ES2557553T3 - Forma de base libre cristalina de un compuesto de bifenilo - Google Patents

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Abstract

Una base libre cristalina del éster 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4-ílico del ácido bifenil-2-ilcarbámico caracterizada por un patrón de difracción de rayos X de polvo que comprende picos de difracción a valores 2θ de 6,6 ± 0,1, 13,1 ± 0,1, 18,6 ± 0,1, 19,7 ± 0,1 y 20,2 ± 0,1 y que tiene cinco o más picos de difracción adicionales a valores 2θ seleccionados de 8,8 ± 0,1, 10,1 ± 0,1, 11,4 ± 0,1, 11,6 ± 0,1, 14,8 ± 0,1, 15,2 ± 0,1, 16,1 ± 0,1, 16,4 ± 0,1, 16,9 ± 0,1, 17,5 ± 0,1, 18,2 ± 0,1, 19,3 ± 0,1, 19,9 ± 0,1, 20,8 ± 0,1, 21,1 ± 0,1, 21,7 ± 0,1 y 22,3 ± 0,1.

Description

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DESCRIPCION
Forma de base libre cristalina de un compuesto de bifenilo Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una novedosa forma cristalina de un compuesto de bifenilo, que se espera que sea util para tratar trastornos pulmonares. La invencion tambien se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden el compuesto cristalino o preparadas a partir de tal compuesto, procesos y productos intermedios para preparar tal compuesto cristalino, y encuentra utilidad en metodos de uso de tal compuesto para tratar un trastorno pulmonar.
Estado de la tecnica
La publicacion de patente de EE.UU. N° 2005/0203133 a Mammen et al. desvelan novedosos compuestos de bifenilo que se espera que sean utiles para tratar trastornos pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y asma. En particular, el compuesto ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1- ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico se describe espedficamente en la presente solicitud como que posee actividad antagonista o anticolinergica de receptores muscannicos.
La estructura qmmica del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico se representa por la formula I:
imagen1
El compuesto de formula I se ha nombrado usando el software comercialmente disponible AutoNom (MDL, San Leandro, California).
Agentes terapeuticos utiles para tratar trastornos pulmonares o respiratorios se administran ventajosamente directamente en las vfas respiratorias por inhalacion. A este respecto, se han desarrollado varios tipos de dispositivos de inhalacion farmaceuticos para administrar agentes terapeuticos por inhalacion que incluyen inhaladores de polvo seco (DPI), inhaladores de dosis medida (MDI) e inhaladores nebulizadores. Cuando se preparan composiciones farmaceuticas y formulaciones para su uso en tales dispositivos, es altamente deseable tener una forma cristalina del agente terapeutico que no sea ni higroscopica ni delicuescente y que tenga un punto de fusion relativamente alto que permita asf que el material se micronice sin descomposicion significativa. Aunque se ha informado de formas de base libre cristalina del compuesto de formula I en la publicacion de patente de EE.UU. N° 2007/0112027 a Axt et al. como la forma I y la forma II, la forma de base libre cristalina de la presente invencion tiene propiedades diferentes y particularmente utiles, que incluyen un mayor punto de fusion.
Resumen de la invencion
La invencion se refiere a una base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1- ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico, designada la forma III, que se caracteriza por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a 28 valores de 6,6±0,1, 13,1±0,1, 18,6±0,1, 19,7±0,1 y 20,2±0,1; y adicionalmente caracterizada por tener cinco o mas picos de difraccion adicionales a valores 20 seleccionados de 8,8±0,1, 10,1±0,1, 11,4±0,1, 11,6±0,1, 14,8±0,1, 15,2±0,1, 16,1±0,1, 16,4±0,1, 16,9±0,1, 17,5±0,1, 18,2±0,1, 19,3±0,1, 19,9±0,1, 20,8±0,1, 21,1±0,1, 21,7±0,1 y 22,3±0,1.
Tambien se describe, pero no se reivindica en el presente documento, una base libre cristalina de ester 1-(2-{[4-(4- carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico, designada la forma IV, que se caracteriza por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a valores 20 de 6,6±0,1, 13,1±0,1, 18,6±0,1, 19,7±0,1 y 20,2±0,1; y adicionalmente caracterizada por tener cinco o mas picos de difraccion adicionales a valores 20 seleccionados de 10,6±0,1, 15,0±0,1, 16,0±0,1, 17,3±0,1, 17,7±0,1, 20,9±0,1, 21,4±0,1,22,6±0,1, 24,6±0,1 y 27,8±0,1.
Otro aspecto de la invencion se refiere a la composicion farmaceutica que comprende la base libre cristalina de la invencion y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Todavfa otro aspecto de la invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden la base libre cristalina de la invencion en combinacion con uno o
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varios de otros agentes terapeuticos. Por consiguiente, en una realizacion, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende (a) un vehmulo farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de la base libre cristalina de la invencion; y (b) una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente seleccionado de un agente antiinflamatorio esteroideo tal como un corticosteroide; un agonista de receptores p2-adrenergicos; un inhibidor de la fosfodiesterasa-4; o una combinacion de los mismos; en el que la base libre cristalina y el agente se formulan juntos o por separado. Cuando el agente se formula por separado, puede incluirse un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Normalmente, la base libre cristalina de la invencion y el agente estaran presentes en cantidades terapeuticamente eficaces.
Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una solucion salina isotonica acuosa que comprende la base libre cristalina de la invencion, en la que la disolucion tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4 a 6. En una realizacion particular, una formulacion de nebulizador acuosa se tampona con tampon citrato a un pH de aproximadamente 5.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un dispositivo de administracion de farmaco que comprende un inhalador de polvo seco que contiene una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo farmaceuticamente aceptable y la base libre cristalina de la invencion.
El compuesto de formula I tiene actividad de antagonista de receptores muscarmicos. Por consiguiente, se espera que una base libre cristalina del compuesto de formula I tenga la misma actividad, y asf encuentre utilidad en el tratamiento de trastornos pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva cronica. Asf, otro aspecto de la invencion encuentra utilidad en un compuesto I para su uso en un metodo de tratamiento de un trastorno pulmonar que comprende administrar a un paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de la base libre cristalina de la invencion. Todavfa otro aspecto de la invencion encuentra utilidad en un compuesto I para su uso en un metodo de produccion de broncodilatacion en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad productora de broncodilatacion de la base libre cristalina de la invencion. En una realizacion, el compuesto se administra por inhalacion. La invencion tambien encuentra utilidad en un compuesto I para su uso en un metodo de tratamiento de enfermedad pulmonar obstructiva cronica o asma que comprende administrar a un paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de la base libre cristalina de la invencion. Otro aspecto de la invencion encuentra utilidad en un compuesto I para su uso en un metodo de antagonizacion de un receptor muscarmico en un marnffero que comprende administrar al mamffero una cantidad terapeuticamente eficaz de la base libre cristalina de la invencion.
La invencion tambien se refiere a procesos de preparacion de la forma de base libre cristalina III del compuesto de formula I. La invencion tambien proporciona un proceso de purificacion del compuesto de formula I que comprende formar la forma de base libre cristalina III del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1- ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico. La invencion se refiere ademas a productos preparados por el proceso descrito en el presente documento.
La invencion tambien se refiere a la base libre cristalina del compuesto de formula I en la forma III en una forma micronizada; y a composiciones farmaceuticas que comprenden un vehmulo farmaceuticamente aceptable y una base libre cristalina micronizada de la invencion.
La invencion tambien se refiere a la forma de base libre cristalina III del compuesto de formula I para su uso en terapia o como un medicamento. Adicionalmente, la invencion se refiere al uso de la base libre cristalina de la invencion para la fabricacion de un medicamento; especialmente para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno pulmonar o para antagonizar un receptor muscarmico en un mairnfero.
Breve descripcion de los dibujos
Diversos aspectos de la presente invencion se ilustran por referencia a los dibujos adjuntos.
La FIG. 1 muestra un patron de difraccion de rayos X de polvo (PXRD) de la forma III de la base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico (el compuesto de formula I). Otras caractensticas de la forma III se presentan en la FIG. 4, que muestra un termograma de calorimetna diferencial de barrido (DSC) y la FIG. 6, que muestra un trazo de analisis termogravimetrico (TGA).
La FIG. 2 muestra un patron de PXRD de la forma IV de la base libre cristalina del compuesto de formula I. La FIG. 3 muestra una transparencia de los patrones de PXRD de la forma III y la forma IV. Otras caractensticas de la forma IV se presentan en la FIG. 5, que muestra un termograma de DSC, y la FIG. 7, que muestra un trazo de TGA.
Descripcion detallada de la invencion
Sorprendentemente, se ha encontrado que la forma de base libre cristalina III de la invencion no es delicuescente, incluso cuando se expone a humedad atmosferica. Adicionalmente, la forma de base libre cristalina de la invencion tiene niveles aceptables de higroscopicidad y punto de fusion aceptable. Por ejemplo, la forma de base libre
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cristalina III tiene un punto de fusion de aproximadamente 125 °C. La forma IV de la base libre cristalina tiene un punto de fusion de aproximadamente 119 °C.
Entre otros usos, la forma de base libre cristalina de la invencion es util para preparar composiciones farmaceuticas que se espera que tengan utilidad en el tratamiento de trastornos pulmonares. Por consiguiente, un aspecto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un vehmulo farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de la base libre cristalina de la invencion.
Definiciones
Cuando se describen los compuestos, composiciones, metodos y procesos de la invencion, los siguientes terminos tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario. Adicionalmente, como se usa en el presente documento, las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyen las formas en plural correspondientes, a menos que el contexto de uso dicte claramente de otro modo. Los terminos “que comprende”, “que incluye” y “que tiene” pretenden ser inclusivos y significa que puede haber elementos adicionales distintos de los elementos enumerados. Todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reaccion, etc., usados en el presente documento deben entenderse que estan modificados en todos los casos por el termino “aproximadamente”, a menos que se indique lo contrario. Por consiguiente, los numeros expuestos en el presente documento son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener por la presente invencion. Al menos, y no como un intento por limitar la aplicacion de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada numero debe interpretarse al menos en vista de los dfgitos significativos informados y aplicando tecnicas de redondeo comunes.
Tanto la forma III como la forma IV son polimorfos cristalinos de base libre. Si se hace referencia a “una base libre cristalina de la invencion”, se entiende que el termino incluye solo la forma III.
Como se usa en el presente documento, la expresion “que tiene la formula” o “que tiene la estructura” no pretende ser limitante y se usa de la misma forma que comunmente se usa el termino “que comprende”.
El termino “farmaceuticamente aceptable” se refiere a un material que no es biologicamente o de otro modo inaceptable cuando se usa en la invencion. Por ejemplo, el termino “vehmulo farmaceuticamente aceptable” se refiere a un material que puede incorporarse en una composicion y administrarse a un paciente sin causar efectos biologicos inaceptables o interaccionar inaceptablemente con otros componentes de la composicion. Tales materiales farmaceuticamente aceptables normalmente han cumplido los patrones requeridos de pruebas toxicologicas y de fabricacion, e incluyen aquellos materiales identificados como principios inactivos adecuados por la Agencia Estadounidense del Medicamento.
El termino “cantidad terapeuticamente eficaz” significa una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente en necesidad del mismo, es decir, la cantidad de farmaco necesaria para obtener el efecto terapeutico deseado. Por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz para tratar un trastorno pulmonar es una cantidad de compuesto necesaria para, por ejemplo, reducir, suprimir, eliminar o prevenir los smtomas del asma o la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (“EPOC”), o para tratar la causa subyacente del asma o la EPOC. En una realizacion, una cantidad terapeuticamente eficaz es que cantidad necesaria para producir broncodilatacion. Por otra parte, el termino “cantidad eficaz” significa una cantidad suficiente para obtener un resultado deseado, que puede no ser necesariamente un resultado terapeutico. Por ejemplo, cuando se estudia un sistema que comprende un receptor muscarmico, una “cantidad eficaz” puede ser la cantidad necesaria para antagonizar el receptor.
El termino “tratar” o “tratamiento”, como se usa en el presente documento, significa el tratar o tratamiento de una enfermedad o afeccion medica (tal como EPOC) en un paciente tal como un marnffero (particularmente un ser humano) que incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad o afeccion medica, es decir, tratamiento profilactico de un paciente; (b) mejorar la enfermedad o afeccion medica tal como eliminando o causando la regresion de la enfermedad o afeccion medica en un paciente; (c) suprimir la enfermedad o afeccion medica tal como ralentizar o detener el desarrollo de la enfermedad o afeccion medica en un paciente; o (d) aliviar los smtomas de la enfermedad o afeccion medica en un paciente. Por ejemplo, el termino “tratar EPOC” incluina prevenir que se produzca EPOC, mejorar EPOC, suprimir EPOC y aliviar los smtomas de EPOC. El termino “paciente” pretende incluir aquellos mairnferos, tales como seres humanos, que estan en necesidad de tratamiento o prevencion de enfermedad o que actualmente estan siendo tratados para la prevencion de la enfermedad o tratamiento de una enfermedad espedfica o afeccion medica. El termino “paciente” tambien incluye sujetos de prueba en los que los compuestos de la invencion estan siendo evaluados o sujetos de prueba que se usan en un ensayo, por ejemplo, un modelo animal.
