ES2564293T3

ES2564293T3 - Enlazamiento de formas patológicas de proteínas priónicas

Info

Publication number: ES2564293T3
Application number: ES03709945.4T
Authority: ES
Inventors: Amin Reza Lane; Christopher J. Stanley; Stuart Mark Wilson
Original assignee: Microsens Biophage Ltd
Current assignee: Microsens Biophage Ltd
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2016-03-21
Anticipated expiration: 2023-02-28
Also published as: JP2005519088A; CN1643381A; CO5611225A2; BRPI0307976A2; EP1478931B1; NZ535276A; EP1478931B2; EP1478931A2; BRPI0307976B8; US20100184054A1; RU2309410C2; WO2003073106A3; AU2003214375B2; BRPI0307976B1; US7659076B2; CA2477569C; CA2477569A1; CN100526884C; US20050221404A1; JP4550425B2

Abstract

Un procedimiento para el enlazamiento selectivo de una forma anormal de agregación de una proteína en presencia de la forma normal de no agregación de la proteína, que comprende poner en contacto bajo condiciones de enlazamiento selectivo un material que contiene tanto dicha forma anormal como normal con un agente de enlazamiento, que es un poliglicósido polianiónico, una poliamina o una polietilenimina, que tiene una avidez de enlazamiento por dicha forma de agregación de dicha proteína que está presente en la muestra.

Description

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proteína de agregación. Los detergentes aniónicos adecuados pueden competir más efectivamente por el enlazamiento con la forma de no agregación para mejorar la selectividad. Convenientemente, la selectividad obtenida es tal que la avidez por el enlazamiento con la proteína de agregación es al menos tres veces aquella para la forma normal, preferiblemente al menos de 10:1.

En un aspecto adicional, la invención incluye un proceso para separar PrPSc de PrPC que comprende enlazar selectivamente PrPSc con un agente de enlazamiento que es un poliglicósido polianiónico, una poliamina o una polietilenimina en presencia de una amida de aminoácido de un ácido graso. Las condiciones preferidas para tal enlazamiento se exponen en forma detallada más arriba y la proteína enlazada puede ser ensayada como se describe.

La invención será descrita e ilustrará además mediante los siguientes ejemplos haciendo referencia al dibujo acompañante en el cual:

La Figura 1 muestra curvas de dilución contenidas en el Ejemplo 9.

Ejemplo 1: Separación de un prión normal de la proteína priónica rogue utilizando polisulfato de pentosano biotinilado y la posterior captura por afinidad.

Introducción

Se conjugó biotina con polisulfato de pentosano utilizando métodos químicos estándar. Se permitió que el polisulfato de pentosano biotinilado se enlazará a la proteína priónica rogue en homogeneizados de cerebro y después del enlazamiento se capturaron los complejos de polisulfato de pentosano/prión usando perlas superparamagnéticas que forman derivados con estreptavidina. Se eluyó posteriormente el prión rogue capturado de las perlas y se detectó usando el kit de detección de BSE PlateliaMR de Bio-Rad basado en inmunología; este último kit es incapaz de diferenciar la proteína priónica rogue de la normal y dará señal con ambas proteínas. Se investigó un banco de dos cerebros de bovino infectados con BSE y dos no infectados y se utilizaron para demostrar que el polisulfato de pentosano, bajo las condiciones específicas descritas, podría ser utilizado para capturar específicamente la proteína priónica rogue a partir de los homogeneizados de cerebro.

Método

Preparación de las perlas superparamagnéticas

1.: Justo antes del uso, se lavaron 400 µl de perlas superparamagnéticas de estreptavidina (Sigma-Aldrich Company Ltd., S-2415) por captura magnética en tres volúmenes consecutivos de 1 ml de TBST (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, Tween 20 al 0,05% (v/v) [Sigma-Aldrich Company Ltd., P-7949]).

2.: Se resuspendieron finalmente las perlas en 400 µl de TBST.

