por medio de un elemento de limpieza apropiado. En este caso, como elemento de limpieza se puede emplear cualquier elemento que sea apto para absorber una muestra de analito, y posibilite una subsiguiente transferencia de la muestra al elemento de ensayo, a modo de ejemplo bajo utilizacion de efectos capilares. El elemento de limpieza presenta una o varias superficies de limpieza (independientes entre sf), siendo preferentes elementos de limpieza con 2, 3 o 4 superficies de limpieza en el caso de varias superficies de limpieza. En tanto se emplee un elemento de ensayo con varias superficies de limpieza, en la posterior reunion de un dispositivo de ensayo, que comprende varios elementos de ensayo (independientes entre sf), y el elemento de limpieza, se pone en contacto respectivamente un elemento de ensayo con una superficie de limpieza del elemento de limpieza.
La superficie de limpieza, al menos una, que esta soldada preferentemente con una superficie del elemento de limpieza, puede estar constituida en principio por cualquier material que el especialista considere util para los fines de la presente invencion, y posibilite tanto una concentracion de analito en la superficie de limpieza, como tambien una posterior transferencia del analito al elemento de ensayo. En este caso se han mostrado convenientes especialmente materiales absorbentes, en especial tejidos, vellones y/o matrices porosas (por ejemplo membranas y esponjas). En el ambito de la invencion se emplean de modo especialmente preferente vellones, en especial vellones a base de fibras de celulosa, poliester y/o vidrio, pudiendose cohesionar las fibras, en caso dado, con ayuda de un agente aglutinante organico. Se describen vellones apropiados, o bien fibras, a modo de ejemplo, en los documentos DE 38 02 366 A1 y EP 0 699 906 A2, a cuya manifestacion se hace referencia expresamente.
En lo que se refiere al acondicionamiento externo de la(s) superficie(s) de limpieza, en principio no existen limitaciones respecto a grosor, dimension y geometna. El grosor de la(s) superficie(s) de ensayo, o bien del material empleado a tal efecto, es de significado subordinado para los fines de la presente invencion, y se situa habitualmente en un intervalo de 0,1 a 3 mm. La dimension de la(s) superficie(s) de limpieza esta adaptada ventajosamente a la dimension del elemento de limpieza, es decir, la anchura de la(s) superficie(s) de ensayo no debfa sobrepasar ni ser inferior a la anchura del elemento de ensayo. Las dimensiones preferentes de la(s) superficie(s) de ensayo se situan en el intervalo de 0,3 a 2 cm respecto a la longitud, en el intervalo de 0,3 a 1 cm respecto a la anchura. La geometna de la(s) superficie(s) de limpieza se puede adaptar a los respectivos requisitos en la superficie a analizar, considerandose especialmente ventajoso una configuracion triangular, rectangular (por ejemplo cuadrada, rectangular, romboidal) o cilmdrica de la(s) superficie(s) de ensayo. En este caso, una configuracion cilmdrica de la(s) superficie(s) de ensayo tiene la ventaja de que, a traves de la gran superficie del (de las) area(s) de limpieza se realiza un contacto especialmente bueno entre el elemento de limpieza y la segunda zona del elemento de ensayo, y correspondientemente se puede conseguir un aumento de la sensibilidad del procedimiento.
Para garantizar una sensibilidad y especificidad especialmente elevada en la determinacion del analito, el procedimiento segun la invencion preve que el elemento de ensayo y/o el elemento de limpieza comprenda un reactivo de transferencia de analito. En una forma de ejecucion de la invencion, el elemento de ensayo empleado para la determinacion del analito comprende el reactivo de transferencia de analito, mientras que en otra forma de ejecucion el elemento de limpieza contiene el reactivo de transferencia de analito. No obstante, de modo especialmente preferente, tanto el elemento de ensayo, como tambien el elemento de limpieza, comprenden un reactivo de transferencia de analito, como se define en detalle a continuacion.
El reactivo de transferencia de analito contiene al menos una substancia inespedfica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato de carbono y un alcohol sacarico, designando el concepto “substancia inespedfica para el analito” una substancia qmmica que no se enlaza exclusivamente al analito a analizar, sino que tambien puede formar enlaces con otras substancias presentes eventualmente en la muestra y/o en el elemento de ensayo. La concentracion de protema, mezcla de protemas, hidrato de carbono, o bien alcohol sacarico, en el reactivo de transferencia de analito/los reactivos de transferencia de analito, se puede adaptar al elemento de ensayo por parte del especialista correspondientemente a los respectivos requisitos, pero en lo habitual asciende, no obstante, a aproximadamente un 0,01 hasta aproximadamente un 15 % en peso, referido a la mezcla total de reactivo de
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transferencia de analito.
En tanto el elemento de ensayo comprenda el reactivo de transferencia de analito, ademas se debe considerar preferente que el reactivo de transferencia de analito contenga un hidrato de carbono y/o un alcohol sacarico, en especial un alcohol sacarico. Por consiguiente, el elemento de limpieza comprende preferentemente un reactivo de transferencia de analito, que contiene una protema inespedfica para el analito o/y una mezcla de protemas inespedfica para el analito, en especial una protema inespedfica para el analito. Como protema inespedfica para el analito, en los elementos de ensayo y/o elementos de limpieza descritos en este caso se emplea preferentemente una albumina, en especial ovoalbumina o albumina de suero vacuno, mientras que como mezcla de protemas inespedfica para el analito se puede aplicar, a modo de ejemplo, gelatina o leche desnatada en polvo.
El concepto “hidrato de carbono”, como se emplea en la presente solicitud, designa monosacaridos, oligosacaridos y polisacaridos de la formula aditiva general CnH2nOn, que puede ser de origen natural o sintetico en cada caso. En el ambito de la invencion se emplean preferentemente monosacaridos u oligosacaridos, aplicandose como monosacaridos en especial tetrosas, pentosas y hexosas presentes en la naturaleza, como por ejemplo eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, lixosa, xilosa, alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa y fructosa, que se pueden presentar en la forma D o en la forma L en cada caso. Como oligosacaridos se pueden emplear en especial disacaridos y trisacaridos presentes en la naturaleza, como por ejemplo lactosa, maltosa, sacarosa, trehalosa, gentianosa, cestosa y rafinosa. En una forma especialmente preferente de ejecucion de la invencion, el reactivo de transferencia contiene un hidrato de carbono seleccionado a partir del grupo constituido por glucosa, lactosa, maltosa y sacarosa.
El concepto “alcohol sacarico”, como se emplea en la presente solicitud, designa alcoholes de azucares monosacaridos de la formula aditiva general CnH2n+2On, y alcoholes disacaridos de la formula aditiva general CnH2nOn-i, que pueden ser de origen natural o sintetico en cada caso. Los alcoholes de azucares monosacaridos preferentes comprenden glicerol, eritritol, treitol, ribitol, arabinitol, xilitol, alitol, altritol, galactitol, glucitol, iditol y manitol, que se pueden presentar en la forma D o en la forma L en cada caso. Como alcoholes de azucares disacaridos se pueden emplear en especial isomalta, lactitol y maltitol. En una forma especialmente preferente de ejecucion de la invencion, en el caso del alcohol sacarico se trata de una substancia seleccionada a partir del grupo constituido por glucitol, glicerol, manitol y xilitol.
