ES2563678T3 - Ensayo de agentes extraños - Google Patents
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Abstract
Un método para ensayar agentes extraños en una composición que comprende al menos un agente activo, comprendiendo el método: a) inmunizar a un sujeto no humano con una construcción de polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que forma al menos una parte del agente activo, con el fin de generar un anticuerpo producido frente al producto de expresión de dicha construcción de polinucleótido, poner en contacto el anticuerpo así generado con la composición que comprende al menos un agente activo, en el que el anticuerpo se une específicamente al agente activo, y b) determinar la presencia o ausencia de agentes extraños en la composición posteriormente a la etapa a) en un modelo animal, en el que el agente activo se neutraliza o inactiva por unión del anticuerpo antes de la etapa b).
Description
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Como las contaminaciones con un agente adventicio pueden ocurrir, o pueden ensayarse adecuadamente, en cualquier momento durante el proceso de fabricación, el método según la invención puede realizarse en cualquier etapa durante la fabricación de dicha composición.
La composición que se va a ensayar comprende al menos un agente activo. Un agente activo en el significado de la presente invención indica cualquier material químico o biológico o compuesto que es el principio activo en la composición. En el caso de una composición farmacéutica, el agente activo puede ser un compuesto fármaco, tal como un fármaco biofarmacéutico, y especialmente un polipéptido expresado. Preferiblemente, el agente activo es un antígeno, preferiblemente el antígeno es un virus inactivado o atenuado, y más preferiblemente el antígeno es un antígeno viral. Los ejemplos de estos antígenos virales son por ejemplo partículas de virus tales como partículas de virus parcialmente fragmentados tales como antígenos de virus fragmentados, antígenos de cubierta purificados tales como antígenos de subunidades de virus o virosomas. Un virosoma es una vesícula de fosfolípidos en bicapa unilamelar con un diámetro medio adecuado, por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 150 nm. Esencialmente, los virosomas representan cubiertas de virus vacías reconstituidas, desprovistas de la nucleocápside incluyendo el material genético del virus fuente. Los virosomas no son capaces de replicarse pero son vesículas activas de fusión pura que contienen glicoproteínas de cubierta viral funcionales tales como hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) del virus influenza intercaladas en la membrana de fosfolípidos en bicapa. También se prefiere que el agente activo comprenda al menos un componente de un virus o una partícula de virus, preferiblemente el agente activo es una partícula de virus influenza.
Como el método según la presente invención es especialmente útil en el campo de la producción de vacunas pandémicas, según una realización preferida, el agente activo es un antígeno o componente de vacuna derivado de una partícula de virus influenza, que puede estar presente en vacunas de influenza. Estas vacunas de influenza pueden estar basadas en cualquier cepa de influenza adecuada. Las vacunas de influenza incluyen típicamente antígenos de al menos una cepa de virus influenza A, B y C, preferiblemente de al menos una cepa de influenza A o
B. Las cepas recomendadas para vacunas pueden cambiar de estación a estación. También puede ser posible que la vacuna se base en más de una cepa de influenza adecuada. Por ejemplo, la vacuna de influenza puede incluir dos cepas de influenza A y una cepa de influenza B. También puede ser posible además que la vacuna pueda ser no sólo una mono vacuna sino también una vacuna bi, tri o multivalente, preferiblemente la vacuna es una vacuna trivalente. Las vacunas de influenza que contienen el agente activo, preferiblemente el antígeno o el componente de vacuna derivado de una partícula de virus influenza, pueden fabricarse por cualquier técnica que es conocida para un experto en la técnica. Por ejemplo, las vacunas pueden fabricarse usando construcciones de polinucleótido que codifican el agente activo o parte del agente activo, o infectando huevos o células con preparaciones de virus vivos. Preferiblemente, las vacunas se fabrican infectando huevos o células con preparaciones de virus vivos. En el caso en el que la fabricación de vacunas esté basada en células, se usan las células que son capaces de albergar virus en crecimiento, por ejemplo, células de mamíferos tales como MDCK (células de riñón canino Madin-Darby), CHO (células de ovario de hámster chino), BHK (células de riñón de cría de hámster), Vero (células derivadas de células epiteliales de riñón del mono verde africano), MRC-5 (fibroblastos de pulmón humano secundarios), PER.C6 (células derivadas de células retinales embrionarias humanas), WI-38 (células derivadas de tejido de pulmón fetal humano) y semejantes. Habitualmente, el virus o la preparación de virus vivos, respectivamente, se inyecta en las células en las que se multiplica. Las paredes exteriores de las células se retiran, recogen, purifican, e inactivan. En una fabricación basada en huevos, habitualmente el virus o preparación de virus vivos, respectivamente, se inyecta en el huevo y se acumula en el fluido que rodea el embrión. El embrión se infecta de manera que el virus pueda multiplicarse. Después de un determinado periodo de tiempo, el virus se recoge, purifica, e inactiva químicamente. Este virus o pares del virus se usan para producir la vacuna.