Smtesis
La forma de base libre cristalina de la invencion puede sintetizarse a partir de materiales de partida facilmente disponibles como se describe mas adelante y en los ejemplos. Aunque puede haber varios metodos que pueden usarse para producir cada forma de base libre cristalina, se observa, sin embargo, que el contenido cristalino,
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ademas del habito de los cristales (tamano y forma), puede variar, basandose parcialmente en el metodo de preparacion, ademas de en la composicion del disolvente.
Se apreciara que aunque se facilitan condiciones de proceso espedficas (es decir, temperatures de cristalizacion, tiempos, relaciones molares de reactantes, disolventes, presiones, etc.), tambien pueden usarse otras condiciones de proceso, a menos que se establezca de otro modo. En algunos casos se realizaron reacciones o cristalizaciones a temperatura ambiente y no se tomo medicion de temperatura real. Se entiende que la temperatura ambiente puede tomarse para significar una temperatura dentro del intervalo comunmente asociado a la temperatura ambiente en un entorno de laboratorio, y normalmente estara en el intervalo de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 50 °C. En otros casos se realizaron reacciones o cristalizaciones a temperatura ambiente, y la temperatura se midio y registro en realidad. Todos los pesos, volumenes y equivalentes son con respecto al material de partida ester 1-(2- {[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico (o forma de sal).
Generalmente, las cristalizaciones se realizan en un diluyente inerte o sistema de disolventes adecuado, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, isopropanol, isobutanol, acetato de etilo, acetonitrilo, diclorometano, metil f-butil eter, y similares, y mezclas de los mismos. Tras completarse cualquiera de las anteriores cristalizaciones, los compuestos cristalinos pueden aislarse de la mezcla de reaccion por cualquier medio convencional tal como precipitacion, concentracion, centrifugacion y similares.
El ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico, ademas de sus sales tales como la sal de difosfato, empleado en la invencion puede prepararse facilmente a partir de materiales de partida y reactivos comercialmente disponibles usando los procedimientos descritos en los ejemplos, o usando los procedimientos descritos en la publicacion de patente de EE.UU. N° 2005/0203133 a Mammen et al. y la publicacion de patente de EE.UU. N° 2007/0112027 a Axt et al.
Las relaciones molares descritas en los metodos de la invencion pueden determinarse facilmente por diversos metodos disponibles para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, tales relaciones molares pueden determinarse facilmente por rMn 1H. Alternativamente, pueden usarse analisis elemental y metodos de HPLc para determinar la relacion molar.
Forma III
La base libre cristalina de la forma III del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoil-piperidin-1- ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico puede prepararse a partir del ester o la sal de difosfato del ester.
En una realizacion, la base libre cristalina de forma III se prepara poniendo en contacto el ester 1-(2-{[4-(4- carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]-metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico con acetonitrilo. Normalmente, la relacion de miligramos del ester con respecto a los mililitros totales de acetonitrilo es aproximadamente 100:1, anadiendose el acetonitrilo en dos etapas. Generalmente, esta reaccion se realiza mientras que se cicla repetidamente a traves de un intervalo de temperatura de 0-40 °C. Los solidos se afslan entonces por filtracion a vacfo y se secan.
En otra realizacion, la base libre cristalina de la forma III se prepara usando un cristal semilla de la base libre cristalina de la forma III y la sal de difosfato del ester. Este metodo implica: a) formar un cristal semilla de la forma III de la base libre cristalina; b) disolver la sal de difosfato del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1- ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico en acetato de isopropilo y agua para formar una disolucion; c) y anadir el cristal semilla a la disolucion. Mas espedficamente, la sal de difosfato del ester (1 peso) se suspende en acetato de isopropilo (17,5 vol) y agua (10 vol) a 20 ± 3 °C bajo nitrogeno. La suspension se calienta a 53 ± 3 °C y se anade NaOH 10 M (0,5 vol). La mezcla se agita a esa temperatura durante un tiempo corto, entonces las fases se separan y se elimina la fase acuosa basica. Se anade agua (5 vol) a la fase organica, y se agita. Las fases se separan y la fase acuosa se elimina. Se anade acetato de isopropilo (17,5 vol) y se recogen aproximadamente 10 volumenes de destilado por destilacion atmosferica. Esta etapa se repite con acetato de isopropilo adicional (10 vol). Despues de la segunda destilacion, la temperatura de la disolucion transparente se reduce a 53 ± 3 °C, luego se siembra con una suspension de la forma III de la base libre cristalina (0,005 peso; 0,5 % en peso) en acetato de isopropilo (0,08 vol). La suspension resultante se agita a 53 ± 3 °C durante al menos 2 horas, luego se enfna a 10 ± 3 °C a una tasa de enfriamiento aproximada de 0,19 °C/min. La suspension se agita a 10 ± 3 °C durante al menos 2 horas y luego se recoge por filtracion. La torta de filtracion resultante se lava con acetato de isopropilo (2 x 3 volumenes) y entonces el producto se seca dando la base libre cristalina de la forma III.
Forma IV
La base libre cristalina de la forma IV puede prepararse usando un cristal semilla de la base libre cristalina de la forma III. Este metodo implica: a) formar un cristal semilla de la forma de base libre cristalina III; b) disolver la forma III de la base libre cristalina en acetonitrilo para formar una disolucion; c) y anadir el cristal semilla a la disolucion.
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Normalmente, la relacion de peso de semilla con respecto a ester esta en el intervalo de aproximadamente 2:250. Normalmente, la relacion de gramos de la forma III de la base libre cristalina con respecto a mililitros totales de acetonitrilo esta dentro del intervalo de aproximadamente 2:10 a 3:30, siendo 2,5:16 un intervalo. El acetonitrilo se anade normalmente en varias alfcuotas. Generalmente, esta reaccion se realiza mientras que se cicla repetidamente a traves de un intervalo de temperatura de 0-40 °C. Entonces se afslan los solidos por filtracion a vado y se secan.
Propiedades cristalinas
Como es muy conocido en el campo de la difraccion de rayos X de polvo, las alturas de pico relativas de los espectros de difraccion de rayos X de polvo (PXRD) dependen de varios factores referentes a la preparacion de muestras y geometna del instrumento, mientras que las posiciones de picos son relativamente insensibles a los detalles experimentales. Se obtuvieron patrones de PXRD para la forma III y la forma IV de la base libre cristalina como se expone en el Ejemplo 5. Asf, en una realizacion, el compuesto cristalino de la invencion se caracteriza por un patron de PXRD que tiene ciertas posiciones de picos.
Cada forma de base libre cristalina presenta un patron de PXRD diferentes, pero con ciertos picos comunes. Ambas formas de base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico se caracterizan por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a valores 20 seleccionados de 6,6 ± 0,1, 13,1 ± 0,1, 18,6 ± 0,1, 19,7 ± 0,1 y 20,2 ± 0,1.
La forma III de la base libre cristalina se caracteriza por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a valores 20 de 6,6 ± 0,1, 13,1 ± 0,1, 18,6 ± 0,1, 19,7 ± 0,1 y 20,2 ± 0,1; y adicionalmente caracterizada por tener cinco o mas picos de difraccion adicionales a valores 20 seleccionados de 8,8 ± 0,1, 10,1 ± 0,1, 11,4 ± 0,1, 11,6 ± 0,1, 14,8 ± 0,1, 15,2 ± 0,1, 16,1 ± 0,1, 16,4 ± 0,1, 16,9 ± 0,1, 17,5 ± 0,1, 18,2 ± 0,1, 19,3 ± 0,1, 19,9 ± 0,1,20,8 ± 0,1, 21,1 ± 0,1,21,7 ± 0,1 y 22,3 ± 0,1. En otra realizacion, la forma III de la base libre cristalina se caracteriza por una difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a valores 20 seleccionados de 6,6 ± 0,1, 11,4 ± 0,1, 13,1 ± 0,1, 16,1 ± 0,1, 17,5 ± 0,1, 18,2 ± 0,1, 18,6 ± 0,1, 19,3 ± 0,1, 19,7 ± 0,1, 19,9 ± 0,1,20,2 ± 0,1,20,8 ± 0,1,21,1 ± 0,1,21,7 ± 0,1 y 22,3 ± 0,1. En otra realizacion mas, la forma III de la base libre cristalina se caracteriza por un patron de PXRD en el que las posiciones de picos son sustancialmente segun aquellas mostradas en la FIG. 1.
La forma IV de la base libre cristalina se caracteriza por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a valores 20 de 6,6 ± 0,1, 13,1 ± 0,1, 18,6 ± 0,1, 19,7 ± 0,1 y 20,2 ± 0,1; y adicionalmente caracterizada por tener cinco o mas picos de difraccion adicionales a valores 20 seleccionados de 10,6 ± 0,1, 15,0 ± 0,1, 16,0 ± 0,1, 17,3 ± 0,1, 17,7 ± 0,1,20,9 ± 0,1, 21,4 ± 0,1, 22,6 ± 0,1,24,6 ± 0,1 y 27,8 ± 0,1. En otra realizacion, la forma IV de la base libre cristalina se caracteriza por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a valores 20 seleccionados de 6,6 ± 0,1, 13,1 ± 0,1, 15,0 ± 0,1, 17,3 ± 0,1, 17,7 ± 0,1, 18,6 ± 0,1, 19,7 ± 0,1, 20,2 ± 0,1, 20,9 ± 0,1, 21,4 ± 0,1 y 22,6 ± 0,1. En otra realizacion mas, la forma IV de la base libre cristalina se caracteriza por un patron de PXRd en el que las posiciones de picos son sustancialmente segun aquellas mostradas en la FIG. 2.
En otra realizacion mas, la base libre cristalina de la invencion se caracteriza por un termograma de calorimetna diferencial de barrido (DSC). Los termogramas de DSC se obtuvieron como se expone en el Ejemplo 6. Los puntos de fusion informados en el presente documento se estiman basandose en la aparicion del fundido registrada durante el analisis de DSC. Asf, en una realizacion, el compuesto cristalino de la invencion se caracteriza por su termografo de DSC. En una realizacion, la forma III de la base libre cristalina se caracteriza por un termografo de DSC que muestra una aparicion del flujo de calor endotermico a aproximadamente 123 °C y un punto de fusion de aproximadamente 125 °C, como se observa en la FIG. 4. La forma IV de la base libre cristalina se caracteriza por un termografo de DSC que muestra una aparicion de flujo de calor endotermico a aproximadamente 66 °C, una segunda aparicion de flujo de calor endotermico a aproximadamente 119 °C y un punto de fusion de aproximadamente 119 °C, como se observa en la FIG. 5.
Se realizo analisis termogravimetrico (TGA) en la forma de base libre cristalina de la invencion como se describe en el Ejemplo 6. Asf, en una realizacion, la base libre cristalina se caracteriza por su trazo de TGA. En una realizacion, la forma III de la base libre cristalina se caracteriza por el trazo de TGA representado en la FIG. 6. La forma IV de la base libre cristalina se caracteriza por el trazo de tGa representado en la FIG. 7.
Se realizo una evaluacion de sorcion gravimetrica de vapor (GVS) en la forma de base libre cristalina de la invencion como se describe en el Ejemplo 7. Se ha demostrado que la forma de base libre cristalina de la invencion tiene un perfil de sorcion/desorcion reversible con niveles aceptables de higroscopicidad. Por ejemplo, la forma III de la base libre cristalina mostro una captacion de agua reversible de <2 % peso/peso entre el 0 y el 90 % de humedad relativa a 25 °C. Adicionalmente, se ha encontrado que la forma III de la base libre cristalina es estable tras la exposicion a temperatura y humedad elevada.
Estas propiedades de la forma de base libre cristalina de la invencion se ilustran adicionalmente en los ejemplos mas adelante.
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Utilidad
El compuesto de formula I posee actividad de antagonista de receptores muscarmicos y, por tanto, se espera que una forma de base libre cristalina del compuesto de formula I sea util para tratar afecciones medicas mediadas por receptores muscarmicos, es decir, afecciones medicas que mejoran mediante el tratamiento con un antagonista de receptores muscarmicos. Tales afecciones medicas incluyen, a modo de ejemplo, trastornos pulmonares o enfermedades que incluyen aquellas asociadas a obstruccion reversible de las vfas respiratorias tales como enfermedad pulmonar obstructiva cronica (por ejemplo, bronquitis cronica y sibilante y enfisema), asma, fibrosis pulmonar, rinitis alergica, rinorrea, y similares. Otras afecciones medicas que pueden tratarse con los antagonistas de receptores muscarmicos son trastornos de las vfas genitourinarias tales como vejiga hiperactiva o hiperactividad del detrusor y sus smtomas; trastornos del tubo gastrointestinal tales como smdrome del intestino irritable, enfermedad diverticular, acalasia, trastornos de hipermotilidad gastrointestinal y diarrea; arritmias cardfacas tales como bradicardia sinusal; enfermedad de Parkinson; trastornos cognitivos tales como enfermedad de Alzheimer; dismenorrea; y similares.