3.: Se prepararon alícuotas de 100 µl en cuatro tubos y se removió el líquido. Las perlas estaban entonces listas para uso.

Preparación de los homogeneizados del cerebro.

1.: Se agregaron 300-500 mg de cada tejido de cerebro a los tubos de trituración que contenían perlas de trituración suministradas en el kit de purificación BSE (Bio-Rad). Se aspiró el líquido suministrado originalmente en estos tubos en del kit y se descartó antes del uso.

2.: Se añadió un volumen de NaCl de 150 mM que se calculó para generar un homogeneizado de cerebro al 50% (p/v) después de la homogeneización, a cada tubo.

3.: Los tubos e homogeneizaron durante 45 segundos a una velocidades fijada en 6,5 en un Ribolyzer (adquirido a través de Bio-Rad).

4.: Los homogeneizados se diluyeron 1:1 con NaCl 150 mM.

5.: Se colocaron volúmenes de 50 µl de cada homogeneizado en tubos separados.

Captura específica de la proteína priónica rogue

6.: Se agregaron luego 10 µl de N-lauroilsarcosina al 20% (p/v) (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-9150) a cada tubo del homogeneizado y se mezcló.

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Homogeneizado de cerebro utilizado

Muestra 1 de cerebro de bovino infectado con BSE Muestra 2 de cerebro de bovino infectado con BSE Muestra 1 de cerebro de bovino normal Muestra 2 de cerebro de bovino normal

La señales de los dos homogeneizados de cerebro infectados con BSE que contenían prión rogue, es significativamente mayor que en los homogeneizados de cerebro normales no infectados.

Discusión

El kit de detección de BSE PlateliaMR de Bio-Rad no puede diferenciar entre la proteína priónica rogue o normal. Normalmente, la especificidad por la proteína priónica rogue se logra mediante digestión previa de la muestra con proteinasa K que remueve la proteína priónica normal susceptible a la proteasa. Cualquier proteína priónica rogue en la muestra es más resistente a la digestión con proteasa y permanece y es posteriormente detectada por el ensayo con PlateliaMR. En este experimento se demostró un enfoque alternativo para digestión de la muestra con proteasa. Se utilizaron condiciones definidas bajo las cuales el polisulfato de pentosano biotinilado en solución puede enlazarse específicamente con la proteína priónica rogue en la muestra. Se puede capturar luego el complejo de prión rogue/polisulfato de pentosano utilizando perlas superparamagnéticas de estreptavidina. Después del lavado, la proteína priónica rogue puede ser posteriormente eluida y detectada en el inmunoensayo. La proteína priónica normal no es capturada por este protocolo y retirada por lavado y por lo tanto no es detectada en el inmunoensayo. Se ha demostrado que mediante el uso de esta técnica se puede detectar correctamente la proteína priónica rogue en dos cerebros de bovino infectados con BSE y no se observó señal en dos cerebros normales de bovino.

7.: Se agregaron luego 50 µl de polisulfato de pentosano biotinilado (10 µg/ml) en agua estéril destilada) a cada tubo, se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.

8.: Se añadió luego cada reacción a un tubo de perlas superparamagnéticas lavadas de estreptavidina y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.

9.: Se lavaron luego las perlas mediante captura magnética en tres volúmenes de 1 ml de TBST. Elución de la proteína priónica rogue e inmunodetección.

1.: Finalmente, después del último lavado, se resuspendieron las perlas de cada reacción en 10 µl de C1 (suministrado con el kit de detección de BSE PlateliaMR de Bio-Rad)

2.: Se agregaron 5 µl de SDS al 0,2% (p/v) a cada suspensión de perlas y se mezcló.

3.: Se agregaron 5 µl de tiocianato de guanidina 1 M (Sigma-Aldrich Company Ltd., G-9277) a cada suspensión de perlas y se mezcló.