El reactivo de transferencia de analito, que favorece la transferencia de analito de la superficie a analizar al elemento de limpieza y/o la subsiguiente transferencia de analito del elemento de limpieza al elemento de ensayo, en especial mediante bloqueo de puntos de enlace libres en el elemento de limpieza o/y mediante influencia de las propiedades del analito, puede estar impregnado, a modo de ejemplo, en el elemento de ensayo o/y el elemento de limpieza, en especial en la zona de la(s) superficie(s) de limpieza. Las tecnicas que se pueden emplear para la aplicacion del reactivo de transferencia de analito sobre el elemento de ensayo o/y el elemento de limpieza, son conocidas por el especialista, y se pueden elegir selectivamente correspondiendo a los requisitos en el elemento de ensayo.
Para garantizar una absorcion lo mas completa posible de analito, la superficie de limpieza, al menos una, del elemento de limpieza, en el caso de analisis de superficies secas, se puede humedecer con una cantidad reducida, a modo de ejemplo con aproximadamente 1 - 100 pl, de un lfquido apropiado. Con este fin, el lfquido se puede aplicar, a modo de ejemplo por medio de una pipeta, un dispositivo de dosificacion automatico, o un material que desprende el lfquido (por ejemplo una esponja impregnada con el lfquido) sobre la(s) superficie(s) de limpieza. Alternativamente, la humectacion de la(s) superficie(s) de ensayo se puede efectuar tambien de modo que la superficie de limpieza, al menos una, contenga el lfquido en forma microencapsulada o envasada en blisters, y el lfquido se libere sobre la superficie a investigar mediante medidas apropiadas, a modo de ejemplo mediante prensado de la(s) superficie(s) de limpieza. Los lfquidos que son apropiados para una humectacion de superficie(s) de limpieza comprenden en especial agua y disoluciones tampon acuosas, que pueden contener, en caso dado, otras substancias, como por ejemplo un detergente o/y un disolvente organico, como se describe anteriormente en cada caso. En tanto el elemento de limpieza se ponga en contacto con superficies humedas o muestras lfquidas, generalmente no es necesaria una humectacion previa de la(s) superficie(s) de limpieza.
Tras absorcion de la muestra, en un paso adicional del procedimiento segun la invencion, el elemento de limpieza se pone en contacto con la segunda zona del elemento de ensayo, que comprende el componente de enlace espedfico para el analito, preferentemente mediante ligera presion mecanica de su(s) superficie(s) de limpieza, transfiriendose al menos una parte de la muestra del elemento de limpieza al elemento de ensayo. La presion con la que el elemento de limpieza se presiona sobre el elemento de ensayo debfa ser al menos tan elevada que se diera un contacto superficial entre la superficie del elemento de ensayo y la superficie de limpieza/las superficies de limpieza del elemento de limpieza, y en este sentido se posibilitara una comunicacion fluida entre ambos elementos. Mediante el contacto directo entre elemento de limpieza y la segunda zona del elemento de ensayo se realiza un contacto directo, y con ello rapido, entre el analito y el componente de enlace
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espedfico para el analftico, mediante lo cual se puede efectuar una formacion rapida de complejo a partir de analito y componente de enlace espedfico para el analito, y se mejora la sensibilidad y especificidad del procedimiento de identificacion.
En una variante preferente, para mejorar adicionalmente la sensibilidad y especificidad del procedimiento, la segunda zona del elemento de ensayo configurada para la aplicacion de la muestra comprende adicionalmente al menos un agente que ocasiona una elaboracion qdmica o/y mecanica de la muestra que contiene los analitos, a modo de ejemplo mediante bloqueo, o bien destruccion de puntos de enlace inespedficos en la muestra o/y mediante modificacion de la consistencia de la muestra. De este modo, el analito se encuentra disponible de manera optima para un enlace en el componente de enlace espedfico para el analito (por ejemplo en un anticuerpo), por lo cual se mejora la accesibilidad del analito para los componentes de enlace espedficos para el analito, asf como el transporte a traves de las zonas aisladas del elemento de ensayo. En tanto se emplee un agente qmmico de elaboracion de muestras, este puede estar absorbido, a modo de ejemplo, en el elemento de ensayo, empleandose para la impregnacion preferentemente una disolucion acuosa o no acuosa, que contiene el agente qmmico de elaboracion de muestras en una concentracion de aproximadamente un 0,01 a aproximadamente un 5 % en peso. De modo especialmente preferente, en el elemento de ensayo se aplica paralelamente al menos un agente qmmico de elaboracion de muestras, y al menos un agente mecanico de elaboracion de muestras.
Los agentes qmmicos de elaboracion de muestras, que se pueden aplicar en el ambito del procedimiento segun la invencion, comprenden en especial acidos, bases, tampones, disolventes organicos y detergentes, considerandose especialmente preferentes bases y detergentes. Los ejemplos concretos de acidos comprenden acidos inorganicos (por ejemplo acido clorlddrico) y acidos organicos (por ejemplo acido acetico y acido dtrico). Las bases ejemplares comprenden en especial hidroxidos metalicos alcalinos y alcalinoterreos, como por ejemplo hidroxido sodico e hidroxido de calcio, mientras que como tampon se pueden emplear, entre otros, carbonato de calcio, Tris, PBS, tampon fosfato, tampon borato, tampon BICINE y HEPES. Los ejemplos de detergentes comprenden, entre otros, octilglucosido, colamidopropanosulfonato, polidocanol,
polialquilenglicoleter (por ejemplo Brij®, Synperonic®) y polisorbatos (por ejemplo Tween® 20, Tween® 80). Los disolventes organicos ejemplares comprenden en especial dimetilsulfoxido, etanol, glicerina, isopropanol, metanol, y mezclas de los mismos.
Los agentes mecanicos de elaboracion de muestras, que se pueden aplicar en el ambito del procedimiento segun la invencion, comprenden, a modo de ejemplo, tejidos y/o vellones, en especial vellones, por medio de los cuales se filtra, o bien se separa la muestra antes de incubacion del analito con el componente de enlace espedfico para el analito, de modo que se retienen componentes de muestra especialmente solidos y viscosos (por ejemplo componentes de saliva solidos y viscosos), que pueden influir negativamente en el procedimiento de identificacion. Los ejemplos concretos de vellones, que pueden ocasionar una elaboracion mecanica de la muestra, comprenden, a modo de ejemplo, los productos adquiribles comercialmente Ahlstrom 8964, Whatman Rapid 24Q y Freudenberg FS 2216, pero no se limitan a estos.
Para facilitar al usuario la puesta en contacto de elemento de ensayo y elemento de limpieza, en una forma de ejecucion de la invencion, uno o varios elementos de ensayo pueden estar alojados en una carcasa. En este caso, la carcasa presenta preferentemente al menos una escotadura, a traves de la cual se puede poner en contacto el elemento de limpieza con la zona del respectivo elemento de ensayo configurada para la aplicacion de la muestra. En tanto el elemento de limpieza presente varias superficies de limpieza, se debe considerar preferente que la carcasa contenga unicamente una unica escotadura para el alojamiento del elemento de limpieza. En este sentido, alternativamente tambien es posible que la carcasa contenga un numero de escotaduras correspondiente al numero de superficies de limpieza.
La(s) escotadura(s) puede/pueden estar dispuestas en cualquier forma (respectivamente), y presentar cualquier dimension y geometna que el especialista considere apropiada, pero habitualmente esta/estan adaptada(s) a la disposicion, la dimension y la geometna de la(s) superficie(s) de limpieza del elemento de limpieza. De este modo es posible, por ejemplo, obtener una reunion de elemento de limpieza y elemento de ensayo definida previamente, para evitar de este modo una utilizacion indebida del sistema de ensayo (vease la figura 3).