El término “polinucleótido" tal y como se usa en la presente memoria debe entenderse que significa una molécula de ácido nucleico bicatenaria o monocatenaria, por ejemplo, una molécula de ADN, ADNc, ADN genómico, ARN y/o ARNm o semejantes. La molécula de ácido nucleico puede estar presente bien como la cadena codificadora o como la cadena complementaria. El polinucleótido puede ser de una fuente natural o producirse por tecnología génica o procesos químicos y métodos de síntesis o puede haber derivado de éstos. Preferiblemente, la secuencia de polinucleótido codifica un antígeno como el agente activo.
El anticuerpo generado en la etapa a), que se ha producido frente a un producto de expresión de una construcción de polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la menos una parte del agente activo, se pone en contacto posteriormente con una composición que comprende al menos un agente activo, en el que el anticuerpo se une específicamente al agente activo, por ejemplo, formando un complejo antígeno-anticuerpo.
En lo que sigue, los anticuerpos usados en el método de la presente invención se describen con detalle. Derivan de una construcción de polinucleótido o vector. El término “construcción de polinucleótido” o “vector”, respectivamente, indica una molécula que se usa para introducir polinucleótidos exógenos (o insertos, respectivamente) en células huésped u organismos huésped. La construcción de polinucleótido comprende un polinucleótido como se ha descrito anteriormente, preferiblemente la construcción de polinucleótido o vector es una secuencia de ADN o ARN, y más preferiblemente una secuencia de ADN. La construcción de polinucleótido contiene una secuencia de polinucleótido,
o un inserto, respectivamente, que codifica uno o más (poli)péptidos o proteínas. Este polinucleótido, o inserto, respectivamente, puede ser una molécula de ácido nucleico bicatenaria o monocatenaria, por ejemplo, una molécula de ADN, ADNc, ADN genómico, ARN y/o ARNm o semejantes. La molécula de ácido nucleico puede estar presente
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Con el fin de caracterizar el polinucleótido plasmídico producido, pueden usarse en general análisis de restricción, electroforesis en gel y métodos bioquímicos y de biología molecular adicionales como método analítico. Estos métodos así como métodos usados para la generación de la construcción de polinucleótido descrita anteriormente son muy conocidos y se han publicado muchos tratados sobre métodos de polinucleótidos recombinantes, incluyendo Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Press, (2000), Davis, et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986), y Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1988).
La transformación de las células huésped puede usarse para la amplificación del vector de expresión. Este vector de expresión amplificado puede usarse entonces, a su vez, por ejemplo, para inmunizar un sujeto como se describe más adelante.
