ES2560602T3 - Receptor de células T capaz de reconocer un antígeno de citomegalovirus - Google Patents

Abstract

Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena α de un receptor de células T (TCR) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ß de un TCR, cuyo TCR se une a un péptido de la fosfoproteína pp65 de citomegalovirus (CMV) que tiene la secuencia de aminoácidos NLVPMVATV (SEQ ID Nº 1) cuando es presentado por una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), en el que la cadena α comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que tienen las secuencias de aminoácidos siguientes: CDR1α - SSNFYA (SEQ ID Nº 4) CDR2α - MTLNGD (SEQ ID Nº 5) CDR3α - ARNTGNQFYFGTGTSLTVIPN (SEQ ID Nº 2) y en el que la cadena ß comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que tienen las secuencias de aminoácidos siguientes: CDR1ß - MNHEY (SEQ ID Nº 6) CDR2ß - SVGAGI (SEQ ID Nº 7) CDR3ß - ASSFQTGASYGYTFGSGTRLTVL (SEQ ID Nº 3).

Description

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hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos, con tal de que se conserve la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, y tirosina.

Se pueden hacer sustituciones conservativas, por ejemplo, según la Tabla siguiente. Se pueden sustituir entre sí los aminoácidos del mismo bloque de la segunda columna, y preferiblemente de la misma línea de la tercera columna:

ALIFÁTICOS

Apolares G A P

I L V

Polares -sin carga

C S T M

N Q

Polares -cargados

D E

K R

AROMÁTICOS

H F W Y

La presente invención también abarca la sustitución homóloga (sustitución se usa en la presente memoria para

10 significar el intercambio de un residuo de aminoácido existente con un residuo alternativo), es decir, la sustitución entre residuos parecidos, tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También se puede dar la sustitución no homóloga, es decir, de una clase de residuo a otra o, de manera alternativa, que implica la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (denominada Z más adelante en la presente memoria), ácido diaminobutírico-ornitina (denominado B más adelante en la presente memoria), norleucina-ornitina (denominado O

15 más adelante en la presente memoria), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

Fosfoproteína pp65 de CMV

La invención se refiere a un TCR que se une de manera específica a un péptido obtenible de la fosfoproteína de la matriz de CMV principal pp65.

La proteína de la matriz pp65 se ha identificado como un antígeno objetivo para los linfocitos T citotóxicos CD8+

20 específicos de virus (McLaughlin-Taylor et al (1994) J. Med. Virol. 43:103-110). Tiene la secuencia proporcionada a continuación:

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El péptido NLVPMVATV reconocido por el receptor de células T de la invención se muestra en rojo. 25 Moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC)

El TCR se une al péptido en forma de un complejo péptido:MHC.

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La molécula del MHC puede ser una molécula de clase I o II del MHC. El complejo puede estar en la superficie de una célula presentadora de antígenos, tal como una célula dendrítica o una célula B, o se puede inmovilizar, por ejemplo, revistiéndolo sobre una microesfera o placa.

El sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA) es el nombre del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en seres humanos, e incluye los antígenos de clase I del HLA (A, B y C) y los antígenos de clase II del HLA (DP, DQ, y DR).

El TCR de la presente invención puede estar, por ejemplo, restringido por HLA-A*0201.

Reducción de emparejamientos incorrectos

El TCR de la invención se puede expresar en una célula T para alterar su especificidad hacia el antígeno. Las células T transducidas con el TCR expresan al menos dos cadenas alfa de TCR y dos cadenas beta de TCR. Mientras las cadenas alfa/beta del TCR endógeno forman un receptor que es auto-tolerante, las cadenas alfa/beta del TCR introducido forman un receptor con una especificidad definida hacia el antígeno objetivo concreto.

Sin embargo, se pueden dar emparejamientos incorrectos entre las cadenas endógenas y las introducidas para formar receptores nuevos, que podrían exhibir especificidades inesperadas hacia auto-antígenos, y provocar un daño autoinmunitario al transferirlas a los pacientes.

