ES2311994T3 - Procedimiento de deteccion de delta-9-tetrahidrocannabinol. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar en una muestra líquida delta-9-tetrahidrocannabinol (THC), que comprende: (a) poner en contacto dicha muestra con (i) un conjugado de 5-pentilresorcinol/vehículo macromolecular en el que 5-pentilresorcinol se conjuga mediante un grupo hidroxilo o su derivado sobre su anillo benceno al vehículo y (ii) un anticuerpo capaz de unirse tanto a THC como a dicho conjugado; y (b) determinar si la unión de dicho anticuerpo a dicho conjugado se reduce en la presencia de dicha muestra.
Description
Procedimiento de detección de
delta-9-tetrahidrocannabinol.
La invención se refiere a técnicas de
inmunoensayo competitivo para la detección de de cannabinoides,
especialmente
delta-9-tetrahidrocannabinol
(cannabis; THC) y metabolitos relacionados, en matrices biológicas,
composiciones ambientales y en superficies. En particular, la
invención proporciona procedimientos para la detección de alta
sensibilidad de THC en dispositivos para uso en ensayo del punto de
solicitud y en el sitio.
Cannabis es hoy la droga ilícita de abuso más
ampliamente consumida en el mundo (Journal of Chromatography B,
volumen 733, páginas 119-126) y en muchos países se
asigna como droga prohibida de clase 1 o clase 2. La detección de
cannabinoides se lleva a cabo rutinariamente por científicos
forenses, toxicólogos, clínicas de rehabilitación de drogas y como
parte de ensayos en el sitio de trabajo para drogas de abuso.
Recientemente, ha llegado a ser una droga ilícita principal en lo
que se refiere a la realización de pruebas de conducción bajo su
influencia.
Delta-9-tetrahidrocannabinol
(THC, véase el diagrama estructural I en la Figura 1) es el
principal analito psicoactivo en las flores o parte superior de los
frutos de la planta Cannabis sativa. El THC se metaboliza de
manera extensa en el hombre en dos productos principales
11-nor-9-carboxi-delta-9-THC
(THC-COOH, véase el diagrama estructural II en la
Figura 1) y
11-hidroxi-delta-9-THC
(THC-OH, véase el diagrama estructural III en la
Figura 1). De estos dos metabolitos, solamente el metabolito hidroxi
tiene efectos psicoactivos.
Los procedimientos de detección de THC conocidos
en general, se pueden clasificar en tres grupos. Las técnicas
convencionales de oro emplean GS/MS, tándem GC/MS/MS, LC/MS y tándem
LC/MS/MS (GC = cromatografía de gas; LC = cromatografía líquida; MS
= espectrometría de masas). Estas técnicas están basadas
estrictamente en laboratorio y requieren especialistas
entrenamiento y equipo especializado, que les hace no adecuados para
el ensayo en el punto de solicitud.
Los procedimientos cualitativos para la
detección de cannabis se conocen en la técnica anterior Patentes de
Estados Unidos números 3715189, 4196167, 4771005, 4816415 y 5457054,
y también en la patente de Gran bretaña 1426177 y las referencias
dentro de ellas, describen procedimientos para la detección de
cannabis basados en las reacciones químicas que implican cambio de
color. Sin embargo, los procedimientos químicos tienden a ser no
específicos y carecen del nivel de sensibilidad requerido para la
detección de drogas en matrices biológicas.
El tercer grupo de procedimientos de detección
de cannabinoides emplean técnicas inmunológicas. Por ejemplo, los
anticuerpos inducidos a diversos derivados de cannabinoides
conjugados a macromolécula vehículo y los inmunoensayos se
establecen después usando estos anticuerpos y se marcan sus
derivados, por ejemplo, derivados radiomarcados o fluorescentes
para uso en radioinmunoensayos y fluoroinmunoensayos y derivados
marcados con enzima para uso en diversos formatos de inmunoensayo
de enzima. Tales inmunoensayos d enzima incluyen, por ejemplo, los
ELISA dirigidos que usan derivado de droga inmovilizado y anticuerpo
marcado por enzima. Como un formato alternativo, los anticuerpos
anticannabinoide marcados, por ejemplo, tales anticuerpos marcados
con partículas de látex u oro coloidal, se han usado para la
detección de cannabinoides mediante inmunocromatografía de flujo
lateral. Los derivados de droga usados se basan en general en la
molécula precursora
delta-9-tetrahidrocannabinol (THC)
y su metabolito principal THC-COOH. Para la
modificación de THC, se une normalmente un reactivo de reticulación
al compuesto en el C2, C5' o la posición C1 del grupo fenólico
(véanse por ejemplo las patentes de Gran Bretaña 1364925, documento
EP0276732, documento EP0279308, Estados Unidos 5237057, Estados
Unidos 5747352 y Nueva Biología de la Naturaleza (1972) volumen 236
páginas 216-217). THC-COOH se pueden
derivatizar de la misma manera que THC. Además, la disponibilidad
del grupo carboxílico en C9 de THC-COOH permite la
reticulación directa de los grupos amino de las moléculas vehículo
que usan la reacción de acoplamiento de carbodiimida. Los
anticuerpos inducidos a THC o THC-COOH acoplados
mediante C1, C2 y C5' se esperan que muestre diferente reactividad
cruzada para los dos compuestos debido a la ausencia y presencia
del grupo carboxílico en C9, respectivamente. Por lo tanto para
lograr la reactividad cruzada comparable para THC y
THC-COOH, muchos de los inmunoensayos conocidos
para la detección de los compuestos emplean anticuerpos inducidos
THC-COOH acoplados a una molécula vehículo mediante
el grupo carboxílico en C9.