Con el fin de generar anticuerpos o antisuero que se une específicamente al agente activo que está presente en la composición que se va a ensayar, en una realización preferida de la invención, se inmuniza un sujeto con la construcción de polinucleótido que comprende un polinucleótido o inserto, respectivamente, que codifica al menos una parte del agente activo. Esta inmunización directa de un sujeto adecuado con la construcción de polinucleótido da lugar a una generación más rápida de anticuerpos dirigidos frente al producto de expresión, ya que, por ejemplo, pueden evitarse etapas del proceso que podrían ser necesarias en el caso en el que la inmunización se lleve a cabo con el agente activo, por ejemplo, el (poli)péptido, en sí mismo. Dicha etapa del proceso requerida en otro caso puede ser por ejemplo la purificación laboriosa del (poli)péptido. El método diligente que ahorra tiempo según la presente invención es particularmente ventajoso en el caso en el que el agente activo sea un antígeno viral, una partícula de virus, un virosoma o cualesquiera partes de los mencionados anteriormente, ya que se puede proporcionar más rápidamente el ensayo de una vacuna segura, de alta calidad. Esto es ventajoso en particular en el caso de un brote pandémico o estacional de influenza, ya que existe la necesidad de un lanzamiento rápido de vacunas pandémicas o estacionales al mercado. Mediante la aplicación del método según la invención, pueden generarse rápidamente anticuerpos específicos dirigidos frente a, y que son homólogos a, la presente cepa pandémica o estacional de estos antígenos de influenza y usarse en la generación de preparaciones de vacuna de influenza. Pueden aplicarse situaciones similares a otras preparaciones de vacuna. Además, como la inmunización puede llevarse a cabo con una construcción de polinucleótido sintética, el riesgo de inmunizar a un animal adecuado con contaminaciones se reduce sustancialmente. Como consecuencia, el riesgo de generar anticuerpos dirigidos frente a estas contaminaciones puede evitarse o al menos reducirse, evitando por lo tanto, por ejemplo, resultados del ensayo del agente extraño falsos negativos. Esto aumentará significativamente la seguridad y calidad de las composiciones ensayadas.
El sujeto también puede inmunizarse con dos o más tipos diferentes de construcciones de polinucleótido, portando cada tipo un polinucleótido diferente. El sujeto que se va a inmunizar es un sujeto no humano, tal como un animal adecuado, por ejemplo, una oveja, una cabra, un conejo, una rata, un ratón, un perro, o una cobaya, preferiblemente, un conejo, un ratón, una cobaya o una rata, y más preferiblemente un conejo. La inmunización del animal adecuado puede llevarse a cabo siguiendo procedimientos estándar muy conocidos. En general, la construcción de polinucleótido opcionalmente purificada se introduce preferiblemente en tejido animal por varios métodos de administración, tales como inyección de la construcción de polinucleótido en disolución salina, usando una aguja hipodérmica estándar, administración por pistola de genes o inyección neumática. Además, la administración puede llevarse a cabo mediante aplicaciones tópicas, o puede llevarse a cabo una administración mediada por citofectina. El animal inmunizado produce entonces anticuerpos que son específicos para al menos partes de, o el total de, los (poli)péptidos o proteínas expresados. Los anticuerpos producidos están presentes en la sangre del sujeto inmunizado y pueden recuperarse por procedimientos estándar que son muy conocidos para los expertos en la técnica. También es posible preparar muestras de suero a partir de la sangre recogida de los sujetos inmunizados. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, dependiendo de la naturaleza del (poli)péptido o proteína que se está expresando. El término "anticuerpo monoclonal" en el significado de la presente invención indica anticuerpos que tienen la misma especificidad antigénica, es decir, anticuerpos que son todos específicos para el mismo epítopo (determinante antigénico). Esto significa, si el (poli)péptido que se está expresando corresponde a un único epítopo, entonces los anticuerpos son "anticuerpos monoclonales" en los términos de la presente invención. En el caso en el que el (poli)péptido o proteína que se está expresando comprenda más de un epítopo, los anticuerpos específicos que se están produciendo por el animal inmunizado son "anticuerpos policlonales" en los términos de la presente invención.
Después de un determinado periodo de tiempo, por ejemplo hasta 100 días y habitualmente hasta 70 días o hasta 50 días, preferiblemente alrededor de 70 días después de la inmunización, los anticuerpos específicos generados por los animales inmunizados pueden obtenerse según métodos muy conocidos para los expertos en la técnica. Preferiblemente, los animales se exanguinan y se obtienen muestras de suero que contienen los anticuerpos. En una realización preferida, el anticuerpo que se va a usar para la etapa a) está representado simplemente por una muestra de suero obtenida del animal inmunizado.