4.: Se calentó la reacción a 100ºC durante 5 minutos.

5.: Se agregaron luego 100 µl de R6 (suministrados con el kit de detección de BSE PlateliaMR de Bio-Rad) y se mezcló.

6.: Se utilizaron luego 100 µl de cada eluato en el kit de detección de PlateliaMR BSE de Bio-Rad usando el protocolo y los reactivos suministrados con este kit. En resumen, este kit involucra inmunocaptura de la proteína priónica rogue y/o normal e inmunodetección con un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante.

Resultados

Después de realizar la inmunodetección en el ensayo con PlateliaMR con base en la placa de microtitulación, se midió la señal en cada pozo a una longitud de onda de 450 nm usando un lector de ELISA.

DO450

0,229 0,208 0,061 0,047

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3.: Los tubos se homogeneizaron por 45 segundos a una velocidad ajustada en 6.5 en un Ribolyzer (adquirido a Bio-Rad).

4.: Se diluyeron 5 veces 50 µl de cada homogeneizado en soluciones reguladoras de pH 5,7, 7,5, 8,4 y 9,6 que contenían todas BSA al 5% (p/v).

5.: Se colocaron alícuotas de un volumen de 45 µl de cada homogeneizado diluido en tubos por separado.

5 6. Se agregaron 5 µl de SDS al 20% (p/v) (dodecil sulfato de sodio) (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-5750) a cada tubo y se mezclaron completamente.

7. Se agregaron luego 450 µl de solución reguladora del mismo pH que la solución reguladora de la dilución inicial que contenía albúmina de bovino al 5% (p/v) a cada alícuota y se mezclaron.

8.: Se agregaron luego 50 µl de N-lauroilsarcosina al 20% (p/v) (Sigma-Aldrich Company Ltd., L-9150) y se mezclaron. 10 Captura con perlas de los homogeneizados de cerebro

1. Se agregaron 10 µl de perlas preparadas superparamagnéticas recubiertas con polisulfato de pentosano en solución reguladora del correspondiente pH a cada homogeneizado de cerebro diluido, y se incubó con movimiento de balanceo durante 1 hora a temperatura ambiente.

2.: Cada reacción se lavó luego por captura magnética con 3 volúmenes de 100 µl de TBS. 15 Elución de la proteína priónica rogue e inmunodetección.

1.: Se resuspendieron las perlas de cada reacción en 10 µl de C1 (suministrado con el kit de detección de BSE PlateliaMR de Bio-Rad).

3.: Se agregaron 5 ml de tiocianato de guanidina 1 M (Sigma-Aldrich Company Ltd., G-9277) a cada suspensión de perlas 20 y se mezcló.

4.: Se calentó la reacción a 100ºC durante 5 minutos.

5.: Se agregaron luego 100 µl de R6 (suministrado con el kit de detección de BSE PlateliaMR de Bio-Rad) y se mezcló.

6.: Se usaron luego 100 µl de cada eluato en el kit de detección de BSE PlateliaMR de Bio-Rad usando el protocolo y los

reactivos suministrados con este kit. Brevemente, este kit involucra inmunocaptura de la proteína priónica rogue y/o normal 25 y la inmunodetección con un anticuerpo conjugado de peroxidasa de rábano picante.

Resultados

Después de realizar la inmunodetección en el ensayo PlateliaMR con base en la placa de microtitulación, se midió la señal en cada pozo a una longitud de onda de 450 nm usando un lector de ELISA.