En otra forma de ejecucion, la carcasa puede comprender ademas un dispositivo de sujecion, que permite una fijacion reversible del elemento de limpieza a la carcasa, de modo que esta ultima se puede retirar, a modo de ejemplo, para la toma de muestras, y colocar de nuevo en la carcasa tras la toma de muestras. En este caso, mediante seleccion de una posicion apropiada para el dispositivo de sujecion se puede situar el elemento de limpieza en la carcasa de modo que se asegura un contacto intensivo entre elemento de limpieza, o bien su(s) superficie(s) de limpieza, y el elemento de ensayo, lo que garantiza una buena transferencia de analito del elemento de limpieza al elemento de ensayo que comprende el componente de enlace espedfico para el analito.
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Segun la invencion, el elemento de ensayo y el elemento de limpieza humedecido con el analito se ponen en contacto entre sf para una sensibilidad y especificidad de la determinacion de analitos mas elevada, durante un intervalo de tiempo de al menos 10 segundos, incubandose el componente de enlace espedfico para el analito, que se encuentra en el elemento de ensayo, con el analito a determinar, y efectuandose, en caso dado adicionalmente, una elaboracion qdmica y/o mecanica de la muestra que contiene los analitos. De este modo se asegura por una parte que el analito se desprenda lo mas completamente posible de la matriz de muestra del elemento de limpieza, y por otra parte que pueda reaccionar casi cuantitativamente con el componente de
enlace espedfico para el analito. En este contexto se ha mostrado ventajoso un tiempo de incubacion de
aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 600 segundos, de modo mas preferente de
aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 300 segundos, del modo mas preferente de
aproximadamente 60 segundos a aproximadamente 180 segundos. Mediante tal control de procedimiento, el volumen de muestra necesario para la determinacion del analito se reduce habitualmente a menos de 10 pm, y la sensibilidad del sistema de ensayo se mejora claramente.
A continuacion de la incubacion con el analito, el elemento de ensayo se pone en contacto con un agente eluyente. Con este fin, el elemento de ensayo comprende preferentemente una zona terminal, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente, y habitualmente un material absorbente, como por ejemplo tejido y/o vellon. Tras humectacion de esta zona con agente eluyente, el agente eluyente migra a traves de las diversas zonas del elemento de ensayo, transportandose concomitantemente analito, componente de enlace espedfico para el analito, asf como sus complejos de modo correspondiente. En este caso se puede utilizar ventajosamente la accion capilar de los componentes aislados del elemento de ensayo, que se disponen, o bien se unen entre sf, de tal manera que se garantiza un flujo de agente eluyente ininterrumpido.
En el ambito de la presente invencion se puede emplear como agente eluyente en principio cualquier agente eluyente que el especialista considere conveniente. Sin embargo, en el procedimiento aqm descrito se aplica preferentemente agua y disoluciones tampon acuosas, que pueden contener, en caso dado, otras substancias, como por ejemplo un hidrato de carbono, o un alcohol sacarico, un detergente y/o un disolvente organico, como se describe anteriormente en cada caso, en una concentracion de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 1,5 % en peso. En una forma preferente de ejecucion de la invencion, el agente eluyente comprende un alcohol sacarico, como se define anteriormente, y/o un derivado del mismo, en el que al menos un grupo hidroxi del alcohol sacarico esta substituido por un grupo mercapto. En el ambito del procedimiento segun la invencion se considera especialmente preferente un agente eluyente preferentemente acuoso, que comprende 1,4-ditioeritritol como componente, mediante cuyo empleo se puede conseguir un aumento de la sensibilidad y/o especificidad de la determinacion de analitos.
En tanto el elemento de ensayo este alojado en una carcasa, en dependencia de la configuracion de la carcasa existen diversas posibilidades para ocasionar una humectacion del elemento de ensayo con agente eluyente. Si el elemento de ensayo esta completamente alojado en la carcasa, el agente eluyente se puede aplicar, a modo de ejemplo, mediante presion sobre una ampolla que contiene el agente eluyente, que esta alojada preferentemente dentro de la carcasa, sobre la primera zona del elemento de ensayo, configurada para la absorcion de agente eluyente. Si la primera zona del elemento de ensayo, configurada para la absorcion de agente eluyente, sobresale de la carcasa, existe posibilidad de sumergir la zona en el agente eluyente.
Tras puesta en contacto del elemento de ensayo con el agente eluyente se pone en marcha la determinacion de analito, que se efectua preferentemente por vfa inmunologica y comprende, a modo de ejemplo, un formato de ensayo competitivo o/y un formato de ensayo no competitivo (formato de ensayo tipo sandwich), en especial una combinacion de un formato de ensayo competitivo y un formato de ensayo no competitivo. Habitualmente, el procedimiento de identificacion segun la invencion comprende en primer lugar la formacion de un complejo a partir de moleculas de analito y componente de enlace espedfico para el analito, en caso dado marcado, que se transporta de modo subsiguiente con ayuda del agente eluyente, a modo de ejemplo junto con componente de enlace no enlazado o/y otras substancias presentes en la muestra, hasta una zona del elemento de ensayo que esta configurada para la deteccion optica de analito.
La zona configurada para la deteccion optica de analito comprende habitualmente varias secciones definidas, en las que pueden estar inmovilizados diversos reactivos. En una forma de ejecucion, esta zona comprende una seccion que esta configurada para el enlace de componente de enlace espedfico para el analito no enlazado, una seccion que esta configurada para el enlace de complejo constituido por analito y componente de enlace espedfico para el analito, y en caso dado una seccion en la que se genera una serial de control dependiendo del analito (vease figura 1). En este caso, la zona configurada para la deteccion optica de analito puede estar formada por uno o varios materiales, que el especialista considere apropiados para los fines de la invencion, como por ejemplo membranas de Nylon®, nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno.
La seccion prevista para el enlace de componente de enlace espedfico para el analito no enlazado puede comprender, a modo de ejemplo analogos de analito inmovilizados, en especial polihaptenos, que capturan el componente de enlace espedfico para el analito, en caso dado marcado, debido a la formacion de un complejo
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en una posicion definida sobre el elemento de ensayo (lmea de captura), y de este modo evitan la generacion de resultados falsos positivos. El complejo constituido por analito y componente de enlace espedfico para el analito no se inmoviliza habitualmente en la lmea de captura, ya que el analito bloquea los puntos de enlace necesarios a tal efecto en el componente de enlace espedfico para el analito.
La seccion configurada para el enlace del complejo de analito y componente de enlace espedfico para el analito comprende preferentemente un componente de enlace espedfico para el componente de enlace espedfico para el analito, en caso dado marcado, que provoca una inmovilizacion de complejo constituido por analito y componente de enlace espedfico para el analito en una posicion predeterminada sobre el elemento de ensayo (lmea de ensayo), y de este modo posibilita una determinacion optica de analito. La inmovilizacion de complejo se efectua por regla general a traves de un punto de enlace libre del componente de enlace espedfico para el analito, yendo acompanada una identificacion positiva de analito de una coloracion de la lmea de ensayo.
Para poder leer claramente la senal en la lmea de ensayo y para excluir confusiones con la lmea de captura, la lmea de captura se puede cubrir, en caso dado de modo apropiado. En tanto el elemento de ensayo comprenda ademas una seccion de control, en la puesta en practica del procedimiento aparece adicionalmente una lmea de control, que actua como indicador para una funcionalidad inmejorable del elemento de ensayo. El agente eluyente excedente, que abandona la zona del elemento de ensayo configurada para la deteccion optica de analito, se puede absorber con ayuda de material absorbente de lfquido en una zona del elemento de ensayo configurada especialmente a tal efecto.
