ES2554688T3 - Procedimiento de tratamiento de enfermedades - Google Patents

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ES2554688T3 ES12007365.5T ES12007365T ES2554688T3 ES 2554688 T3 ES2554688 T3 ES 2554688T3 ES 12007365 T ES12007365 T ES 12007365T ES 2554688 T3 ES2554688 T3 ES 2554688T3
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Abstract

Danazol o una sal farmacéuticamente aceptable de danazol para su uso en la inhibición de la hiperpermeabilidad vascular, en el que el danazol o la sal farmacéuticamente aceptable de danazol se administra por vía oral en una dosis diaria de 10 mg/día a aproximadamente 90 mg/día o por vía tópica o vía local a una concentración de 0,0001 μM a 5 μM.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de tratamiento de enfermedades Campo de la invencion
La invencion se refiere a danazol o una sal farmaceuticamente aceptable de danazol para su uso en la inhibicion de la hiperpermeabilidad vascular. En particular, estas enfermedades y afecciones se tratan con una cantidad de un compuesto de danazol eficaz para inhibir la hiperpermeabilidad vascular y una cantidad de un segundo farmaco eficaz para tratar la enfermedad o afeccion. Se describen ademas, pero no son parte de la presente invencion, composiciones farmaceuticas y kits que comprenden un compuesto de danazol y un segundo farmaco eficaz para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular.
Se describe ademas, pero no es parte de la invencion, un metodo para inhibir la hiperpermeabilidad vascular, que es un efecto secundario provocado por la administracion de un farmaco a, u otro tratamiento de, un animal. El metodo comprende la administracion de un compuesto de danazol al animal, eficaz para inhibir el efecto secundario de la hiperpermeabilidad vascular. Tambien se desvela una composicion farmaceutica y un kit que comprende un farmaco que provoca como efecto secundario hiperpermeabilidad vascular y un compuesto de danazol.
Se describe ademas, pero no es parte de la invencion, la modulacion del citoesqueleto de celulas endoteliales. En particular, el citoesqueleto se modula usando una cantidad de un compuesto de danazol y una cantidad de un segundo farmaco eficaz para modular el citoesqueleto. Tambien se describen composiciones farmaceuticas y kits que comprenden un compuesto de danazol y un segundo farmaco eficaz para modular los citoesqueletos de celulas endoteliales.
Antecedentes
El endotelio vascular reviste el interior de todos los vasos sangumeos. Actua de superficie de separacion entre la sangre y los tejidos y organos. El endotelio forma una barrera semipermeable que mantiene la integridad del compartimiento del fluido sangumeo, pero permite el paso de manera regulada de agua, iones, moleculas pequenas, macromoleculas y celulas. La desregulacion de este proceso produce la fuga vascular a los tejidos subyacentes. La fuga de fluido a los tejidos que provoca edema puede tener consecuencias graves y peligrosas para la vida.
Por consiguiente, sena altamente deseable tener metodos y productos para reducir el edema y restaurar la barrera endotelial a un nivel fisiologico.
El documento WO 2007/009087 A2 se refiere al tratamiento de enfermedades y afecciones con una cantidad eficaz de un esteroide que tiene las formulas dadas en la memoria descriptiva, o una sal o ester farmacologicamente aceptable del mismo. La enfermedad o afeccion tratable incluye enfermedades y afecciones angiogenicos del ojo, enfermedades y afecciones angiogenicos del cerebro, enfermedades y afecciones inflamatorios del ojo, enfermedades y afecciones inflamatorios del cerebro y enfermedades neurodegenerativas.
Tomino Y. et al.: "Clinical Effect of Danazol en Patients with IGA Nephropathy", Japanese Journal of Medicina, vol. 26, n.° 2, 1987, paginas 162-166 desvela la eficacia de danazol 300 mg/dfa en el tratamiento de nefropatfa por IgA, en la que el danazol se administra por via oral.
Hoepfl et al.: "Long-term Danazol Therapy for Hereditary Angio-Edema", DMW (Deutsche Medizinische Wochenschrift), vol. 115, n.° 4, 1990, paginas 133, 138 desvela el uso de 400 mg de danazol por semana para el tratamiento de angioedema hereditario.
Sumario de la invencion
La invencion proporciona danazol o una sal farmaceuticamente aceptable de danazol para su uso en la inhibicion de la hiperpermeabilidad vascular de acuerdo con la reivindicacion 1. Adicionalmente se describe un metodo de tratamiento de una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular en un animal. El metodo comprende administrar al animal una cantidad de un compuesto de danazol eficaz para inhibir la hiperpermeabilidad vascular y una cantidad de un segundo farmaco eficaz para tratar la enfermedad o afeccion.
Tambien se describe una composicion farmaceutica que comprende un transportador farmaceuticamente aceptable, un primer farmaco y un segundo farmaco. El primer farmaco es un compuesto de danazol y el segundo farmaco es un farmaco adecuado para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular.
Se describe adicionalmente un kit que comprende un primer contenedor y un segundo contenedor. El primer contenedor comprende un compuesto de danazol y el segundo contenedor comprende un farmaco adecuado para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular.
Ademas, se describe un metodo de inhibicion de la hiperpermeabilidad vascular en un animal que es un efecto secundario provocado por un farmaco administrado al animal o por un tratamiento del animal. El metodo comprende
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administrar al animal una cantidad eficaz de un compuesto de danazol eficaz para inhibir la hiperpermeabilidad vascular.
Se describe ademas una composicion farmaceutica que comprende un transportador farmaceuticamente aceptable, un primer farmaco y un segundo farmaco. El primer farmaco es un compuesto de danazol y el segundo farmaco es un farmaco que provoca hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario.
Se describe ademas un kit que comprende un primer contenedor y un segundo contenedor. El primer contenedor comprende un compuesto de danazol y el segundo contenedor comprende un farmaco que provoca hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario.
Se describe ademas, pero no es parte de la invencion, un metodo de modulacion del citoesqueleto de celulas endoteliales en un animal. El metodo comprende administrar al animal una cantidad eficaz de un compuesto de danazol y una cantidad eficaz de un segundo farmaco eficaz para modular el citoesqueleto.
Tambien se describe una composicion farmaceutica que comprende un transportador farmaceuticamente aceptable, un primer farmaco y un segundo farmaco. El primer farmaco es un compuesto de danazol y el segundo farmaco es un farmaco que modula el citoesqueleto de celulas endoteliales.
“Hiperpermeabilidad vascular” se usa en el presente documento para indicar la permeabilidad de un endotelio vascular que esta aumentada en comparacion con los niveles basales. “Hiperpermeabilidad vascular”, como se usa en el presente documento, incluye la hiperpermeabilidad causada por paracelular y la hiperpermeabilidad causada por transcitosis.
“Hiperpermeabilidad causada por paracelular” se usa en el presente documento para indicar la hiperpermeabilidad vascular causada por el transporte paracelular que esta aumentada en comparacion con los niveles basales. A continuacion se describen otras caractensticas de la “hiperpermeabilidad causada por paracelular”.
“Transporte paracelular” se usa en el presente documento para indicar el movimiento de iones, moleculas y fluidos a traves de las uniones interendoteliales (UIE) entre las celulas endoteliales de un endotelio.
“Hiperpermeabilidad causada por transcitosis” se usa en el presente documento para indicar la hiperpermeabilidad vascular causada por transcitosis que esta aumentada en comparacion con los niveles basales.
“Transcitosis” se usa en el presente documento para indicar el transporte activo de macromoleculas y constituyentes plasmaticos de fase fluida acompanantes a traves de las celulas endoteliales de un endotelio.
“Nivel basal” se usa en el presente documento para indicar el nivel encontrado en un tejido u organo normal.
“Inhibir”, “que inhibe” y terminos similares se usan en el presente documento para indicar reducir, retardar o prevenir.
“Mediado” y terminos similares se usan en el presente documento para indicar causado por, que causa, que participa o agravado por, hiperpermeabilidad vascular.
“Tratar”, “tratando” o “tratamiento” se usan en el presente documento para indicar la reduccion (total o parcial) de los smtomas, la duracion o la gravedad de una enfermedad o afeccion, incluyendo la curacion de la enfermedad, o la prevencion de la enfermedad o afeccion.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra los niveles de DO medidos despues de la incubacion de celulas HUVEC con danazol como una medida de su capacidad para prevenir la proliferacion inicial de celulas endoteliales.
La figura 2 muestra fotograffas de las celulas HUVEC tomadas despues de la incubacion con danazol como una medida de su capacidad para prevenir la formacion de tubos de las celulas endoteliales. A = control; B = danazol 1 |jM, C = danazol 10 jM, D = danazol 50 jM y E = LY294002 50 jM.
La figura 3 muestra la fluorescencia medida despues del tratamiento de las celulas HUVEC con danazol como una medida de su capacidad para prevenir la invasion de celulas endoteliales.
Descripcion detallada de las realizaciones presentemente preferidas de la invencion
El endotelio es un elemento de control clave que controla el intercambio de moleculas desde la sangre al parenquima tisular. Controla en gran medida la permeabilidad de un lecho vascular particular a las moleculas trasportadas por la sangre. La permeabilidad y la selectividad de la barrera celular endotelial son fuertemente dependientes de la estructura y tipo de endotelio que reviste la microvasculatura en los diferentes lechos vasculares. Las celulas endoteliales que revisten los lechos microvasculares de diferentes organos presentan una diferenciacion estructural que puede agruparse en tres categonas morfologicas principales: sinusoidal, fenestrada y continua.
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El endotelio sinusoidal (tambien denominado “endotelio discontinuo”) tiene grandes huecos intercelulares y no tiene membrana basal, permitiendo un transporte mmimamente restringido de moleculas de la luz capilar al tejido y viceversa. El endotelio sinusoidal se encuentra en hugado, bazo y medula osea.
Los endotelios fenestrados se caracterizan por la presencia de un gran numero de aberturas transcelulares circulares llamadas fenestraciones con un diametro de 60 nm a 80 nm. Los endotelios fenestrados se encuentran en tejidos y organos que requieren el rapido intercambio de moleculas pequenas, que incluyen el rinon (glomerulos, capilares peritubulares y vasos rectos ascendentes), el pancreas, las glandulas suprarrenales, las glandulas endocrinas y el intestino. Las fenestraciones estan cubiertas por finos diafragmas, excepto aquellos glomerulos sanos maduros. Vease Ichimura y col., J. Am. Soc. Nephrol., 19:1463-1471 (2008).
Los endotelios continuos no contienen fenestraciones o grandes huecos. En su lugar, los endotelios continuos se caracterizan por una monocapa de celulas endoteliales sin interrupciones. La mayona de los endotelios en el cuerpo son endotelios continuos, y el endotelio continuo se encuentra en o alrededor del cerebro (barrera hematoencefalica), el diafragma, la musculatura duodenal, la grasa, el corazon, algunas areas de los rinones (microvasculatura papilar, vasos rectos descendentes), los vasos sangumeos grandes, los pulmones, el mesenterio, los nervios, la retina (barrera hematorretiniana), el musculo esqueletico, los testmulos y otros organos y tejidos del cuerpo.
Se puede considerar, en un sentido general, que el transporte endotelial en el endotelio continuo se produce por las vfas paracelular y transcelular. La via paracelular es la via entre las celulas endoteliales, a traves de las uniones interendoteliales (UIE). En endotelio continuo inalterado, el agua, los iones y las moleculas pequenas se transportan paracelularmente por difusion y conveccion. Una cantidad significativa de agua (hasta el 40 %) tambien cruza la barrera de celulas endoteliales transcelularmente a traves de los canales de membrana de transporte de agua llamados acuaporinas. Una variedad de estfmulos puede alterar la organizacion de las UIE, abriendose asf huecos en la barrera endotelial. La formacion de estos huecos intercelulares permite de manera no restringida el paso de fluido, iones, macromoleculas (por ejemplo, protemas) y otros componentes plasmaticos entre las celulas endoteliales. Esta hiperpermeabilidad causada por paracelular produce edema y otros efectos adversos que con el tiempo pueden producir dano a tejidos y organos.