Por lo tanto, se han explorado varias estrategias para reducir el riesgo de emparejamientos incorrectos entre las cadenas endógenas y las del TCR introducido. Las mutaciones de la interfase alfa/beta de TCR es una estrategia empleada en la actualidad para reducir los emparejamientos incorrectos indeseados.

Por ejemplo, la introducción de una cisteína adicional en los dominios constantes de la cadena alfa y beta permite la formación de un enlace disulfuro adicional, y mejora el emparejamiento de las cadenas introducidas a la vez que reduce el emparejamiento incorrecto con las cadenas de tipo natural.

El TCR de la presente invención puede comprender, por lo tanto, una cisteína adicional en la cadena α y en la cadena β, que forman un enlace disulfuro adicional entre las dos cadenas, lo que produce dos enlaces disulfuro en total.

Las cisteínas adicionales se muestran en rojo en la secuencia de aminoácidos mostrada anteriormente en la Sección "Secuencias de las CDR".

Secuencia de nucleótidos

La invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor TCR de la invención o una parte del mismo, tal como la cadena α y/o la cadena β.

La secuencia de nucleótidos puede ser de cadena doble o simple, y puede ser ARN o ADN.

Se pueden optimizar los codones de la secuencia de nucleótidos. Las diferentes células difieren en su uso de codones particulares. Esta tendencia de los codones corresponde a una tendencia en la abundancia relativa de los tARNs particulares en el tipo celular. Mediante la alteración de los codones en la secuencia, de forma que se adapten para coincidir con la abundancia relativa de los tARNs correspondientes, es posible incrementar la expresión.

Muchos virus, que incluyen el VIH y otros lentivirus, usan un gran número de codones poco frecuentes, y cambiando estos para que correspondan a los codones de mamífero usados habitualmente, se puede conseguir una expresión incrementada de los componentes de empaquetamiento en las células productoras mamíferas. Las tablas de uso de codones se conocen en la técnica para las células mamíferas, así como para una diversidad de otros organismos.

La optimización de codones también puede implicar la eliminación de motivos de inestabilidad del mARN y de sitios crípticos de corte y empalme.

Las secuencias de nucleótidos comprenden todo o parte de la secuencia siguiente (SEQ ID Nº 9) o una variante de la misma que tiene al menos un 80%, 90%, o 95% de identidad de secuencia de aminoácidos:

Sec. codificante de CMVa18-p2A-Vb13:

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La célula puede derivar de una célula T aislada de un sujeto. La célula T puede ser parte de una población de células mezcladas aisladas del sujeto, tal como una población de linfocitos de sangre periférica (PBL). Las células T dentro de la población de PBL se pueden activar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 y CD28.

La célula T puede ser una célula T auxiliar CD4+ o una célula T citotóxica CD8+. La célula puede estar en una población mixta de células T auxiliares CD4+/células T citotóxicas CD8+. La activación policlonal, por ejemplo mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 opcionalmente en combinación con anticuerpos anti-CD28, desencadenará la proliferación de las células T CD4+ y CD8+, pero puede desencadenar también la proliferación de células T reguladoras CD4+25+. La transferencia de genes de TCR en las células T reguladoras es indeseable, ya que puede inhibir la actividad antiviral de las células T citotóxicas y auxiliares modificadas genéticamente. La población CD4+CD25+ se puede reducir, por lo tanto, antes de la transferencia de genes de TCR.

La presente invención proporciona también un método para producir una célula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un TCR de la invención que comprende la etapa de transfectar o transducir una célula in vitro o ex vivo con un vector según la invención.

La célula se puede aislar del sujeto al que se va a transferir de manera adoptiva la célula genéticamente modificada. A este respecto, la célula se puede producir aislando una célula T de un sujeto, opcionalmente activando la célula T, con la transferencia de genes de TCR ex vivo y la inmunoterapia posterior del sujeto mediante la transferencia adoptiva de las células transducidas con el TCR.