En otra forma de ejecucion, la zona configurada para la deteccion optica del analito, como se describe anteriormente, no comprende una seccion configurada para el enlace de componente de enlace espedfico para el analito no enlazado (vease la figura 2). En este caso, para la generacion del complejo a partir de analito y componente de enlace espedfico para el analito se emplea preferentemente un componente de enlace espedfico para el analito especial, como se describe, a modo de ejemplo, en el documento EP 1 579 222 B1. Por consiguiente, tales complejos se pueden inmovilizar por medio de un componente de enlace espedfico para el complejo, lo que conduce en ultimo termino a una deteccion simplificada de analito, ya que se evita la generacion de senales falsas positivas, que se pueden ocasionar, entre otras maneras, mediante el componente de enlace espedfico para el analito no enlazado en la lmea de captura.
La seccion configurada para el enlace del complejo constituido por analito y componente de enlace espedfico para el analito comprende preferentemente un componente de enlace espedfico para el complejo, que ocasiona una inmovilizacion de complejo constituido por analito y componente de enlace espedfico para el analito en una posicion predeterminada sobre el elemento de ensayo (lmea de ensayo), y de este modo posibilita una determinacion optica de analito. La inmovilizacion del complejo constituido por analito y componente de enlace espedfico para el analito se efectua por regla general a traves de un punto de enlace libre del componente de enlace espedfico para el analito, yendo acompanada una identificacion positiva de analito de una coloracion de la lmea de ensayo.
La determinacion cualitativa y/o cuantitativa de analito llevada a cabo en el ultimo paso del procedimiento segun la invencion se puede efectuar de cualquier modo. A tal efecto se pueden emplear en principio todos los metodos para la identificacion de una formacion de complejo conocidos por el estado de la tecnica, que generan una senal mensurable, que se puede valorar, o bien leer manualmente o bajo empleo de agentes apropiados. En el ambito de la presente invencion se emplean preferentemente metodos de identificacion opticos, en especial metodos de identificacion fotometricos o fluorimetricos. Segun la invencion es especialmente preferente una identificacion optica-visual de analito.
En una forma de ejecucion especialmente preferente, por medio del procedimiento segun la invencion se determinan varios analitos diferentes, en especial 2 a 20 analitos distintos, de manera simultanea. En este caso, el elemento de ensayo comprende habitualmente un numero de componentes de enlace espedficos para el analito diferentes correspondiente al numero de analitos diferentes en la segunda zona configurada para la aplicacion de la muestra, y, en tanto el elemento de ensayo no contenga ninguna seccion para la captura de componentes de enlace espedficos para el analito no enlazados, en caso dado un numero de componentes de enlace espedficos para el complejo correspondiente al numero de analitos diferentes, como se describen anteriormente. De este modo se puede asegurar que la determinacion paralela de diversos analitos en el elemento de ensayo se efectue esencialmente de modo independiente entre sf, y no se presente ningun tipo de interferencias.
El procedimiento segun la invencion posibilita la determinacion de uno o varios analitos con sensibilidad y especificidad elevadas. De este modo, segun la invencion es preferente determinar analitos con una especificidad de al menos un 95 % o/y una sensibilidad de al menos un 90 %. De modo mas preferente, la determinacion se efectua con una especificidad de al menos un 98 % o/y una sensibilidad de al menos un 95 %, de modo que por medio del procedimiento aqm descrito se pueden identificar analitos hasta un lfmite de
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identificacion inferior de aproximadamente 1 ng/ml de muestra.
Segun la invencion es preferente ademas que el elemento de ensayo o/y el elemento de limpieza empleado en el ambito del procedimiento aqm descrito sea esteril antes del contacto con la muestra que contiene los analitos. En este caso, el elemento de ensayo o/y el elemento de limpieza se pueden introducir en un deposito de reserva apropiado antes o despues de la esterilizacion, debiendose considerar preferente una introduccion correspondiente antes de la puesta en practica de la esterilizacion. La propia esterilizacion se puede efectuar de diversas maneras, y comprende, a modo de ejemplo, esterilizacion qmmica, esterilizacion mediante calentamiento y esterilizacion por medio de radiacion ionizante. El elemento de ensayo esterilizado se envasa preferentemente en medio esteril, en caso dado junto con el elemento de limpieza, a continuacion de la esterilizacion. El envasado esteril posibilita mantener en condiciones esteriles tanto elemento de ensayo, como tambien elemento de limpieza, hasta un empleo posterior sin que se requiera una nueva esterilizacion. En el caso del elemento de ensayo, o bien del elemento de limpieza aqm descrito, se trata de modo especialmente preferente de un artmulo desechable, que no se emplea de nuevo tras uso.
El procedimiento segun la invencion se puede emplear para la determinacion de cualquier substancia biologica o qmmica, que sea identificable, a modo de ejemplo, bajo empleo de tecnicas inmunologicas. En este sentido, el procedimiento aqm descrito se emplea preferentemente para la identificacion de estupefacientes, como estan alistados en la ley alemana de estupefacientes. Los ejemplos concretos de tales estupefacientes comprenden, entre otros, agentes disociativos, delirantes, empatogenos, contactogenos, hipnoticos, narcoticos, psicodelicos, sedantes y estimulantes, pero no estan limitados a los mismos. En una forma de ejecucion mas preferente, segun la invencion se determina al menos un analito seleccionado a partir del grupo constituido por anfetaminas, benzodiacepinas, cannabinoides, en especial A9-tetrahidrocannabinol, ketaminas, metanfetaminas, opiaceos, en especial morfina, codema o dihidrocodema, opioides naturales o sinteticos, en especial heroma, y alcaloides de tropano, en especial cocama, siendo especialmente preferentes A9-tetrahidrocannabinol y cocama como analitos.
El analito puede proceder de cualquier fuente, como por ejemplo de una superficie de un objeto humedecido con el analito, o de un fluido corporal, como por ejemplo sangre total, plasma, suero, orina, saliva o sudor. Por medio del procedimiento aqm descrito se determina preferentemente la presencia o/y la cantidad de un analito en una muestra de sangre total, orina o saliva. La cantidad de muestra requerida para la puesta en practica del procedimiento asciende de modo habitual de aproximadamente 0,01 pl a aproximadamente 100 pl, de modo preferente de aproximadamente 0,05 pl a aproximadamente 20 pl, de modo mas preferente de aproximadamente 0,1 pm a < 10 pl, y del modo mas preferente de aproximadamente 0,5 pl a aproximadamente 5 pl.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un elemento de ensayo para la determinacion de un analito, que comprende:
(i) una primera zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente,
(ii) una segunda zona, que esta configurada para la aplicacion de una muestra que contiene los analitos, y comprende un componente de enlace espedfico para los analitos,
(iii) una tercera zona, que esta configurada para la deteccion optica de analito,
(iv) una cuarta zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente excedente,
(v) en caso dado una carcasa, y
(vi) un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato de carbono y un alcohol sacarico.
En otro aspecto adicional, la invencion se refiere al empleo de un elemento de limpieza en un procedimiento como se describe anteriormente, para la absorcion de un analito de una superficie, y para la transferencia del analito a un elemento de ensayo, comprendiendo el elemento de ensayo un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia espedfica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato de carbono y un alcohol sacarico. En otro aspecto adicional, la invencion se refiere a un kit para la determinacion de un analito, que se emplea preferentemente para la puesta en practica del procedimiento descrito anteriormente, y comprende los siguientes componentes:
(a) un elemento de ensayo, que comprende
(i) una primera zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente,
(ii) una segunda zona, que esta configurada para la aplicacion de una muestra que contiene los analitos, y comprende un componente de enlace espedfico para los analitos,
(iii) una tercera zona, que esta configurada para la deteccion optica de analito,
(iv) una cuarta zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente excedente, y
(v) en caso dado una carcasa, y
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(b) un elemento de limpieza que esta configurado para la absorcion de una muestra de analito,
comprendiendo el elemento de ensayo o/y el elemento de limpieza un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato de carbono y un alcohol sacarico.