Muchos inmunoensayos para THC están
comercialmente disponibles. El radioinmunoensayo de diagnóstico de
Roche (Patente de estados unidos nº 4438207) e inmunoensayo de
polarización de fluorescencia (Patente Europea nº 0392332) son
anticuerpos inducidos a THC-COOH acoplados a una
proteína vehículo mediante el grupo fenólico en C1 y un
THC-COOH radiomarcado de manera similar o marcado
por fluorescencia. Como se espera, este ensayo muestra la detección
excelente de del ácido pero solamente un 5% de reactividad cruzada
con la droga precursora, THC. El inmunoensayo de polarización de
fluorescencia de Abbott (Patente Europea nº 0279308) usa anticuerpos
inducidos a THC-COOH ligado a una proteína vehículo
mediante el grupo carboxilato en C9 y THC-COOH con
un resto fluorescente en la misma posición. Este ensayo muestra una
mejor reactividad cruzada con la droga precursora así como el
derivado 11-hidroxi (Figura 1, compuesto III).
También están disponibles numerosos inmunoensayos de enzima para la
detección de cannabinoide incluyendo uno realizado por Cozart
Bioscience Limited. Éstos emplean un anticuerpo inducido a
THC-COOH ligado a una proteína vehículo mediante el
grupo carboxilato y peroxidasa de rábano picante
THC-COOH marcado por (HRP)-(la marca unida mediante
el grupo carboxilato del ácido).
Casi todos los inmunoensayos descritos son
Buenos para detectar THC-COOH lo que los hace
adecuados para la detección de uso de cannabis que usan matrices de
tipo orina y sangre. Sin embargo, el fluido oral (saliva) de los
usuarios de cannabis no muestra o muestra cantidades diminutas de
THC-COOH and THC-OH. La
determinación del componente psicoactivo principal, THC, es de esta
forma esencial en el caso de ensayo al lado de la carretera para
los que conducen bajo la influencia de esa droga usando muestras de
fluido oral (propuesto como la mejor matriz para el ensayo al lado
de la carretera para las drogas de abuso). La capacidad de detectar
bajas cantidades de la droga precursora THC es también necesario
que sea capaz de de recoger el uso reciente de esta droga. La
presente invención se refiere a este problema proporcionando nuevas
técnicas de inmunoensayo competitivo para la detección de THC, que
también puede proporcionar la ventaja de mostrar alta
reactividad< cruzada para tanto THC-COOH como
THC-OH.
Ahora se ha encontrado que mediante el uso de un
conjugado vehículo de un intermedio en la biosíntesis de THC, más
particularmente 5-pentilresorcinol (véase la Figura
2) conjugado a un vehículo macromolecular tal como albúmina sérica
bovina mediante sus grupos hidroxilos, THC se puede detectar
mediante inmunoensayo competitivo a incluso niveles muy bajos, por
ejemplo \leq 20 ng/ml, como se puede encontrar en muestras de
fluidos orales. Inesperadamente se ha encontrado que
5-pentilresorcinol en solución libre no interfiere
con la unión del anticuerpo anti-THC comercialmente
disponible (anticuerpo anti-THC monoclonal de ratón
como disponible de East Coast Biologics, Estados Unidos) a
conjugados inmovilizados
5-pentilresorcinol-macromolécula.
Además, THC-OH se puede detector usando tal
combinación de conjugado y anticuerpo a una sesibilidad comparable
a la de la droga precursora mientras que THCCOOH se puede detectar a
mucha más sensibilidad, tan bajo como aproximadamente 1,0 ng/ml.
De cuerdo con lo anterior, la invención
proporciona en un aspecto un procedimiento para detector en una
muestra líquida THC, que comprende:
(a) poner en contacto dicha muestra con (i) un
conjugado de 5-pentilresorcinol/vehículo
macromolecular en el que 5-pentilresorcinol se
conjuga mediante un grupo hidroxilo o su derivado sobre su anillo de
benceno al vehículo y (ii) un anticuerpo anti-THC
que es capaz de unirse a tanto THC como a dicho conjugado; y
(b) determinar si la unión de dicho anticuerpo a
dicho conjugado se reduce en la presencia de dicha muestra.
De manera deseable, el anticuerpo
anti-THC se unirá adicionalmente a tanto
THC-COOH como THC-OH, por ejemplo,
u anticuerpo se empleará inducido a THC-COOH
acoplado a una proteína vehículo mediante el grupo carboxilato como
se ejemplifica mediante el anticuerpo anti-THC
comercial indicado anteriormenteUna reducción en la unión del
anticuerpo al conjugado en un procedimiento de la invención será
entonces indicativo de que la muestra contiene uno o más de THC,
THC-COOH y THC-OH en una cantidad
igual o mayor que el nivel mínimo detectable.
Un procedimiento de ensayo de la invención puede
conformarse con cualquier formato convencional para un inmunoensayo
competitivo. Puede por ejemplo, tener el formato de un ELISA
competitivo convencional en el que el anticuerpo o o el conjugado
5-pentilresorcinol/vehículo se inmoviliza sobre un
soporte sólido. Sin embargo, de manera más conveniente para el
ensayo en el sitio, ensayo al lado de la carretera, un procedimiento
de la invención puede tener la forma de un inmunoensayo de
inmunocromatografía de flujo lateral que emplea una tira de ensayo
poroso. En este caso, de nuevo, el reactivo inmovilizado para
detección de analito puede ser anticuerpo inmovilizado o conjugado
5-pentilresorcinol/vehículo inmovilizado.