De manera alternativa, la célula se puede aislar de un sujeto diferente, de forma que sea alogénica. La célula se puede aislar de un sujeto donante. Por ejemplo, si el sujeto se está sometiendo a un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (Alo-HSCT) o un trasplante de órganos sólidos o trasplante de células o terapia con células madre, la célula puede derivar del donante, del cual derivan los órganos, tejidos o células. El donante puede ser un donante seronegativo para CMV. El donante y el sujeto que se somete al tratamiento pueden ser hermanos. El donante puede ser seronegativo para CMV.

De manera alternativa, la célula puede ser, o derivar de, una célula madre, tal como una célula madre hematopoyética (HSC). La transferencia génica en HSCs no conduce a la expresión de TCR en la superficie celular, ya que las células madre no expresan las moléculas CD3. Sin embargo, cuando las células madre se diferencian hasta los precursores linfoides que migran hacia el timo, el inicio de la expresión de CD3 conduce a la expresión en la superficie del TCR introducido en los timocitos.

Una ventaja de esta aproximación es que las células T maduras, una vez producidas, expresan solamente el TCR introducido y poco o nada de las cadenas del TCR endógeno, porque la expresión de las cadenas del TCR introducido inhibe el reordenamiento de los segmentos génicos del TCR endógeno para formar los genes alfa y beta del TCR funcional.

Un beneficio adicional es que las células madre modificadas genéticamente son una fuente continua de células T maduras con la especificidad antigénica deseada. La célula puede ser, por lo tanto, una célula madre modificada genéticamente, que, tras la diferenciación, produce una célula T que expresa un TCR del primer aspecto de la invención. La presente invención también proporciona un método para producir una célula T que expresa un TCR del primer aspecto de la invención induciendo la diferenciación de una célula madre que comprende una secuencia de nucleótidos según el segundo aspecto de la invención.

Una desventaja de la aproximación de células madre es que los TCRs con la especificidad deseada pueden eliminarse durante el desarrollo hasta células T en el timo, o pueden inducir tolerancia al expresarse en células T periféricas. Otro posible problema es el riesgo de mutagénesis por inserción en las células madre.

Enfermedades asociadas a CMV

En la presente memoria se describe un método para tratar y/o prevenir una enfermedad asociada a CMV en un sujeto que comprende la etapa de transferencia adoptiva de una célula T específica de CMV al sujeto.

La célula T específica de CMV puede reconocer la fosfoproteína de la matriz de CMV principal pp65. La célula T específica de CMV puede reconocer el epítopo NLVPMVATV.

El TCR puede estar, por ejemplo, restringido por HLA-A*01, A*02, A*03, A*11 o A*24. El TCR puede estar restringido por HLA-A*0201.

El término "prevenir" pretende referirse a evitar, retrasar, obstaculizar o dificultar la contracción de la enfermedad. El tratamiento puede prevenir o reducir, por ejemplo, la probabilidad de la infección y/o reactivación de CMV.

"Tratar", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cuidar de un sujeto enfermo, para mejorar, curar o reducir los síntomas de la enfermedad, o reducir o detener la progresión de la enfermedad. También se refiere al tratamiento que hace al sujeto viralmente infectado no infeccioso para otros sujetos.

El CMV es un herpes virus humano ubicuo que infecta aproximadamente a un 50% de los individuos normales. En la mayoría de casos, la respuesta inmunitaria es capaz de controlar la infección aguda reconociendo los antígenos derivados de CMV. El virus persiste después durante la vida del hospedador en un estado latente. El crecimiento se impide por los mecanismos efectores del sistema inmunitario, que incluyen anticuerpos neutralizantes hacia las proteínas de la membrana del virus, células T auxiliares y citotóxicas específicas de CMV restringidas por HLA, y efectores sin restricciones por el MHC.

La infección por CMV es importante para ciertos grupos de alto riesgo. Las áreas principales de riesgo de infección incluyen los fetos y lactantes y los individuos inmunodeprimidos, tales como los receptores de trasplantes de órganos, personas con leucemia, o las infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En las personas infectadas por VIH, el CMV se considera una infección característica del SIDA, que indica que el recuento de células T ha caído hasta niveles bajos.