Regulador de pH usado: Cerebro de bovino usado DO450

5,7: Cerebro infectado con BSE 0,79

5,7: Cerebro normal 0,30

7,5: Cerebro infectado con BSE 1,57

7,5: Cerebro normal 1,25

8,4: Cerebro infectado con BSE 0,42

8,4: Cerebro normal 0,04

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Tipo de pozos usados: Cerebro normal o infectado con BSE DO450

Polisorp: Infectado con BSE 0,05

Polisorp: Normal 0,03

Maxisorp: Infectado con BSE 0,02

Maxisorp: Normal 0,02

Maxisorp recubierto con sulfato de dextrano: Infectado con BSE 1,0

Maxisorp recubierto con sulfato de dextrano: Normal 0,02

Discusión La superficie de poliestireno aniónica, bajo las condiciones usadas en este experimento, capturó específicamente PrPres. El plástico no cargado no tuvo este efecto, a menos que hubiera sido recubierto con un ligando polianiónico.

5 Ejemplo 9: Estudio de los efectos de la dilución de una muestra de cerebro positiva en una muestra negativa Material Muestra positiva: Una suspensión al 25% de homogeneizado de cerebro que se sabe que es positiva para PrPSc Muestra negativa: Una suspensión al 25% de homogeneizado de cerebro que se sabe que es negativa para PrPSc Preparación

10 Se recubrieron placas Maxisorb de acuerdo con el siguiente protocolo de recubrimiento. Se recubrieron las placas con 1 mg de Polibreno en solución reguladora de carbonato a pH 7,4 y se dejó durante la noche, se lavó 3 veces con PBS. Se recubrieron luego las placas con 1 mg de sulfato de dextrano en PBS. Después de 6 horas, se lavaron las placas 3 veces con PBS, luego se bloquearon con BSA al 5% mediante la adición de 400 µl de solución de BSA al 5% y se dejaron así durante 30 minutos. Se lavaron luego las placas 3 veces con PBS y se permitió que se secaran.

15 Preparación de la muestra Preparación de la dilución de la muestra en cerebro negativo

Muestra: Método

+ve pura: 40 µl de muestra +ve

1/5: 8 µl de muestra +ve + 32 µl de muestra -ve

1/10: 5 µl de muestra +ve + 45 µl de muestra -ve

1/100: 6 µl de (muestra +ve diluida 1/10) + 54 µl de muestra -ve

1/250: 20 µl de (muestra +ve diluida 1/100) + 30 µl de muestra -ve

1/1000: 10 µl de (muestra +ve diluida 1/250) + 30 µl de muestra -ve

-ve pura: 25 µl de muestra -ve

Preparación de la dilución de la muestra en agua

Muestra: Método

+ve pura: 40 µl de muestra +ve

1/5: 8 µl de muestra +ve + 32 µl de H2O

1/10: 5 µl de muestra +ve + 45 µl de H2O

1/100: 6 µl de (muestra +ve diluida 1/10) + 54 µl H2O

1/250: 20 µl de (muestra +ve diluida 1/100) + 30 µl de H2O

1/1000: 10 µl de (muestra +ve diluida 1/250) + 30 µl de H2O

20 Preparación de la muestra antes de correrla en el ensayo

Se mezclaron 40 µl de la muestra con 60 µl de H2O y 25 µl de solución reguladora de captura, Tris 250 mM pH 8,4, BSA al 5%, Triton X-100 al 5%, Sarkosyl al 5%, 1,25 mg/ml de tripsina. Los ensayos se realizaron de acuerdo con el siguiente protocolo de ensayo:

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DO

mg de cerebro +ve: Diluido en cerebro -ve Diluido en H2O

2,00: 1,992 2,377

1,00: 1,252 1,395

0,10: 0,175 0,145

0,04: 0,077 0,053

0,01: 0,039 0,016

0,00: 0,021 --------------

Estos resultados se presentan gráficamente en la Figura 1, que muestra las curvas de dilución para la dilución de cerebro positivo respectivamente con cerebro negativo y agua. Las dos curvas son esencialmente iguales, demostrando que la presencia de material de cerebro negativo no interfiere con el ensayo.