En un aspecto adicional, la invención también
proporciona kits para llevar a cabo un inmunoensayo de la invención
que comprende (i) un conjugado
5-pentilresorcinol/vehículo como se ha descrito
anteriormente y (ii) un anticuerpo capaz de unirse a tanto dicho
conjugado como THC, más preferiblemente todos los THC,
THC-COOH y THC-OH.
Figura 1: diagramas estructurales de THC (I),
THC-COOH (II) y THC-OH (III).
Figura 2: diagrama estructural de
5-pentilresorcinol e ilustración del acoplamiento de
ese compuesto a albúmina sérica bovina (BSA) mediante albúmina
sérica bovina mediante un grupo hidroxi.
Figura 3: curva de valoración para unión de
anticuerpo anti-THC a conjugado
THC-COOH/BSA inmovilizado obtenido usando el
procedimiento de acoplamiento de carbodiimida.
Figura 4: curva de valoración para unión de
anticuerpo anti-THC a conjugado
5-pentilresorcinol/BSA (BSACAN).
Figura 5: Diagrama que ilustra una tira de
ensayo de flujo lateral para uso en llevar a cabo un ensayo de
inmunocromatografía de flujo lateral de acuerdo con la invención en
la que (1) es una tira de ensayo poroso de hoja de nitrocelulosa
laminada sobre un soporte de respaldo, (2) es la zona de detección
de analito que presenta BSA-CAN inmovilizado, (3) es
la zona de control que presenta anticuerpo inmovilizado para
capturar el anticuerpo marcado, (4) es el tampón de liberación de la
marca que libera el anticuerpo marcado en el líquido extraído en
este tampón de la muestra que recibe el tampón (5) y (6) es un
tampón de mecha.
Los conjugados de
5-pentilresorcinol adecuados para uso en llevar a
cabo los ensayos de acuerdo con la invención son tales que el
conjugado en el que 5-pentilresorcinol está ligado
mediante un grupo hidroxilo a un vehículo macromolecular de manera
que sea capaz de unirse al anticuerpo que une todos los THC,
THC-COOH y THC-OH. Como se ha
indicado anteriormente, esto puede ser un anticuerpo obtenido
mediante el uso como el inmunógeno THC-COOH ligado
a una proteína vehículo mediante su grupo carboxilato como se
ejemplifica por el anticuerpo anti-THC monoclonal de
ratón comercial mencionado anteriormente.
Se apreciará que la conjugación de
5-pentilresorcinaol al vehículo elegido puede ser
mediante cualquiera de los dos grupos hidroxilo sobre su anillo de
benceno y las preparaciones del conjugado se pueden emplear para
que contengan una mezcla de tales conjugados que se puede esperar
que sean funcionalmente equivalentes en un ensayo de la invención.
(Dibujo de una línea a través de la estructura del
5-pentilresorcinol como se muestra en la Figura 2 a
través de una la cadena lateral alifática y el anillo de benceno
produce dos mitades simétricas siendo los dos grupos OH idénticos).
Sin embargo, también se puede contemplar que para el propósito de
acoplamiento de un vehículo se puede derivatizar un grupo hidroxilo
de 5-pentilresorcinol, más particularmente, por
ejemplo, convertirse en grupo carboxilato. En este caso, el
acoplamiento al vehículo puede ser mediante el procedimiento de
carbodiimida.
En una realización, el vehículo puede ser una
proteína. Para el propósito de ejemplificación, se encontró
conveniente usar albúmina sérica bovina (BSA), pero se pueden
emplear otras proteínas tales como albúmina, gammaglobulinas y
tiroglobulina. Una proteína vehículo adecuada puede ser, por
ejemplo, peroxidasa de rábano picante. En es te caso, se contempla
que el vehículo también puede servir como una marca detectable en un
ensayo de la invención. También se contempla que el vehículo unido
a 5-pentilresorcinol puede ser un homo- o
hetero-polímero que contiene cadenas secundarios de
aminoácidos tales como polilisina, poliomitina o poli-(glutamina),
lisina).
El conjugado de
5-pentilresorcinol también se puede marcar directa o
indirectamente con una marca detectable que no es el vehículo. En
este caso, la marca se puede unir a cualquier porción del conjugado
mediante el que la capacidad de unirse a anticuerpos adecuados se
mantiene, por ejemplo, una proteína vehículo. Las marcas adecuadas,
incluyen, por ejemplo, radiosiótopos tales como ^{125}I, ^{32}P
o ^{35}S, marcas particuladas tales como oro coloidal, perlas de
látex o liposomas, marcas fluorescentes tales como fluoresceína, y
biotina.
Para el propósito de la ejemplificación, se ligó
directamente el 5-pentilresorcinol a un vehículo
usando un reactivo de reticulación. Dos de tales planteamientos se
describen más adelante, el uso del procedimiento de dimetil
aminopiridina/carbonato de disuccinimidilo o el uso de vinil
sulfona. Sin embargo, se conocen otros procedimientos conocidos
para unir grupos hidroxilo a grupos amino y se pueden encontrar
igualmente adecuados (para revisión véase "Bioconjugate
Techniques" por G.T. Hermanson, 1996, Academic Press). En la
formación de un bioconjugado de 5-pentilresorcinol
adecuado, se puede emplear una molécula espaciadora, por ejemplo, un
espaciador de ácido aminocaproico.