Por consiguiente, en una realizacion, la invencion encuentra utilidad en un compuesto I para su uso en un metodo de tratamiento de un trastorno pulmonar, comprendiendo el metodo administrar a un paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de la forma III de la base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1- ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico. Cuando se usa para tratar un trastorno pulmonar, la base libre cristalina de la invencion normalmente se administrara por inhalacion en multiples dosis por dfa, en una unica dosis diaria o una unica dosis semanal. Generalmente, la dosis para tratar un trastorno pulmonar oscilara de aproximadamente 10 pgMa a 200 pgMa.
Cuando se administra por inhalacion, la base libre cristalina de la invencion normalmente tendra el efecto de producir broncodilatacion. Por consiguiente, en otra realizacion, la invencion encuentra utilidad en un compuesto I para su uso en un metodo de producir broncodilatacion en un paciente, comprendiendo el metodo administrar a un paciente una cantidad productora de broncodilatacion de la forma III de la base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4- carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico. Generalmente, la dosis terapeuticamente eficaz para producir broncodilatacion oscilara de aproximadamente 10 pg/dfa a 200 pgMa.
En una realizacion, la invencion encuentra utilidad en un compuesto I para su uso en un metodo de tratamiento de enfermedad pulmonar obstructiva cronica o asma, comprendiendo el metodo administrar a un paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de la forma III de la base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1- ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico. Cuando se usa para tratar EPOC o asma, la base libre cristalina de la invencion normalmente se administrara por inhalacion en multiples dosis por dfa o en una unica dosis diaria. Generalmente, la dosis para tratar EPOC o asma oscilara de aproximadamente 10 pg/dfa a 200 pg/dfa. Como se usa en el presente documento, EPOC incluye bronquitis obstructiva cronica y enfisema (vease, por ejemplo, Barnes, Chronic Obstructive Pulmonary Disease, New England Journal of Medicine 343:269-78 (2000)).
Cuando se usa para tratar un trastorno pulmonar, la base libre cristalina de la invencion se administra opcionalmente en combinacion con otros agentes terapeuticos. Por consiguiente, en una realizacion particular, las composiciones farmaceuticas y metodos de la invencion comprenden ademas una cantidad terapeuticamente eficaz de un agonista de p2-adrenoreceptor, un corticosteroide, un agente antiinflamatorio no esteroideo, o combinacion de los mismos.
En otra realizacion, la base libre cristalina de la invencion se usa para antagonizar un receptor muscarmico en un sistema biologico, y un marnffero en particular tal como ratones, ratas, cobayas, conejos, perros, cerdos, seres humano, etc. En esta realizacion, una cantidad terapeuticamente eficaz de la base libre cristalina de la invencion se administra al mairnfero. Si se desea, los efectos de antagonizar el receptor muscarmico pueden entonces determinarse usando procedimientos y equipo convencionales.
Las propiedades y utilidad de la base libre cristalina de la invencion, tales como la actividad antagonizante de receptores muscarmicos, pueden demostrarse usando diversos ensayos in vitro e in vivo que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, ensayos representativos se describen en mas detalle en los siguientes ejemplos e incluyen, a modo de ilustracion y no limitacion, ensayos que miden la union al receptor muscarmico hMi, hM2, hM3, hM4 y hM5 (por ejemplo, como se describe en el Ensayo 1). Ensayos funcionales utiles para determinar la actividad antagonizante de receptores muscarmicos de una base libre cristalina de la invencion incluyen, a modo de ilustracion y no limitacion, ensayos que miden los cambios mediados por ligando en adenosin monofosfato dclico (AMPc) intracelular, cambios mediados por ligando en la actividad de la enzima adenilil ciclasa
5'-O-(Y-tio)trifosfato S]GTPyS por GDP,
cambios mediados por ligando en iones calcio intracelulares libres (medidos, por ejemplo, con un lector de placas de obtencion de imagenes asociado a fluorescencia o FLIPR® de Molecular Devices, Inc.), y similares. Ensayos a modo de ejemplo se describen en el Ensayo 2. Se espera que la base libre cristalina antagonice o disminuya la activacion de receptores muscarmicos en cualquiera de los ensayos enumerados anteriormente, o ensayos de una naturaleza similar, y normalmente se usaran en estos estudios a una concentracion que oscila de aproximadamente 0,1-100
(que sintetiza AMPc), cambios mediados por ligando en la incorporacion de guanosin ([35S]GTPyS) en membranas aisladas mediante el intercambio catalizado por receptor de [35
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nanomolar. As^ los ensayos anteriormente mencionados son utiles en determinar la utilidad terapeutica, por ejemplo, la actividad broncodilatadora, de una base libre cristalina de la invencion.
Otras propiedades y utilidades de una base libre cristalina de la invencion pueden demostrarse usando diversos ensayos in vitro e in vivo muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, la potencia in vivo de una base libre cristalina puede medirse en un modelo animal tal como el modelo de Einthoven. Brevemente, la actividad broncodilatadora de una base libre cristalina se evalua en un animal anestesiado (el modelo de Einthoven), que usa presion de ventilacion como medida sustituta de la resistencia de las vfas respiratorias. Veanse, por ejemplo, Einthoven (1892) Pfugers Arch. 51:367-445; y Mohammed et al. (2000) Pulm Pharmacol Ther. 13(6):287- 92, ademas del Ensayo 3 que describe un modelo de rata de Einthoven. Otro ensayo in vivo util es el ensayo de rata antisialogogo (por ejemplo, como se describe en el Ensayo 4).
Composiciones farmaceuticas y formulaciones
Una base libre cristalina de la invencion normalmente se administra a un paciente en forma de una composicion farmaceutica o formulacion. Tales composiciones farmaceuticas pueden administrarse al paciente por cualquier via de administracion aceptable que incluye, pero no se limita a, modos inhalado, oral, nasal, topico (incluyendo transdermico) y parenteral de administracion. Sin embargo, se entendera por aquellos expertos en la materia que, una vez se ha formulado una base libre cristalina de la invencion, ya no puede estar en forma cristalina, es decir, la base libre cristalina puede disolverse en un vetuculo adecuado.
Por consiguiente, en una realizacion, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un vetuculo o excipiente farmaceuticamente aceptable y la forma III de la base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4- carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico. La composicion farmaceutica puede contener otros agentes terapeuticos y/o de formulacion, si se desea.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion normalmente contienen una cantidad terapeuticamente eficaz de la base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico, como agente activo. Normalmente, tales composiciones farmaceuticas contendran de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 95 % en peso del agente activo; que incluye de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 30 % en peso; tal como de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 10 % en peso del agente activo.
Puede usarse cualquier vehfculo o excipiente convencional en las composiciones farmaceuticas de la invencion. La eleccion de un vehfculo o excipiente particular, o combinacion de vehfculos o excipientes, dependera del modo de administracion que se usa para tratar un paciente particular o tipo de afeccion medica o estado de enfermedad. A este respecto, la preparacion de una composicion farmaceutica adecuada para un modo de administracion particular esta bien dentro del alcance de aquellos expertos en las tecnicas farmaceuticas. Adicionalmente, los ingredientes para tales composiciones estan comercialmente disponibles de, por ejemplo, Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. A modo de ilustracion adicional, tecnicas de formulacion convencionales se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edicion, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); y H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Edicion, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).
Ejemplos representativos de materiales que pueden servir de vehfculos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: azucares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidon de mafz y almidon de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de alazor, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; esteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes de tamponamiento tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; acido algmico; agua sin pirogenos; solucion salina isotonica; disolucion de Ringer; alcohol etflico; disoluciones de tampon fosfato; gases propulsores comprimidos tales como clorofluorocarbonos e hidrofluorocarbonos; y otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en composiciones farmaceuticas.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion normalmente se preparan mezclando o combinando minuciosa e mtimamente la base libre cristalina con un vehfculo farmaceuticamente aceptable y uno o mas ingredientes opcionales. Si fuera necesario o se desea, la mezcla combinada uniformemente resultante puede entonces formarse o cargarse en comprimidos, capsulas, pfldoras, latas, cartuchos, dispensadores y similares usando procedimientos y equipo convencionales.
En una realizacion, las composiciones farmaceuticas de la invencion son adecuadas para administracion inhalada. Composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion inhalada normalmente estaran en forma de un aerosol o un polvo. Tales composiciones se administran generalmente usando dispositivos de administracion muy conocidos
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tales como un inhalador nebulizador, un inhalador de dosis medida (MDI), un inhalador de polvo seco (DPI) o un dispositivo de administracion similar.
En una realizacion espedfica de la invencion, una composicion farmaceutica que comprende el agente activo se administra por inhalacion usando un inhalador nebulizador. Tales dispositivos nebulizadores normalmente producen una corriente de aire de alta velocidad que hace que la composicion farmaceutica comprenda el agente activo a pulverizar como una niebla que es llevada a las vfas respiratorias del paciente. Por consiguiente, cuando se formula para su uso en un inhalador nebulizador, el agente activo de base libre cristalina normalmente se disuelve en un veldculo adecuado Tpara formar una disolucion. Dispositivos nebulizadores adecuados incluyen el inhalador Respimat® Soft Mist™ (Boehringer Ingelheim), el sistema de administracion pulmonar AERx® (Aradigm Corp.), y el nebulizador reutilizable PARI LC Plus (Pari GmbH).
Una composicion farmaceutica representativa para su uso en un inhalador nebulizador comprende una disolucion acuosa isotonica que comprende de aproximadamente 0,05 pg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de una base libre cristalina de la invencion. En una realizacion, la formulacion acuosa de nebulizador es isotonica. En una realizacion, una disolucion tal tiene un pH de aproximadamente 4-6. En una realizacion particular, la formulacion acuosa de nebulizador se tampona con tampon citrato a un pH de aproximadamente 5. En otra realizacion particular, la formulacion acuosa contiene de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml de equivalentes de base libre de ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2- ilcarbamico.
En otra realizacion espedfica de la invencion, la composicion farmaceutica que comprende el agente activo se administra por inhalacion usando un DPI. Tales DPI normalmente administran el agente activo como un polvo fluido que se dispersa en una corriente de aire del paciente durante la inspiracion. Con el fin de lograr un polvo fluido, el agente activo de base libre cristalina normalmente se formula con un excipiente adecuado tal como lactosa, almidon, manitol, dextrosa, acido polilactico, polilactida-co-glicolida, y combinaciones de los mismos. La micronizacion es un metodo comun de reduccion del tamano de cristal de manera que sea adecuado para administracion pulmonar. Normalmente, un agente activo de base libre cristalina se microniza y se combina con un veldculo adecuado para formar una suspension de partfculas micronizadas de tamano respirable, en la que “partfculas micronizadas” o “forma micronizada” significa que al menos aproximadamente el 90 % de las partfculas tienen un diametro inferior a aproximadamente 10 pm. Tambien pueden usarse otros metodos de reduccion del tamano de partfcula tales como molienda fina, picado, machacado, trituracion, molienda, tamizado, trituracion, pulverizacion, etc., en tanto que pueda obtenerse el tamano de partfcula deseado.
Una composicion farmaceutica representativa para su uso en un DPI comprende lactosa seca que tiene un tamano de partfcula entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 100 pm y partfculas micronizadas de una base libre cristalina de la invencion. Una formulacion en polvo seca tal puede prepararse, por ejemplo, combinando la lactosa con el agente activo de base libre cristalina y luego mezclando en seco los componentes. Alternativamente, si se desea, el agente activo de base libre cristalina puede formularse sin un excipiente. La composicion farmaceutica se carga entonces normalmente en un dispensador de polvo seco, o en cartuchos de inhalacion o capsulas para su uso con un dispositivo de administracion de polvo seco.
Ejemplos de dispositivos de administracion de DPI incluyen Diskhaler (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC; vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 5.035.237 a Newell et al.); Diskus (GlaxoSmithKline; vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.378.519 a Davies et al.); Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, DE; vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 4.524.769 a Wetterlin); Rotahaler (GlaxoSmithKline; vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 4.353.365 a Hallworth et al.) y Handihaler (Boehringer Ingelheim). Otros ejemplos de dispositivos DPI adecuados se describen en las patentes de EE.UU. N° 5.415.162 a Casper et al., 5.239.993 a Evans, y 5.715.810 a Armstrong et al., y referencias citadas en su interior. Las divulgaciones de las patentes anteriormente mencionadas se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
En otra realizacion espedfica mas de la invencion, una composicion farmaceutica que comprende un agente activo de base libre cristalina se administra por inhalacion usando un MDI, que normalmente descarga una cantidad medida del agente activo usando gas propulsor comprimido. Por consiguiente, las composiciones farmaceuticas administradas usando un MDI normalmente comprenden una disolucion o suspension del agente activo de base libre cristalina en un propulsor licuado. Puede emplearse cualquier propulsor licuado adecuado que incluye clorofluorocarbonos tales como CC^F e hidrofluoroalcanos (HFA) tales como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, (HFA 227). Debido a cuestiones sobre clorofluorocarbonos que afectan la capa de ozono, generalmente se prefieren las formulaciones que contienen HFA. Componentes de HFA opcionales adicionales incluyen co-disolventes tales como etanol o pentano, y tensioactivos tales como trioleato de sorbitano, acido oleico, lecitina y glicerina. Vease, por ejemplo, la patente de Ee.UU. N° 5.225.183 a Purewal et al., documento EP 0717987 A2 (Minnesota Mining and Manufacturing Company) y el documento WO 92/22286 (Minnesota Mining and Manufacturing Company, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
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Una composicion farmaceutica representativa para su uso en un inhalador de dosis medida comprende de aproximadamente el 0,01 al 5% en peso de un compuesto cristalino de base libre de la invencion; de aproximadamente el 0 al 20 % en peso de etanol; y de aproximadamente el 0 al 5 % en peso de tensioactivo; siendo el resto un propulsor de HFA.