La via transcelular es responsable del transporte activo de macromoleculas, tales como albumina y otras protemas plasmaticas, a traves de las celulas endoteliales, un proceso denominado “transcitosis”. El transporte de macromoleculas se produce en vesmulas llamadas caveolas. Casi todos los endotelios continuos tienen abundantes caveolas, excepto los endotelios continuos localizados en el cerebro y testmulos, que tienen pocas caveolas. La transcitosis es un proceso en multiples etapas que implica la sucesiva gemacion y fision de caveolas de la membrana plasmatica y la translocacion a traves de la celula, seguido de acoplamiento y fusion con la membrana plasmatica opuesta, en la que las caveolas liberan su contenido por exocitosis al intersticio. La transcitosis es selectiva y esta bien regulada en condiciones fisiologicas normales.
Existe una creciente toma de conciencia de la importancia fundamental de la via transcelular. La transcitosis de protemas plasmaticas, especialmente de albumina, que representa el 65 % de las protemas plasmaticas, es de especial interes debido a su capacidad para regular el gradiente de presion oncotica transvascular. Como puede apreciarse entonces, el aumento de la transcitosis de albumina y otras protemas plasmaticas por encima de los niveles basales aumentara la concentracion de protemas tisulares de las mismas que, a su vez, hara que el agua se desplace a traves de la barrera endotelial, produciendo asf edema.
Las lipoprotemas de baja densidad (LDL) son tambien transportadas a traves de las celulas endoteliales por transcitosis. En hiperlipidemia se ha detectado un aumento significativo en la transcitosis de LDL como acontecimiento inicial en la aterogenesis. La LDL se acumula en el espacio subendotelial, atrapadas dentro de la lamina basal expandida y la matriz extracelular. La acumulacion subendotelial de lipoprotemas en la hiperlipidemia va seguida de una cascada de acontecimientos que producen la formacion de placas ateromatosas. Se informa que las lesiones ateroscleroticas avanzadas van ocasionalmente acompanadas de la apertura de las UIE y el paso incontrolado masivo de LDL y albumina.
Las complicaciones vasculares son una caractenstica distintiva de la diabetes. Al nivel de los grandes vasos, la enfermedad parece ser expresada como una aceleracion de un proceso aterosclerotico. Con respecto a la microangiopatfa, las alteraciones en la microvasculatura de la retina, el glomerulo renal y los nervios provocan el mayor numero de complicaciones clmicas, pero un numero cada vez mayor de investigaciones muestra que la diabetes tambien afecta la microvasculatura de otros organos, tales como el mesenterio, la piel, el musculo esqueletico, el corazon, el cerebro y el pulmon, provocando complicaciones clmicas adicionales. En todos estos lechos vasculares, los cambios en la permeabilidad vascular parecen representar una caractenstica distintiva de la disfuncion endotelial diabetica.
En el endotelio continuo, la hiperpermeabilidad capilar a las macromoleculas plasmaticas en la fase temprana de la diabetes se explica por una intensificacion del transporte vesicular transendotelial (es decir, por el aumento de la transcitosis) y no por la desestabilizacion de las UIE. Ademas, se ha informado que las celulas endoteliales de los diabeticos, incluyendo las del cerebro, contienen un elevado numero de caveolas en comparacion con las normales,
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y las protemas glicosiladas, particularmente la albumina glicosilada, son absorbidas por celulas endoteliales y transportadas por transcitosis a velocidades sustancialmente mayores que sus formas nativas. Ademas, el aumento de la transcitosis de las macromoleculas es un proceso que continua mas alla de la fase temprana de la diabetes y que parece ser una causa de edema en los tejidos y organos diabeticos durante toda la enfermedad si no se trata. Este edema, a su vez, conduce a dano a tejidos y organos. Se ha informado de aumentos similares en el transporte transcelular de macromoleculas en hipertension.
La hiperpermeabilidad causada por paracelular tambien es un factor en la diabetes y las complicaciones vasculares de la diabetes. Las UIE de la via paracelular incluyen las uniones adherentes (UA) y las uniones estrechas (UE). La diabetes altera el contenido, fosforilacion y localizacion de ciertas protemas en las UAy en las UE, contribuyendo asf al aumento de la permeabilidad de la barrera endotelial.
En apoyo de la discusion anterior y para mayor informacion, veanse Frank y col., Cell Tissue Res., 335:41-47 (2009), Simionescu y col., Cell Tissue Res., 335:27-40 (2009); van den Berg y col., J. Cyst. Fibros., 7(6): 515-519 (2008); Viazzi y col., Hypertens. Res., 31:873-879 (2008); Antonetti y col., Capttulo 14, paginas 340-342, en Diabetic Retinopathy (editado por Elia J. Duh, Humana Press, 2008), Felinski y col., Current Eye Research, 30:949-957 (2005), Pascariu y col., Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 52(1):65-76 (2004); Bouchard y col., Diabetologia, 45:1017-1025 (2002); Arshi y col., Laboratory Investigation, 80(8):1171-1184 (2000); Vinores y col., Documenta Ophthalmologica, 97:217-228 (1999); Oomen y col., European Journal of Clinical Investigation, 29:10351040 (1999); Vinores y col., Pathol. Res. Pract., 194:497-505 (1998); Antonetti y col., Diabetes, 47:1953-1959 (1998), Popov y col., Acta Diabetol., 34:285-293 (1997); Yamaji y col., Circulation Research, 72:947-957 (1993); Vinores y col., Histochemical Journal, 25:648-663 (1993); Beals y col., Microvascular Research, 45:11-19 (1993); Caldwell y col., Investigative Ophthalmol. Visual Sci., 33(5):1610-1619 (1992).
El transporte endotelial en endotelio fenestrado tambien se produce por transcitosis y la via paracelular. Ademas, el transporte endotelial se produce por medio de las fenestraciones. Los endotelios fenestrados muestran una permeabilidad sorprendentemente alta al agua y solutos hidrofilos pequenos debido a la presencia de las fenestraciones.
Las fenestraciones pueden o pueden no estar cubiertas por un diafragma. Las localizaciones de endotelio con fenestraciones con diafragma incluyen tejido endocrino (por ejemplo, islotes pancreaticos y corteza suprarrenal), mucosa gastrointestinal y capilares peritubulares renales. La permeabilidad a las protemas plasmaticas del endotelio con fenestraciones con diafragma no supera la del endotelio continuo.
Las localizaciones de endotelio con fenestraciones sin diafragma incluyen los glomerulos de los rinones. El endotelio glomerular fenestrado esta cubierto por un glicocaliz que se extiende al interior de las fenestraciones (formando los llamados “tapones de criba”) y por una capa de glicoprotemas superficial de celulas endoteliales mas libremente asociadas. Los analisis matematicos de los estudios de permeabilidad selectiva funcional han concluido que el glicocaliz de las celulas endoteliales glomerulares, incluyendo el presente en las fenestraciones, y su capa superficial asociada, representan la retencion de hasta el 95 % de las protemas plasmaticas dentro de la circulacion.
Se ha encontrado que la perdida de fenestraciones en el endotelio glomerular esta asociada con proteinuria en varias enfermedades, que incluyen nefropatfa diabetica, glomerulopatfa del trasplante, preeclampsia, diabetes, insuficiencia renal, nefropatfa por ciclosporina, nefritis por enfermedad del suero y nefritis por Thy-1. Se ha encontrado que el reordenamiento de actina y, en particular, la despolimerizacion de las fibras de estres es importante para la formacion y el mantenimiento de las fenestraciones.
En apoyo de la anterior discusion de endotelios fenestrados y para informacion adicional, veanse Satchell y col., Am. J. Physiol. Renal Physiol., 296:F947-F956 (2009); Haraldsson y col., Curr. Opin. Nephrol. Hypertens., 18:331-335 (2009); Ichimura y col., J. Am. Soc. Nephrol., 19:1463-1471 (2008); Ballermann, Nephron Physiol., 106:19-25 (2007); Toyoda y col., Diabetes, 56:2155-2160 (2007); Stan, “Endothelial Structures Involved In Vascular Permeability”, paginas 679-688, Endothelial Biomedicine (ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); Simionescu y Antohe, “Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium: Changes in Various Pathologies”, paginas 42-69, The Vascular Endothelium I (eds. Moncada and Higgs, Springer-Verlag, Berlin, 2006).
El transporte endotelial en el endotelio sinusoidal se produce por transcitosis y a traves de los huecos intercelulares (hendiduras interendoteliales) y los huecos intracelulares (fenestraciones). El tratamiento del endotelio sinusoidal con farmacos que alteran los filamentos de actina puede inducir un aumento rapido y sustancial del numero de huecos, que indica regulacion de la porosidad del revestimiento endotelial por el citoesqueleto de actina. Se ha informado que otros farmacos que alteran el citoesqueleto cambian los diametros de las fenestraciones. Por tanto, el citoesqueleto asociado a las fenestraciones probablemente controla la importante funcion de filtracion endotelial en el endotelio sinusoidal. En el fngado, la defenestracion (perdida de fenestraciones), que provoca una reduccion de la permeabilidad del endotelio, se ha asociado a la patogenesis de varias enfermedades y afecciones, que incluyen envejecimiento, aterogenesis, aterosclerosis, cirrosis, fibrosis, insuficiencia hepatica y canceres hepaticos primario y metastasico. En apoyo de lo anterior y para informacion adicional, veanse Yokomori, Med. Mol. Morphol., 41:1-4 (2008); Stan, “Endothelial Structures Involved In Vascular Permeability”, paginas 679-688, Endothelial Biomedicine (ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); DeLeve, “The Hepatic Sinusoidal Endothelial Cell”,
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paginas 1226-1238, Endothelial Biomedicine (ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); Pries y Kuebler, “Normal Endothelium”, paginas 1-40, The Vascular Endothelium I (eds. Moncada and Higgs, Springer- Verlag, Berlin, 2006); Simionescu y Antohe, “Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium: Changes in Various Pathologies”, paginas 42-69, The Vascular Endothelium I (eds. Moncada and Higgs, Springer-Verlag, Berlin, 2006); Braet y Wisse, Comparative Hepatology, 1:1-17 (2002); Kanai y col., Anat. Rec., 244:175-181 (1996); Kempka y col., Exp. Cell Res., 176:38-48 (1988); Kishimoto y col., Am. J. Anat., 178:241-249 (1987).
Se describe, pero no es parte de la invencion, un procedimiento de inhibicion de la hiperpermeabilidad vascular presente en cualquier tejido u organo que contiene o que esta rodeado por endotelio continuo. Como se ha senalado anteriormente, el endotelio continuo esta presente en o alrededor del cerebro (barrera hematoencefalica), el diafragma, la musculatura duodenal, la grasa, el corazon, algunas areas del rinon (microvasculatura papilar, vasos rectos descendentes), los vasos sangumeos grandes, los pulmones, el mesenterio, los nervios, la retina (barrera hematorretiniana), el musculo esqueletico, la piel, los testmulos, la vena umbilical y otros tejidos y organos del cuerpo. Preferentemente, el endotelio continuo es el que se encuentra en o alrededor del cerebro, el corazon, los pulmones, los nervios o la retina.