En lo que se refiere a configuraciones preferentes del elemento de ensayo segun la invencion, del empleo segun la invencion del elemento de limpieza y del elemento de ensayo, o bien elemento de limpieza contenido en el kit segun la invencion, se remite a las explicaciones en relacion con la descripcion del procedimiento segun la invencion.
La invencion se explicara mas detalladamente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Descripcion de las figuras
Figura 1:
Figura 2:
Figura 3:
Figura 4:
Ejemplos
seccion transversal de una forma de ejecucion de un elemento de ensayo para la puesta en practica del procedimiento segun la presente invencion. El elemento de ensayo representado en forma de una tira de ensayo comprende:
(a) una primera zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente (zona 1),
(b) una segunda zona, que esta configurada para la aplicacion de una muestra que contiene los analitos y un componente de enlace espedfico para el analito, marcado, asf como, en caso dado, otros reactivos (zona 2),
(c) una tercera zona, que esta configurada para la deteccion optica de analito, y una lmea de captura, una lmea de ensayo y una lmea de control (zona 3), y
(d) una cuarta zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente excedente (zona 4).
seccion transversal de una forma de ejecucion de un elemento de ensayo para la puesta en practica del procedimiento segun la presente invencion. El elemento de ensayo representado en forma de una tira de ensayo comprende:
(a) una primera zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente (zona 1),
(b) una segunda zona, que esta configurada para la aplicacion de una muestra que contiene los analitos y un componente de enlace espedfico para el analito, marcado, asf como, en caso dado, otros reactivos (zona 2),
(c) una tercera zona, que esta configurada para la deteccion optica de analito, y una lmea de ensayo y una lmea de control (zona 3), y
(d) una cuarta zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente excedente (zona 4).
representacion de una forma de ejecucion de un elemento de limpieza y un dispositivo de ensayo para la puesta en practica del procedimiento segun la presente invencion. El elemento de limpieza comprende tres superficies de limpieza separadas entre sf espacialmente (respectivamente en forma triangular) para la absorcion de al menos 3 analitos diferentes. El dispositivo de ensayo comprende tres elementos de ensayo separados entre sf espacialmente (respectivamente en forma de una tira de ensayo), asf como una carcasa que contiene los elementos de ensayo, que comprende por su parte una escotadura para la lectura de los resultados de ensayo, asf como una escotadura para la puesta en contacto del elemento de limpieza con los elementos de ensayo.
representacion de otra forma de ejecucion de un elemento de limpieza y un dispositivo de ensayo para la puesta en practica del procedimiento segun la presente invencion. El elemento de limpieza comprende tres superficies de limpieza separadas entre sf espacialmente (respectivamente en forma de cilindro) para la absorcion de al menos 3 analitos diferentes. El dispositivo de ensayo comprende tres elementos de ensayo separados entre sf espacialmente (respectivamente en forma de una tira de ensayo), asf como una carcasa que contiene los elementos de ensayo, que comprende por su parte una escotadura para la lectura de los resultados de ensayo, asf como una escotadura para la puesta en contacto del elemento de limpieza con los elementos de ensayo.
Ejemplo 1: Obtencion de inmunogeno de A9-THC
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Se diluyeron 1,25 ml de una disolucion madre de acido A^tetrahidrocannabinolico A (acido 1-hidroxi- (6aR,10aR)-6,6,9-trimetil-3-pentil-6a,7,8,10a-tetrahidrobenzo[c]cromen-2-carbox^lico; firma Lipomed) en N,N- dimetilformamida (concentracion: 100,8 mg/ml) con 8,75 ml de N,N-dimetilformamida a un volumen final de 10 ml (concentracion final: 12,6 mg/ml).
A continuacion se anadieron 5 ml de esta disolucion diluida bajo agitacion a una disolucion acuosa de albumina de suero vacuno (BSA), que se habfa obtenido previamente mediante disolucion de 250 mg de albumina de suero vacuno (firma Sigma Aldrich) en una mezcla de 25 ml de agua destilada y 2,5 ml de N,N- dimetilformamida. Tras adicion de 6,3 ml de agua destilada a la mezcla de reaccion obtenida se anadieron sucesivamente los restantes 5 ml de la disolucion diluida de acido A9-tetrahidrocannabinolico A en N,N- dimetilformamida descrita anteriormente, otros 6 ml de agua destilada, asf como 0,2 ml de una disolucion de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (firma Sigma Aldrich) en N,N-dimetilformamida (concentracion 500 mg/ml).
El vaso de precipitados con la disolucion contenida en el mismo se envolvio en lamina de aluminio y se agito en un agitador magnetico durante 24 horas a 5°C. A continuacion se transfirio la disolucion a un deposito de dialisis y se dializo durante un intervalo de tiempo de 4 dfas a 5°C frente a una disolucion al 25 % de N,N- dimetilformamida en agua. El producto de dialisis se sometio a ensayo por medio de inmunoelectroforesis. Incubacion con un anticuerpo anti-BSA de cabra (firma Genetex), asf como bandas de precipitado, muestran que el inmunogeno de A9-THC se diferencia de la banda de albumina de suero vacuno.
Ejemplo 2: obtencion de anticuerpos contra A9-THC
Se inmunizaron 20 ratones con el inmunogeno de A9-THC obtenido en el ejemplo 1 en adyuvante de Freund completo (firma Sigma Aldrich), ascendiendo la dosis para la primera y para cada inmunizacion adicional a 75 |jg de inmunogeno por animal en cada caso. Las inmunizaciones se efectuaron durante un intervalo de tiempo de 6 meses en un intervalo de un mes respectivamente.
Los sueros obtenidos a partir de los ratones inmunizados se analizaron a continuacion en un ensayo en placas de microtitracion para verificar la presencia de anticuerpos contra A9-THC. A tal efecto, las placas de microtitracion revestidas con estreptavidina se incubaron en primer lugar con 10 ml de una disolucion de A9- tetrahidrocannabinol-[N'-biotinilaminocaproil-(3,6-dioxa-8-aminooctil)-amida] en disolucion acuosa tamponada con fosfato, que se habfa obtenido previamente mediante reaccion de A9-tetrahidrocannabinolsuccinimidilester y N-(biotinilaminocaproil)-1,8-diamino-3,6-dioxaoctano (firma Applichem), y se incubo durante 12 h a 4°C.
Tras lavado con 20 ml de una disolucion al 0,05 % de Tween 20 en disolucion salina tamponada con fosfato se incubaron las placas de microtitracion respectivamente durante 1 h a 20°C con 10 ml de sueros a analizar, y a continuacion de nuevo con 20 ml de una disolucion al 0,05 % de Tween 20 en disolucion salina tamponada con fosfato. Para la deteccion se incubo durante 1 h a 20°C con 10 ml de una disolucion de un conjugado de peroxidasa e IgG anti-raton de conejo (firma Dako), se lavo con 20 ml de una disolucion al 0,05 % de Tween 20 en disolucion salina tamponada con fosfato, y se mezclo con substrato. Se seleccionaron sueros con una buena afinidad frente a A9-THC para la obtencion de anticuerpos contra A9-THC.