Tales composiciones normalmente se preparan anadiendo hidrofluoroalcano enfriado o presurizado a un recipiente adecuado que contiene el agente activo de base libre cristalina, etanol (si esta presente) y el tensioactivo (si esta presente). Para preparar una suspension, el agente activo de base libre cristalina se microniza y a continuacion se combina con el propulsor. La formulacion se carga entonces en un bote de aerosol, que forma una porcion de un dispositivo inhalador de dosis medida. Ejemplos de dispositivos inhaladores de dosis medida desarrollados espedficamente para su uso con propulsores de HFA se describen en las patentes de EE.UU. N° 6.006.745 a Marecki y 6.143.277 a Ashurst et al. Alternativamente, puede prepararse una formulacion en suspension secando por pulverizacion un recubrimiento de tensioactivo sobre partfculas micronizadas del agente activo. Vease, por ejemplo, el documento WO 99/53901 (Glaxo Group Ltd.) y el documento WO 00/61108 (Glaxo Group Ltd.). Las divulgaciones de las patentes y publicaciones anteriormente mencionadas se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
Para ejemplos adicionales de procesos de preparacion de partfculas respirables, y formulaciones y dispositivos adecuados para la dosificacion por inhalacion, veanse las patentes de EE.UU. N° 6.268.533 a Gao et al., 5.983.956 a Trofast; 5.874.063 a Briggner et al.; y 6.221.398 a Jakupovic et al.; y documento WO 99/55319 (Glaxo Group Ltd.) y el documento WO 00/30614 (AstraZeneca AB); cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
En otra realizacion, las composiciones farmaceuticas de la invencion son adecuadas para administracion por via oral. Composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion por via oral pueden estar en forma de capsulas, comprimidos, pfldoras, pastillas para chupar, sellos, comprimidos recubiertos de azucar, polvos, granulos; o como una disolucion o una suspension en un lfquido acuoso o no acuoso; o como una emulsion lfquida de aceite en agua o agua en aceite; o como un elixir o jarabe; y similares; conteniendo cada una una cantidad predeterminada de una base libre cristalina de la invencion como principio activo. La composicion farmaceutica puede envasarse en una forma de dosificacion unitaria.
Cuando esta prevista para administracion por via oral en una forma de dosificacion solida (es decir, como capsulas, comprimidos, pfldoras y similares), una composicion farmaceutica de la invencion normalmente comprendera una base libre cristalina de la invencion como principio activo y uno o mas vedculos farmaceuticamente aceptables tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio. Opcionalmente o alternativamente, tales formas de dosificacion solidas tambien pueden comprender: cargas o sustancias de relleno tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o acido silfcico; aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arabiga; humectantes tales como glicerol; agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato calcico, almidon de patata o de tapioca, acido algmico, ciertos silicatos, y/o carbonato sodico; agentes retardantes de la disolucion tales como parafina; aceleradores de la absorcion tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes tales como alcohol cetflico y/o monoestearato de glicerol; absorbentes tales como caolm y/o arcilla de bentonita; lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, laurilsulfato de sodio, y/o mezclas de los mismos; agentes colorantes; y agentes de tamponamiento.
Agentes de liberacion, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes tambien pueden estar presentes en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistema, bisulfato de sodio, metabisulfato de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales tales como acido dtrico, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico, y similares. Agentes de recubrimiento para comprimidos, capsulas, pfldoras, y similares, incluyen aquellos usados para recubrimientos entericos tales como acetato-ftalato de celulosa (CAP), poli(acetato-ftalato de vinilo) (PVAP), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, copolfmeros de acido metacnlico-ester del acido metacnlico, acetato-trimelitato de celulosa (CAT), carboximetiletilcelulosa (CMEC), acetato-succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS), y similares.
Si se desea, las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden formularse para proporcionar liberacion lenta o controlada del principio activo usando, a modo de ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables; u otras matrices de polfmero, liposomas y/o microesferas.
Ademas, las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden contener opcionalmente opacificantes y pueden formularse de manera que liberen el principio activo solo, o preferencialmente, en una cierta porcion del tubo gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Ejemplos de incorporacion de composiciones que pueden usarse incluyen sustancias polimericas y ceras. El principio activo de base libre cristalina tambien puede estar en forma micro-encapsulada, si es apropiada, con uno o mas de los excipientes anteriormente descritos.
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Formas de dosificacion Ifquidas adecuadas para administracion por via oral incluyen, a modo de ilustracion, emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Tales formas de dosificacion lfquidas normalmente comprenden el principio activo y un diluyente inerte tal como, por ejemplo, agua u otros disolventes, solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etilico, alcohol isopropflico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bendlico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (especialmente aceites de semilla de algodon, cacahuete, mafz, germen, oliva, ricino y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofunlico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Las suspensiones, ademas del principio activo, pueden contener agentes de suspension tales como, por ejemplo, alcoholes isoesteanlicos etoxilados, polioxietilensorbitol y esteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Una base libre cristalina de la invencion tambien puede administrarse transdermicamente usando sistemas de administracion transdermica y excipientes conocidos. Por ejemplo, la base libre cristalina puede mezclarse con potenciadores de la permeacion tales como propilenglicol, monolaurato de polietilenglicol, azacicloalcan-2-onas y similares, e incorporarse en un parche o sistema de administracion similar. Excipientes adicionales que incluyen gelificantes, emulsionantes y tampones pueden usarse en tales composiciones transdermicas, si se desea.
Una base libre cristalina de la invencion tambien puede co-administrarse con otros agentes terapeuticos. Esta terapia de combinacion implica usar la base libre cristalina combinada con uno o mas de estos agentes secundarios, tanto formulados juntos (por ejemplo, envasados juntos en una unica formulacion) como formulados por separado (por ejemplo, envasados como formas de dosificacion unitaria separadas). Metodos de formulacion de multiples agentes juntos en la misma formulacion o en formas de dosificacion unitaria separadas son muy conocidos en la tecnica. El termino “forma de dosificacion unitaria” se refiere a una unidad ffsicamente discreta adecuada para la dosificacion a un paciente, es decir, cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la invencion calculada para producir el efecto terapeutico deseado tanto solo como en combinacion con una o mas unidades adicionales. Por ejemplo, tales formas de dosificacion unitaria pueden ser capsulas, comprimidos, pfldoras y similares.
El (Los) agente(s) terapeutico(s) adicional(es) puede(n) seleccionarse de otros broncodilatadores (por ejemplo, inhibidores de PDE3, moduladores de adenosina 2b y agonistas de receptores p2-adrenergicos); agentes antiinflamatorios (por ejemplo, agentes antiinflamatorios esteroideos tales como corticosteroides; agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE) e inhibidores de PDE4); otros antagonistas de receptores muscarmicos (es decir, agentes anticolinergicos); agentes antiinfecciosos (por ejemplo, antibioticos Gram-positivos y Gram-negativos o antivirales); antihistammicos; inhibidores de la proteasa; y bloqueantes de aferentes (por ejemplo, agonistas de D2 y moduladores de neuroquinina).
Una realizacion particular de la invencion se refiere a una composicion que comprende (a) un veldculo farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de una base libre cristalina de la invencion; y (b) un vedculo farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente seleccionado de un agente antiinflamatorio esteroideo tal como un corticosteroide; un agonista de receptores p2-adrenergicos; un inhibidor de la fosfodiesterasa-4; o una combinacion de los mismos; en la que la base libre cristalina y el agente se formulan juntos o por separado. En otra realizacion, (b) es un vedculo farmaceuticamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un agonista de receptores p2-adrenergicos y un agente antiinflamatorio esteroideo. Los agentes secundarios pueden usarse en forma de sales o solvatos farmaceuticamente aceptables, y si es apropiado, como estereoisomeros opticamente puros.
Agonistas de receptores p2-adrenergicos representativos que pueden usarse en combinacion con una base libre cristalina de la invencion incluyen, pero no se limitan a, salmeterol, salbutamol, formoterol, salmefamol, fenoterol, terbutalina, albuterol, isoetarina, metaproterenol, bitolterol, pirbuterol, levalbuterol y similares, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Otros agonistas de receptores p2-adrenergicos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, 3-(4-{[6-({{(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)-fenil]etil}amino)- hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida y 3-(-3-{[7-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}-amino)heptil]oxi}- propil)bencenosulfonamida y compuestos relacionados descritos en el documento WO 02/066422 (Glaxo Group Ltd.); 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}amino)hexil]oxi}butil)-fenil]imidazolidin-2,4-diona y compuestos relacionados descritos en el documento WO 02/070490 (Glaxo Group Ltd.); 3-(4-{[6-({(2R)-2-[3- (formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, 3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(formilamino)- 4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, 3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formilamino)-4-
hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, N-(t-butil)-3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(formilamino)-4- hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]-oxi}butil) bencenosulfonamida, N-(terc-butil)-3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-(formilamino)-4- hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)-hexil]oxi}butil)-bencenosulfonamida, N-(terc-butil)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-
(formilamino)-4-hidroxifenil]-2-hidroxietil}amino)hexil]-oxi}butil)bencenosulfonamida y compuestos relacionados descritos en el documento WO 02/076933 (Glaxo Group Ltd.); 4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-
diclorobencil)oxi]etoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol y compuestos relacionados descritos en el documento WO 03/024439 (Glaxo Group Ltd.); N-{2-[4-((R)-2-hidroxi-2-feniletilamino)fenil]etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3- formamido-4-hidroxifenil)etilamina y compuestos relacionados descritos en la patente de EE.UU. N° 6.576.793 a Moran et al.; N-{2-[4-(3-fenil-4-metoxifenil)aminofenil]etil}-(R)-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2(1H)-quinolinon-5-il)etilamina y
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compuestos relacionados descritos en la patente de EE.UU. N° 6.653.323 a Moran et al.; y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. En una realizacion particular, el agonista de p2-adrenoreceptores es una sal de monoclorhidrato cristalina de W-{2-[4-((R)-2-hidroxi-2-feniletilamino)fenil]etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3-formamido-4-
hidroxifenil)etilamina. Cundo se emplea, el agonista de p2-adrenoreceptores estara presente en la composicion farmaceutica en una cantidad terapeuticamente eficaz. Normalmente, el agonista de p2-adrenoreceptores estara presente en una cantidad suficiente para proporcionar de aproximadamente 0,05 |jg a 500 |jg por dosis. Las divulgaciones de las patentes y publicaciones anteriormente mencionadas se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
Agentes antiinflamatorios esteroideos representativos que pueden usarse en combinacion con una base libre cristalina de la invencion incluyen, pero no se limitan a, metilprednisolona, prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, ester S-fluorometilico del acido 6a,9a-difluoro-17a-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11p-hidroxi-16a-metil-3- oxoandrosta-1,4-dieno-17p-carbotioico, ester (2-oxo-tetrahidrofuran-3SHlico) del acido 6a,9a-difluoro-11p-hidroxi- 16a-metil-3-oxo-17a-propioniloxi-androsta-1,4-dieno-17p-carbotioico, esteres de beclometasona (por ejemplo, el ester de 17-propionato o el ester de 17,21-dipropionato), budesonida, flunisolida, esteres de mometasona (por ejemplo, el ester de furoato), acetonido de triamcinolona, rofleponida, ciclesonida, propionato de butixocort, RPR- 106541, ST-126 y similares, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Cuando se emplean, el agente antiinflamatorio esteroideo estara presente en la composicion en una cantidad terapeuticamente eficaz. Normalmente, el agente antiinflamatorio esteroideo estara presente en una cantidad suficiente para proporcionar de aproximadamente 0,05 jg a 500 jg por dosis.
Una combinacion a modo de ejemplo es una base libre cristalina de la invencion, co-administrada con salmeterol como el agonista de receptores p2-adrenergicos, y propionato de fluticasona como el agente antiinflamatorio esteroideo. Otra combinacion a modo de ejemplo es una base libre cristalina de la invencion, co-administrada con una sal de monoclorhidrato cristalina de W-{2-[4-((R)-2-hidroxi-2-feniletilamino)fenil]etil}-(R)-2-hidroxi-2-(3-formamido- 4-hidroxifenil)etilamina como el agonista de p2-adrenoreceptores, y ester S-fluorometflico del acido 6a,9a-difluoro- 17a-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11p-hidroxi-16a-metil-3-oxoandrosta-1,4-dieno-17p-carbotioico como el agente antiinflamatorio esteroideo. Como se observa anteriormente, estos agentes pueden formularse juntos o por separado.