La invencion proporciona tambien danazol o una sal farmaceuticamente aceptable de danazol para uso en la inhibicion de la hiperpermeabilidad vascular presente en cualquier tejido u organo que contiene o esta rodeado por endotelio fenestrado. Como se ha senalado anteriormente, el endotelio fenestrado esta presente en o alrededor del rinon (glomerulos, capilares peritubulares y vasos rectos ascendentes), el pancreas, las glandulas suprarrenales, las glandulas endocrinas y el intestino. Preferentemente, el endotelio fenestrado es el que se encuentra en los rinones, especialmente el que se encuentra en los glomerulos de los rinones.
Ademas, puede tratarse, con los compuestos de la invencion, cualquier enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular. Tales enfermedades y afecciones incluyen diabetes, hipertension y aterosclerosis.
En particular, pueden tratarse, con los compuestos de la presente invencion, las complicaciones vasculares de diabetes, que incluyen las del cerebro, corazon, rinones, pulmon, mesenterio, nervios, retina, musculo esqueletico, piel y otros tejidos y organos que contienen endotelio continuo o fenestrado. Estas complicaciones vasculares incluyen edema, acumulacion de LDL en el espacio subendotelial, aterosclerosis acelerada, y las siguientes: cerebro (envejecimiento acelerado de las paredes vasculares), corazon (edema de miocardio, fibrosis del miocardio, disfuncion diastolica, cardiomiopatfa diabetica), rinon (nefropatfa diabetica), pulmon (retraso del desarrollo pulmonar en los fetos de madres diabeticas, alteraciones de varios parametros fisiologicos pulmonares y aumento de la susceptibilidad a infecciones), mesenterio (hiperplasia vascular), nervios (neuropatfa diabetica), retina (edema macular y retinopatfa diabetica) y piel (enrojecimiento, discroirnas, sequedad y ulceraciones).
La retinopatfa diabetica es la causa principal de ceguera que afecta a aproximadamente el 25 % de los aproximadamente 21 millones de estadounidenses con diabetes. Aunque su incidencia y progresion pueden reducirse mediante el control intensivo de la glucemia y la tension arterial, casi todos los pacientes con diabetes mellitus tipo 1 y mas del 60 % de aquellos con diabetes mellitus tipo 2 desarrollan con el tiempo retinopatfa diabetica. Existen dos etapas de retinopatfa diabetica. La primera, la retinopatfa no proliferativa, es la etapa mas temprana de la enfermedad y se caracteriza por aumento de la permeabilidad vascular, microaneurismas, edema y, con el tiempo, oclusiones vasculares. La neovascularizacion no es un componente de la fase no proliferativa. La mayor parte de la perdida visual durante esta etapa es debida a la acumulacion de lfquido en la macula, el area central de la retina. Esta acumulacion de lfquido se llama edema macular y puede provocar disminucion de la vision temporal o permanente. La segunda etapa de la retinopatfa diabetica se llama retinopatfa proliferativa y se caracteriza por formacion anormal de nuevos vasos. Desafortunadamente, esta neovascularizacion anormal puede ser muy perjudicial, debido a que puede provocar hemorragia en el ojo, tejido cicatricial en la retina, desprendimientos de retina diabetica o glaucoma, cualquiera de los cuales puede provocar una disminucion de la vision o ceguera. El edema macular tambien puede producirse en la fase proliferativa.
La neuropatfa diabetica es una complicacion grave comun de la diabetes. Existen cuatro tipos principales de neuropatfa diabetica: neuropatfa periferica, neuropatfa autonomica, radiculoplexopatfa y mononeuropatfa. Los signos y smtomas de la neuropatia periferica, el tipo mas comun de neuropatfa diabetica, incluyen entumecimiento o disminucion de la capacidad de sentir dolor o cambios en las temperatura (especialmente en los pies y dedos de los pies), una sensacion de hormigueo o ardor, dolor agudo, dolor al caminar, sensibilidad extrema al toque mas ligero, debilidad muscular, dificultad para caminar y graves problemas en los pies (tales como ulceras, infecciones, deformidades y dolor oseo y articular). La neuropatfa autonomica afecta al sistema nervioso autonomo que controla el corazon, la vejiga, los pulmones, el estomago, los intestinos, los organos sexuales y los ojos, y pueden producirse problemas en cualquiera de estas areas. La radiculoplexopatfa (tambien llamada amiotrofia diabetica, neuropatfa femoral o neuropatfa proximal) normalmente afectar los nervios en las caderas, hombros o abdomen, normalmente en un lado del cuerpo. Mononeuropatfa significa dano a un solo nervio, normalmente en un brazo, una pierna o la cara. Complicaciones comunes de la neuropatfa diabetica incluyen la perdida de miembros (por ejemplo, dedos de los pies, pies o piernas), articulaciones de Charcot, infecciones urinarias, incontinencia urinaria, hipoglucemia asintomatica (incluso puede ser mortal), hipotension arterial, problemas digestivos (por ejemplo, estrenimiento, diarrea, nauseas y vomitos), disfuncion sexual (por ejemplo, disfuncion erectil) y aumento o disminucion de la sudoracion. Como puede verse, los smtomas pueden variar de leves a dolorosos, incapacitantes e incluso mortales.
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La nefropatfa diabetica es la causa mas comun de insuficiencia renal terminal en los Estados Unidos. Es una complicacion vascular de la diabetes que afecta los capilares glomerulares del rinon y reduce la capacidad de filtracion del rinon. La nefropatfa se indica primero por la aparicion de hiperfiltracion y luego microalbuminuria. La proteinuria masiva y un deterioro progresivo de la funcion renal preceden a la insuficiencia renal terminal. Normalmente, antes de que aparezca cualquier signo de nefropatfa, normalmente se ha diagnosticado retinopatia. Normalmente se recomienda trasplante renal a los pacientes con insuficiencia renal terminal debido a la diabetes. La tasa de supervivencia a los 5 anos para los pacientes que reciben un trasplante es de aproximadamente el 60 % en comparacion con solo el 2 % de aquellos en dialisis.
La hipertension normalmente se desarrolla durante muchos anos, y afecta con el tiempo a casi todo el mundo. La hipertension no controlada aumenta el riesgo de problemas de salud graves, que incluyen infarto de miocardio, insuficiencia cardfaca congestiva, accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periferica, insuficiencia renal, aneurismas, dano ocular y problemas de memoria o comprension.
La aterosclerosis tambien se desarrolla gradualmente. La ateroesclerosis puede afectar las arterias coronarias, la arteria carotida, las arterias perifericas o la microvasculatura, y las complicaciones de la aterosclerosis incluyen enfermedad de las arterias coronarias (que puede provocar angina o un infarto de miocardio), enfermedad microvascular coronaria, enfermedad de las arterias carotidas (que puede provocar un ataque isquemico transitorio o accidente cerebrovascular), enfermedad arterial periferica (que puede provocar perdida de sensibilidad al calor y al fno, o incluso la muerte del tejido), y aneurismas.
Enfermedades y afecciones adicionales que pueden ser tratadas segun la invencion incluyen lesion pulmonar aguda, smdrome disneico agudo (SDA), degeneracion macular senil, edema cerebral, edema coroideo, coroiditis, enfermedad microvascular coronaria, enfermedad microvascular cerebral, enfermedad de Eals, edema producido por lesion (por ejemplo, traumatismo o quemaduras), edema asociado a la hipertension, fuga vascular glomerular, choque hemorragico, smdrome de Irvine Gass, isquemia, edema macular (por ejemplo, producido por oclusiones vasculares, despues de una cirugfa intraocular (por ejemplo, cirugfa de cataratas), uveitis o retinitis pigmentosa, ademas de la causada por la diabetes), nefritis (por ejemplo, glomerulonefritis, nefritis por enfermedad del suero y nefritis por Thy-1), nefropatfas, edema nefrotico, smdrome nefrotico, neuropatfas, insuficiencia organica debida a edema tisular (por ejemplo, en la septicemia o debido a un trauma), preeclampsia, edema pulmonar, hipertension pulmonar, insuficiencia renal, edema retiniano, hemorragia retiniana, oclusiones de la vena retiniana (por ejemplo, oclusiones de la vena central o de una de sus ramas), retinitis, retinopatfas (por ejemplo, retinopatfa arteriosclerotica, retinopatfa hipertensiva, retinopatfa por radiacion, retinopatfa de celulas falciformes y retinopatfa del prematuro, ademas de la retinopatfa diabetica), infarto cerebral silencioso, smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SRIS), glomerulopatfa del trasplante, uveitis, smdrome de fuga vascular, hemorragia vftrea y enfermedad de Von Hipple Lindau. Ademas, se sabe que ciertos farmacos, que incluyen aquellos usados para tratar esclerosis multiple, provocan hiperpermeabilidad vascular, y puede usarse danazol para reducir este efecto secundario no deseado cuando se usan estos farmacos. El angioedema hereditario y el adquirido estan expresamente excluidos de aquellas enfermedades y afecciones que pueden tratarse segun la invencion.
“Tratar”, “tratando” o “tratamiento” se usan en el presente documento para indicar la reduccion (total o parcial) de los smtomas, la duracion o la gravedad de una enfermedad o afeccion, incluyendo la curacion de la enfermedad, o la prevencion de la enfermedad o afeccion.
Pruebas recientes indican que la hiperpermeabilidad causada por transcitosis es la primera etapa de un proceso que, con el tiempo, conduce a dano a tejidos y organos en muchas enfermedades y afecciones. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un medio de intervencion temprana en estas enfermedades y afecciones que puede reducir, retardar o incluso posiblemente prevenir el dano a tejidos y organos observados en ellos. Por ejemplo, un animal puede tratarse inmediatamente tras el diagnostico de una de las enfermedades o afecciones tratables segun la invencion (las enfermedades y afecciones descritas anteriormente). Alternativamente, se prefiere el tratamiento de animales que tienen signos tempranos de, o una predisposicion a desarrollar, una enfermedad o afeccion tal antes de la existencia de los smtomas. Los signos tempranos de, y los factores de riesgo para, la diabetes, la hipertension y la aterosclerosis son bien conocidos, y el tratamiento de un animal que presenta estos signos tempranos o factores de riesgo puede iniciarse antes de la presencia de los smtomas de la enfermedad o afeccion (es decir, profilacticamente).
Por ejemplo, puede iniciarse el tratamiento de un paciente al que se le ha diagnosticado diabetes inmediatamente tras el diagnostico. En particular, los diabeticos deben ser tratados preferentemente antes de que se presente cualquier smtoma de una complicacion vascular, aunque esto no es normalmente posible, ya que la mayona de los diabeticos muestran tales smtomas cuando son diagnosticados (vease mas adelante). Alternativamente, los diabeticos deben ser tratados mientras la retinopatfa diabetica no proliferativa es leve (es decir, niveles moderados de microaneurismas y hemorragia retiniana). Vease Diabetic Retinopathy, pagina 9 (Ed. Elia Duh MD, Human Press, 2008). Tal tratamiento precoz proporcionara la mejor oportunidad de prevenir edema macular y la progresion de la retinopatfa a retinopatfa diabetica proliferativa. Por tanto, la presencia de retinopatfa diabetica se considera un signo de que existen o se desarrollaran otras complicaciones microvasculares de la diabetes (vease arriba, paginas 474477), y el tratamiento precoz tambien puede prevenir o reducir estas complicaciones adicionales. Por supuesto,
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tambien pueden tratarse con resultados beneficiosos enfermedades y afecciones mas avanzadas que son complicaciones vasculares de la diabetes.