Antes de la etapa b), el agente activo se neutraliza o inactiva por unión del anticuerpo. Preferiblemente la unión es específica.
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Farmacopea Europea, 2005, capítulo (2.6.16.). Esto haría que la neutralización anterior del virus de siembra ya no sea necesaria, sin alterar la capacidad del modelo de ensayo animal para responder a agentes contaminantes. Esto incrementará adicionalmente la robustez del sistema de ensayo, reducirá el número de animales usados en al marco del ensayo según 2.6.16., y reducirá significativamente el tiempo necesario para mostrar conformidad con 2.6.16.
El anticuerpo y el agente activo pueden no obtenerse usando la misma construcción de polinucleótido, preferiblemente ADN. Una construcción de polinucleótido puede someterse a diferentes propósitos bien de generar anticuerpos frente al agente activo para ensayo de agentes adventicios según la presente invención, o para producir el agente activo en una escala preparativa, esto significa que la construcción de polinucleótido que se usa para la producción del agente activo, por ejemplo, el antígeno viral o la partícula de virus, no se usa para la generación de los anticuerpos específicos que neutralizan o inactivan este agente activo.
La expresión "no se obtiene usando la misma construcción de polinucleótido" indica que la construcción de polinucleótido se diferencia en al menos un componente estructural y/o funcional, por ejemplo, respecto a determinadas partes de la construcción completa o se ha preparado en un sistema diferente. Por ejemplo, un experto en la técnica sabe que las construcciones de polinucleótido o vectores, respectivamente, pueden diferenciarse respecto a los elementos funcionales que contienen, dependiendo de para qué se pretenda usarlas. Si un vector se usa sólo, por ejemplo, para multiplicar el polinucleótido o inserto, respectivamente, en una célula huésped adecuada, debe contener al menos un origen de replicación (ori) que permita la replicación semiindependiente del vector y el inserto comprendido en la célula huésped. Además, dichos vectores pueden contener elementos funcionales adicionales, tales como un sitio de clonación múltiple (MCS) que incluye protuberancias de nucleótidos para la inserción de un inserto, o múltiples sitios consenso de enzimas de restricción que permiten la inserción del polinucleótido. Si se desea la transcripción del inserto, el vector debe contener además una secuencia promotora. Sin embargo, estos vectores carecen típicamente de secuencias funcionales que son necesarias para la expresión del polinucleótido. En el caso en el que se desea la expresión del polinucleótido con el fin de provocar una generación aumentada de anticuerpos frente a polipéptido expresado, los vectores comprenden además una secuencia de poliadenilación que crea una cola de poliadenilación al final del pre-ARNm transcrito que protege al ARNm de exonucleasas y asegura la terminación de la transcripción y traducción. Además, la cola de poliadenilación estabiliza la producción de ARNm. Además, se favorece sólo una longitud mínima de la región no traducida (UTR) o ninguna UTR, ya que las UTR contienen características específicas que pueden impedir la transcripción o traducción. Además, estos vectores también deben comprender una secuencia Kozak en el ARNm, que ensambla el ribosoma para la traducción del ARNm.
En el caso en el que el agente activo que está presente en una composición que se va a ensayar sea un antígeno viral o una partícula de virus generada usando una construcción de polinucleótido, por lo tanto, el antígeno viral o una partícula de virus se genera usando una construcción de polinucleótido que es preferiblemente diferente de la construcción de polinucleótido usada para la inmunización de un animal adecuado, es decir, usada para la generación de anticuerpos para la etapa a) que preferiblemente se unen específicamente al producto de expresión de la secuencia de polinucleótido que está comprendida por la construcción de polinucleótido usada para la inmunización. Por ejemplo, estas construcciones de polinucleótido pueden diferenciarse respecto a la presencia de una secuencia de poliadenilación, una región no traducida o una región promotora, y más preferiblemente respecto a la presencia de una secuencia de poliadenilación.