Otras combinaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo, AINE (por ejemplo, cromoglicato de sodio, nedocromil sodico e inhibidores de fosfodiesterasas (PDE) tales como teofilina, inhibidores de PDE4 e inhibidores mixtos de PDE3/PDE4); antagonistas de leucotrieno (por ejemplo, monteleucast); inhibidores de la smtesis del leucotrieno; inhibidores de iNOS; inhibidores de la proteasa tales como inhibidores de triptasa y de elastasa; antagonistas de integrina beta-2 y agonistas o antagonistas de receptores de adenosina (por ejemplo, agonistas de adenosina 2a); antagonistas de citocinas (por ejemplo, antagonistas de quimiocinas tales como un anticuerpo para interleucinas (anticuerpo aIL), espedficamente, una terapia con aIL-4, una terapia con aIL- 13, o una combinacion de los mismos); o inhibidores de la smtesis de citocinas.
Inhibidores de la fosfodiesterasa-4 (PDE4) o inhibidores mixtos de PDE3/PDE4 representativos que pueden usarse en combinacion con una base libre cristalina de la invencion incluyen, pero no se limitan a, acido c/s-4-ciano-4-(3- ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexano-1-carboxflico, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-
difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ona; c/s-[4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ol]; acido c/s-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]ciclohexano-1-carboxflico y similares, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Otros inhibidores de PDE4 o mixtos de PDE4/PDE3 representativos incluyen AWD-12- 281 (elbion); NCS-613 (INSERM); D-4418 (Chiroscience y Schering-Plough); CI-1018 o PD-168787 (Pfizer); compuestos de benzodioxol descritos en el documento WO99/16766 (Kyowa Hakko); K-34 (Kyowa Hakko); V- 11294A (Napp); roflumilast (Byk-Gulden); compuestos de ftalazinona descritos en el documento WO99/47505 (Byk- Gulden); pumafentrina (Byk-Gulden, ahora Altana); arofilina (Almirall-Prodesfarma); VM554/UM565 (Vernalis); T-440 (Tanabe Seiyaku); y T2585 (Tanabe Seiyaku).
Antagonistas muscarmicos representativos (es decir, agentes anticolinergicos) que pueden usarse en combinacion con una base libre cristalina de la invencion incluyen, pero no se limitan a, atropina, sulfato de atropina, oxido de atropina, nitrato de metilatropina, bromhidrato de homatropina, bromhidrato de hiosciamina (d, l), bromhidrato de escopolamina, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, metantelina, bromuro de propantelina, metilbromuro de anisotropina, bromuro de clidinio, copirrolato (Robinul), yoduro de isopropamida, bromuro de mepenzolato, cloruro de tridihexetilo (Pathilone), metilsulfato de hexociclio, clorhidrato de ciclopentolato, tropicamida, clorhidrato de trihexifenidilo, pirenzepina, telenzepina, AF-DX 116 y metoctramina y similares, o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos; o, para aquellos compuestos enumerados como una sal, sal farmaceuticamente aceptable alternativa de los mismos.
Antihistammicos representativos (es decir, antagonistas de receptores H1) que pueden usarse en combinacion con una base libre cristalina de la invencion incluyen, pero no se limitan a, etanolaminas tales como maleato de carbinoxamina, fumarato de clemastina, clorhidrato y dimenhidrinato de difenilhidramina; etilendiaminas tales como maleato de pirilamina, clorhidrato de tripelenamina y citrato de tripelenamina; alquilaminas tales como clorfeniramina y acrivastina; piperazinas tales como clorhidrato de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, clorhidrato de ciclizina, lactato de ciclizina, clorhidrato de meclizina y clorhidrato de cetirizina; piperidinas tales como astemizol, clorhidrato
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de levocabastina, loratadina o su analogo de descarboetoxi, clorhidrato de terfenadina y de fexofenadina; clorhidrato de azelastina; y similares, o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos; o, para aquellos compuestos enumerados como una sal, sal farmaceuticamente aceptable alternativa de los mismos.
A menos que se indique lo contrario, dosis adecuadas a modo de ejemplo para los otros agentes terapeuticos administrados en combinacion con una base libre cristalina de la invencion estan en el intervalo de aproximadamente 0,05 pg/dfa a 100 mg/dfa.
Las siguientes formulaciones ilustran composiciones farmaceuticas representativas de la invencion, ademas de metodos de preparacion a modo de ejemplo. Uno o mas agentes secundarios pueden opcionalmente formularse con una base libre cristalina de la invencion (agente activo primario). Alternativamente, el (los) agente(s) secundario(s) puede(n) formularse por separado y co-administrarse con el agente activo primario, tanto simultaneamente como secuencialmente. Por ejemplo, en una realizacion, una formulacion en polvo seca unitaria puede fabricarse para incluir tanto la base libre cristalina de la invencion como uno o mas agentes secundarios. En otra realizacion, una formulacion se fabrica para contener la base libre cristalina de la invencion y se fabrican formulacion (formulaciones) separada(s) que contiene(n) el (los) agente(s) secundario(s). Tales formulaciones en polvo seco pueden entonces envasarse en envases alveolados separados y administrarse con un dispositivo DPI individual.
Formulacion en polvo seco a modo de ejemplo para administracion por inhalacion
Se micronizan 0,2 mg de una base libre cristalina de la invencion y luego se combinan con 25 mg de lactosa. La mezcla combinada se carga entonces en un cartucho de inhalacion de gelatina. El contenido del cartucho se administra usando un inhalador de polvo.
Formulacion en polvo seco a modo de ejemplo para administracion por un inhalador de polvo seco
Se prepara un polvo seco que tiene una relacion de formulacion a granel de base libre cristalina micronizada de la invencion (agente activo) con respecto a lactosa de 1:200. El polvo se envasa en un dispositivo de inhalacion de polvo seco capaz de administrar entre aproximadamente 10 |jg y 100 |jg de agente activo por dosis.
Formulaciones a modo de ejemplo para administracion por un inhalador de dosis medida
Se prepara una suspension que contiene 5 % en peso de una base libre cristalina de la invencion (agente activo) y 0,1 % en peso de lecitina dispersando 10 g de la base libre cristalina como partfculas micronizadas con un tamano medio inferior a 10 jm en una disolucion formada a partir de 0,2 g de lecitina disueltos en 200 ml de agua desmineralizada. La suspension se seca por pulverizacion y el material resultante se microniza dando partfculas que tienen un diametro medio inferior a 1,5 jm. Las partfculas se cargan en cartuchos con 1,1,1,2-tetrafluoroetano presurizado.
Alternativamente, se prepara una suspension que contiene 5 % en peso de una base libre cristalina de la invencion, 0,5 % en peso de lecitina y 0,5 % en peso de trehalosa dispersando 5 g de la base libre cristalina como partfculas micronizadas con un tamano medio inferior a 10 jm en una disolucion coloidal formada a partir de 0,5 g de trehalosa y 0,5 g de lecitina disueltos en 100 ml de agua desmineralizada. La suspension se seca por pulverizacion y el material resultante se microniza dando partfculas que tienen un diametro medio inferior a 1,5 jm. Las partfculas se cargan en botes con 1,1,1,2-tetrafluoroetano presurizado.
Formulacion en aerosol acuosa a modo de ejemplo para administracion por nebulizador
Se prepara una composicion farmaceutica disolviendo 0,5 mg de una base libre cristalina de la invencion (agente activo) en 1 ml de una disolucion al 0,9 % de cloruro sodico acidificado con acido cftrico. La mezcla se agita y se sonica hasta que el agente activo se disuelve. El pH de la disolucion se ajusta a un valor en el intervalo de 3 a 8 (normalmente aproximadamente 5) por la lenta adicion de NaOH.
Formulacion de capsula de gelatina dura a modo de ejemplo para administracion por v^a oral
Los siguientes ingredientes se combinan minuciosamente y luego se cargan en una capsula de gelatina dura: 250 mg de una base libre cristalina de la invencion, 200 mg de lactosa (secada por pulverizacion) y 10 mg de estearato de magnesio, durante un total de 460 mg de composicion por capsula.
Formulacion en suspension a modo de ejemplo para administracion por v^a oral
Se mezclan los siguientes ingredientes para formar una suspension que contiene 100 mg de principio activo por 10 ml de suspension.
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Ingredientes_____________________
una base libre cristalina de la invencion
acido fumarico
cloruro sodico
metilparabeno
propilparabeno
azucar granulada
sorbitol (disolucion al 70 %)
Veegum k (Vanderbilt Co.) aromatizante colorantes agua destilada
Formulacion inyectable a modo de ejemplo
Cantidad________
1.0 g 0,5 g
2.0 g 0,15 g 0,05 g 25,5 g 12,85 g
1.0 g 0,035 ml 0,5 mg
c.s.p. hasta 100 ml
Se combinan los siguientes ingredientes y el pH se ajusta a 4 ± 0,5 usando HCl 0,5 N o NaOH 0,5 N.
Ingredientes_________________________
una base libre cristalina de la invencion disolucion de tampon acetato sodico (0,4 M) HCl (0,5 N) o NaOH (0,5 N) agua (destilada, esteril)
Cantidad_______
0,2 g 2,0 ml
c.s.p. hasta pH 4 c.s.p. hasta 20 ml
EJEMPLOS
Las siguientes preparaciones y ejemplos se proporcionan para ilustrar realizaciones espedficas de la invencion. Estas realizaciones espedficas, sin embargo, no pretenden limitar el alcance de la invencion de ningun modo, a menos que se indique espedficamente. Las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario, y cualquier otra abreviatura usada en el presente documento y no definida tiene su significado estandar:
AC adenilil ciclasa
BSA albumina de suero bovino
AMPc 3'-5' adenosin monofosfato dclico
CHO ovario de hamster chino
cM5 receptor M5 de chimpance clonado
DCM diclorometano
dPBS solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco EDTA acido etilendiaminatetraacetico EtOAc acetato de etilo FBS suero bovino fetal
FLIPR lector de placas de obtencion de imagenes fluorometrica
HBSS disolucion salina tamponada con Hank
HEPES acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico
hM1 receptor M1 humano clonado
hM2 receptor M2 humano clonado
hM3 receptor M3 humano clonado
hM4 receptor M4 humano clonado
hMs receptor M5 humano clonado
HOBT W-hidroxibenzotriazol
HPLC cromatograffa de lfquidos de alta resolucion
MCh metilcolina
MeCN acetonitrilo
Cualquier otra abreviatura usada en el presente documento, pero no definida, tiene su significado estandar generalmente aceptado. A menos que se indique de otro modo, los reactivos, materiales de partida y disolventes se compraron de proveedores comerciales (tales como Sigma-Aldrich, Fluka, y similares) y se usaron sin mas purificacion.
Preparacion 1
Ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil1metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico
Se disolvio la sal de difosfato del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico (16 g) en una mezcla bifasica de agua (100 ml) y EtOAc (200 ml). Se anadio NaOH (2
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N, 75 ml) durante un periodo de 5 minutos. La mezcla se agito entonces durante 30 minutes. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (200 ml). Las fases organicas combinadas se concentraron. Se anadio DCM (100 ml), y la mezcla se evaporo a sequedad. Los solidos se secaron en un horno durante aproximadamente 48 horas dando el compuesto del tftulo (9,6 g).
EJEMPLO 1
Base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]iTietilaiTiino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico (forma III)
Se disolvio ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2- ilcarbamico (102,4 mg) en MeCN (500 jl). La disolucion se agito a temperatura ambiente durante 80 minutos y se formo un precipitado solido blanco. La mezcla se dispuso en un bloque agitador para someterse a ciclos termicos (040 °C en bloques de una hora) durante 48 horas. Se observo un solido inmovil denso blanco. Se anadio MeCN (500 jl) para movilizar la suspension. La mezcla se dispuso de nuevo en el bloque agitador durante 2 horas. Los solidos se aislaron por filtracion a vacte usando un embudo de sinterizacion, luego se dispusieron en la secadora de piston a 40 °C bajo vacte completo durante 15,5 horas, dando 76,85 mg del compuesto cristalino del tftulo.