Como se ha indicado anteriormente, un anticuerpo
adecuado para uso en un procedimiento de la invención será capaz de
unirse específicamente a a un conjugado de
5-pentilresorcinol como se ha descrito anteriormente
y también será capaz de unirse específicamente a THC. De manera
deseable, el anticuerpo empleado será capaz de unirse
específicamente a tanto THC-COOH como
THC-OH. Lo más deseablemente, el anticuerpo mostrará
aproximadamente al menos una reactividad cruzada igual o mayor con
estos dos metabolitos en un ensayo de inmunocromatografía de flujo
lateral que emplea conjugado de 5-pentilresorcinol
como se ejemplifica más adelante. De manera má deseable, tal
anticuerpo será capaz de detectar THC en tal ensayo a \leq 20
ng/ml. Aunque un anticuerpo comercialmente disponible para este
propósito se ha mencionado ya anteriormente, se apreciará que otros
anticuerpos igualmente adecuados (policlonal or monoclonal) se
pueden producir usando técnicas convencionales y
THC-COOH acoplarse mediante su grupo carboxilato a
una proteían vehículo, u otros derivados de THC unidos a una
molécula vehículo, como inmunógeno.
Se contempla que anticuerpos adecuados se pueden
generar también mediante el uso como inmunógeno de conjugado de
5-pentilresorcinol como se ha descrito
anteriormente. Se postula que en enlace de
5-pentilresorcinol a una proteína tal como BSA
mediante sus grupos hidroxilos provoca el cambio en al configuración
del compuesto de tal forma que los anticuerpos
anti-THC puedan reconoces específicamente la
configuración.
Un anticuerpo para uso en un procedimiento de la
invención se puede marcar directa o indirectamente, por ejemplo,
mediante anticuerpos marcados secundarios. Las marcas adecuadas para
este propósito son cualquier marca empleada de manera convencional
en inmunoensayos incluyendo marcas radiactivas, marcas
fluorescentes, marcas particuladas tales como oro coloidal, marcas
de enzima tales como peroxidasa de rábano picante y biotina.
El término "anticuerpo" como se usa en el
presente documento se entenderá que se extiende a fragmentos de
anticuerpo, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab' y Fv, que retienen la
capacidad de unión de anticuerpo y se podría utilizar en un
procedimiento de la invención.
Como se ha indicado anteriormente, un
procedimiento de la invención puede adoptar cualquier formato para
realizar un inmunoensayo competitivo. La unión de
fármaco-anticuerpo se puede producir en solución
seguido de la separación de marca complejada unida. Como
alternativa y preferiblemente, un conjugado de anticuerpo
anti-THC y 5-pentilresorcinol se
puede unir a un soporte sólido, por ejemplo, u soporte sólido que
comprende nitrocelulosa o plástico, por ejemplo, una superficie de
pocillo de plástico, o perlas sólidas, por ejemplo, perlas de
plástico o de vidrio. A un procedimiento de la invención, puede de
este modo, por ejemplo, conformarse con un formato ELISA
competitivo convencional que emplea anticuerpo
anti-THC marcado directa o indirectamente o
conjugado 5-pentilresorcinol/vehículo. En este caso,
o bien conjugado 5-pentilresorcinol/vehículo o
anticuerpo anti-THC se puede inmovilizar en
pocillos de una placa de microvaloración o sobre perlas sólidas. Sin
embargo, como alternativa anticuerpo anti-THC o
conjugado 5-pentilresorcinol/vehículo se puede
inmovilizar sobre una tira u hoja de ensayo que permita el ensayo
de fármaco en el sitio conveniente mediante un ensayo de
inmunocromatografía de flujo lateral por ejemplo, una tira u hoja
de ensayo que comprende nitrocelulosa. Tal tira u hoja de ensayo
puede estar, por ejemplo, en la forma de nitrocelulosa unida a un
soporte de respaldo, por ejemplo hoja de plástico. Tal tira u hoja
de ensayo puede ser una tarjeta de nitrocelulosa. Los ensayos de
inmunocromatografía de flujo lateral de acuerdo con la invención se
describen más completamente inmediatamente más adelante y se
ilustran por la ejemplificación.
Los ensayos de inmunocromatografía de flujo
lateral de acuerdo con la invención se pueden llevar a cabo usando
cualquier forma conocida de dispositivo de flujo lateral y
dependiendo de la unión de anticuerpos anticannabinoides
competitivos. Tales ensayos se pueden llevar a cabo usando la
metodología como se describe en la patente de Gran Bretaña 2339615
de Cozart Bioscience Limited, correspondiente a la Solicitud
Internacional publicada WO 00/04831 y Journal of Forensic Science
2001, volumen 46, páginas 1214-1220.
Una característica común de dispositivos de
flujo lateral para la detección de analito es la provisión de una
tira u hoja de ensayo que comprende un material poroso seco tal como
nitrocelulosa mediante la cual una muestra de líquido se puede
extraer apara alcanzar una o más zonas de detección de analito
distintas espacialmente. Cada tal zona presenta un reactivo de
unión específica inmovilizada. Para el propósito de un ensayo de
inmunocromatografía de flujo lateral de acuerdo con la invención,
al menos una tal zona de detección de analito se proporcionará para
que presente o bien un conjugado
5-pentilresorcinol/vehículo adecuado o un anticuerpo
anti-cannabinoide adecuado. Tal tira u hoja de
ensayo también unida a ello, o integral a ello, una zona de
liberación de marca que sea capaz de liberarse en el líquido
extraído en esa zona o bien anticuerpo marcado, si dicha de
detección de analito presenta conjugado inmovilizado o conjugado
detectable si dicha zona de detección de analito presenta
anticuerpos anti-canabinoide inmovilizado.