5 Ejemplo 10: Captura de la proteína tau agregada en cerebro con Alzheimer y controles normales agrupados por edad

Se ha mostrado que, bajo condiciones definidas, varios agentes de captura selectivos son específicos para la captura de proteína priónica patógena agregada de tal manera que no se captura el prión no agregado normal. La proteína priónica agregada tiene una estructura de lámina de pliegues beta, mientras que el prión normal es principalmente de estructura de hélice alfa. Este ejemplo demuestra que otras proteínas de lámina de pliegues beta agregadas, tales como los 10 agregados tau que se encuentran en la enfermedad de Alzheimer, pueden ser selectivamente capturados en forma similar.

Método

1. Se prepararon homogeneizados al 25% (p/v) de cerebros con Alzheimer y de control agrupados por edad, en agua destilada.

2. Se llevaron 4 µl de cerebro hasta 100 µl en solución reguladora de captura (Tris 50 mM pH 8,4, Triton X-100 al 1% 15 (v/v), N-lauroil sarcosina al 1% (p/v), BSA al 1% (p/v)).

3.: Se llevaron 25 µl de cerebro hasta 100 µl en solución reguladora de captura que contenía 25 µg de Tripsina.

4.: Se agregaron alícuotas por duplicado de 100 µl de cerebro preparadas como en las etapas 2 y 3 anteriores, a pozos de microtitulación recubiertos con sulfato de dextrano y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente.

5.: Se lavaron luego los pozos tres veces con Tris 50 mM pH 8,4, N-lauroil sarcosina al 1% (p/v).

20 6. Se incubaron las muestras con un anticuerpo monoclonal anti-tau en Tween 20 al 0,1% (v/v) en PBS.

7.: Después de 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron los pozos tres veces con Tween 20 al 0,1% (v/v) en PBS.

8.: Se detectó el anticuerpo primario inmovilizado con un conjugado de peroxidasa de rábano picante -IgG antirratón de acuerdo con procedimientos estándar.

Resultados25 Resultados con el anticuerpo anti-tau

Cerebro: 1 mg de cerebro sin tripsina 10 mg de cerebro con tripsina

1 de Alzheimer: 1,32 1,26

2 de Alzheimer: 0,85 0,62

Control 1: 0,56 0,20

Control 2: 0,97 0,51

Discusión

Se sabe que los cerebros de la mayoría de los individuos de edad contienen tau agregado, pero en la enfermedad de Alzheimer hay más de estos agregados que en los controles agrupados por edad. Aquí, el agente de captura selectivo 30 captura estos agregados. En este ejemplo, la digestión de tripsina reduce el enlazamiento de la proteína y reduce la señal, pero, bajo estas condiciones, no la reduce completamente. La relación de señal después del tratamiento con tripsina con respecto a la señal sin tratamiento fue mucho mayor en los cerebros de Alzheimer que en los controles. Esto sugiere que

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hay más agregados resistentes a la proteasa de la proteína tau en el cerebro de Alzheimer en comparación con los controles agrupados por edad. Ejemplo 11: El efecto de la valoración de tripsina en muestras positivas para PrPSc Método

Placa recubierta de sulfato de dextrano: Se colocó 1 mg de bromuro de hexadimetrina (Polibreno) (100 µl de 10 mg/ml en solución reguladora de carbonato pH 7,4) en placas Maxisorb y se dejó durante la noche a temperatura ambiente.

Cada placa se lavó entonces 3 veces con PBS y se recubrió con 1 mg de sulfato de dextrano (PM 500.000) (patrón de 10

mg/ml en solución reguladora Tris pH 8,6) y se dejó a temperatura ambiente durante 4 horas. Las placas se lavaron entonces 3 veces con PBS y luego se bloquearon con 300 µl de solución de BSA al 5% en TBS y se dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Las placas se lavaron luego 3 veces con PBS. Regulador de captura Solución reguladora Tris 250 mM a pH 8,4 que contenía BSA al 5%, Sarkosyl al 5%, Triton al 5%. Muestra Se trataron cerebros BI63 y SV10 débil y fuertemente positivos (homogeneizados al 25%) de la siguiente forma, para proporcionar muestras para ensayo. 25 µl de homogeneizado de cerebro + 25 µl de solución reguladora de captura, Tris 250 mM pH 8,4, BSA al 5%, Triton X-100 al 5%, Sarkosyl al 5%, + 65 µl de H2O. A esta muestra se le agregaron 10 µl de varias concentraciones de tripsina. Solución reguladora de lavado Tris 50 mM pH 8,4 + Sarkosyl al 1% Método Protocolo de ensayo