EJEMPLO 2
Base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]iTietilaiTiino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico (forma III)
Se suspendio la sal de difosfato del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoil-piperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4- flico del acido bifenil-2-ilcarbamico (C35H43N5O4^2HaPO4; MW 793,75; 632,9 g) en acetato de isopropilo (11,08 l) y agua (6,33 l) a temperatura ambiente bajo nitrogeno. La suspension se calento hasta 53 ± 3 °C y se anadio NaOH 10 M (317 ml) a la mezcla con agitacion, mientras que se mantema la temperatura de la mezcla por encima de 50 °C. La mezcla se agito durante aproximadamente 5 minutos a 53 ± 3 °C antes de permitir que las fases sedimentaran. A continuacion, las fases se separaron y la fase acuosa se elimino. Se anadio agua (3,16 l) a la fase organica mientras que se mantema la temperatura de la mezcla por encima de 50 °C. La mezcla se agito durante 5 minutos a 53 ± 3 °C antes de permitir que las fases sedimentaran. Las fases se separaron y la fase acuosa se elimino. Se anadio acetato de isopropilo (6,33 l) y entonces se recogieron aproximadamente 10 volumenes de destilado por destilacion atmosferica. Esta etapa se repitio con acetato de isopropilo adicional (3,2 l). Despues de la segunda destilacion, la temperatura de la disolucion transparente se redujo a 53 ± 3 °C, luego se sembro con una suspension de la base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico (forma III; 3,2 g) en acetato de isopropilo (51 ml). La suspension resultante se agito a 53 ± 3 °C durante 2 horas, a continuacion se enfrio a 10 ± 3 °C durante 4 horas. La suspension se agito a 10 ± 3 °C durante al menos 2 horas y a continuacion los solidos se recogieron por filtracion. La torta de filtracion resultante se lavo con acetato de isopropilo (2 x 1,9 l) y el producto se seco a vacte a 50 °C dando el compuesto cristalino del tftulo (C35H43N5O4; MW 597,76; 382,5 g, rendimiento del 80,3 %).
EJEMPLO 3
Recristalizacion de la base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1- ilmetil)benzoil1metilamino}etil)piperidin-4-ilico del acido bifenil-2-ilcarbamico (forma III)
Se suspendio base libre cristalina del ester 1-(2-{[[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4- flico del acido bifenil-2-ilcarbamico (forma III; C35H43N5O4; MW 597,76; 372,5 g) en tolueno (5,6 l) a 20 ± 3 °C bajo nitrogeno. La suspension se calento hasta 82 ± 3 °C, y se mantuvo a esta temperatura hasta que se observo disolucion completa. La disolucion se clarifico entonces en el recipiente cristalizador, seguido de aclarado con tolueno (373 jl). Los solidos se observaron en el recipiente cristalizador, y el recipiente se volvio a calentar a 82 ± 3 °C para efectuar la disolucion, luego se enfrio a 58 ± 3 °C y se sembro con una base libre cristalina previamente sonicada (aproximadamente 1 minuto) (forma III; 1,9 g) en tolueno (8 jl). La suspension resultante se dejo reposar a 58 ± 3 °C durante al menos 4 horas, luego se enfrio a 20 ± 3 °C durante 2 horas (tasa de enfriamiento aproximada de 0,33°C/min). La suspension se agito a 20 ± 3 °C durante al menos 1 hora, a continuacion los solidos se recogieron por filtracion. La torta de filtracion resultante se lavo con tolueno (2 x 1,2 l) y el producto se seco a vacte a 52 ± 3 °C dando el compuesto cristalino del tftulo (345,3 g, rendimiento del 92,7 %).
EJEMPLO 4 (no parte de la invencion)
Base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil1metilamino}etil)piperidin-4-ilico del acido bifenil-2-ilcarbamico (forma IV)
Se disolvio el ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2- ilcarbamico (preparado como se describe en la Preparacion 1; 2,5 g) en MeCN (10 ml) dando un material amarillo palido aceitoso viscoso. Se anadio MeCN adicional (5 ml) para diluir el material. La disolucion se sembro con base libre cristalina (20 mg; forma III preparada como se describe en el Ejemplo 1) y se agito a temperatura ambiente
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durante 90 minutos. Se observo una gran cantidad de precipitado blanco (cristales pequenos). La suspension se analizo bajo un microscopio optico polarizado y se encontro que era birrefringente.
Se anadio MeCN adicional (3 ml) y la suspension se dispuso en un bloque Metz Syn10 para someter a ciclos termicos (0-40 °C en bloques de una hora) a 800 rpm durante la noche. Metz Syn10 es una estacion de reaccion paralela de 10 posiciones que es estatica. La agitacion de la disolucion/suspension fue por una barra de agitador magnetico en cruz. El bloque agitador fue una pieza separada del equipo que se calento y se enfrio por un bano Julabo externo. El material se saco a 0 °C. Se observo que la suspension habfa sedimentado, dejando una disolucion amarilla palida encima del precipitado blanco. La suspension se agito y se dispuso de nuevo en el bloque agitador para someterla a ciclos termicos. El material se saco a 40 °C, y se agito a una alta tasa de agitacion a temperatura ambiente durante 80 minutos. La suspension se analizo de nuevo y se encontro que era birrefringente. La torta de filtracion se aislo por filtracion a vado usando un embudo de sinterizacion. Se uso MeCN (3 ml) para humedecer el papel de filtro y la torta de filtracion se lavo con MeCN antes de la filtracion. La torta se deshidrato a vado durante 40 minutos dando 2,3 g de un polvo blanco a reflujo. El material se dispuso en una secadora de piston a 40 °C durante 65 horas, dando 2,2 g del compuesto cristalino del tftulo como un polvo blanco (pureza del 99,6 %).
La mayona de los espectros de Raman del producto estuvieron de acuerdo con el del material de partida de la forma III. Sin embargo, se observaron tres desplazamientos:
Forma III Producto
878 cm'1
881 cm'1
775 cm'1
772 cm'1
485 cm'1
488 cm'1
El producto se analizo entonces por difraccion de rayos X de polvo, calorimetna diferencial de barrido y analisis termogravimetrico. Se determino que el producto era una base libre cristalina diferente del material de partida de la forma III, y se designo la forma IV.
EJEMPLO 5
Difraccion de rayos X de polvo
Se adquirieron patrones de difraccion de rayos X de polvo (PXRD) de las formas III de la base libre cristalina (del Ejemplo 1) y IV (del Ejemplo 4) en un difractometro de polvo PANalytical X'Pert Pro, equipado con un detector XCelerator. Las condiciones de adquisicion fueron radiacion: Ka de Cu; tension del generador: 40 kV; corriente del generador: 45 mA; angulo inicial 2,0° 20; angulo final 40,0° 20, tamano de etapa: 0,0167° 20. El tiempo por etapa fue 31,750 segundos. La muestra se preparo montando algunos miligramos de muestra sobre una placa de oblea de sflice (ruido de fondo cero), produciendo una delgada capa de polvo.
Las posiciones de picos caractensticas y separaciones d calculadas se resumen a continuacion, informando solo aquellos picos con mas del 14 % de intensidad relativa. Estos se calcularon a partir de los datos sin procesar usando el software Highscore. El error experimental en las posiciones de picos es aproximadamente ± 0,1° 20. Las intensidades de picos relativas variaran debido a la orientacion preferida.
Forma III
Pos.
Separacion d Int. rel.
[° 2 Th]
[A] [%]
6,6
13,5 53,8
8,8
10,1 14,8
10,1
8,8 14,1
11,4
7,8 21,7
11,6
7,6 14,7
13,1
6,8 29,3
14,8
6,0 15,2
15,2
5,8 15,8
16,1
5,5 30,1
Forma IV
Pos.
Separacion d Int. rel.
[° 2 Th]
[A] [%]
6,6
13,4 27,1
10,6
8,4 13,7
13,1
6,8 42,0
15,0
5,9 58,4
16,0
5,5 15,0
17,3
5,1 41,2
17,7
5,0 45,6
18,6
4,8 100,0
19,7
4,5 81,2
Forma III
Pos. [° 2 Th]
Separacion d [A] Int. rel. [%]
16,4
5,4 13,9
16,9
5,2 13,8
17,5
5,1 25,5
18,2
4,9 38,4
18,6
4,8 23,6
(continuacion)
Forma IV
Pos. [° 2 Th]
Separacion d [A] Int. rel. [%]
20,2
4,4 29,7
20,9
4,2 34,8
21,4
4,1 74,8
22,6
3,9 34,3
24,6
3,6 18,1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
19,3
4,6 23,1
19,7
4,5 100,0
19,9
4,5 73,5
20,2
4,4 22,8
20,8
4,3 72,7
21,1
4,2 51,5
21,7
4,1
21,7
22,3
4,0 31,0
Un patron de PXRD representativo para la forma III de la base libre cristalina se muestra en la FIG. 1. Un patron de PXRD representativo para la forma IV de la base libre cristalina se muestra en la FIG. 2.
EJEMPLO 6
Analisis termico
Se obtuvieron termogramas de calorimetna diferencial de barrido (DSC) de las formas III de la base libre cristalina (del Ejemplo 1) y IV (del Ejemplo 4) usando un calonmetro de TA Instruments. Las muestras se pesaron en un platillo de aluminio, se coloco una tapa de platillo encima y se plego ligeramente sin sellar el platillo. Los experimentos se realizaron usando una tasa de calentamiento de 10 °C/min.
Un termografo de DSC representativo para la forma III de la base libre cristalina se muestra en la FIG. 4. El termografo de DSC demuestra que la forma III se caracteriza por un termografo de DSC que muestra una aparicion de flujo de calor endotermico a 123,1 °C (entalpfa 67,7 J/g).
Un termografo de DSC representativo para la forma IV de la base libre cristalina se muestra en la FIG. 5. El termografo de DSC demuestra que la forma IV se caracteriza por un termografo de DSC que muestra una pequena endoterma y una endoterma principal, es decir, una pequena primera aparicion de flujo de calor endotermico que se produce a 65,6 °C (entalpfa 0,8 J/g) y una segunda aparicion principal de flujo de calor endotermico que se produce a 118,8 °C (entalpfa 66,8 J/g).
Se obtuvieron datos de analisis termogravimetrico (TGA) usando un instrumento Q500 de TA Instruments. Las muestras se calentaron en un platillo de aluminio abierto a una tasa de calentamiento de 10 °C/min a 200 °C.
Un trazo de TGA representativo para la forma III de la base libre cristalina se muestra en la FIG. 6, e indica que se observo perdida de peso despreciable antes de la degradacion de la muestra. Un trazo de TGA representativo para la forma IV de la base libre cristalina se muestra en la FIG. 7, e indica que se observo aproximadamente el 0,3 % de perdida de peso antes del fundido de la muestra, que esta de acuerdo con la perdida de disolvente residual.
EJEMPLO 7
Evaluacion de la sorcion gravimetrica de vapor
Se realizaron estudios de sorcion gravimetrica de vapor (GVS) usando un instrumento DVS-1 de Surface Measurements System para la generacion de isoterma de absorcion completa usando perfusion de vapor de agua a 25 °C. Se dispuso un tamano de muestra de aproximadamente 7 mg en un platillo de malla de muestra tarado limpio y seco y se peso usando la balanza interna. Los intervalos de humedad relativa (HR) objetivo fueron del 30 % al 90%, luego del 90% al 0% y del 0% al 30% con etapas del 10%. El punto de equilibrio se determino automaticamente usando un establecimiento de asmtota de 0,02 dm/dt.
Los estudios de GVS en una muestra de la forma III de la base libre cristalina realizados a 25 °C demostraron que el material tuvo una baja propension a captar humedad durante el intervalo del 0 % de HR al 90 % de HR. La muestra mostro una captacion de agua reversible de <2 % en peso/peso entre el 0 y el 90 % de HR a 25 °C. Este trazo de GVS demuestra que la forma III tiene un aumento de peso aceptable cuando se expone a un amplio intervalo de humedad.
EJEMPLO 8
Micronizacion
Las muestras de la forma III de la base libre cristalina se micronizaron usando tanto un micronizador APTM 4'' como el tamano de partfcula determinado por difraccion de luz laser.
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40
45
50
55
60
Cantidad de material cristalino
Tamano de partfcula del material micronizado (pm)
entrada (g)
rendimiento (g) X10 X50 X90
60,11
50,73 1,27 2,69 5,25
Por referencia, el tamano de partfcula de la forma III de la base libre cristalina de entrada fue Xio=5,58 pm, Xso=18,2 pm y Xgo=49,7 pm. La micronizacion dio partfculas en el intervalo de tamano respirable. La micronizacion produjo una reduccion en la cristalinidad, pero retuvo las caractensticas esenciales del material previamente micronizado. No se observaron cambios en el PXRD despues del almacenamiento durante 3 meses a 40 °C/20 % de humedad relativa, a 40 °C/75 % de humedad relativa (sin tapar) y a 50 °C/humedad ambiente.
El termografo de DSC para la forma III de la base libre cristalina mostro una fusion brusca a 125 °C, antes y despues de la micronizacion. Hubo un pequeno acontecimiento termico adicional en el material micronizado a 87 °C, probablemente debido a la cristalizacion. Despues del almacenamiento durante 3 meses a 40 °C/20 % de HR, 40 °C/75 % de HR desnudo y 50 °C/ humedad ambiente, el material micronizado mostro una fusion brusca a 125 °C sin evidencia de contenido amorfo.
EJEMPLO 9
Compatibilidad de lactosa
Se evaluaron dos formulaciones de la forma III de la base libre cristalina en cuanto a la estabilidad durante 3 meses a 40 °C/20 % de humedad relativa (HR), a 40 °C/75 % de HR (sin tapar) y a 50 °C/humedad ambiente. Se prepararon formulaciones de 0,08 % en peso/peso (dosis de DPI de 10 pg) y 2 % en peso/peso (dosis de DPI de 250 pg) como una mezcla con lactosa sola, o con lactosa y 1 % en peso/peso de estearato de magnesio. Se encontro que la estabilidad de todas las formulaciones era aceptable.