De este modo, también se proporciona por la
invención una tira u hoja de ensayo para llevar a cabo un ensayo de
inmunocromatrografía de flujo lateral de acuerdo con la invención
que tiene las siguientes características:
(i) una tira u hoja que comprende un material
poroso seco, preferiblemente nitrocelulosa, que tiene inmovilizado
a él en una zona de de detección de analito un conjugado de
5-pentilresorcinol/vehículo adecuado como se ha
descrito anteriormente o un anticuerpo anti-THC
adecuado; y
(ii) unido a, o integral a, dicha tira u hoja
proporcionando dicha zona de detección de analito una zona de
liberación de marca separada que es capaz de liberarse en el líquido
extraído en esa zona o bien dicho anticuerpos en la forma marcada,
si dicha zona de detección presenta conjugado de
5-pentilresorcinol inmovilizado, o, si dicha zona
de detección de analito presenta anticuerpo inmovilizado, conjugado
de 5-pentilresorcinol detectable como se ha
descrito previamente. Tal conjugado detectable puede ser, por
ejemplo, conjugado de 5-pentilresorcinol marcado con
oro o perlas de látex coloreado.
La ejemplificación describe en más detalle
inmunocromatrografía de flujo lateral de acuerdo con la invención
que emplea conjugado 5-pentilresorcinol y anticuerpo
anti-THC marcado, más particularmente anticuerpo
marcado capaz de unirse a THC y mostrar alta reactividad cruzada
con tanto THC-COOH como THC-OH. Se
ilustra el uso preferido de de anticuerpo marcado con partícula de
oro, aunque se pueden emplear otras marcas, por ejemplo, de nuevo
partículas de látex coloreadas. Usando esta metodología y anticuerpo
anti-THC comercialmente disponible marcado con oro
como se ha descrito anteriormente, tanto THC como THCOH se
encontraron que eran detectables a \leq 20 ng/ml, mientras que
THC-COOH era detectable con incluso todavía mayor
sensibilidad (paoximadamente 1,0 ng/ml).
Además de la zona de detección de analito como
se ha descrito anteriormente, una tira u hoja de ensayo para los
ensayos de flujo lateral de acuerdo con la invención pueden tener
una o más zonas de detección de analito adicionales para la
detección de una o más drogas adicionales o clases o grupos de
drogas.
Se apreciará que en un dispositivo de flujo
lateral, la zona de liberación de marca será proximal a la(s)
zona(s) de detección de analito que tienen consideración con
la dirección del flujo de líquido. Puede estar en la forma de
tampón, por ejemplo, un tampón que comprende fibra de vidrio, unido
a una tira u hoja que proporciona la(s)
zona(s)
de detección de analito. Los procedimientos para proporcionar en tal tal tira u hoja una zona de liberación de marca integral se conocen bien. Por ejemplo, una región de una tira de nitrocelulosa se puede glasear, por ejemplo, depositando una solución acuosa de azúcar o de celulosa y así la región glaseada se pone en contacto con el reactivo marcado (véase, por ejemplo, patente europea nº 0291194 y las Patentes europeas relacionadas 0560410 y 0560411).
de detección de analito. Los procedimientos para proporcionar en tal tal tira u hoja una zona de liberación de marca integral se conocen bien. Por ejemplo, una región de una tira de nitrocelulosa se puede glasear, por ejemplo, depositando una solución acuosa de azúcar o de celulosa y así la región glaseada se pone en contacto con el reactivo marcado (véase, por ejemplo, patente europea nº 0291194 y las Patentes europeas relacionadas 0560410 y 0560411).
Una tira u hoja de ensayo para uso en el
procedimiento de flujo lateral de la invención también puede además
comprender una muestra que recibe miembro o tampón proximal a la
zona de liberación de la marca. Tal muestra que recibe el miembro o
tampón puede hacerse a partir de cualquier absorbente capaz de
absorber el líquido rápidamente.
Típicamente, tal tira u hoja de ensayo tendrá,
además de la(s) zona(s) de detección de analito en la
dirección del flujo de líquido propuesta a lo largo de la tira, es
decir distal a la(s) zona(s) de detección de analito,
una zona de detección adicional que presenta e inmoviliza el
reactivo de unión específico inmovilizado de manera que proporcione
una zona de control. El control de las funciones de la zona para
indicar que el líquido de la muestra ha atravesado la(s)
zona(s) de detección de analito precedentes en condiciones
adecuadas para la detección de analito. Por ejemplo, cuando se
proporciona anticuerpo inmovilizado por la zona de liberación de la
marca, la zona de control puede presentar un anticuerpo inmovilizado
que es capaz de unirse al anticuerpo marcado.
Distal a las zonas de detección en la dirección
del flujo de líquido propuesto, una tira u hoja de ensayo de la
invención puede además comprender un tampón de desecho absorbente
(extremo o tampón de mecha).
La invención también se extiende a dispositivos
de lectura de flujo lateral que incorpora una tira u hoja de ensayo
para llevar a cabo un procedimiento de la invención, por ejemplo, un
dispositivo de selección portátil descrito en el documento WO
00/04381 de Cozart Bioscience Limited.
Las muestras de ensayo adecuadas estarán en
forma líquida para permitir la interacción con el anticuerpo
anti-cannabinoide. Como se ha indicado
anteriormente, la metodología de la invención está favorecida
particularmente para la aplicación a muestras de fluido oral
(saliva), que se puede primero diluir con tampón, por ejemplo,
Tampón de Dilución de Fluido Oral (producto Cozart de Bioscience
CR-BUFF). Tales muestras están favorecidas
especialmente para el ensayo en el sitio, por ejemplo al lado de la
carretera, para cannabis que usan un ensayo de lectura visual o que
emplea un dispositivo de lectura de flujo lateral portátil como se
ha descrito anteriormente. Sin embargo, se apreciará que los
procedimientos de la invención se pueden aplicar a cualquier tipo de
muestra líquida empleada de manera común para ensayar las drogas de
abuso. De este modo, la muestra puede ser una muestra de fluido que
consta de, se deriva de, cualquier fluido oral, orina, sangre,
fluido ocular, sudor o pelo. Una muestra adecuada se puede derivar
de una fuente ambiental o hisopo, por ejemplo, un hisopo puesto en
contacto con fluido oral en la boca o una superficie sospechosa de
contaminación por cannabis. La muestra se puede obtener disolviendo
un material, por ejemplo, resina sólida o polvo, a ensayar para
determinar la presencia de cannabis en solución tampón. Las
referencias que se pueden mencionar para la preparación de muestra
incluyen "Drug Monitoring in Nonconventional Biological Fluids and
Matrices" en Clinical Pharmacokinetics 1996, volumen 30, páginas
211-228 y "Testing for drugs of Abuse in Hair"
en Forensic Science review 1997, volumen 9, páginas
23-25.