1.: Agregar 100 µl de muestra a la placa y e incubar a temperatura ambiente durante 120 minutos.

2.: Lavar 3 veces con Tris 50 mM pH 8,4 + Sarkosyl al 1% y 3 veces con PBS.

3.: Agregar 100 µl de GuSCN 4 M (en PEG al 20%) y se incuba durante 10 minutos a 2-8ºC.

4.: Lavar 3 veces con PBS.

5.: Agregar 100 µl de conjugado de anticuerpo de enzima PlateliaMR de Bio-Rad e incubar a 2-8ºC durante 60 minutos.

6.: Lavar 5 veces con lavado PlateliaMR de Bio-Rad.

7.: Agregar 100 µl de substrato PlateliaMR de Bio-Rad e incubar durante 30 minutos en la oscuridad.

8.: Agregar 100 µl de solución de detención PlateliaMR de Bio-Rad y leer. Resultados

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5 mg de cerebro Bi63 positivo

Tripsina (1µg): DO

1000: 0,135

100: 0,14

25: 0,169

10: 0,173

1: 0,068

0: 0,068

5 mg de cerebro SV10 positivo

Tripsina (1µg): DO

25: 2,858

0: 0,894

Conclusión

La presencia de tripsina parece haber aumentado la señal. También parece que se puede usar un amplio intervalo de concentración de tripsina sin un efecto perjudicial sobre el ensayo.

Ejemplo 12: Demostración del enlazamiento específico de PrPSc por policationes

Método

Este ejemplo demuestra el uso de varios policationes para la captura específica de PrPSc. Los ligandos se recubrieron ya sea pasivamente en microplacas de poliestireno o se recubrieron activamente (es decir, se enlazaron), según sea apropiado, sobre placas de anhídrido maleico.

Inmovilización del agente de enlazamiento selectivo

Todos los agentes de enlazamiento selectivo se inmovilizaron durante la noche a 16-25ºC en solución reguladora de carbonato 50 mM pH 9,6 a una concentración de 10 µg/ml. Después de la inmovilización, se lavaron los pozos 3 veces con PBS y luego se bloquearon con BSA al 5% (p/v) en PBS durante 30 minutos. Después del bloqueo, se lavaron los pozos 2 veces con PBS antes de usarse. Se colocaron el dendrímero Starbust PAMA, poli L-lisina y polietilenimina tanto sobre microplacas Maxisorp como microplacas de anhídrido maleico, mientras se colocaron el polibreno y pDADMAC solo en placas Maxisorp.

Captura de PrPSc

1.: Se homogeneizaron cerebros de bovino no infectados y de bovino infectados con BSE en agua destilada de acuerdo con los protocolos definidos comercialmente.

2.: Se capturaron 0,5 mg del cerebro homogeneizado en pozos recubiertos con ligando en un volumen total de 100 µl de Tris 50 mM pH 8,3, N-lauroil sarcosina al 1% (p/v), Triton X-100 al 1% (v/v), BSA al 1% (p/v), 0,5 mg/ml de tripsina (páncreas porcino).

3.: Después de captura durante 2 horas a 18-25ºC, se lavaron los pozos 3 veces con Tris 50 mM pH 8,3, N-lauroil sarcosina al 1% (p/v).

4.: Se lavaron luego los pozos 3 veces con PBS y se incubaron durante 10 minutos con 100 ml de tiocianato de guanidina 4 M, PEG 8000 al 20% a 4-8ºC.