Ejemplo 3: obtencion de un anticuerpo marcado con oro contra A9-THC
Se obtuvo sol de oro con un diametro de partfcula de 20 mm, determinado mediante espectroscopfa de correlacion de fotones, en ajuste al estado de la tecnica (Frens, Nature (1973), 241, 20-22). El marcaje del anticuerpo espedfico para A9-THC obtenido en el ejemplo 2 con las partfculas de oro se efectuo coincidiendo con procedimientos conocidos (Geoghegan et al., J. Immunol. Meth. (1980), 34, 11-31).
Ejemplo 4: empleo de glucitol para el aumento de sensibilidad y especificidad
Se impregno una zona formada por vellon de una tira de ensayo cromatografica, que contema un anticuerpo espedfico para A9-THC segun el ejemplo 3, con tres disoluciones de glucitol (firma Sigma) de diferente concentracion en agua destilada.
A continuacion se ajusto saliva de zona de almacenamiento (mezcla de salivas de cinco personas) con una disolucion de A9-THC diluida en metanol (firma Cerilliant) a una concentracion de A9-THC de 100 ng/ml. Tras aplicacion de 10 jl de esta saliva de zona de almacenamiento dotada sobre la superficie de limpieza de un elemento de limpieza comercial (firma Securetec Detektionssysteme) se puso en contacto el elemento de limpieza con la zona impregnada de la tira de ensayo cromatografica, y las tiras de ensayo se incubaron durante un intervalo de tiempo de 60 segundos a temperatura ambiente.
Tras incubacion con la muestra de analito se sumergieron la tiras de ensayo durante 15 segundos en agua
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5
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20
25
corriente, y de este modo se inicio el proceso de cromatograffa. El tiempo de desarrollo del ensayo completo ascendfa a 5 hasta 10 minutos. Los resultados de las tres determinaciones estan representados en la tabla 1.
Tabla 1
- Concentracion de glucitol (% en peso en la disolucion de impregnacion)
- Senal de lmea de ensayo para A9-THC
- 2%
- Positiva
- 1%
- Ligeramente positiva
- 0%
- Negativa
Como se desprende de la tabla 1, una impregnacion del vellon con concentraciones crecientes de glucitol conduce a una transferencia de saliva mejorada del elemento de limpieza a la tira de ensayo cromatografica. Glucitol mejora simultaneamente la extraccion de A9-THC de la muestra de saliva.
Un mejor contacto entre A9-THC y el anticuerpo marcado, dispuesto en la zona de la tira de ensayo en contacto, posibilita ambas simultaneamente, lo que ocasiona un enlace claramente mas espedfico y mas sensible de A9- THC al componente de enlace espedfico, y conduce a un desarrollo de serial intensificado en la lmea de ensayo de la tira de ensayo cromatografica.
Ejemplo 5: empleo de 1,4-ditioeritritol en el agente eluyente para el aumento de la sensibilidad y la especificidad
Se ajusto saliva de zona de almacenamiento (mezcla de salivas de cinco personas) con una disolucion de A9- THC diluida en metanol (firma Cerilliant) a una concentracion de A9-THC de 80 ng/ml. Tras aplicacion de 10 pl de esta saliva de zona de almacenamiento dotada sobre la superficie de limpieza de un elemento de limpieza comercial (firma Securetec Detektionssysteme) se puso en contacto el elemento de limpieza con una zona de una tira de ensayo cromatografica formada por vellon, que contema un anticuerpo espedfico para A9-THC segun ejemplo 3, y las tiras de ensayo se incubaron durante un intervalo de tiempo de 60 segundos a temperatura ambiente.
Tras incubacion con la muestra de analito se sumergieron las tiras de ensayo durante 15 segundos en agua bidestilada, que contema 1,4-ditioeritritol, adquirible comercialmente bajo el nombre comercial Sputolysin® (firma VWR), en cuatro concentraciones diferentes, y de este modo se inicio el proceso de cromatograffa. El tiempo de desarrollo de ensayo completo ascendfa a 5 hasta 10 minutos. Los resultados de las cuatro determinaciones estan representados en la tabla 2.
Tabla 2
- Concentracion de 1,4-ditioeritritol en el agente eluyente (% en peso)
- Senal de lmea de ensayo para A9-THC
- 5%
- Negativa
- 1%
- Ligeramente positiva
- 0.1%
- Positiva
- 0%
- Ligeramente positiva
Como se desprende de la tabla 2, un mezclado de 1,4-ditioeritritol al agente eluyente en un intervalo de concentracion de aproximadamente un 0,01 a aproximadamente un 1 % en peso conduce a un desarrollo de senal intensificado en la lmea de ensayo de la tira de ensayo cromatografica.
5
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Ejemplo 6: empleo de hidroxido sodico para el aumento de la sensibilidad y la especificidad
Se impregno una zona de una tira de ensayo cromatografica con una disolucion de un 2,0 % en peso de albumina de suero vacuno (firma Sigma Aldrich), un 0,5 % en peso de Brij® (firma Sigma Aldrich) y un 0,03 % en peso de hidroxido sodico en agua destilada (vellon A). Para evaluar el efecto de hidroxido sodico con el fin de una elaboracion qmmica de saliva se impregno paralelamente una zona de una segunda tira de ensayo cromatografica, formada por vellon, con una disolucion de un 2,0 % en peso de albumina de suero vacuno y un 0,5 % en peso de Brij® en agua destilada (vellon B).
A continuacion se ajusto saliva de zona de almacenamiento (mezcla de salivas de cinco personas) con una disolucion de benzodiacepina diluida en metanol (firma Cerilliant) a una concentracion de benzodiacepina de 20 ng/ml, 30 ng/ml, 50 ng/ml, o bien 100 ng/ml. Tras aplicacion de 10 pl de esta saliva de zona de almacenamiento dotada sobre la superficie de limpieza de un elemento de limpieza comercial (firma Securetec Detektionssysteme) se puso en contacto el elemento de limpieza con la zona impregnada de ambas tiras de ensayo cromatograficas, y las tiras de ensayo se incubaron durante un intervalo de tiempo de 30 segundos a temperatura ambiente.
Tras incubacion con la muestra de analito se sumergieron la tiras de ensayo en agua bidestilada, y de este modo se inicio el proceso de cromatograffa. El tiempo de desarrollo del ensayo completo ascendfa a 5 hasta 10 minutos. Los resultados de las determinaciones estan representados en la tabla 3.
Tabla 3
- Concentracion de benzodiacepina
- Senal de lmea de ensayo para benzodiazepina
- Vellon A Vellon B
- 20 ng/ml
- Ligeramente positiva Negativa
- 30 ng/ml
- Positiva Negativa
- 50 ng/ml
- Positiva Negativa
- 100 ng/ml
- Positiva Positiva
Como se desprende de la tabla 3, una impregnacion del vellon con cantidades reducidas de hidroxido sodico conduce a un desarrollo de senal intensificado en la lmea de ensayo de la tira de ensayo cromatografica, y con ello a una mejora de la identificacion de benzodiazepina.
Ejemplo 7: empleo de vellones para el aumento de la sensibilidad y la especificidad
Para evaluar el efecto de diversos vellones con el fin de una elaboracion mecanica de saliva se puso a disposicion tiras de ensayo cromatograficas, que comprendfan una zona formada por Sontara® 8423 (Firma DuPont), Ahlstrom 8964 (Firma Ahlstrom), Rapid 24Q (Firma Whatman), o bien FS 2216 (Firma Freudenberg), para la absorcion de una muestra a investigar.