Como se ha indicado previamente anteriormente,
la invención adicionalmente se extiende a kits para llevar a cabo
un procedimiento de la invención que comprende un conjugado de
5-pentilresorcinol/vehículo macromolecular adecuado
como se ha descrito anteriormente y un anticuerpo
anti-THC. O bien el conjugado de
5-pentilresorcinol o el anticuerpo
anti-THC se puede marcar directamente con una marca
detectable. En el caso del conjugado de
5-pentilresorcinol, como ya se ha indicado
anteriormente, puede ser posible para la parte del vehículo del
conjugado que sirva como una marca detectable. Como alternativa, se
pueden proporcionar los medios para marcar indirectamente o bien el
conjugado o el anticuerpo anti-THC, por ejemplo,
anticuerpo marcado secundariamente. O bien el conjugado de
5-pentilresorcinol o el anticuerpo
anti-THC se puede inmovilizar sobre un soporte
sólido. Por ejemplo, el kit puede comprender o bien el conjugado o
el anticuerpo anti-THC inmovilizado sobre una tira
u hoja de ensayo como se ha descrito anteriormente para llevar a
cabo la inmunocromatografía de flujo lateral. Tal tira u hoja de
ensayo se puede insertar en un alojamiento proporcionando una
ventana o ventanas sobre la(s) zona(s) de detección de
analito o conjuntamente con tal alojamiento.
Un kit de la invención puede comprender
componentes adicionales. Por ejemplo, donde la muestra de ensayo se
ha de recoger de un sujeto de ensayo, el kit puede además comprender
un medio de recogida de fluidos, por ejemplo, un dispositivo de
recogida oral o hisopo, un recipiente tal como un recipiente
adecuado para la recogida de sangre u orina. Un kit para uso en el
procedimiento de flujo lateral puede incluir un dispositivo de
lectura portátil en el que se puede ajustar un alojamiento como se
ha descrito anteriormente para la detección de la marca unida en
la(s) zona(s) de detección y exposición digital de los
resultados.
El siguiente ejemplo ilustra la invención.
\newpage
Ejemplo
THC-COOH se conjugó a BSA usando
el procedimiento de acoplamiento de carbodiimida. El grupo de ácido
carboxílico de la droga se unió a los grupos
\varepsilon-amino de los restos de lisina como
sigue:
1. Disolver 5,0 mg de ácido delta
9-THC (Helena, nº de catálogo DR021) en 1 ml de
etanol.
2. Añadir 1,0 ml de dimetilformamida (DMF).
3. Añadir 10 \mul de
N-metilmorfolina (NMM, Sigma Co., nº de catálogo
67869)
4. Añadir N-hidroxisuccininmida
(N-HS), 6,3 mg en 50 \mul de dimetilformamida
(DMF). Agitar la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente
durante 24 horas.
5. Pesar 30 mg de albúmina sérica bovina en una
botella de color pardo. Disolver en 4 ml de bicarbonate sódico 0,1
M.
6. Añadir la droga activada gota a gota a la
solución de BSA. Agitar durante toda una noche a temperatura
ambiente en la oscuridad.
7. Añadir 100 \mul de 2 M Tris y mantener la
agitación durante otros 60 minutos.
8. Dializar durante toda una noche frente a
solución salina tamponada con fosfato, pH 7,3 que contiene 0,1% de
azida de sodio.
9. Determinar la concentración de proteína
usando el ensayo de proteína de Lowry y ajustar 1 mg/ml en
PBS/azide. Almacenar las alícuotas a -20ºC.
El conjugado se ensayó mediante inmunoensayo de
enzimas, placas de microvaloración de 96 pocillos se recubrieron,
durante toda una noche a temperatura ambiente, con el conjugado a 5
\mug/ml, 100 \mul/pocillo en 50 mM tampón carbonato
de/bicarbonato de sodio, pH 9,6. Los pocillos se lavaron con
solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 que contiene 0,05% de
Tween-20 (tampón de lavado) (4 veces, 330
\mul/pocillo) y se bloquearon en el mismo tampón durante 30
minutos, diluciones 3 veces de anticuerpo monoclonal de ratón
anti-THC (East COSAT Biologics, Estados Unidos) se
añadieron a los pocillos (100 \mul/pocillo) en tampón de lavado
que contiene 5 mg/ml BSA (tampón de ensayo). Después de 1 hora la
incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó 4 veces como
antes con tampón de lavado e IgG anti-ratón de cabra
marcado con peroxidasa de rábano picante se añadió en tampón de
ensayo (dilución 1/2000, 100 \mul/pocillo) y la placa se incubó
durante 30 minutos adicionales. Después la placa se lavó como antes
y se añadió solución de sustrato de tetrametilbenzidina a los
pocillos (100 \mul/pocillo). El desarrollo de color se terminó
después después de 30 minutos mediante la adición de 1 M de ácido
sulfúrico (100 \mul/pocillo) y se leyó la densidad óptica a 450
nm. La Figura 3 muestra una curva de valoración típica.