Los médicos reconocen tres formas clínicas de CMV. Estas incluyen: (1) Enfermedad por inclusión de CMV del recién nacido, que oscila en gravedad desde la ausencia de síntomas hasta ser una enfermedad grave que afecta al hígado, bazo y sistema nervioso central, con posibles discapacidades del desarrollo; (2) Infección por CMV adquirida aguda, que es similar a la mononucleosis infecciosa y se caracteriza por fiebre, malestar, dolor esquelético-muscular y ausencia de faringitis; (3) CMV en personas inmunodeprimidas (por ejemplo, personas que se han sometido a trasplantes de órganos o que tienen VIH) con un riesgo incrementado de infecciones oculares complicadas (retinitis por CMV), CMV gastrointestinal, y encefalitis.

Los tipos más habituales de infecciones por CMV se pueden agrupar como sigue:

 Feto/Lactante:

○

Infección por CMV congénita

○

Infección por CMV perinatal

 Paciente inmunocompetente:

○

Mononucleosis por CMV

○

CMV tras transfusión

 Paciente inmunodeprimido:

○

Neumonitis por CMV

○

Enfermedad GI por CMV

○

Retinitis por CMV

El sujeto puede ser un sujeto humano. En particular, el sujeto puede ser un feto o un recién nacido, o un individuo inmunodeprimido. Los individuos inmunodeprimidos incluyen los sujetos con leucemia o SIDA o un individuo inmunodeprimido, tal como un receptor de trasplantes.

El sujeto puede ser positivo para HLA-A*0201. El sujeto puede ser seropositivo para CMV.

El método se puede usar en combinación con las terapias antivirales tradicionales, tales como el uso de fármacos antivirales (Ganciclovir™, Foscarnet™).

Alo-HSCT

El método descrito en la presente memoria se puede usar para tratar y/o prevenir la reactivación de CMV latente tras un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

El trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) es el trasplante de células madre sanguíneas derivadas de la médula ósea o sangre. El trasplante de células madre se lleva a cabo la mayoría de las veces para personas con enfermedades de la sangre, médula ósea, o ciertos tipos de cáncer.

Con la disponibilidad de los factores de crecimiento de células madre GM-CSF y G-CSF, la mayoría de procedimientos de trasplante de células madre hematopoyéticas se llevan a cabo actualmente mediante el uso de células madre recogidas de la sangre periférica, en vez de la médula ósea. La recogida de células madre de sangre periférica proporciona un injerto mayor, no requiere que el donante se someta a anestesia general para recoger el injerto, da como resultado un tiempo más corto para llevar a cabo el injerto, y puede proporcionar una tasa de recidiva inferior a largo plazo.

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retroviral. Las células T específicas de CMV derivadas del donante se usan después para la inmunoterapia adoptiva para un receptor de Alo-HSCT.

El método puede implicar la transferencia adoptiva de células T específicas de CMV CD8+ y CD4+, por ejemplo en forma de una población mixta. Se cree que la provisión de la cooperación de las células T CD4+ mejora la respuesta de CTL y la hace más eficaz. Es posible redirigir la especificidad de una célula T auxiliar CD4+ mediante el uso de TCR específicos de CMV restringidos por la clase I del MHC. También puede ser necesario transferir el gen CD8 a la célula T auxiliar si el TCR es dependiente de CD8.

Se usa un ensayo basado en PCR cuantitativa como parte de la práctica clínica rutinaria para determinar la carga viral de CMV tras Alo-HSCT. Cuando el paciente o el donante son seropositivos para CMV antes del trasplante, se ha demostrado que más del 60% de los pacientes se hacen positivos por PCR en cierto momento tras el trasplante con acondicionamiento mieloablativo, y hasta el 85% con acondicionamiento de intensidad reducida que incorpora la eliminación de células T. Este ensayo se usa como un indicador para el inicio de la terapia farmacológica antiviral.