Si de otra manera las construcciones de polinucleótido usadas para la producción del agente activo no codificaran sólo la secuencia de este agente activo sino también una secuencia que codifica una contaminación, entonces, después de la inmunización de un sujeto con esta construcción de polinucleótido, esta secuencia que codifica la contaminación además de la secuencia que codifica el agente activo se expresará en dicho sujeto. Como resultado, el sujeto inmunizado generará anticuerpos que son específicos no sólo para el agente activo, sino también para el (poli)péptido contaminante. Como consecuencia, estos anticuerpos específicos de contaminación podrían neutralizar las contaminaciones, dando lugar de esta manera a resultados del ensayo falsos negativos.
Sin embargo, mediante el uso de diferentes construcciones de polinucleótido, los resultados del ensayo falsos negativos se evitan en un ensayo de agentes extraños ya que no se generaron anticuerpos frente a este polipéptido contaminante. Como se ha descrito anteriormente, las construcciones de polinucleótido pueden diferenciarse en elementos estructurales y/o funcionales, dependiendo de para qué se pretende usarlas: En el caso en el que la construcción de polinucleótido se usa, según la presente invención, para la generación de anticuerpos específicos, se usa preferiblemente un vector de expresión, ya que se desea la expresión del polinucleótido que codifica al menos una parte del agente activo en el sujeto inmunizado. AlteARNtivamente, también es posible que las construcciones de polinucleótido se diferencien respecto al polinucleótido respectivo que codifican: Mediante la aplicación de la presente invención no es necesario, por ejemplo, que el vector de expresión usado para la inmunización de un sujeto porte la secuencia de polinucleótido que codifica el agente activo completo. Para la generación de anticuerpos específicos en un sujeto inmunizado también podría ser adecuado que el vector de expresión sólo porte una secuencia de polinucleótido que codifica una parte del agente activo, tal como que codifica una o más regiones conservadas del agente activo.
Además, en una realización preferida de la presente invención, la secuencia de polinucleótido que codifica al menos una parte del agente activo puede someterse a optimización de codones, en particular optimización de codones para
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producción o fabricación, respectivamente, de la composición farmacéutica. Preferiblemente, el ensayo puede llevarse a cabo en los lotes de siembra o en las recogidas de virus, y más preferiblemente el ensayo puede llevarse a cabo en los lotes de siembra. Además, también puede llevarse a cabo una vez o repetidamente, por ejemplo, al comienzo y/o al final del cultivo celular, o en medio. El ensayo de los agentes extraños también puede llevarse a cabo en la preparación de vacuna ya preparada, incluyendo por ejemplo el ensayo de una o más muestras de un lote de producción.
Opcionalmente, se lleva a cabo una etapa de tratamiento de la composición farmacéutica, en particular la vacuna o un producto intermedio de ésta, y/o un cultivo celular a partir del cual deriva la composición farmacéutica o la vacuna, mediante el cual el agente extraño se elimina y/o inactiva. Los métodos adecuados para la eliminación del agente extraño de la composición o cultivo celular respectivo son conocidos para el experto en la técnica y comprenden métodos de inactivación o eliminación química y/o física, por ejemplo, métodos de filtración, métodos de adsorción, tratamientos químicos, por ejemplo, por formaldehído o beta-propiolactona, tratamientos físicos tales como calentamiento y/o irradiación electromagnética (por ejemplo, tratamiento con UV-C, o irradiación con radiación gamma), o semejantes. Un beneficio adicional de los métodos útiles de la presente invención reside en que, una vez se ha demostrado la presencia de un agente extraño, la etapa de eliminación del agente extraño puede adaptarse específicamente para eliminar y/o inactivar dicho agente extraño. Por ejemplo, si el agente extraño que está presente en la composición que se va a ensayar se identifica (opcionalmente), puede usarse un método específico de eliminación y/o inactivación, que se sabe que elimina y/o inactiva particularmente dicho agente extraño. Mediante la eliminación y/o inactivación de dicho agente extraño, por ejemplo, podría evitarse el descarte del lote completo de la composición, ahorrando por lo tanto tiempo y dinero.