\vskip1.000000\baselineskip
5-pentilresorcinol se acopló a
albúmina sérica bovina mediante sus grupos hidroxilo usando el
procedimiento de dimetil aminopiridina (DMAP/carbonato de
disuccinimidilo (DSC) o vinil sulfona como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
1. Disolver 10 mg of
5-pentilresorcinol en 1 ml de isopropanol.
2. Disolver 88 mg de DSC en 0,4 ml de DMF.
3. Disolver 42 mg de DMAP in 0,4 ml de
acetona.
4. Añadir solución de DSC gota a gota a la
solución de 5-pentilresorcinol.
5. Añadir solución de DMAP lentamente y gota a
gota. Agitar en la oscuridad durante toda la noche a temperatura
ambiente.
6. Añadir la droga active a 70 mg de BSA en 4 ml
de 0,1 M bicarbonato de sodio. Agitar durante toda una noche a
temperatura ambiente.
7. Dializar el conjugado durante tres días con
tres cambios de 1 litro cada uno frente solución salina tamponada
con fosfato (PBS), pH 7,3 que contiene 0,1% de azida de sodio.
8. Determinar la concentración de proteína
usando el ensayo de proteína de Lowry y ajustar hasta 1 mg/ml.
Almacenar las alícuotas a -20ºC.
Reemplazar BSA en este procedimiento mediante
BSA con un espaciador aminocaproico proporciona un conjugado
igualmente adecuado.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Disolver 10 mg de BSA en 1 ml de 0,1 M de
tampón de carbonato/bicarbonato de sodio, pH 10,0. Añadir lentamente
0,1 ml de vinil sulfona y agitar la mezcla durante toda una noche a
temperatura ambiente. Dializar la proteína activada contra 0,15 M de
cloruro de sodio durante 6 horas a temperatura ambiente.
2. Añadir 1,5 mg de
5-pentilresorcinol en 0,2 ml de isopropanol e
incubar la mezcla durante toda una noche a temperatura ambiente.
3. Dializar el conjugado durante 3 días frente a
PBS/azida con 3 cambios de 2 litros cada uno.
4. Determinar la concentración de proteína
usando el ensayo de proteína de Lowry y diluir hasta 1 mg/ml.
Almacenar las alícuotas a -20ºC.
Los conjugados de BSA-CAN
también se ensayaron mediante inmunoensayo de enzimas como se ha
descrito para el conjugado BSA-THC. La Figura 4
muestra un perfil de valoración típica.
\vskip1.000000\baselineskip
BSA-THC y
BSA-CAN se usaron para establecer un ensayo de flujo
lateral para cannabis. La Figura 5 muestra el formato de este
ensayo. Los conjugados se diluyeron 1 mg/ml en PBS que contiene 3%
de etanol. BSA-THC o BSA-CAN se
inmovilizaron sobre nitrocelulosa usando procedimientos de chorro de
tinta o de contacto directo. Los anticuerpos IgG
anti-ratón de oveja (que actúan como línea de
control (3)) a 0,5 de mg/ml también se inmovilizaron sobre la tira
de nitrocelulosa (2). Se secaron las tiras durante toda una noche a
37ºC. Se laminaron un tampón de fibra de vidrio (4) que contenía
anticuerpo anti-THC monoclonal de ratón marcado con
oro (anticuerpo no marcado obtenido de East Coast Biologics,
Estados unidos) un tampon de muestra (5) y un tampón de mecha (6)
se laminaron sobre la tira de nitrocelulosa como se muestra en la
Figura 5. Las muestras de fluido oral (1 ml) se recogieron usando
un tampón de recogida de muestras de Cozart (Producto nº MANU018) y
se diluyeron con 2 ml de tampón de dilución de fluido oral de
Cozart (Producto nº CR-BUFF). 120 \mul del fluido
oral diluido se añadieron lentamente al tampón de muestra. El
líquido que se mueve a través de la tira mediante la acción capilar
que hidrata el anticuerpo marcado con oro.
Si la muestra no contenía cannabis, el
anticuerpo marcado unido al conjugado BSA-droga
inmovilizado proporciona una línea de color rojizo/marrón. La línea
de control captaba el anticuerpo marcado en exceso. Si la muestra
de fluido oral diluida contenía cannabis, esta unión al anticuerpo
marcado con oro en preferencia al conjugado
BSA-droga inmovilizado da como resultado la
intensidad de color reducida de la línea BSA-droga.
El resultado de cada ensayo se leyó usando el lector Cozart®
Rapiscan (patente de Gran Bretaña nº 2339615, que corresponde a la
solicitud de patente Internacional publicada WO 00/04831 y Journal
of Forensic Science 2001, volumen 46, páginas
1214-1220, Producto nº CR200S-UK).
El lector mide la intensidad de color de la línea
BSA-droga, que está inversamente relacionada con la
concentración de droga en la muestra de fluido oral diluido, y
reseña el resultado del ensayo como positivo o negativo contra un
valor de corte preestablecido. El fluido oral sin droga se recogió
con THF (I) o THC-COOH (II) o THC-OH
(III) a diversas concentraciones y después se ensayó usando las
tiras de flujo lateral de BSA-THC o
BSA-CAN. Las concentraciones más bajas de drogas que
proporcionan una señal positive sobre el lector se enumeran en la
Tabla 1. Está claro que el uso del conjugado de
BSA-CAN novedoso incrementó la sensibilidad de la
detección de THC en aproximadamente 10 veces.