EJEMPLO 10
Solubilidad y estabilidad a pH
La forma III de la base libre cristalina muestra solubilidad (superior a aproximadamente 2 mg/ml) en medio de hasta pH 7. La solubilidad en agua es 0,66 mg/ml con un pH natural de 8,9. La solubilidad en lfquido de pulmon simulado es 0,46 mg/ml sin cambio observado entre las mediciones de solubilidad de 4 horas y de 24 horas.
Las disoluciones de la forma III de la base libre cristalina son estables en tampones a pH 4 y pH 6 durante hasta 7 dfas a 50 °C o expuestas a la luz. Las disoluciones son estables en agua y solucion salina durante 7 dfas a temperatura ambiente, protegidas de la luz.
ENSAYO 1
Ensayo de union a radioligando
Preparacion de membranas a partir de celulas que expresan los subtipos de receptor muscannico hMi, hM2, hM3 y hM4
Se cultivaron lmeas celulares CHO que expresan establemente los subtipos de receptores muscarmicos hM1, hM2, hM3 y hM4 humanos clonados, respectivamente, a casi confluencia en medio que consistfa en HAM's F-12 complementado con 10 % de FBS y 250 pg/ml de geneticina. Las celulas se cultivaron en una estufa de incubacion de 5 % de CO2, 37 °C, y se elevaron con EDTA 2 mM en dPBS. Las celulas se recogieron por centrifugacion de 5 minutos a 650 x g, y los sedimentos de celulas tanto se almacenaron congelados a -80 °C como se prepararon membranas inmediatamente. Para la preparacion de membranas, se resuspendieron sedimentos de celulas en tampon de lisis y se homogeneizaron con un disruptor de tejido Polytron PT-2100 (Kinematica AG; 20 segundos x 2 rafagas). Las membranas en bruto se centrifugaron a 40.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. El sedimento de membranas se resuspendio entonces con tampon de resuspension y se homogeneizo de nuevo con el disruptor de tejido Polytron. La concentracion de protema de la suspension de membrana se determino por el metodo descrito en Lowry, O. et al., Journal of Biochemistry 193:265 (1951). Todas las membranas se almacenaron congeladas en alfcuotas a -80 °C o se usaron inmediatamente. Las alfcuotas de membranas de receptor hM5 preparadas se compraron directamente de Perkin Elmer y se guardaron a -80 °C hasta uso.
Ensayo de union a radioligando sobre los subtipos de receptor muscannico hMi, hM2, hM3, hM4y hM5
Se realizaron ensayos de union a radioligando en placas de microtitulacion de 96 pocillos en un volumen de ensayo total de 1000 pl. Se diluyeron membranas de celulas CHO que expresan establemente tanto el subtipo muscannico hM1, hM2, hM3, hM4 como hM5 en tampon de ensayo a las siguientes concentraciones objetivo espedficas de
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protema (jg/pocillo): 10 |jg para hMi, 10-15 jg para hM2, 10-20 jg para hM3, 10-20 jg para hM, y 10-12 |jg para hMs. Las membranas se homogeneizaron brevemente usando un disruptor de tejido Polytron (10 segundos) antes de ensayar la adicion a placa. Se realizaron estudios de union de saturacion para determinar los valores de Kd del radioligando usando cloruro de metilo de L-[A/-metil-3H]escopolamina ([3H]-NMS) (TRK666, 84,0 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) a concentraciones que oscilaban de 0,001 nM a 20 nM. Los ensayos de desplazamiento para la determinacion de valores de K,- de compuestos de prueba se realizaron con [3H]- NMS a 1 nM y once concentraciones de compuestos de prueba diferentes. Los compuestos de prueba se disolvieron inicialmente a una concentracion de 40 jM en tampon de dilucion y a continuacion se diluyeron en serie 5x con tampon de dilucion a concentraciones finales que oscilaron de 400 fM a 4 jM. El orden de adicion y volumenes a las placas de ensayo fueron los siguientes: 825 jl de tampon de ensayo con 0,1 % de BSA, 25 jl de radioligando, 100 jl de compuesto de prueba diluido y 50 jl de membranas. Las placas de ensayo se incubaron durante 6 horas a 37 °C. Las reacciones de union se terminaron por filtracion rapida sobre placas de filtro de fibra de vidrio GF/B (Perkin Elmer Inc., Wellesley, MA) previamente tratadas en 0,3 % de polietilenimina (PEI). Las placas de filtro se aclararon tres veces con tampon de lavado (HEPES 10 mM) para eliminar la radiactividad no unida. Entonces, las placas se secaron al aire y se anadieron 50 jl de lfquido de centelleo lfquido Microscint-20 (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA) a cada pocillo. A continuacion, las placas se contaron en un contador de centelleo lfquido PerkinElmer Topcount (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Los datos de union se analizaron por analisis de regresion no lineal con el paquete de software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando el modelo de competicion de un sitio. Los valores de K,- para los compuestos de prueba se calcularon a partir de valores de CI50 observados y el valor de Kd del radioligando usando la ecuacion de Cheng-Prusoff (Cheng Y; Prusoff W.H. Biochemical Pharmacology 22(23):3099-108 (1973)). Los valores de K, se convirtieron en valores de pKi para determinar la media geometrica y los intervalos de confianza del 95 %. Esta estadfstica resumen se convirtio entonces de nuevo en valores de K, para informar los datos.
En este ensayo, un valor de K,- mas bajo indica que el compuesto de prueba tiene una mayor afinidad de union por el receptor probado. Se encontro que el compuesto de formula I tema un valor de K, inferior a aproximadamente 5 nM para el subtipo de receptor muscarmico Macuando se probo en este o un ensayo similar.
ENSAYO 2
Ensayos de potencia funcional de receptores muscarinicos
Bloqueo de la inhibicion mediada por agonistas de la acumulacion de AMPc
En este ensayo, la potencia funcional de un compuesto de prueba se determina midiendo la capacidad del compuesto de prueba para bloquear la inhibicion por oxotremorina de la acumulacion de AMPc mediada por forskolina en celulas CHO-K1 que expresan el receptor hM2.
Los ensayos de AMPc se realizan en un formato de radioinmunoensayo usando el sistema de ensayo de activacion de adenilil ciclasa Flashplate con 125I-AMPc (NEN SMP004B, PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA), segun las instrucciones del fabricante.
Las celulas se aclaran una vez con dPBS y se elevaron con disolucion de tripsina-EDTA (0,05 % de tripsina/ EDTA 0,53 mM) como se describe en el Ensayo 1. Las celulas desprendidas se lavan dos veces por centrifugacion a 650 x g durante cinco minutos en 50 ml de dPBS. El sedimento de celulas se resuspende entonces en 10 ml de dPBS, y las celulas se cuentan con un contador de partfculas dual Coulter Z1 (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Las celulas se centrifugan de nuevo a 650 x g durante cinco minutos y se resuspenden en tampon de estimulacion a una concentracion de ensayo de 1,6 x 106 - 2,8 x 106 celulas/ml.
El compuesto de prueba se disuelve inicialmente a una concentracion de 400 jM en tampon de dilucion (dPBS complementado con 1 mg/ml de BSA (0,1 %)), y a continuacion se diluye en serie con tampon de dilucion a concentraciones molares finales que oscilan de 100 jM a 0,1 nM. La oxotremorina se diluye de una manera similar.
Para medir la inhibicion por oxotremorina de la actividad de AC, se anaden 25 jl de forskolina (concentracion final 25 jM diluida en dPBS), 25 jl de oxotremorina diluida y 50 jl de celulas a pocillos de ensayo de agonista. Para medir la capacidad de un compuesto de prueba para bloquear la actividad de AC inhibida por oxotremorina, se anaden 25 jl de forskolina y oxotremorina (concentraciones finales 25 jM y 5 jM, respectivamente, diluidas en dPBS), 25 jl de compuesto de prueba diluido y 50 jl de celulas a los restantes pocillos de ensayo.
Las reacciones se incuban durante 10 minutos a 37 °C y se detienen mediante la adicion de 100 jl de tampon de deteccion frio en hielo. Las placas se tapan, se incuban durante la noche a temperatura ambiente y se cuentan a la manana siguiente en un contador de centelleo lfquido TopCount de PerkinElmer (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). La cantidad de AMPc producida (pmol/pocillo) se calcula basandose en los recuentos observados para las muestras y los patrones de AMPc, como se describe en el manual de usuario del fabricante. Los datos se analizan por analisis de regresion no lineal con el paquete de software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando la ecuacion de competicion de un sitio de regresion no lineal. La ecuacion de Cheng-Prusoff se usa para calcular K,, usando la CE50 de la curva de concentracion-respuesta de oxotremorina y la concentracion de ensayo de
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oxotremorina como Kd y [L], respectivamente. Los valores de K,- se convierten en valores de pK,- para determinar la media geometrica y los intervalos de confianza del 95 %. Esta estad^stica resumen se convierte de nuevo en valores de K, para informar datos.
En este ensayo, un menor valor de K, indica que el compuesto de prueba tiene una mayor actividad funcional en el receptor probado. Se encontro que el compuesto de formula I tema un valor de K inferior a aproximadamente 5 nM para el bloqueo de la inhibicion por oxotremorina de la acumulacion de AMPc mediada por forskolina en celulas CHO-K1 que expresan el receptor hM2, cuando se prueba en este ensayo o un ensayo similar.
Bloqueo de la union de [35S]GTPyS mediada por agonista
En un segundo ensayo funcional, la potencia funcional de compuestos de prueba puede determinarse midiendo la capacidad de los compuestos para bloquear la union de [35S]gTPyS estimulada por oxotremorina en celulas CHO- K1 que expresan el receptor hM2.
En el momento de uso, membranas congeladas se descongelan y a continuacion se diluyen en tampon de ensayo con una concentracion de tejido objetivo final de 5-10 |jg de protema por pocillo. Las membranas se homogenefzan brevemente usando un disruptor de tejidos Polytron PT-2100 y a continuacion se anaden a las placas de ensayo.
El valor de CEgo (concentracion eficaz para el 90 % de respuesta maxima) para la estimulacion de la union de [35S]GTPyS por el agonista oxotremorina se determina en cada experimento.
Para determinar la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la union de [35S]GTPyS estimulada por oxotremorina, lo siguiente se anade a cada pocillo de placas de 96 pocillos: 25 jl de tampon de ensayo con [35S]GTPyS (0,4 nM), 25 jl de oxotremorina (CEgo) y GDP (3 jM), 25 jl de compuesto de prueba diluido y 25 jl de membranas de celulas CHO que expresan el receptor hM2. Las placas de ensayo se incuban entonces a 37 °C durante 60 minutos. Las placas de ensayo se filtran sobre 1 % de filtros GF/B pretratados con BSA usando un recolector de 96 pocillos de PerkinElmer. Las placas se aclaran con tampon de lavado fno en hielo durante 3 x 3 segundos y a continuacion se secan al aire o a vado. Se anade lfquido de centelleo Microscint-20 (50 jl) a cada pocillo, y cada placa se sella y se cuenta la radiactividad en un Topcounter (PerkinElmer). Los datos se analizan por analisis de regresion no lineal con el paquete de software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando la ecuacion de competicion de un sitio de regresion no lineal. La ecuacion de Cheng-Prusoff se usa para calcular K,, usando los valores de CI50 de la curva de concentracion-respuesta para el compuesto de prueba y la concentracion de oxotremorina en el ensayo como Kd y [L], concentracion ligando, respectivamente.
En este ensayo, un menor valor de K,- indica que el compuesto de prueba tiene una mayor actividad funcional en el receptor probado. Se encontro que el compuesto de formula I tema un valor de Ki inferior a aproximadamente 5 nM para el bloqueo de la union de [35S]GTPyS estimulada por oxotremorina en celulas CHO-K1 que expresan el receptor hM2, cuando se prueba en este ensayo o un ensayo similar.
Bloqueo de la liberacion de calcio mediada por agonista mediante ensayos de FLIPR
Los subtipos de receptor muscarmico (receptores M1, M3 y M5), que se acoplan a protemas Gq, activan la via de la fosfolipasa C (PLC) tras la union del agonista al receptor. Como resultado, PLC activada hidroliza el difosfato de fosfatil inositol (PIP2) a diacilglicerol (DAG) y fosfatidil-1,4,5-trifosfato (IP3), que a su vez genera la liberacion de calcio de reservas intracelulares, es decir, el retfculo endoplasmico y sarcoplasmico. El ensayo de FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) saca el maximo rendimiento de este aumento en el calcio intracelular usando un colorante sensible al calcio (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR) que fluoresce cuando se une a calcio libre. Este acontecimiento de fluorescencia se mide en tiempo real por el FLIPR, que detecta el cambio en fluorescencia de una monocapa de celulas clonada con receptores M1 y M3 humano, y M5 de chimpance. La potencia del antagonista puede determinarse por la capacidad de los antagonistas para inhibir aumentos mediados por agonistas en calcio intracelular.