Sin embargo, como se ha senalado anteriormente, las complicaciones vasculares a menudo ya estan presentes en el momento en que se diagnostica la diabetes. Por consiguiente, es preferible tratar profilacticamente a un paciente que tiene signos tempranos de, o una predisposicion a desarrollar, diabetes. Estos signos tempranos y factores de riesgo incluyen glucosa en ayunas que es alta, pero no lo suficientemente alta como para clasificarse como diabetes (“prediabetes”), hiperinsulinemia, hipertension, dislipidemia (colesterol alto, trigliceridos altos, lipoprotemas de baja densidad altas y/o bajo nivel de lipoprotema de alta densidad), obesidad (mdice de masa corporal superior a 25), inactividad, edad superior a 45 anos, falta de sueno, antecedentes familiares de diabetes, raza minoritaria, antecedentes de diabetes gestacional y antecedentes de smdrome de ovario poliqmstico.
Similarmente, puede iniciarse el tratamiento de un paciente al que se le ha diagnosticado hipertension inmediatamente tras el diagnostico. La hipertension normalmente no produce ningun smtoma, pero puede iniciarse tratamiento profilactico en un paciente que tiene predisposicion a desarrollar hipertension. Los factores de riesgo para la hipertension incluyen edad, raza (la hipertension es mas comun en la raza negra), antecedentes familiares (la hipertension es hereditaria), sobrepeso u obesidad, falta de actividad, tabaquismo, exceso de sal en la dieta, muy poco potasio en la dieta, muy poca vitamina D en la dieta, beber demasiado alcohol, niveles altos de estres, ciertas afecciones cronicas (por ejemplo, colesterol alto, diabetes, enfermedad renal y apnea del sueno) y el uso de ciertos farmacos (por ejemplo, anticonceptivos orales, anfetaminas, pastillas para adelgazar y algunas medicaciones para el resfriado y para la alergia).
Puede iniciarse el tratamiento de un paciente al que se le ha diagnosticado aterosclerosis inmediatamente tras el diagnostico. Sin embargo, es preferible tratar profilacticamente a un paciente que tiene signos tempranos de, o una predisposicion a desarrollar, aterosclerosis. Los signos tempranos y factores de riesgo para la aterosclerosis incluyen edad, antecedentes familiares de aneurisma o enfermedad cardiaca precoz, hipertension, colesterol alto, trigliceridos altos, resistencia a la insulina, diabetes, obesidad, tabaquismo, falta de actividad fisica, dieta poco saludable y alto nivel de protema C reactiva.
La invencion proporciona danazol o una sal farmaceuticamente aceptable de danazol para su uso en la inhibicion de la hiperpermeabilidad vascular. Adicionalmente se describen, pero no son parte de la invencion, metodos, composiciones farmaceuticas y kits para tratar un animal que lo necesita. Un animal "que necesita" tal tratamiento si el animal tiene actualmente una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular, muestra signos tempranos de tal enfermedad o afeccion, tiene predisposicion a desarrollar tal enfermedad o afeccion o se esta tratando con un farmaco u otro tratamiento que provoca hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario. Preferentemente, el animal es un mamifero, tal como un conejo, cabra, perro, gato, caballo o ser humado. De la manera mas preferente, el animal es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, “un compuesto de danazol” significa danazol y sales farmaceuticamente aceptables de danazol. El danazol (17[a]-pregna-2,4-dien-20-ino-[2,3-d]-isoxazol-17[p]-ol) es una hormona esteroidea sintetica conocida. Su estructura es:
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Los procedimientos de preparacion del danazol son conocidos en la tecnica. Veanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 3.135.743 y la patente de GB n° 905.844. Por tanto, el danazol esta disponible comercialmente de muchas fuentes, incluyendo Barr Pharmaceuticals, Inc., Lannett Co., Inc., Sanofi-Aventis Canada, Sigma-Aldrich y Parchem Trading Ltd.
“Profarmaco” significa cualquier compuesto que libera un farmaco parental activo (danazol en este caso) in vivo cuando se administra tal profarmaco a un animal. Los profarmacos de danazol incluyen danazol, en el que el grupo hidroxilo esta unido a cualquier grupo que puede ser escindido in vivo para generar el hidroxilo libre. Ejemplos de profarmacos de danazol incluyen esteres (por ejemplo, acetato, formiato y derivados de benzoato) de danazol.
Las sales farmaceuticamente aceptables del danazol y sus profarmacos incluyen sales no toxicas convencionales, tales como sales derivadas de acidos inorganicos (tales como clorhidrico, bromhidrico, sulfurico, fosforico, mtrico y similares), acidos organicos (tales como acido acetico, propionico, succmico, glicolico, estearico, lactico, malico, tartarico, dtrico, glutamico, aspartico, benzoico, salicflico, oxalico, ascorbico y similares) o bases (tales como el
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hidroxido, carbonato o bicarbonato de un cation de metal farmaceuticamente aceptable o cationes organicos derivados de N,N-dibenciletilendiamina, D-glucosamina o etilendiamina). Las sales se preparan de manera convencional, por ejemplo, por neutralizacion de la forma de base libre del compuesto con un acido. En particular, los isoxazoles, tales como danazol, son sustancias debilmente basicas y formaran sales de adicion de acido tras la adicion de acidos fuertes y sales de amonio cuaternario tras la adicion de esteres de acidos fuertes (por ejemplo, un ester de un acido sulfonico inorganico u organico fuerte, preferentemente un alquilo inferior, alquenilo inferior o ester de aralquilo inferior, tal como yoduro de metilo, yoduro de etilo, bromuro de etilo, bromuro de propilo, bromuro de butilo, bromuro de alilo, sulfato de metilo, bencenosulfonato de metilo, sulfonato de metil-p-tolueno, cloruro de bencilo y similares). Vease la patente de EE.UU. n° 3.135.743.
Como se ha indicado anteriormente, un compuesto de danazol puede usarse para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular y para inhibir la hiperpermeabilidad vascular provocada como un efecto secundario de un tratamiento o administracion de un farmaco. Para ello, el compuesto de danazol se administra a un animal en necesidad de tratamiento.
Las formas de dosificacion, los modos de administracion y las cantidades de dosificacion eficaces para el compuesto de danazol pueden determinarse empmcamente usando la orientacion proporcionada en el presente documento. Los expertos en la materia entenderan que la cantidad de dosificacion variara con la enfermedad o afeccion particular a tratarse, la gravedad de la enfermedad o afeccion, la(s) vfa(s) de administracion, la duracion del tratamiento, la identidad de cualquier otro farmaco que se administre al animal, la edad, el tamano y la especie del animal, y factores similares conocidos en las tecnicas medicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de danazol de la presente invencion sera aquella cantidad del compuesto de danazol que sea la dosis eficaz mas baja para producir un efecto terapeutico. Sin embargo, la dosis diaria sera determinada por un medico adjunto o veterinario dentro del alcance criterio medico sensato. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados durante el dfa. La administracion del compuesto de danazol debe continuar hasta conseguir una respuesta aceptable.
Se ha informado previamente de que los compuestos de danazol inhiben la angiogenesis. Vease la solicitud PCT WO 2007/009087. Sorprendente y bastante inesperadamente, se ha encontrado que los compuestos de danazol pueden usarse en la practica de la presente invencion a dosis optimas que son aproximadamente de 100-1000 veces menores que las previamente informadas para inhibir la angiogenesis y considerablemente mas bajas que aquellas cantidades actualmente administradas a pacientes para el tratamiento de otras enfermedades y afecciones (normalmente 200-800 mg/dfa para un ser humano adulto). Los usos de estas dosis mas bajas de compuestos de danazol debenan evitar cualquier efecto secundario significativo, tal vez todos los efectos secundarios, que sera especialmente ventajoso para el tratamiento temprano o profilactico de las enfermedades y afecciones segun la presente invencion.
La cantidad de dosificacion eficaz de un compuesto de danazol para inhibir la hiperpermeabilidad vascular es de aproximadamente 10 mg/dfa a aproximadamente 90 mg/dfa, cuando se administra por via oral. Cuando se administra por via topica o local, el compuesto de danazol se administrara a una concentracion de 0,0001 pM a 5 |jM, preferentemente de 0,1 pM a 1,0 pM, mas preferentemente de 0,1 pM a 0,5 pM, lo mas preferentemente de aproximadamente 0,1 pM, o a una concentracion de aproximadamente el 0,17 % (peso/peso) o menos, preferentemente del 0,00034 % al 0,17 %, lo mas preferentemente del 0,0034 % al 0,017 %. Cuando se administra por via oral a un ser humano adulto, la dosis sera de aproximadamente 10 mg/dfa a aproximadamente 90 mg/dfa, preferentemente administrada en dos dosis iguales al dfa. Ademas, se espera que el danazol se acumule en las celulas y tejidos, de manera que una dosis (de carga) inicial (por ejemplo, 100 mg al dfa) pueda reducirse despues de un penodo de tiempo (por ejemplo, 2-4 semanas) a una dosis de mantenimiento mas baja (por ejemplo, 1 mg al dfa) que puede administrarse indefinidamente sin efectos secundarios significativos, tal vez sin efectos secundarios.
El compuesto de danazol se administra en combinacion con uno o mas segundos farmacos adecuados para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular. Por ejemplo, el compuesto de danazol puede administrarse antes de, junto con (incluyendo simultaneamente con) o despues del segundo farmaco(s). El segundo farmaco o farmacos y el compuesto de danazol pueden administrarse en composiciones farmaceuticas separadas o como parte de la misma composicion farmaceutica. El segundo farmaco puede ser uno que tambien inhibe la hiperpermeabilidad vascular, uno que inhibe o trata otras patologfas o smtomas de la enfermedad o afeccion, o uno que haga ambas cosas.
Las formas de dosificacion eficaces, modos de administracion y cantidades de dosificacion para los segundos farmacos son bien conocidos y/o pueden determinarse empmcamente. Se entiende por los expertos en la materia que la cantidad de dosificacion variaran con la enfermedad o afeccion o particular que va a tratarse, la gravedad de la enfermedad o afeccion, la via o vfas de administracion, la duracion del tratamiento, la identidad de cualquier otro de los farmacos que se esten administrando al animal, la edad, el tamano y la especie del animal, y factores similares conocidos en las tecnicas medicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un segundo farmaco sera aquella cantidad del compuesto que es la dosis mas baja eficaz para producir un efecto terapeutico. Sin embargo, la dosificacion diaria se determinara por el veterinario o facultativo tratante dentro del ambito del buen criterio medico. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede administrarse en forma de dos, tres, cuatro, cinco, seis o
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mas subdosis, administrate por separado a intervalos adecuados a lo largo del dfa. La administracion del segundo farmaco debe continuarse hasta que se alcance una respuesta aceptable.
En una realizacion, el segundo farmaco puede ser un compuesto que inhibe la hiperpermeabilidad vascular. Los compuestos adecuados incluyen metilnaltrexona y naloxona (vease Singleton et al., Am J. Respir. Cell Mol. Biol., 37:222-231 (2007), derivados de fumagilol (vease solicitud PCT n.° WO 2009/036108), antagonistas de angiopoyetina-2 (vease solicitud PCT n.° WO 2007/033216), inhibidores de la anhidrasa carbonica (vease solicitud PCT n.° WO 2006/091459), agentes neuroprotectores (por ejemplo, cannabidiol; vease Antonetti et al., "Vascular Permeability en in Diabetic Retinopathy," paginas 333-352, en Diabetic Retinopathy (Elia J. Duh, ed., Humana Press, 2008)), A6 (inhibidor de uroquinasar; Angstrom Pharmaceuticals), y otros que se describen mas adelante.