Se puede usar el mismo ensayo o un ensayo equivalente para monitorizar la carga viral con respecto al método descrito en la presente memoria:

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antes del tratamiento, para determinar el momento adecuado para el tratamiento; y/o

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después del tratamiento, para analizar el efecto de las células T específicas de CMV transferidas de manera adoptiva a monitorizar.

La invención se describirá adicionalmente a continuación por medio de los Ejemplos, que pretenden servir para ayudar a alguien de experiencia habitual en la técnica a llevar a cabo la invención, y no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 -Construcción de un vector retroviral para administrar genes de TCR específicos de CMV

Una cuestión importante para la terapia génica de TCR es la selección de los vectores capaces de expresarse a nivel elevado y mantenido en los linfocitos T. Son necesarios niveles de expresión elevados para permitir que el TCR introducido compita con el TCR endógeno por una reserva limitada de moléculas CD3. Los requisitos adicionales para la terapia génica de TCR son (i) una eficacia de transducción de hasta un 30% con una manipulación ex vivo mínima, (ii) la ausencia de vectores competentes de replicación, y (iii) la expresión estable del TCR a lo largo del tiempo para permitir el desarrollo de memoria.

En este estudio se usó el esqueleto del vector MP71 con una secuencia de TCR con optimización de los codones y una cisteína adicional en cada región constante de las cadenas alfa y beta para aumentar la expresión génica y minimizar los emparejamientos incorrectos con las cadenas del TCR endógeno. El esqueleto del vector MP71 se ha descrito previamente (Hildigner et al (1999) J. Virol. 73:4083-4089). La LTR del vector MP71 deriva del virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), y la secuencia líder (LS) deriva del virus de células madre embrionarias de ratón (MESV). La secuencia líder se diseñó para incrementar la seguridad del vector en las aplicaciones clínicas. Se han eliminado todos los codones ATG para disminuir el riesgo de posible producción de proteínas/péptidos y reducir la probabilidad de recombinación homóloga con secuencias retrovirales endógenas. La expresión de los genes insertados en MP71 se incrementa mediante un sitio mínimo aceptor de corte y empalme en el extremo 3' de la secuencia líder. El vector MP71 original contuvo un elemento de respuesta de la hepatitis de marmota (WPRE) de longitud completa para aumentar la expresión génica a nivel post-transcripcional. El vector MP71 que contenía un WPRE truncado con codones ATG mutados se usa actualmente en Alemania en un ensayo clínico que usa células T modificadas genéticamente en pacientes de VIH.

Los presentes inventores han modificado adicionalmente el vector MP71 y las variantes ensayadas sin ninguna secuencia de WPRE. El vector comprende los genes alfa y beta de TCR de CMV, unidos por medio de una secuencia de teschovirus porcino 2A autoescindible interna, como se muestra en la Figura 1. Los genes de TCR alfa y beta se sintetizaron basándose en el uso de TCR dominante en los clones de CTL específicos de pp65 de CMV restringido por HLA-A*0201. La secuencia de aminoácidos para el producto TCR alfa-2A-TCR beta se proporciona como SEQ ID Nº 8, y su secuencia codificante se proporciona como SEQ ID Nº 9.

Ejemplo 2 -Producción de células T humanas transducidas con TCR específicas de pp65 de CMV

Se transdujeron genes de receptores de células T (TCR) humanos específicos de CMV en células T humanas mediante el uso de vectores retrovirales que portaban los genes de TCR deseados. Brevemente, se transfectaron células de empaquetamiento anfotrópicas que expresaban los genes gag-pol retrovirales con los vectores retrovirales de TCR especificados mediante el uso del método de precipitación con fosfato cálcico. Tras la transfección retroviral, el medio de transfección se cambió por medio de células T humanas para la recogida del sobrenadante retroviral. El sobrenadante retroviral recogido que contenía las partículas virales que expresaban los genes de TCR deseados se usó después para infectar/transducir células T humanas activadas. 24 horas más tarde,

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