Además, también se describe el uso de un anticuerpo que se ha producido frente a un producto de expresión de una construcción de polinucleótido que comprende una secuencia que codifica al menos una parte del agente activo, en el que el anticuerpo se une específicamente al agente activo, para la purificación de dicho agente activo, y en el que el anticuerpo y el agente activo no se obtienen usando la misma construcción de polinucleótido. Los términos "anticuerpos que se han producido frente a un producto de expresión de una construcción de polinucleótido" y "el anticuerpo y el agente activo no se obtienen usando la misma construcción de polinucleótido" se describen anteriormente. El término "purificación" tal y como se usa en la presente memoria incluye, pero no está limitado a, purificación por afinidad, que se usa para purificar proteínas reteniéndolas en una columna a través de su afinidad para otras proteínas tales como anticuerpos (que se han producido como se describe en la presente memoria) que se han inmovilizado en un soporte sólido, por ejemplo, una columna, y separación, por ejemplo, la separación de diferentes antígenos. Preferiblemente, el agente activo es un antígeno de virus, en particular un antígeno de influenza. El uso del anticuerpo según la presente invención permite la purificación rápida y altamente específica de las partículas de virus que se originan a partir de o representan la cepa de virus cuya purificación se desea, ya que los anticuerpos usados para la purificación se producen específicamente frente a un producto de expresión de esta cepa de virus.
Preferiblemente, el anticuerpo que se usa para la purificación de un agente activo es un anticuerpo como se ha definido anteriormente. Se prefiere además que el anticuerpo que se usa para propósitos de purificación comprenda además una etiqueta de afinidad para unión a una fase sólida.
Además, se describe un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene, por ejemplo, al menos 90%, y preferiblemente, por ejemplo, al menos 95% de identidad de secuencia con el ácido nucleico mostrado en SEQ ID NO: 1 ó 2. Lo más preferiblemente, el polinucleótido tiene un ácido nucleico mostrado en SEQ ID NO: 1 ó 2. Con respecto a dicho polinucleótido, se hace referencia a la descripción anterior.
También se describe una construcción de polinucleótido que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene, por ejemplo, al menos 90%, y preferiblemente, por ejemplo, al menos 95% de identidad de secuencia con el ácido nucleico mostrado en SEQ ID NO: 1 ó 2. Lo más preferido, la construcción de polinucleótido comprende un polinucleótido que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO: 1 ó 2. Con respecto a dicho polipéptido, se hace referencia a la descripción anterior. La construcción de polinucleótido también se describe anteriormente.
También se describen células huésped procariotas o eucariotas que comprenden los polinucleótidos como se ha descrito anteriormente o una construcción de polinucleótido que comprende dicho polinucleótido. Preferiblemente, las células huésped se transforman de forma estable o transitoria con las construcciones de polinucleótido descritas anteriormente. Respecto al procedimiento de transformación se indica que la transformación puede llevarse a cabo según protocolos estándar, Sin embargo, se hace referencia a Sambrook et al. (2000), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. Otro aspecto más de la presente invención es proporcionar organismos no humanos, animales transgénicos así como microorganismos transgénicos que contienen los polinucleótidos descritos anteriormente o los vectores o construcciones de polinucleótido descritos anteriormente, respectivamente.
Preferiblemente, las células huésped o los animales o microorganismos expresan y sintetizan el polipéptido de unión a antígeno.
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recepción hasta que pudieron incubarse. La incubación puede tener lugar a 37ºC +/-2ºC en una atmósfera a 70% de humedad.
Preparación de las muestras
Los WSV pueden neutralizarse con antisuero de conejo u oveja. Puede añadirse 1% de antibióticos en disolución acuosa para evitar contaminaciones bacterianas de los huevos. Después, las muestras pueden inyectarse en los huevos con agujas de jeringa adecuadas.
Pre-incubación de los huevos
En el momento de la recepción y antes de la pre-incubación, los huevos pueden observarse por encima, y los huevos dañados pueden desecharse. Después, los huevos pueden pre-incubarse a 37ºC durante 9-11 días. Al final del periodo de pre-incubación, los huevos pueden observarse bajo luz fría con el fin de evitar calentamiento y se desecharon los huevos no fertilizados o los huevos sin embrión vivo.