En otra realizacion, el segundo farmaco puede ser un compuesto que inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) mediante, por ejemplo, la inhibicion de la funcion del VEGF, inhibicion de la funcion de receptores de VEGF, reduccion de la produccion del VEGF, etc., puesto que VEGF es un inductor de la permeabilidad vascular en muchas enfermedades y afecciones. Los compuestos adecuados incluyen cualquier molecula organica o inorganica, incluyendo acidos nucleicos modificados y no modificados, tales como acidos nucleicos antisentido, agentes de ARNi, tales como ARNip o ARNhc, peptidos, peptidomimeticos, receptores, ligandos y anticuerpos. Los compuestos espedficos adecuados son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), inhibidores del receptor Tie2, inhibidores de angiopoyetina, inhibidores de neuropilina, factor derivado del epitelio pigmentario, endostatina, angiostatina, analogos de somatastatina (por ejemplo, octreotida), aptameros inhibidores del VEGF (por ejemplo, pegaptanib (Macugen, Pfizer/Gilead/Eyetech)), anticuerpos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF, tales como bevacizumab (Avastina, Genentech o fragmentos de los mismos, tales como ranibizumab (Lucentis, Genentech)), cetuximab (Erbitux, Imclone, Bristol- Myers Squibb), polipeptidos o polinucleotidos de tirosina quinasa 1 similar a fms soluble (sFlt1), aflibercept o trampa de VEGF (Regeneron/Aventis), CP-547.632 (clorhidrato de amida del acido 3-(4-bromo-2,6-difluoro-benciloxi)-5-[3- (4-pirrolidin-1-il-butil)-ureido]-isotiazol-4-carboxflico; Pfizer), AG13736, AG28262, SU5416, SU11248 y SU6668 (antiguamente disponible de Sugen, ahora Pfizer), ZD-6474 y ZD-4190 (AstraZeneca), CEP-7055 (Cephalon, Inc.), PKC 412 (Novartis), AEE788 (Novartis), AZD-2171, sorafenib (Nexavar®, BAY 43-9006, Bayer Pharmaceuticals y Onyx Pharmaceuticals), vatalanib (tambien conocido como PtK-787, ZK-222584; Novartis & Schering AG), IM862 (glufanida disodica, Cytran Inc.), DC101 (anticuerpo monoclonal selectivo de VEGFR2; ImClone Systems, Inc.), angiozima (una ribozima sintetica de Ribozyme y Chiron), Sirna-027 (un inhibidor de VEGFR1 basado en ARNip, Sirna Therapeutics), Neovastat (Aeterna Zentaris, Inc.), talidomida, dopamina, iressa, AV-951 (AVEO Pharmaceuticals), y AGA-1470 (un analogo sintetico de fumagilina, A.G. Scientific). Veanse solicitudes PCT WO 2006/091459 y WO 2009/036108, Do et al., "Anti-VEGF Therapy as un Emerging Treatment for Diabetic Retinopathy", paginas 401-422, en Diabetic Retinopathy (Elia J. Duh, ed., Humana Press, 2008) y Bhattacharya et al., J. Mol. Signaling, 3:14 (2008). Se prefieren aquellos compuestos que pueden administrarse por via oral, incluyendo sunitinib (SU11248), sorafenib (BAY 43-9006), vandetanib (ZD6474), CEP7055, AV-951, recentina (AZD2171), talidomida y dopamina. Tambien se prefieren pegaptanib, bevacizumab (Avastina) y ranibizumab (Lucentis) para inyeccion intravftrea.
Otro inductor de la hiperpermeabilidad vascular en muchas enfermedades y afecciones es la histamina. Por consiguiente, el compuesto de danazol tambien puede administrarse en combinacion con un antihistammico. Los antihistammicos son bien conocidos y estan facilmente disponibles comercialmente. Los antihistammicos incluyen loratadina (Claritin), cetrizina (Zyrtec), fexofenadina (Allegra) y difenhidramina (Benadrilo).
Algunas de las enfermedades y afecciones que estan mediadas por la hiperpermeabilidad vascular tambien pueden implicar angiogenesis en estados avanzados de las enfermedades y afecciones. Por consiguiente, en otra realizacion mas de la invencion, se administra un farmaco que inhibe la angiogenesis ademas del compuesto de danazol. Los farmacos adecuados para inhibir la angiogenesis incluyen aquellos compuestos que inhiben el VEGF que se han enumerado anteriormente, puesto que el VEGF tambien puede inducir la angiogenesis en condiciones adecuadas. Tambien pueden usarse inhibidores de otros factores implicados en la angiogenesis (incluyendo hormona del crecimiento (GH), factor de crecimiento similar a insulina (IGF), factores de crecimiento de fibroblastos, angiopoyetinas, eritropoyetina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de necrosis tumoral, serina proteasas extracelulares y metaloproteasas de matriz y factor de crecimiento placentario). Tales inhibidores incluyen antagonistas de angiopoyetina-2 (vease solicitud PCT n.° WO 2007/033216). Tales inhibidores tambien incluyen analogos de somatostatina (por ejemplo, octreotida; inhibidores del eje GH-IGF), antagonistas de Tie-2 (por ejemplo, muTek delta Fc), A6 (inhibidor de uroquinasa; Angstrom Pharmaceuticals), factor de crecimiento derivado del epitelio pigmentario, Serpina (inhibidor de serina proteasa), angiostatina, endostatina, trombospondina-1, inhibidor tisular de metaloproteasas de matriz (vease Das et al., "Beyond VEGF - Other Factors Important en Retinal Neovascularization", paginas 375-398, en Diabetic Retinopathy (Elia J. Duh, ed., Humana Press, 2008)). Los compuestos anti-angiogenicos adicionales tambien incluyen TNP-470, caplostatina y lodamina (todos derivados de fumigilol; SynDevRx, Inc.), taxol, herceptina (Genentech), carboxiamidotriazol (CAI), IM862 (Cytran, Inc.), trombospondinas y analogos de trombospondina (por ejemplo, ABT-510; Abbott Laboratories), etaracizumab (Vitaxin, Medlmmune), EMD121974 (cilengitida, Merck & Co.), trilostano y derivados de trilostano descritos en la solicitud PCT WO 2007/009087, los peptidos de union a metales descritos en la Publicacion de Patentes de Estados
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Unidos N.° 20030130185 y los derivados de metilfenidato descritos en la Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20060189655.
En otra realizacion, el segundo farmaco puede ser un compuesto que inhibe la protema quinasa C (PKC). Los inhibidores de PKC adecuados incluyen PKC412 (N-benzoil estaurosporina; Fementek Biotechnology, LC Laboartories y otros), benfotiamina y LY333531 (ruboxistaurina o RBX). Vease Sun et al., "Clinical Trials in Protein Kinase C-p Inhibition in Diabetic Retinopathy" paginas 423-434, en Diabetic Retinopathy (Elia J. Duh, ed., Humana Press, 2008). Se prefieren benfotiamina (un derivado sintetico soluble en lfpidos de vitamina B1, disponible de muchas fuentes) y RBX (Eli Lilly). RBX puede administrate por via oral y se ha demostrado que inhibe la permeabilidad vascular y la angiogenesis.
Algunas de las enfermedades y afecciones que estan mediados por la hiperpermeabilidad vascular tambien pueden implicar inflamacion. Por consiguiente, en otra realizacion mas de la invencion, se administra un farmaco antiinflamatorio ademas del compuesto de danazol. Los farmacos antiinflamarios adecuados incluyen esteroides antiinflamatorios y farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Los farmacos antiinflamatorios no esteroideos incluyen corticoesteroides (por ejemplo, cortisona, prednisona, prednisolona, metilpredinisolona, dexametasona, betametasona e hidrocortisona) y acetonido de triamcinolona. Los esteroides antiinflamatorios son bien conocidos y estan facilmente disponibles comercialmente. Se prefiere acetonido de triamcinolona intravttrea, disponible de Apothecon, Allergan y Alcon. Los AINE tambien son bien conocidos y estan facilmente disponibles comercialmente. Tales AINE incluyen inhibidores de COX-1, inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib (Celebrex)), ibuprofeno (por ejemplo, Advilo y Motrin), acetaminofeno (por ejemplo, Tylenol), indometacina, naproxeno (por ejemplo, Aleve), glicina y salicilatos (por ejemplo, acido acetilsalidlico o aspirina). Los AINE adicionales incluyen DAIIS (peptidos antiinflamatorios que alteran la migracion de celulas inflamatorias; disponibles de Immulon BioTherapeutics). Los AINE preferidos son glicina y aspirina.
El S1 P (esfingosina-1 fosfato) desempena una funcion muy importante en la formacion y mantenimiento del endotelio vascular. El empobrecimiento de S1 P conduce a filtracion vascular y edema, y S1 P puede invertir la disfuncion endotelial y restablecer la funcion de barrera. Por consiguiente, el segundo farmaco usado en combinacion con danazol puede ser un farmaco que aumente los niveles de S1P. Dichos farmacos incluyen S1P y agonistas de S1P. Los agonistas de S1P incluyen FTY720 (2-amino-2-(4-octilfenetilo) propano-1,3-diol; fingolimod; Novartis), CYM-5442 (2-(4-(5-(3,4-dietoxifenil)-1,2,4-oxadiazol-3-il)-2,3-dihidro-1H-inden-1-ilamino)etanol) y SEW2871 (5-[4-fenil-5-(trifluorometil)-2-tienil]-3-[3-(trifluorometilo)fenil]-1,2,4,-oxadizol).
El glicocalix recubre la superficie luminal del endotelio continuo y del fenestrado y contribuye a la permeabilidad selectiva de estos endotelios restringiendo el paso de albumina. Las enzimas que degradan el glucocalix (por ejemplo, heparanasa) estan reguladas positivamente en determinadas patologfas proteinuricas, incluyendo diabetes (incluyendo diabetes prematura), hipertension y enfermedades renales diabeticas y no diabeticas (por ejemplo, nefritis, smdrome nefrotico y nefropatfa). Por consiguiente, el segundo farmaco usado en combinacion con el compuesto de danazol puede ser un farmaco que inhibe las enzimas que degradan el glucocalix. Tales farmacos incluyen heparinas de bajo peso molecular (por ejemplo, sulodexida (disponible de, por ejemplo, PharmGKB).
El farmaco usado en combinacion con el compuesto de danazol tambien puede ser un farmaco que se use para el tratamiento convencional de la enfermedad o afeccion. Por ejemplo, los tratamientos convencionales para la diabetes incluyen farmacos que disminuyen el nivel de glucosa (medido tfpicamente en la sangre del paciente). Muchos de tales farmacos que disminuyen la glucosa son bien conocidos y estan facilmente disponibles comercialmente. Tales farmacos incluyen insulina, analogos de insulina, biguanidas (por ejemplo, fenformina, metformina y buformina), sulfonamidas (por ejemplo, glibenclamida, cloropropamida, tolbutamida, glibornurida, tolazamida, carbutamida, glipizida, gliquidona, gliclazida, metahexamida, glisoxepida, glimepirida y acetohexamida), inhibidores de alfa glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, miglitol y voglibosa), tiazolidindionas (por ejemplo, troglitazona, rosiglitazona y proglitazona), inhibidores de dipeptidil peptidasa (por ejemplo, silagliptina y vildagliptina) y otros (por ejemplo, goma guar, repaglinida, nateglinida, exenatida, pramlintida, benfluorex y liraglutida).
El farmaco usado en combinacion con el compuesto de danazol puede ser un antioxidante. Los antioxidantes adecuados son bien conocidos y estan facilmente disponibles comercialmente. Tales farmacos incluyen cistema, glutation, vitamina E, vitamina C, vitamina B2, lutema, licopeno, coenzima Q10, curcuma, resveratrol y benfotiamina (vease anteriormente). Otros antioxidantes adecuados incluyen aquellos peptidos y derivados de peptidos descritos en las Patentes de Estados Unidos N.° 7.529.304 y 7.632.803.