Para los ensayos de estimulacion de calcio de FLIPR, celulas CHO que expresan establemente los receptores hM1, hM3 y cMg se siembran en placas de FLIPR de 96 pocillos la noche antes de hacer el ensayo. Las celulas sembradas se lavan dos veces por Cellwash (MTX Labsystems, Inc.) con tampon FLIPR (HEPES 10 mM, pH 7,4, cloruro de calcio 2 mM, probenecid 2,5 mM en HBSS sin calcio y magnesio) para eliminar medios de crecimiento y dejando 50 jl/pocillo de tampon FLIPR. Las celulas se incuban entonces con 50 jl/pocillo de FLUO-4AM 4 jM (se preparo una disolucion 2X) durante 40 minutos a 37 °C, 5 % de dioxido de carbono. Tras el periodo de incubacion con colorante, las celulas se lavan dos veces con tampon FLIPR, dejando un volumen final de 50 jl/pocillo.
Para determinar la potencia antagonista, la estimulacion dependiente de la dosis de la liberacion de Ca2+ intracelular para oxotremorina se determina primero de manera que la potencia del antagonista pueda medirse despues contra la estimulacion de oxotremorina a una concentracion CE90. Las celulas se incuban primero con tampon de dilucion de compuesto durante 20 minutos, seguido de la adicion de agonista, que se realiza por el FLIPR. Se genera un valor de CE90 para oxotremorina segun el metodo detallado en la medicion de FLIPR y la seccion de reduccion de datos de mas adelante, conjuntamente con la formula CEf = ((F/100-F)A1/H) * CE50. Se prepara una concentracion
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de oxotremorina de 3 x ECf en placas de estimulacion de forma que se anada una concentracion de CE90 de oxotremorina a cada pocillo en las placas de ensayo de inhibicion de antagonista.
Los parametros usados para FLIPR son: longitud de exposicion de 0,4 segundos, intensidad del laser de 0,5 vatios, longitud de onda de excitacion de 488 nm y longitud de onda de emision de 550 nm. El nivel inicial se determina midiendo el cambio en la fluorescencia durante 10 segundos antes de la adicion de agonista. Tras la estimulacion del agonista, el FLIPR mide continuamente el cambio de fluorescencia cada 0,5 a 1 segundos durante 1,5 minutos para capturar el maximo cambio de fluorescencia.
El cambio de fluorescencia se expresa como la maxima fluorescencia menos la fluorescencia inicial para cada pocillo. Los datos sin procesar se analizan contra el logaritmo de la concentracion de farmaco por regresion no lineal con GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) usando el modelo de construccion para dosis- respuesta sigmoide. Los valores de Ki de antagonista se determinan por Prism usando el valor de CE50 de oxotremorina como Kd y CE90 de oxotremorina para la concentracion de ligando segun la ecuacion de Cheng-Prusoff (Cheng & Prusoff, 1973).
En este ensayo, un menor valor de Ki indica que el compuesto de prueba tiene una mayor actividad funcional en el receptor probado. Se encontro que el compuesto de formula I tema un valor de Ki inferior a aproximadamente 5 nM para el bloqueo de la liberacion de calcio mediada por agonista en celulas CHO que expresan establemente el receptor hM3, cuando se prueba en este ensayo o un ensayo similar.
Ensayo 3
Ensayo de rata de Einthoven
Este ensayo in vivo se usa para evaluar los efectos broncoprotectores de compuestos de prueba que presentan actividad de antagonista de receptores muscarmicos. Todos los compuestos de prueba se diluyen en agua esteril y se dosifican por via por inhalacion (IH). Las ratas (Sprague-Dawley, macho, 250-350 g) se exponen al aerosol generado a partir de un LC Star Nebulizer Set y se conduce por una mezcla de gases (5 % de CO2/95 % de aire atmosferico). Cada disolucion de compuesto de prueba se nebuliza durante un periodo de tiempo de 10 minutos en una camara de dosificacion con forma de tarta capaz de contener seis ratas. En momentos de tiempo predeterminados despues de la inhalacion de compuesto, se realiza el ensayo de Einthoven.
Treinta minutos antes del inicio de la evaluacion pulmonar, los animales se anestesian con inactina (tiobutabarbital, 120 mg/kg IP). La vena yugular se cateteriza con cateteres de polietileno llenos de solucion salina (PE-50) y se usa para infundir MCh. Entonces se direcciona la traquea y se canula con una aguja de 14G y se usa para la ventilacion de la rata durante la evaluacion pulmonar. Una vez se ha completado la cirugfa, las ratas se ventilan usando un equipo de respirador de piston a un volumen de embolada de 1 ml/100 g de peso corporal pero sin superar 2,5 ml de volumen, y a una tasa de 90 emboladas por minuto.
Se miden los cambios en la presion que se producen con cada respiracion. Los valores iniciales se recogen durante al menos 2,5 minutos, entonces las ratas se exponen no acumulativamente a aumentos incrementales de 2 veces del MCh broncoconstrictor (5, 10, 20, 40 y 80 pg/ml). El MCh se infunde durante 2,5 minutos desde una bomba de jeringa a una tasa de 2 ml/kg/min. Los animales se sacrifican tras completarse los estudios.
Los cambios en la presion de ventilacion (cm de H2O) en animales tratados se expresan como el % de inhibicion de respuesta de MCh con respecto a los animales de control. En este ensayo, un mayor valor de % de inhibicion indica que el compuesto de prueba tiene un efecto broncoprotector. Se espera que el compuesto de formula I, cuando se prueba en este ensayo a una dosis de 100 pg/ml, presente mas del 35 % de inhibicion, posiblemente mas del 70 % de inhibicion, e incluso mas posiblemente mas del 90 % de inhibicion.
Determinacion de ID50 a las 1,5 h
Se evaluaron antagonistas muscarmicos estandar en el ensayo de rata de Einthoven 1,5 h despues de la dosis. Se determino que el orden de potencia (ID50) para los cinco patrones probados era: ipratropio (4,4 pg/ml) > tiotropio (6 pg/ml)> des-metil-tiotropio (12 pg/ml) > glicopirrolato (15 pg/ml) > LAS-34237 (24 pg/ml). La potencia del compuesto de prueba se determina similarmente 1,5 h despues de la dosis.
Determinacion de ID50 a las 6 y 24 h
Los patrones tiotropio e ipratropio tambien se evaluaron 24 h y/o 6 h despues de la dosis en el ensayo de rata de Einthoven. El ipratropio (10 y 30 pg/ml) fue aproximadamente 3 veces menos potente 6 h despues de la dosis en comparacion con su potencia a las 1,5 h. La perdida de actividad observada en este momento de tiempo (6 h) esta de acuerdo con su duracion de accion relativamente corta en la clmica. El tiotropio mostro una lenta aparicion del efecto lograndose la broncoproteccion pico 6 h despues de la dosis. Sus valores de potencia a las 6 h y 24 h no fueron significativamente diferentes entre sf y fueron aproximadamente 2 veces mas potentes en comparacion con
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su potencia a las 1,5 h. La aparicion de accion del compuesto de prueba, ademas de los valores de potencia a las 6 y 24 h, se determina similarmente.
ENSAYO 4
Ensayo de rata antisialogogo
Se dosifican ratas (Sprague-Dawley, macho, 250-350 g), se anestesian y se canulan como se ha descrito para el Ensayo 3. En momentos de tiempo predeterminados y despues de la cirugfa, los animales se colocan sobre su lado dorsal a una inclinacion de 20° con su cabeza en pendiente hacia abajo. Una almohadilla de gasa previamente pesada se inserta en la boca del animal y se administra el agonista muscarmico pilocarpina (PILO) (3 mg/kg, iv.). La saliva producida durante 10 minutos despues de PILO se mide gravimetricamente determinando el peso de la almohadilla de gasa antes y despues de PILO. Los efectos antisialogogo se expresan como el % de inhibicion de la salivacion con respecto a animales de control.
Determinacion de DI50 a las 1, 6 y 24 h
Se desarrollo el ensayo de rata antisialogogo para evaluar la exposicion sistemica y calcular el mdice de selectividad del pulmon (LSI) de compuestos de prueba. El patron, tiotropio, se evaluo en este modelo 1, 6 y 24 h despues de la dosis. Se encontro que el tiotropio era mas potente en inhibir la salivacion inducida por pilocarpina 6 h despues de la dosis. Este hallazgo esta de acuerdo con los efectos pico observados en el ensayo de Einthoven.
Este modelo es una version modificada del procedimiento descrito en Rechter, “Estimation of anticholinergic drug effects in mice by antagonism against pilocarpine-induced salivation” Ata Pharmacol Toxicol 24:243-254 (1996). El peso medio de saliva en animales tratados con vehmulo, en cada momento pre-tratamiento, se calcula y se usa para calcular el % de inhibicion de la salivacion, en el momento de pre-tratamiento correspondiente, a cada dosis.
Se espera que los compuestos a modo de ejemplo de la invencion que se prueban en este ensayo presenten valores de DI50 inferiores a 100 pg/ml (medidos a las 24 horas), esperandose que algunos compuestos presenten un valor de DI50 inferior a 30 pg/ml, algunos inferior a 20 pg/ml y algunos inferior a 15 pg/ml.
La relacion de la DI50 de antisialogogo con respecto DI50 de broncoprotector se usa para calcular el mdice de selectividad de pulmon aparente del compuesto de prueba. Generalmente se prefieren los compuestos que tienen un mdice de selectividad de pulmon aparente superior a aproximadamente 5.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. - Una base libre cristalina del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico caracterizada por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a valores 20 de 6,6 ± 0,1, 13,1 ± 0,1, 18,6 ± 0,1, 19,7 ± 0,1 y 20,2 ± 0,1 y que tiene cinco o mas picos de difraccion adicionales a valores 20 seleccionados de 8,8 ± 0,1, 10,1 ± 0,1, 11,4 ± 0,1, 11,6 ± 0,1, 14,8 ± 0,1, 15,2 ± 0,1, 16,1 ± 0,1, 16,4 ± 0,1, 16,9 ± 0,1, 17,5 ± 0,1, 18,2 ± 0,1, 19,3 ± 0,1, 19,9 ± 0,1, 20,8 ± 0,1, 21,1 ± 0,1, 21,7 ± 0,1 y 22,3 ± 0,1.
  2. 2. - El compuesto cristalino de la reivindicacion 1, caracterizado por un patron de difraccion de rayos X de polvo que comprende picos de difraccion a valores 20 seleccionados de 6,6 ± 0,1, 11,4 ± 0,1, 13,1 ± 0,1, 16,1 ± 0,1, 17,5 ± 0,1, 18,2 ± 0,1, 18,6 ± 0,1, 19,3 ± 0,1, 19,7 ± 0,1, 19,9 ± 0,1, 20,2 ± 0,1, 20,8 ± 0,1, 21,1 ± 0,1, 21,7 ± 0,1 y 22,3 ± 0,1.
  3. 3. - El compuesto cristalino de la reivindicacion 1, caracterizado por un patron de difraccion de rayos X de polvo segun el patron mostrado en la FIG. 1.
  4. 4. - El compuesto de la reivindicacion 1, caracterizado adicionalmente por un termograma de calorimetna diferencial de barrido segun el mostrado en la FIG. 4.
  5. 5. - Una composicion farmaceutica que comprende un vehuculo farmaceuticamente aceptable y el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6. - La composicion de la reivindicacion 5, que comprende ademas un agente seleccionado de agonistas de receptores p2-adrenergicos, agentes antiinflamatorios esteroideos, inhibidores de la fosfodiesterasa-4 y combinaciones de los mismos; en la que la forma cristalina y el agente se formulan juntos o por separado.
  7. 7. - La composicion de la reivindicacion 6, que comprende un agonista de receptores p2-adrenergicos y un agente antiinflamatorio esteroideo.
  8. 8. - El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en forma micronizada.
  9. 9. - Un proceso de preparacion de la base libre cristalina de la reivindicacion 1, que comprende poner en contacto el ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]-metilamino}etil)piperidin-44lico del acido bifenil-2-ilcarbamico con un disolvente que consiste en acetonitrilo, siendo la relacion de miligramos del ester con respecto a los mililitros totales de acetonitrilo 100:1, y anadiendose el acetonitrilo en dos etapas.
  10. 10. - Un proceso de preparacion de la base libre cristalina de la reivindicacion 1, que comprende a) formar un cristal semilla de la base libre cristalina de la reivindicacion 1; b) disolver la sal de difosfato del ester 1-(2-{[4-(4- carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]-metilamino}etil)piperidin-4Hlico del acido bifenil-2-ilcarbamico en acetato de isopropilo y agua para formar una disolucion; y c) anadir el cristal semilla a la disolucion.
  11. 11. - Un proceso de purificacion del ester 1-(2-{[4-(4-carbamoilpiperidin-1-ilmetil)benzoil]metilamino}etil)piperidin-4- flico del acido bifenil-2-ilcarbamico, que comprende formar el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  12. 12. - Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en terapia.
  13. 13. - Un compuesto segun la reivindicacion 12, para su uso en el tratamiento de enfermedad pulmonar obstructiva cronica o asma, o para producir broncodilatacion.
  14. 14. - El uso de un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedad pulmonar obstructiva cronica o asma, o para producir broncodilatacion.
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