Claims (28)
1. Un procedimiento para detectar en una muestra
líquida delta-9-tetrahidrocannabinol
(THC), que comprende:
(a) poner en contacto dicha muestra con (i) un
conjugado de 5-pentilresorcinol/vehículo
macromolecular en el que 5-pentilresorcinol se
conjuga mediante un grupo hidroxilo o su derivado sobre su anillo
benceno al vehículo y (ii) un anticuerpo capaz de unirse tanto a THC
como a dicho conjugado; y
(b) determinar si la unión de dicho anticuerpo a
dicho conjugado se reduce en la presencia de dicha muestra.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en
el que dicho anticuerpo es capaz de unirse a todo
delta-9 tetrahidrocannabinol (THC) y sus metabolitos
11-nor-9-carboxi-delta-9-THC
(THC-COOH) y
11-hidroxi-delta-9-THC
(THC-OH) por lo cual uno o más de THC,
THC-COOH y THC-OH se pueden detectar
en la muestra líquida.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2 en
el que dicho anticuerpo es un anticuerpo inducido contra
THC-COOH acoplado a una proteína vehículo mediante
su grupo carboxilato.
4. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que el vehículo de dicho conjugado
5-pentilresorcinol/vehículo es una proteína.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4 en
el que dicha proteína se selecciona entre albúmina sérica bovina,
peroxidasa de rábano picante, ovoalbúmina, una globulina gamma y
tioglobulina.
6. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que dicho anticuerpo está marcado
directa o indirectamente.
7. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho conjugado
5-pentilresorcinol está marcado directa o
indirectamente o el vehículo de dicho conjugado también sirve como
una marca detectable.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones de las reivindicaciones precedentes en el que dicho
conjugado es un conjugado obtenido mediante acoplamiento de
5-pentilresorcinol a través de sus grupos hidroxilo
a grupos amino de dicho vehículo usando dimetil
aminopiridina/carbonato de disuccinimidilo o vinil sulfota.
9. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que
5-pentilresorcinol se acopla a dicho vehículo
mediante una molécula espaciadora.
10. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones de las reivindicaciones precedentes en el que uno
de dicho anticuerpo y dicho conjugado
5-pentilresorcinol/vehículo se inmoviliza sobre
dicho soporte sólido.
11. Un procedimiento según la reivindicación 10
que es un ensayo de cromatografía de flujo lateral.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11
en el que está marcado dicho conjugado de
5-pentilrescorcinol está inmovilizado en una zona de
detección de analito o la tira u hoja de ensayo para dicho ensayo y
dicho anticuerpo.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12
en el que dicho anticuerpo está marcado por partícula de oro.
14. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones de las reivindicaciones precedentes en el que dicha
muestra consta de, o se deriva de, orina, sangre, sudor, fluido
ocular, fluido oral (saliva) o pelo.
15. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13 en el que la muestra aplicada a la tira u
hoja de ensayo para llevar a cabo la inmunocromatografía de flujo
lateral es fluido oral diluido tamponado.
16. A tira u hoja de ensayo para uso en un
dispositivo analítico de flujo lateral para llevar a cabo un ensayo
de inmunocromatografía de flujo lateral de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, teniendo dicha tira u
hoja de ensayo las siguientes características:
(i) una tira u hoja que comprende un material
poroso seco, que tiene inmovilizado a él en una zona de detección de
analito dicho conjugado de
5-pentilresorcinol/vehículo o dicho anticuerpo;
y
(ii) unido a, o integral a, dicha tira u hoja
proporcionando dicha zona de detección de analito una zona de
liberación de marca separada que es capaz de liberarse en el líquido
extraído en esa zona o bien dicho anticuerpos en la forma marcada,
si dicha zona de detección presenta conjugado de
5-pentilresorcinol inmovilizado, o, si dicha zona de
detección de analito presenta anticuerpo inmovilizado, conjugado de
5-pentilresorcinol detectable como se ha descrito en
la reivindicación 7.
17. Una tira u hoja de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 16 en la que dicho material poroso es
nitrocelulosa.
18. Una tira u hoja de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 16 o reivindicación 17 en la que el conjugado
5-pentilresorcinol está inmovilizado en una zona de
detección de analito.
19. Una tira u hoja de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 que comprende además una
zona de control que se localiza distal a la zona de detección de
analito en la dirección del fluido de líquido propuesto.
20. Una tira u hoja de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 que comprende además una
muestra que recibe un miembro o tampón proximal a dicha zona de
liberación de marca que tiene relación con la dirección propuesta de
fluido de líquido.
21. Una tira u hoja de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 que comprende además un
tampón de desecho distal a dicha zona de detección de analitos en la
dirección del flujo del líquido propuesta.
22. Una tira u hoja de ensayo como se reivindica
en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 insertada en un
alojamiento.
23. Un dispositivo de flujo lateral que
incorpora una tira u hoja de ensayo de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 22.
24. Un kit para llevar a cabo un procedimiento
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que
comprende dicho conjugado
5-pentilresorcinol/vehículo y dicho anticuerpo.
25. Un kit según la reivindicación 24 en el que
dicho anticuerpo es anticuerpo marcado directamente o marcado
secundario se proporciona para el marcado de dicho anticuerpo.
26. Un kit según la reivindicación 24 en el que
dicho conjugado es un conjugado detectable como se ha definido en la
reivindicación 7.
27. Un kit como se reivindica en una cualquiera
de las reivindicaciones 24 a 26 en el que dicho anticuerpo o dicho
conjugado está inmovilizado sobre un soporte sólido.
28. Un kit según la reivindicación 27, que
comprende una tira u hoja de ensayo de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 22.
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