Una senal precoz y factor de riesgo para la aterosclerosis es el colesterol alto, y el colesterol alto se trata habitualmente con estatinas. Las estatinas adecuadas son bien conocidas y estan facilmente disponibles comercialmente. Estas incluyen atorvastatina (Lipitor), fluvastatina (Lescol), lovastatina (Mevacor), pravastatina (Pravachol), simvastatina, (Zocor) y rosuvastatina (Crestor). Las estatinas tambien pueden reducir el tamano de las placas, estabilizar las placas, reducir la inflamacion, reducir los niveles de protema C reactiva y disminuir la formacion de coagulos en la sangre.
La hipertension se trata habitualmente con una un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) o un antagonista del receptor de la ECA para disminuir la presion sangumea. Los inhibidores de la ECA y antagonistas
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del receptor de la ECA adecuados son bien conocidos y estan facilmente disponibles comercialmente. Los inhibidores de la ECA adecuados incluyen Capoten (captoprilo), Prinivilo y Zestrilo (lisinoprilo), Vasotec (enalaprilo), Lotensin (benazeprilo), Altace (ramiprilo), Accuprilo (quinaprilo), Monoprilo (fosinoprilo), Mavik (trandolaprilo), Aceon (perindoprilo), agonistas de S1P (por ejemplo, FTY720 (fingolimod) de Novartis), y Univasc (moexiprilo). Se prefiere lisinoprilo o enalaprilo. Los antagonistas del receptor de la ECA adecuados incluyen losartan, irbesartan, olmesartan, candesartan, valsartan y telmisartan. Aunque ha habido informes en el pasado de que estos farmacos pueden ser capaces de reducir y controlar las complicaciones de la diabetes, incluyendo nefropatfa diabetica y retinopatfa diabetica, se ha informado ultimamente de que estos no son eficaces para este proposito (vease Mehlsen et al., Acta Ophthalmol., epub 19 de marzo de 2010. pMiD 20346089).
Se describe ademas un metodo de inhibicion de la hiperpermeabilidad vascular en un animal que es un efecto secundario provocado por un tratamiento o farmaco administrado al animal. Los farmacos que provocan hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario son bien conocidos e incluyen bapineuzumab (Wyet, Elan), bloqueadores del canal de calcio (por ejemplo, Norvasc, Caduet, Lotrel, Exforge, Cardizem, Dilacor, Taztia, Tiazac, Lexxel, Plendilo, DynaCirc, Cardene, Adalat, Procardia, Sular, Calan, Isoptin SR), clopidogrel (por ejemplo, Plavix), dutasterida (por ejemplo, Avodart), antagonistas de endotelina (por ejemplo, avosentan y bosentan), estrogenos, fingolimod (Gilenia), hormona del crecimiento humano, ibuprofeno, interferones (por ejemplo, Betaseron), morfina, natalizumab (Tysabri), agonistas de S1P (por ejemplo, altas dosis de FTY720 (fingolimod) de Novartis provocan edema macular) y tiazolidinedionas (por ejemplo, Actos y Avandia). Los tratamientos que provocan hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario incluyen la radiacion.
Las formas de dosificacion eficaces, modos de administracion y cantidades de dosificacion para farmacos que provocan hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario son bien conocidos y/o pueden determinarse empmcamente. Se entiende por los expertos en la materia que la cantidad de dosificacion variara con la enfermedad o afeccion particular que se este tratando, la gravedad de la enfermedad o afeccion, la via o vfas de administracion, la duracion del tratamiento, la identidad de cualquier otro de los farmacos que se esten administrando al animal, la edad, tamano y especie del animal, y factores similares conocidos en las tecnicas medicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un farmaco que provoca hiperpermeabilidad vascular sera aquella cantidad del compuesto que es la dosis mas baja eficaz para producir un efecto terapeutico. Sin embargo, la dosis diaria se determinara por el facultativo o veterinario tratante dentro del ambito del buen criterio medico. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede administrarse en forma de dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis, administradas por separado a intervalos adecuados a lo largo del dfa. La administracion del farmaco debe continuarse hasta que se consiga luna respuesta aceptable.
Un compuesto de danazol puede administrarse en combinacion con uno de estos tratamientos o farmacos para inhibir el efecto secundario de la hiperpermeabilidad vascular. Por ejemplo, el compuesto de danazol puede administrarse antes de, junto con (incluyendo simultaneamente con), o despues del farmaco (s) y/o tratamiento(s) que provocan el efecto secundario de la hiperpermeabilidad vascular. El farmaco o farmacos que causan el efecto secundario de la hiperpermeabilidad vascular y el compuesto de danazol pueden administrarse en composiciones farmaceuticas separadas o como parte de la misma composicion farmaceutica.
Adicionalmente se describe, pero no es parte de la invencion, un procedimiento de modulacion del citoesqueleto de celulas endoteliales en un animal. Este se basa en los descubrimientos de que el danazol inhibe la formacion de fibras de estres de F-actina, provoca la formacion de anillos de actina cortical, potencia y prolonga la formacion de anillos de actina cortical por la esfingosina-1-fosfato (S1P), inhibe la RhoA, aumenta la fosforilacion de la VE- cadherina, parece activar las GTPasas estabilizadoras de barrera y parece estabilizar los microtubulos. La modulacion del citoesqueleto puede reducir la hiperpermeabilidad vascular y aumentar la hipopermeabilidad vascular (es decir, la permeabilidad por debajo de los niveles basales), devolviendo asf el endotelio a la homeostasis. Por consiguiente, pueden tratarse aquellas enfermedades y afecciones mediadas por hiperpermeabilidad vascular (vease mas arriba) y tambien pueden tratarse aquellas enfermedades y afecciones mediadas por hipopermeabilidad vascular. El ultimo tipo de enfermedades y afecciones incluye envejecimiento hepatico, aterogenesis, aterosclerosis, cirrosis, fibrosis del hfgado, insuficiencia hepatica y canceres hepaticos primario y metastasico.
El metodo de modulacion del citoesqueleto de celulas endoteliales comprende administrar al animal una cantidad eficaz de un compuesto de danazol y de un segundo farmaco eficaz para modular el citoesqueleto. “Compuesto de danazol” y “animal” tienen los mismos significados expuestos anteriormente.
Las formas de dosificacion, los modos de administracion y las cantidades de dosificacion eficaces para un compuesto de danazol para modular el citoesqueleto pueden determinarse empmcamente usando la orientacion proporcionada en el presente documento. Los expertos en la materia entenderan que la cantidad de dosificacion variara con la enfermedad o afeccion particular que va a tratarse, la gravedad de la enfermedad o afeccion, la(s) vfa(s) de administracion, la duracion del tratamiento, la identidad de cualquier otro farmaco que se administre al animal, la edad, el tamano y la especie del animal, y factores similares conocidos en las tecnicas medicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto sera aquella cantidad del compuesto que sea la dosis eficaz mas baja para producir un efecto terapeutico. Sin embargo, la dosificacion diaria sera determinada por el medico adjunto o veterinario dentro del alcance del criterio medico sensato. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis, administradas por separado a intervalos
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apropiados durante el dfa. La administracion del compuesto debe continuar hasta conseguir una respuesta aceptable.
En particular, una cantidad de dosificacion eficaz de un compuesto de danazol para modular el citoesqueleto de celulas endoteliales sera de 0,1 ng/kg/dfa a 35 mg/kg/dfa, preferentemente de 40 ng/kg/dfa a 5,0 mg/kg/dfa, lo mas preferentemente de 100 ng/kg^a a 1,5 mg/kgMa. Una cantidad de dosificacion eficaz tambien sera aquella cantidad que de una concentracion en un fluido relevante (por ejemplo, sangre) de 0,0001 jM a 5 jM, preferentemente de 0,1 jM a 1,0 jM, mas preferentemente de 0,1 jM a 0,5 jM, lo mas preferentemente aproximadamente 0,1 jM. Una cantidad de dosificacion eficaz tambien sera aquella cantidad que de una concentracion en el tejido u organo que va a tratarse de aproximadamente el 0,17 % (peso/peso) o menos, preferentemente del 0,00034 % al 0,17 %, lo mas preferentemente del 0,0034 % al 0,017 %. Cuando se administra por via topica o local, el compuesto de danazol se administrara preferentemente a una concentracion de 0,0001 jM a 5 jM, preferentemente de 0,1 jM a 1,0 jM, mas preferentemente de 0,1 jM a 0,5 jM, lo mas preferentemente aproximadamente 0,1 jM, o a una concentracion de aproximadamente el 0,17 % (peso/peso) o menos, preferentemente del 0,00034 % al 0,17 %, lo mas preferentemente del 0,0034 % al 0,017 %. Cuando se administra por via oral a un ser humano adulto, la dosis sera preferentemente de aproximadamente 1 ng/dfa a aproximadamente 100 mgMa, mas preferentemente la dosis sera de aproximadamente 1 mg/dfa a
aproximadamente 100 mg/dfa, lo mas preferentemente la dosis sera de aproximadamente 10 mgMa a
aproximadamente 90 mgMa, preferentemente administrada en dos dosis iguales al dfa. Ademas, se espera que el danazol se acumule en las celulas y tejidos, de manera que una dosis (de carga) inicial (por ejemplo, 100 mg al dfa) pueda reducirse despues de un penodo de tiempo (por ejemplo, 2-4 semanas) a una dosis de mantenimiento mas baja (por ejemplo, 1 mg al dfa) que puede administrarse indefinidamente sin efectos secundarios significativos, tal vez sin efectos secundarios.
El compuesto de danazol se administra en combinacion con uno o mas segundos farmacos adecuados para modular el citoesqueleto de celulas endoteliales. Por ejemplo, el compuesto de danazol puede administrarse antes de, junto con (incluyendo simultaneamente con), o despues del segundo farmaco o farmacos. El segundo farmaco o farmacos y el compuesto de danazol pueden administrarse en composiciones farmaceuticas separadas o como parte de la misma composicion farmaceutica.
Las formas de dosificacion eficaces, modos de administracion y cantidades de dosificacion para los segundos farmacos son bien conocidas y/o pueden determinarse empmcamente. Se entiende por los expertos en la materia que la cantidad de dosis variara con la enfermedad o afeccion particular que se este tratando, la gravedad de la enfermedad o afeccion, la via o vfas de administracion, la duracion del tratamiento, la identidad de cualquier otro de los farmacos que se esten administrando al animal, la edad, el tamano y la especie del animal, y factores similares conocidos en las tecnicas medicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un segundo farmaco sera aquella cantidad del compuesto que sea la dosis mas baja eficaz para producir un efecto terapeutico. Sin embargo, la dosis diaria se determinara por un facultativo o veterinario tratante dentro del ambito del buen criterio medico. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede administrarse en forma de dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis, administradas por separado en los intervalos adecuados a lo largo del dfa. La administracion del segundo farmaco debe continuarse hasta que se consiga una respuesta aceptable.
El segundo farmaco es un compuesto que modula el citoesqueleto de celulas endoteliales. Tales farmacos incluyen inhibidores de Rho e inhibidores de la quinasa Src. Los inhibidores de Rho incluyen estatinas (vease anteriormente), preferentemente simvastina (disponible de, por ejemplo, Merck & Co.), transferasa de la exoenxzima C3 (disponible de Cytoskeleton, Inc., Denver, Colorado; producto CT04), ALSE-100 (Alseres Pharmaceuticals). Los inhibidores de la quinasa Src incluyen PP2 (Calbiochem/EMD Biosciences, San Diego, CA), AP23846 (una purina 2,6,9- trisustituida; University of Texas), dasatinib (Sprycel, Bristol-Myers Squibb) y AZD0530 (Saracatinib; Astra Ceneca Oncology). Otros farmacos adecuados incluyen aquellos que estabilizan microtubulos, tales como taxanos (por ejemplo, paclitaxel (Bristol-Myers Squibb), docetaxel (sanofi aventis), abraxano (Abraxis Oncology) y carbazitaxel (sanofi aventis)).