5.: Se lavaron los pozos 3 veces con PBS y luego se incubaron con un conjugado de peroxidasa de rábano picante anticuerpo monoclonal anti-prión.

6.: Después de 60 minutos, se lavaron los pozos 5 veces con Tween 20 al 0,1% (v/v) en PBS, y se agregaron 100 µl de substrato TMB.

7.: Después de 30 minutos se midió la DO450 de cada reacción y se registró (ver tabla a continuación).

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Cerebro: Clasificación por el banco de cerebros OD450

97/97: Negativo 0,05

98/98: Negativo 0,08

Discusión

El agente de enlazamiento policatiónico permite la captura de los agregados tau. Cuando se detecta el tau capturado con el anticuerpo anti-tau, los cerebros con enfermedad de Alzheimer producen todos una señal positiva alta, mientras que

5 los cerebros de control negativos producen una señal negativa baja. En conclusión, la captura con un policatión bajo las condiciones especificadas puede permitir la diferenciación de cerebros con enfermedad de Alzheimer de aquellos cerebros sin la enfermedad.

Ejemplo 14: Efecto de diferentes proteasas y ADNasa en la inhibición de la matriz de captura de PrPSc con pDADMAC

Antecedentes

10 Se investigó el efecto de proteasas diferentes sobre la efectividad de la captura de PrPSc con placas recubiertas con policatión (formadas por el recubrimiento de los pozos con poli(cloruro de dialildimetil amonio) (pDADMAC) (Aldrich Chemical Company Inc., catálogo número 40.903-0).

Método

1. Se llevaron 80 µl de homogeneizado de cerebro hasta 100 µl mediante la adición de 20 µl de solución reguladora de

15 captura (Tris 250 mM pH 8,3, Triton X-100 al 5% (v/v), N-lauroil sarcosina al 5% (p/v), BSA al 5% (p/v)) que contiene diferentes proteasas y/o ADNasa.

2.: Se añadieron luego los homogeneizados a los micropozos recubiertos con policationes.

3.: Después de incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron los pozos seis veces con PBS.

4.: Se agregaron 100 µl de tiocianato de guanidina 4 M, PEG al 20% (p/v) a cada pozo.

20 5. Después de incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron los pozos tres veces con PBS.

6.: Se agregaron 100 µl de conjugado de peroxidasa de rábano picante proteína anti-prión (diluido 1:1500 en Tween 20 al 0,1% (v/v) en PBS y BSA al 5% (p/v)).

7.: Después de 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron los pozos cinco veces con Tween 20 al 0,1% (v/v) en PBS.

8.: Se detectó el conjugado inmovilizado con solución TMB de acuerdo con los protocolos estándar.

25 Resultados Evaluación de los efectos de quimotripsina, tripsina, ADNasa y proteinasa K en la solución reguladora de captura

Proteasa o ADNasa usados: Cerebro de bovino infectado

Sin proteasa o ADNasa: 0,122

Quimo/Tripsina (concentración de ambos 6,25 mg/ml): 0,139

ADNasa/Tripsina (concentración 1 mg/ml de ADNasa, 6,25 mg/ml de Tripsina): 0,639

Quimo/ADNasa (concentración 1 mg/ml de ADNasa, 6,25 mg/ml de Quimo): 0,616

Quimo/ADNasa/Tripsina (concentración 1 mg/ml de ADNasa, 6,25 mg/ml de Quimo y Tripsina): 0,460

Tripsina (concentración 6,25 mg/ml): 0,568

Quimo (concentración 6,25 mg/ml): 0,171

ADNasa (concentración 1 mg/ml): 0,180

Proteinasa K (concentración 1 mg/ml) Pronasa (concentración 1,25 mg/ml) Pronasa (concentración 6,25 mg/ml): 0,531 0,222 0,178

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Claims

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