Se ajusto saliva de zona de almacenamiento (mezcla de salivas de cinco personas) con una disolucion de cocama diluida en metanol (firma Cerilliant) a una concentracion de cocama de 5 ng/ml, 15 ng/ml, o bien 50 ng/ml. Tras aplicacion de 10 pl de esta saliva de zona de almacenamiento dotada sobre la superficie de limpieza de un elemento de limpieza comercial (firma Securetec Detektionssysteme) se puso en contacto el elemento de limpieza con la zona formada por vellon de las tiras de ensayo cromatograficas, que contema respectivamente un anticuerpo espedfico para cocama, y las tiras de ensayo se incubaron durante un intervalo de tiempo de 60 segundos a temperatura ambiente.
Tras incubacion con la muestra de analito se sumergieron la tiras de ensayo en agua bidestilada, y de este modo se inicio el proceso de cromatograffa. El tiempo de desarrollo del ensayo completo ascendfa a 5 hasta 10 minutos. Los resultados de las determinaciones estan representados en la tabla 4.
5
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25
30
- Concentracion de cocama
- Senal de lmea de ensayo para cocama
- Sontara® 8423 Ahlstrom 8964 Rapid 24Q FS 2216
- 5 ng/ml
- Negativa Ligeramente positiva Ligeramente positiva Ligeramente positiva
- 15 ng/ml
- Ligeramente positiva Positiva Positiva Positiva
- 50 ng/ml
- Ligeramente positiva Positiva Positiva Positiva
Como se desprende de la tabla 4, el empleo de vellon Ahlstrom 8964, de vellon Whatman Rapid 24Q, asf como de vellon Freudenberg FS 2216, ya a una concentracion de cocama de 5 ng/ml, conduce a un desarrollo de senal intensificado en la lmea de ensayo de la tira de ensayo cromatografica, y con ello a una mejora de la identificacion de cocama. Esto se puede atribuir esencialmente a que Ahlstrom 8964, Whatman Rapid 24Q y Freudenberg FS 2216 retienen los componentes de saliva solidos, o bien viscosos, de modo especialmente conveniente por via mecanica, y en este sentido muestran un comportamiento de cromatograffa mejorado.
Ejemplo 8: influencia de la incubacion de analito y componente de enlace espedfico para el analito sobre la sensibilidad
En el ambito de un estudio clmico se extrajo una muestra de saliva de voluntarios consumidores de metadona, que habfan tomado adicionalmente A9-THC como maximo 8 horas antes de la toma de muestras, y presentaban una boca muy seca, sin saliva evidentemente humeda, por medio de un elemento de limpieza comercial (firma Securetec Detektionssysteme). Como control negativo sirvieron voluntarios que habfan consumido A9-THC antes de la toma de muestras. Para la determinacion del volumen de saliva absorbido en cada caso se peso el elemento de limpieza antes y despues de la toma de muestras.
Para evaluar el efecto de una incubacion directa de analito y componente de enlace espedfico para el analito sobre la sensibilidad del procedimiento de identificacion, en una primera serie de ensayos se pusieron en contacto los elementos de limpieza respectivamente con una zona formada por vellon de una tira de ensayo cromatografica, como se da a conocer en el documento EP 0 699 906 A1 y EP 0 811 842 A2. Ya que las tiras de ensayo dadas a conocer en documentos anteriores no contienen componente de enlace espedfico para el enlace en la zona configurada para la absorcion de la muestra, en ambos casos pueden entrar en contacto entre sf analito y componente de enlace espedfico para el analito solo tras el inicio de la cromatograffa.
En una segunda serie de ensayos se puso en contacto los elementos de limpieza respectivamente con una zona formada por vellon de una tira de ensayo cromatografica segun la invencion, que contema un anticuerpo espedfico para A9-THC segun el ejemplo 3 en la zona configurada para la absorcion de la muestra, y las tiras de ensayo se incubaron durante un intervalo de tiempo de 60 segundos a temperatura ambiente. A continuacion se sumergieron todas las tiras de ensayo respectivamente en agua bidestilada, y se inicio el proceso cromatografico. El tiempo de desarrollo de ensayo completo ascendfa a 5 hasta 10 minutos. Los resultados se representan en la tabla 5.
- Numero de voluntarios
- Volumen de saliva [jl] Senal de lmea de ensayo con incubacion Senal de lmea de ensayo sin incubacion
- 1
- 2.1 Positiva Positiva
- 2
- 1.4 Positiva Negativa
- 3
- 1.0 Ligeramente positiva Negativa
- 4
- 1.5 Positiva Ligeramente positiva
- 5
- 0.8 Positiva Negativa
- 6
- 1.1 Negativa Negativa
- 7
- 1.2 Ligeramente positiva Negativa
- 8
- 1.4 Positiva Negativa
- 9
- 1.5 Ligeramente positiva Negativa
- 10
- 2.0 Positiva Positiva
- 11 (control negativo)
- 1.9 Negativa Negativa
- 12 (control negativo)
- 1.4 Negativa Negativa
- 13 (control negativo)
- 1.2 negativa Negativa
Como se desprende de la tabla 5, mediante una incubacion de 60 segundos de analito y componente de enlace espedfico para el analito, antes del comienzo del proceso cromatografico, incluso en voluntarios con boca muy seca 5 (valor medio de volumen de muestra en los controles positivos: 1,4 j; desviacion standard: 0,4 jl), se puede identificar un numero de consumidores de A9-THC tres veces mas elevado que en el caso de sistemas de ensayo convencionales, que no comprenden una incubacion de analito y componente de enlace espedfico para el analito antes del inicio de la cromatograffa.
Ejemplo 9: influencia del tiempo de incubacion de analito y componente de enlace espedfico para el analito
10 sobre la sensibilidad
Se ajusto saliva de zona de almacenamiento (mezcla de salivas de cinco personas) con una disolucion de A9- THC diluida en metanol (firma Cerilliant) a una concentracion de A9-THC de 200 ng/ml. A continuacion se absorbieron 8 jl de esta saliva de zona de almacenamiento dotada con un elemento de limpieza comercial (firma Securetec Detektionssysteme).
15 A continuacion se puso en contacto el elemento de limpieza obtenido de este modo, en dos series de ensayos durante un intervalo de tiempo de 10, 20, 40, 60, 100, o bien 180 segundos, con una zona formada por vellon de una tira de ensayo cromatografica, empleandose en el ambito de la primera serie de ensayos respectivamente tiras de ensayo cromatograficas que conteman un anticuerpo espedfico para A9-THC segun ejemplo 3 en la zona configurada para la absorcion de la muestra.
Paralelamente se llevo a cabo una segunda serie de ensayos bajo empleo de tiras de ensayo cromatograficas, que no conteman el anticuerpo especifico para A9-THC segun el ejemplo 3 en la zona configurada para la absorcion de la muestra, sino en zonas separadas de la misma, de modo que solo en el transcurso de la cromatograffa se realizo un contacto entre el analito y el componente de enlace espedfico para el analito.
5 A continuacion se sumergieron todas las tiras de ensayo respectivamente en agua bidestilada, y se inicio el proceso cromatografico. El tiempo de desarrollo de ensayo completo ascendfa a 5 hasta 10 minutos. Los resultados estan representados en la tabla 6.