Inoculación
Para el análisis de la muestra que se va a ensayar (WSV potencialmente neutralizado), pueden inocularse 30 huevos después de 9-11 días de incubación a través de la ruta alantoica, y para ensayar los controles, pueden inocularse 25 huevos:
Como control negativo, los huevos pueden inocularse con PBS suplementado con antibióticos (por ejemplo, 10 huevos), con antisuero de conejo no diluido solo (por ejemplo, 5 huevos), y con dos tipos de antisuero de oveja solo (por ejemplo, 5 huevos por tipo).
Como control positivo para el ensayo de hemaglutinación, puede usarse el virus Sendai (no diluido).
La inoculación puede llevarse a cabo como sigue:
Después de la desinfección de las cáscaras de los huevos, puede hacerse un agujero en la cáscara y pueden inocularse 0,5 ml de las muestras que se van a ensayar en 55 huevos a través de la ruta alantoica. Loa agujeros en las cáscaras de los huevos pueden llenarse, y los huevos pueden incubarse a 37ºC +/-2ºC durante 7 días.
Al final del periodo de incubación, los fluidos alantoicos de los embriones vivos pueden recogerse después de observación. En el caso se que se observen embriones muertos, el fluido de los embriones respectivos puede almacenarse a < -70ºC y 5ºC+/-3ºC (en el caso de contaminación bacteriana) para investigaciones adicionales.
Ensayos de hemaglutinación
Al final del periodo de incubación, los ensayos de hemaglutinación pueden llevarse a cabo como sigue:
Los fluidos pueden aclararse por centrifugación (2.500 g, 10 minutos), y 200 μl de los fluidos pueden distribuirse en cuatro placas de 96 pocillos (50 μl por pocillo) con el fin de realizar ensayos de hemaglutinación. Brevemente, en los pocillos de dos placas de 96 pocillos, pueden añadirse 50 μl de una disolución que contiene 0,5% de los eritrocitos (cobayas, adquiridos en Charles River Laboratory, Francia); y en las otras dos placas de 96 pocillos, pueden añadirse 50 μl de una disolución que contiene 0,5% de los eritrocitos (gallina). La mitad de las placas puede incubarse a 5ºC +/-3ºC, la otra mitad a temperatura ambiente. Después de dos horas de incubación, las placas pueden evaluarse para actividades de hemaglutinación.
Las muestras que se van a ensayar se consideran desprovistas de contaminaciones virales, en el caso en el que no pueda observarse actividad de hemaglutinación específica en los fluidos recogidos de huevos inoculados.
5. Ensayo para agentes adventicios/extraños
El suero neutralizador puede usarse entonces para ensayo de agentes adventicios. Estos ensayos pueden llevarse a cabo según los requerimientos farmacopeicos (Farmacopea Europea capítulo 2.6.16). Estos ensayos pueden llevarse a cabo en ratones adultos, ratones lactantes y cobayas según requerimientos farmacopeicos, por ejemplo según los requerimientos de la Farmacopea Europea, 2005, capítulo 2.6.16. (lote de virus de siembra). Respecto al ensayo que puede llevarse a cabo en ratones lactantes, se indica que los ratones lactantes también pueden inocularse con la composición que se va a ensayar al 1-2 día(s) de edad. Para los virus propagados en tejidos aviares, puede llevarse a cabo un ensayo de virus aviares como se describe en la Farmacopea Europea, 2005, capítulo 2.6.16. (lote de virus de siembra y recogida de virus).
5.1 Ratones adultos: ratones CD1
Pueden aclimatarse tres grupos de, por ejemplo, 10 ratones adultos CD1 (15-20 g, por ejemplo, adquiridos en Charles River Laboratory) durante al menos 48 horas. Un grupo puede recibir el suero neutralizado (30 μl inyectados intracerebralmente (ic), 500 μl inyectados intraperitonealmente (IP)), un grupo puede mantenerse en el caso de aparición de muerte en el periodo de observación y un grupo puede usarse como control negativo.
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