Los compuestos (es decir, un compuesto de danazol, un segundo farmaco para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular, un farmaco que provoca hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario o un farmaco que modula el citoesqueleto de celulas endoteliales) pueden administrarse a un paciente animal para terapia mediante cualquier via de administracion adecuada, que incluye la via oral, nasalmente, parenteralmente (por ejemplo, intravenosamente, intraperitonealmente, subcutaneamente o intramuscularmente), transdermicamente, intraocularmente y topicamente (incluyendo bucalmente y sublingualmente). Sin embargo, los compuestos usados de acuerdo con la presente invencion se administran por via oral, topica o local. Generalmente se prefiere la administracion por via oral para cualquier enfermedad o afeccion tratable segun la invencion. Las vfas preferidas de administracion para el tratamiento de enfermedades y afecciones del ojo son por via oral, intraocularmente y topicamente. La mas preferida es por via oral. Las vfas preferidas de administracion para el tratamiento de enfermedades y afecciones del cerebro son por via oral y parenteralmente. La mas preferida es por via oral.
Cuando es posible administrar un compuesto solo (es decir, un compuesto de danazol, un segundo farmaco para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular, un farmaco que provoca
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hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario o un farmaco que modula el citoesqueleto de celulas endoteliales) incluyendo aquellos de la presente invencion, es preferible administrar el compuesto como una formulacion farmaceutica (composicion). Las composiciones farmaceuticas comprenden un compuesto o compuestos de la invencion (es decir, un compuesto de danazol) como principio activo mezclado con uno o mas vehnculos farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, con uno o varios de otros compuestos, farmacos u otros materiales. Cada vehnculo debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulacion y no perjudiciales para el animal. Los vehnculos farmaceuticamente aceptables son muy conocidos en la tecnica. Independientemente de la via de administracion seleccionada, los compuestos de la presente invencion se formulan en formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables por procedimientos convencionales conocidos para aquellos expertos en la materia. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences.
Las formulaciones adecuadas para administracion por via oral pueden estar en forma de capsulas, sellos, pfldoras, comprimidos, polvos, granulos o como una disolucion o una suspension en un lfquido acuoso o no acuoso, o una emulsion lfquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga), y similares, cada una conteniendo una cantidad predeterminada de un compuesto o compuestos de la presente invencion como principio activo. Un compuesto o compuestos de la presente invencion tambien pueden administrarse como bolo, electuario o pasta.
En las formas de dosificacion solidas de la invencion para administracion por via oral (capsulas, comprimidos, pfldoras, comprimidos recubiertos de azucar, polvos, granulos y similares), el principio activo (es decir, un compuesto de danazol) se mezcla con uno o mas vehnculos farmaceuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: (i) sustancias de relleno o sustancias de carga o sustancias de relleno, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o acido silfcico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arabiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como, agar-agar, carbonato calcico, almidon de patata o tapioca, acido algmico, ciertos silicatos, y carbonato sodico; (5) agentes retardantes de la disolucion, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetflico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolm y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, laurilsulfato sodico y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de capsulas, comprimidos y pfldoras, las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes de tamponamiento. Pueden emplearse como sustancias de carga composiciones solidas de tipo similar en capsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azucares de la leche, ademas de polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Puede prepararse un comprimido por compresion o moldeo, opcionalmente con uno o mas componentes accesorios. Los comprimidos pueden prepararse usando aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato sodico de almidon o carboximetilcelulosa sodica reticulada), tensioactivo o dispersante. Los comprimidos pueden prepararse moldeando en una maquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente lfquido inerte.
Los comprimidos, y otras formas de dosificacion solidas de las composiciones farmaceuticas, tales como comprimidos recubiertos de azucar, capsulas, pfldoras y granulos, pueden opcionalmente ranurarse o prepararse con recubrimientos y vainas, tales como recubrimientos entericos y otros recubrimientos muy conocidos en la tecnica de la formulacion farmaceutica. Tambien pueden formularse de manera que proporcionen liberacion lenta o controlada del principio activo en su interior usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberacion deseado, otras matrices polimericas, liposomas y/o microesferas. Pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtracion a traves de un filtro de retencion de bacterias. Estas composiciones tambien pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composicion tal que liberen el principio activo solo, o preferentemente, en una cierta porcion del tubo gastrointestinal, opcionalmente de manera retardada. Ejemplos de composiciones de inclusion que pueden usarse incluyen sustancias polimericas y ceras. El principio activo tambien puede estar en forma microencapsulada.
Las formas de dosificacion lfquidas para administracion por via oral de los compuestos de la invencion incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas del principio activo, las formas de dosificacion lfquidas pueden contener diluyentes inertes comunmente usados en la tecnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etflico, alcohol isopropflico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bendlico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodon, de cacahuete, de mafz, de germen, de oliva, de ricino y de sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofunlico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos.
Ademas de los diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como humectantes, emulsionantes y agentes de suspension, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.
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Las suspensiones, ademas del principio activo, pueden contener agentes de suspension como, por ejemplo, alcoholes isoesteanlicos etoxilados, esteres de polioxietilensorbitol y de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Adicionalmente se describen, pero no es parte invencion, productos farmaceuticos adecuados para el tratamiento del ojo. Tales productos farmaceuticos incluyen composiciones farmaceuticas, dispositivos e implantes (que pueden ser composiciones o dispositivos).
Las formulaciones farmaceuticas (composiciones) para la inyeccion intraocular de un compuesto o compuestos de la invencion en el globo ocular incluyen disoluciones, emulsiones, suspensiones, partfculas, capsulas, microesferas, liposomas, matrices, etc. Veanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 6.060.463, la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n° 2005/0101582 y la solicitud PCT WO 2004/043480. Por ejemplo, una formulacion farmaceutica para inyeccion intraocular puede comprender uno o mas compuestos de la invencion en combinacion con una o mas disoluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotonicas esteriles farmaceuticamente aceptables, que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes de suspension, espesantes o agentes que potencian la viscosidad (tal como un polfmero de acido hialuronico). Ejemplos de velmculos acuosos y no acuosos incluyen agua, solucion salina (preferentemente al 0,9 %), dextrosa en agua (preferentemente al 5 %), tampones, sulfoxido de dimetilo, alcoholes y polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares). Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como humectantes y emulsionantes y dispersantes. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede provocarse por la inclusion de agentes que retardan la absorcion tales como polfmeros y gelatina. Las formas de liberacion prolongada inyectables pueden prepararse incorporando el farmaco en microcapsulas o microesferas hechas de polfmeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Ejemplos de otros polfmeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres), acido poli(glicolico), acido poli(lactico), policaprolactona y poli(antndridos). Las formulaciones de liberacion prolongada inyectables tambien se preparan atrapando el farmaco en liposomas (compuestos por los componentes usuales, tales como fosfatidilcolina de dipalmitoMo) o microemulsiones que sean compatibles con el tejido ocular. Dependiendo de la relacion del farmaco con respecto al polfmero o lfpido, la naturaleza de los componentes de polfmero o lfpido particular, el tipo de liposoma empleado, y si las microcapsulas o microesferas estan recubiertas o sin recubrimiento, puede controlarse la velocidad de liberacion del farmaco de las microcapsulas, microesferas y liposomas.
Los compuestos tambien pueden administrarse quirurgicamente como un implante ocular. Por ejemplo, puede implantarse en o sobre la esclerotica un recipiente con deposito que tiene una pared de difusion de poli(alcohol vimlico) o poli(acetato de vinilo) y que contiene un compuesto o compuestos. Como otro ejemplo, puede incorporarse un compuesto o compuestos en una matriz polimerica hecha de un polfmero, tal como policaprolactona, acido poli(glicolico), acido poli(lactico), poli(antHdrido), o un lfpido, tal como acido sebacico, y puede implantarse en la esclerotica o en el ojo. Esto se realiza normalmente recibiendo al animal una anestesia topica o local y usando una pequena incision hecha detras de la cornea. Entonces, la matriz se inserta a traves de la incision y se sutura a la esclerotica.
Los compuestos de la invencion tambien pueden administrarse topicamente al ojo, y una una composicion farmaceutica topica adecuada para administracion al ojo es descrita. Las composiciones farmaceuticas topicas adecuadas para administracion al ojo incluyen disoluciones, suspensiones, dispersiones, gotas, geles, hidrogeles y pomadas. Veanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.407.926 y las solicitudes PCT WO 2004/058289, wO 01/30337 y WO 01/68053.
Formulaciones topicas adecuadas para administracion al ojo comprenden uno o mas compuestos de la invencion en una base acuosa o no acuosa. Las formulaciones topicas tambien pueden incluir potenciadores de la absorcion, potenciadores de la permeacion, espesantes, potenciadores de la viscosidad, agentes para ajustar y/o mantener el pH, agentes para ajustar la presion osmotica, conservantes, tensioactivos, tampones, sales (preferentemente cloruro sodico), agentes de suspension, dispersantes, solubilizantes, estabilizantes y/o agentes de tonicidad. Formulaciones topicas adecuadas para administracion al ojo comprenderan preferentemente un potenciador de la absorcion o de la permeacion para promover la absorcion o permeacion del compuesto o compuestos de la invencion en el ojo y/o un espesante o potenciador de la viscosidad que sea capaz de aumentar el tiempo de residencia de un compuesto o compuestos de la invencion en el ojo. Veanse las solicitudes PCT WO 2004/058289, WO 01/30337 y WO 01/68053. Potenciadores de la absorcion/permeacion a modo de ejemplo incluyen metilsulfonilmetano, solo o en combinacion con sulfoxido de dimetilo, acidos carboxflicos y tensioactivos. Espesantes y potenciadores de la viscosidad a modo de ejemplo incluyen dextranos, polietilenglicoles, polivinilpirrolidona, geles de polisacaridos, Gelrite®, polfmeros celulosicos (tales como hidroxipropilmetilcelulosa), polfmeros que contienen carboxilo (tales como poifmeros o copolfmeros de acido acnlico), poli(alcohol vimlico) y acido hialuronico o una sal del mismo.
Las formas de dosificacion lfquidas (por ejemplo, disoluciones, suspensiones, dispersiones y gotas) adecuadas para el tratamiento del ojo pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, dispersando, suspendiendo, etc., un compuesto o compuestos de la invencion en un vehfculo, tal como, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar una disolucion, dispersion o suspension. Si se desea, la formulacion farmaceutica tambien puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas, tales como humectantes o
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emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH y similares, por ejemplo, acetato sodico, monolaurato de sorbitano, acetato sodico de trietanolamina, oleato de trietanolamina, etc.
Las suspensiones y disoluciones acuosas adecuadas para el tratamiento del ojo pueden incluir, ademas de un compuesto o compuestos de la invencion, conservantes, tensioactivos, tampones, sales (preferentemente cloruro sodico), agentes de tonicidad y agua. Si se usan suspensiones, los tamanos de partfcula deben ser inferiores a 10 pm para minimizar la irritacion del ojo. Si se usan disoluciones o suspensiones, la cantidad administrada al ojo no debe superar 50 pl para evitar el derrame excesivo del ojo.
Las suspensiones coloidales adecuadas para el tratamiento del ojo se forman generalmente a partir de micropartfculas (es decir, microesferas, nanoesferas, microcapsulas o nanocapsulas, en las que las microesferas y las nanoesferas son generalmente partfculas monolfticas de una matriz de polfmero en la que la formulacion esta atrapada, adsorbida, o contenida de otro modo, mientras que con las microcapsulas y las nanocapsulas la formulacion esta realmente encapsulada). El lfmite superior para el tamano de estas micropartfculas es de aproximadamente 5 p a aproximadamente 10 p.