- Tiempo de incubacion [sec]
- Senal de lmea de ensayo con anticuerpos espedficos para A9-THC en la zona de absorcion Senal de lmea de ensayo sin anticuerpos espedficos para A9-THc en la zona de absorcion
- 10
- ++ +
- 20
- ++ +
- 40
- ++ (+)
- 60
- ++ (+)
- 100
- ++ ((+))
- 180
- ++ ((+))
- ++ senal fuertemente positiva + senal positiva (+) senal ligeramente positiva ((+)) senal positiva lfmite -transicion a senal negativa
Como se desprende de la tabla 6, en el caso de tiras de ensayo cromatograficas que contienen el anticuerpo espedfico para A9-THC en la zona configurada para la absorcion de la muestra, ya mediante una incubacion de 10 5 segundos de analito y componente de enlace espedfico para el analito antes del comienzo de la cromatograffa se consigue un fuerte desarrollo de senal en la lmea de ensayo de la tira de ensayo cromatografica. Simultaneamente es evidente que la intensidad de la senal de lmea de ensayo no vana con tiempo de incubacion ascendente.
Esto ultimo se puede atribuir por una parte a que el analito forma un complejo con el componente de enlace espedfico para el analito inmediatamente tras puesta en contacto de elemento de limpieza y tira de ensayo 10 cromatografica, y por consiguiente no se enlaza, o se enlaza inespedficamente al material de vellon de la tira de ensayo solo en una parte reducida. Por otra parte, con tiempo de incubacion ascendente tampoco se muestra una intensificacion de la senal de lmea de ensayo, ya que la concentracion de analito de 200 ng/ml, relativamente elevada, cubre el efecto positivo de un tiempo de incubacion prolongado.
En la repeticion de las anteriores series de ensayo bajo empleo de una concentracion de A9-THC de 20 ng/ml se 15 obtienen los resultados representados en la tabla 7.
- Tiempo de incubacion [sec]
- Senal de lmea de ensayo con anticuerpos espedficos para A9-THC en la zona de absorcion Senal de lmea de ensayo sin anticuerpos espedficos para A9-THc en la zona de absorcion
- 10
- ((+)) -
- 20
- (+) -
- 40
- (+) -
- 60
- + -
- 100
- ++ -
- 180
- ++ -
- ++ senal fuertemente positiva + senal positiva (+) senal ligeramente positiva ((+)) senal positiva lfmite -transicion a senal negativa - senal negativa
Como se desprende de la tabla 7, en el caso de tiras de ensayo cromatograficas que contienen el anticuerpo espedfico para A9-THC en la zona configurada para la absorcion de la muestra, y posibilitan de este modo una 5 incubacion directa de analito y componente de enlace espedfico para el analito, se puede detectar A9-THC tambien en una concentracion de unicamente 20 ng/ml ya tras un tiempo de incubacion reducido.
Con aumento de tiempo de incubacion aumenta la intensidad de la senal de lmea de ensayo, alcanzandose la senal de lmea de ensayo maxima a partir de un tiempo de incubacion de 100 segundos. De la tabla 7 se desprende simultaneamente que, en el caso de variante de ensayo sin anticuerpos espedficos para A9-THC en la zona de 10 absorcion de muestras de la tira de ensayo cromatografica, no es posible la identificacion de A9-THC en una concentracion de 20 ng/ml.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES1. - Procedimiento para la determinacion de un analito, que comprende los pasos:(a) puesta a disposicion de un elemento de ensayo que comprende(i) una primera zona que esta configurada para la absorcion de agente eluyente,5 (ii) una segunda zona, que esta configurada para la aplicacion de una muestra que contiene losanalitos, y comprende un componente de enlace espedfico para los analitos,(iii) una tercera zona, que esta configurada para la deteccion optica del analito,(iv) una cuarta zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente excedente, y(v) en caso dado una carcasa,10 (b) absorcion de una muestra que contiene los analitos por una superficie de muestra con un elemento delimpieza,(c) puesta en contacto del elemento de limpieza con la segunda zona del elemento de ensayo durante un intervalo de tiempo de al menos 10 segundos, transfiriendose al menos una parte de la muestra del elemento de limpieza al elemento de ensayo, y efectuandose una incubacion de analito con el componente de enlace15 espedfico para el analito,(d) puesta en contacto de la primera zona del elemento de ensayo incubado con un agente eluyente, y(e) determinacion de la presencia y/o de la cantidad de analito, comprendiendo el elemento de ensayo y/o el elemento de limpieza un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato20 de carbono y un alcohol sacarico.
- 2. - Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que se emplea como elemento de ensayo una tira de ensayo cromatografica.
- 3. - Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que se emplea como componente de enlace espedfico para el analito un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo funcional.25 4.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que se emplea un elemento deensayo con una o con varias superficies de limpieza, poniendose en contacto el elemento de limpieza y el elemento de ensayo entre sf en especial durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 10 segundos hasta aproximadamente 600 segundos, o de aproximadamente 60 segundos hasta aproximadamente 180 segundos.30 5.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el elemento de ensayocomprende un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito seleccionada a partir del grupo constituido por un hidrato de carbono y un alcohol sacarico, y/o el elemento de limpieza de un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito seleccionada a partir del grupo constituido por una protema y una mezcla de 35 protemas.
- 6. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la segunda zona del elemento de ensayo comprende ademas un agente para la elaboracion qmmica o/y mecanica de la muestra que contiene los analitos, conteniendo el agente qdmico de elaboracion de muestras en especial una substancia seleccionada a partir del grupo constituido por un acido, una base, un tampon, un disolvente organico y un40 detergente, y comprendiendo el agente mecanico de elaboracion de muestras en especial un tejido o/y un vellon.
- 7. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que comprende una combinacion de un formato de ensayo competitivo y un formato de ensayo no competitivo.
- 8. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el analito se determina con 45 una especificidad de al menos un 95 % o/y con una sensibilidad de al menos un 90 %.215101520253035
- 9. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que como analito se determina un estupefaciente, en especial una substancia seleccionada a partir del grupo constituido por agentes disociativos, delirantes, empatogenos, contactogenos, hipnoticos, narcoticos, psicodelicos, sedantes y estimulantes.
- 10. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que se determinan varios analitos simultaneamente, en especial 2 a 20 analitos diferentes.
- 11. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que se emplea como muestra un fluido corporal, en especial sangre, orina o saliva.
- 12. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que se emplea una muestra con un volumen de aproximadamente 0,05 pl a aproximadamente 20 pl, en especial con un volumen de aproximadamente 0,1 pl a aproximadamente 5 pl.
- 13. - Elemento de ensayo para la determinacion de un analito, que comprende:(i) una primera zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente,(ii) una segunda zona, que esta configurada para la aplicacion de una muestra que contiene los analitos, y comprende un componente de enlace espedfico para los analitos,(iii) una tercera zona, que esta configurada para la deteccion optica de analito,(iv) una cuarta zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente excedente,(v) en caso dado una carcasa, y(vi) un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato de carbono y un alcohol sacarico.
- 14. - Empleo de un elemento de limpieza en un procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 12 para la absorcion de un analito de una superficie y para la transferencia del analito a un elemento de ensayo, comprendiendo el elemento de limpieza un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato de carbono y un alcohol sacarico.
- 15. - Kit para la determinacion de un analito, que comprende:(a) un elemento de ensayo, que comprende(i) una primera zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente,(ii) una segunda zona, que esta configurada para la aplicacion de una muestra que contiene los analitos, y comprende un componente de enlace espedfico para los analitos,(iii) una tercera zona, que esta configurada para la deteccion optica de analito,(iv) una cuarta zona, que esta configurada para la absorcion de agente eluyente excedente, y(v) en caso dado una carcasa, y(b) un elemento de limpieza que esta configurado para la absorcion de una muestra de analito,comprendiendo el elemento de ensayo o/y el elemento de limpieza un reactivo de transferencia de analito, que contiene al menos una substancia inespedfica para el analito, seleccionada a partir del grupo constituido por una protema, una mezcla de protemas, un hidrato de carbono y un alcohol sacarico.
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