Las pomadas oftalmicas adecuadas para el tratamiento del ojo incluyen un compuesto o compuestos de la invencion en una base apropiada, tal como aceite mineral, lanolina lfquida, vaselina filante, una combinacion de dos o tres de los anteriores, o gel de polietileno-aceite mineral. Opcionalmente puede incluirse un conservante.
Los geles oftalmicos adecuados para el tratamiento del ojo incluyen un compuesto o compuestos de la invencion suspendidos en una base hidrofila, tal como Carpobol-940 o una combinacion de etanol, agua y propilenglicol (por ejemplo, en una relacion de 40:40:20). Se usa un gelificante, tal como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o glicirricinato amoniacal. Opcionalmente puede incluirse un conservante y/o un agente de tonicidad.
Los hidrogeles adecuados para el tratamiento del ojo se forman por incorporacion de un polfmero formador de gel hinchable, tal como los enumerados anteriormente como espesantes o potenciadores de la viscosidad, excepto que una formulacion denominada en la tecnica “hidrogel” tiene por lo general una viscosidad superior a una formulacion denominada disolucion o suspension “espesada”. A diferencia de tales hidrogeles preformados, tambien puede prepararse una formulacion de manera que forme un hidrogel in situ tras la administracion al ojo. Tales geles son ifquidos a temperatura ambiente, pero gelifican a mayores temperaturas (y asf se llaman hidrogeles “termorreversibles”), tal como cuando se ponen en contacto con fluidos corporales. Polfmeros biocompatibles que confieren esta propiedad incluyen polfmeros y copolfmeros de acido acnlico, derivados de N-isopropilacrilamida y copolfmeros de bloques de Aba de oxido de etileno y oxido de propileno (denominados convencionalmente “poloxameros” y disponibles con el nombre comercial Pluronic® de BASF-Wayndotte).
Las dispersiones preferidas son liposomales, en cuyo caso la formulacion esta encerrada dentro de liposomas (vesfculas microscopicas compuestas por compartimentos acuosos y bicapas lipfdicas alternos).
Tambien pueden formularse colirios con una base acuosa o no acuosa que comprende uno o mas dispersantes, solubilizantes o agentes de suspension. Las gotas pueden administrarse por medio de un simple frasco cuentagotas para los ojos o por medio de un frasco de plastico adaptado para administrar el contenido lfquido gota a gota por medio de un cierre con forma especial.
Los compuestos de la invencion tambien pueden administrarse por via topica por medio de un vehfculo solido impregnado con el farmaco que se inserta en el ojo. La liberacion del farmaco se efectua generalmente por disolucion o bioerosion del polfmero, osmosis, o combinaciones de los mismos. Pueden usarse varios sistemas de administracion de tipo matriz. Tales sistemas incluyen lentes de contacto blandas hidrofilas impregnadas o empapadas con el compuesto deseado de la invencion, ademas de dispositivos biodegradables o solubles que no necesitan ser retirados despues de la colocacion en el ojo. Estos insertos oculares solubles pueden estar compuestos por cualquier sustancia degradable que pueda ser tolerada por el ojo y que sea compatible con el compuesto de la invencion que va a administrarse. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, poli(alcohol vimlico), polfmeros y copolfmeros de poliacrilamida, acrilato de etilo y vinilpirrolidona, ademas de polipeptidos o polisacaridos reticulados, tales como quitina.
Las formas de dosificacion para los otros tipos de administracion topica (es decir, no al ojo) o para administracion transdermica de los compuestos de la invencion incluyen polvos, esprays, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches, gotas e inhaladores. El principio activo puede mezclarse en condiciones esteriles con un vehfculo farmaceuticamente aceptable, y con cualquier tampon, o propulsor que pueda requerirse. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, ademas del principio activo, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, acido silfcico, talco y oxido de cinc, o mezclas de los mismos. Los polvos y esprays pueden contener, ademas del principio activo, excipientes tales como lactosa, talco, acido silfcico, hidroxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida o mezclas de estas sustancias. Los esprays pueden contener adicionalmente propulsores habituales tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volatiles no sustituidos, tales como butano y propano. Los parches transdermicos tienen la ventaja anadida de proporcionar la liberacion controlada de
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los compuestos de la invencion al cuerpo. Tales formas de dosificacion pueden prepararse disolviendo, dispersando o incorporando de otro modo uno o mas compuestos de la invencion en un medio apropiado, tal como un material de matriz elastomerica. Tambien pueden usarse potenciadores de la absorcion para aumentar el flujo del compuesto a traves de la piel. La velocidad de tal flujo puede controlarse tanto proporcionando una membrana de control de la velocidad como dispersando el compuesto en una matriz o gel polimerico. Tambien puede usarse un vetnculo solido impregnado con el farmaco (por ejemplo, un aposito) para administracion topica.
Las formulaciones farmaceuticas incluyen aquellas adecuadas para administracion por inhalacion o insuflacion, o para administracion nasal. Para administracion a las vfas respiratorias superiores (nasales) o inferiores por inhalacion, los compuestos se administran convenientemente desde un insuflador, nebulizador o un envase presurizado u otros medios convenientes de administracion de un espray de aerosol. Los envases presurizados pueden comprender un propulsor apropiado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificacion puede determinarse proporcionando una valvula para administrar una cantidad medida.
Alternativamente, para administracion por inhalacion o insuflacion, la composicion puede adoptar la forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo de uno o mas compuestos y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidon. La composicion en polvo puede presentarse en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en capsulas o cartuchos, o, por ejemplo, gelatina o envases alveolados de los que puede administrarse el polvo con la ayuda de un inhalador, insuflador o un inhalador de dosis medida.
Para administracion intranasal, los compuestos pueden administrarse por medio de gotas nasales o un espray lfquido, tal como por medio de un frasco atomizador de plastico o un inhalador de dosis medida. Los espray lfquidos se administran convenientemente de envases presurizados. Son tfpicos los atomizadores Mistometer (Wintrop) y Medihaler (Riker).
Pueden formularse gotas nasales con una base acuosa o no acuosa que tambien comprende uno o mas dispersantes, solubilizantes o agentes de suspension. Las gotas pueden administrarse por medio de un simple frasco cuentagotas para los ojos o por medio de un frasco de plastico adaptado para administrar el contenido lfquido gota a gota por medio de un cierre con forma especial.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para administraciones parenterales comprenden uno o mas compuestos en combinacion con una o mas disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotonicas esteriles, o polvos esteriles farmaceuticamente aceptables, que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, solutos que hacen la formulacion isotonica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspension o espesantes. Tambien pueden usarse protesis endovasculares recubiertas de farmaco.
Ejemplos de vehfculos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes, tales como humectantes, emulsionantes y dispersantes. Tambien puede desearse incluir en las composiciones agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro sodico y similares. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede provocarse mediante la inclusion de agentes que retardan la absorcion, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un farmaco, se desea ralentizar la absorcion del farmaco de la inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto puede llevarse a cabo mediante el uso de una suspension lfquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La velocidad de absorcion del farmaco depende entonces de su velocidad de disolucion que, a su vez, puede depender del tamano del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorcion retardada de un farmaco parenteralmente administrado se lleva a cabo disolviendo o suspendiendo el farmaco en un vetnculo de aceite.
Las formas de liberacion prolongada inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas del farmaco en polfmeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relacion del farmaco con respecto al polfmero y la naturaleza del polfmero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberacion del farmaco. Ejemplos de otros polfmeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(anhndridos). Las formulaciones de liberacion prolongada inyectables tambien se preparan atrapando el farmaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Los materiales inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtracion a traves de un filtro de retencion de bacterias.
Las formulaciones pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitarias o de dosis multiples, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condicion liofilizada que requiere solo la adicion del vetnculo lfquido esteril, por ejemplo, agua para inyeccion, inmediatamente antes de uso. Las disoluciones y suspensiones para
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inyeccion extemporanea pueden prepararse a partir de polvos, granulos y comprimidos esteriles del tipo descrito anteriormente.
Tambien se describen, pero no son parte de la invencion, kits. El kit puede comprender al menos dos contenedores. Un contenedor comprende un compuesto de danazol. Cada uno de uno o mas contenedores adicionales comprende uno o mas farmacos adecuados para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular (incluyendo aquellos farmacos descritos anteriormente). Los contenedores adecuados incluyen viales, frascos, envases blister y jeringuillas. El kit tambien contiene instrucciones para la administracion del compuesto de danazol y el uno o mas farmacos adecuados para tratar una enfermedad o afeccion mediada por hiperpermeabilidad vascular. Las instrucciones pueden, por ejemplo, imprimirse sobre el envase que sujeta los dos o mas contenedores, pueden imprimirse sobre una etiqueta unida al kit o a los contenedores o pueden imprimirse en una hoja de papel por separado que esta incluida dentro o junto con el kit. El envase que sujeta los dos o mas contenedores puede ser, por ejemplo, una caja, o los dos o mas contenedores pueden sujetarse juntos mediante, por ejemplo, una envoltura retractil de plastico. El kit tambien puede contener otros materiales que son conocidos en la tecnica y que son deseables desde un punto de vista comercial o para el usuario.
Como se usa en el presente documento, “un” o “una” significan uno o mas.
Los objetos, ventajas y caractensticas novedosas adicionales de la presente invencion seran evidentes para aquellos expertos en la materia considerando los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: efectos del danazol sobre la angiogenesis (comparativo)
A. Proliferacion de celulas HUVEC
Protocolo:
Se obtuvieron celulas endoteliales primarias de vena umbilical humana (HUVEC) y medio de crecimiento EGM-2 de Cambrex (Walkersville, MD). Se realizo un pase de celulas en medio complementado con 2 % de suero bovino fetal (SBF) en matraces de cultivo de tejido a 37 °C y 5 % de CO2. El subcultivo se realizo usando tripsina cuando se obtuvo el 60 %-80 % de confluencia como se especifica por el proveedor.
Se descongelaron las ampollas crioconservadas de las HUVEC del pase 2 y se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos a 5.000 celulas/cm2. Se preparo una disolucion madre de danazol 50 mM en etanol y el SBF en el medio se aumento al 5 % para mantener el danazol en disolucion. Se trataron las celulas con medio que contema concentraciones finales de danazol que oscilan de 0,1 pM a 100 pM, por triplicado. Se realizaron incubaciones de 24, 48 y 72 horas y se determino la proliferacion celular utilizando el ensayo CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation de Promega (Madison, Wl). En resumen, se aspiro el medio de cada pocillo y se lavaron las celulas con 200 pl de solucion salina tamponada con Hepes (HBSS) de Cambrex calentada a 37 °C. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de disolucion CellTiter diluida (15 pl de disolucion madre + 85 pl de EGM-2 que contema 0,1 % de SBF) y se incubaron durante 4 horas adicionales. Se determino la densidad optica mediante un lector de microplacas usando un filtro de 530 nm despues de restar el blanco y los datos se presentaron como DO ± desviacion estandar. La concentracion final de etanol en los pocillos fue inferior al 0,2 % y no tuvo ningun efecto sobre la viabilidad o la proliferacion celular.
Todos los datos se presentan como experimento representativo realizado por triplicado. Las diferencias entre los subconjuntos se analizaron mediante la prueba de la t de Student en Microsoft Excel. P < 0,05 se considero estadfsticamente significativo.
Resultados, observaciones y discusion:
El cultivo de HUVEC primarias en presencia de danazol disminuyo la DO obtenida del ensayo de proliferacion CellTiter de Promega de una manera dependiente de la dosis y del tiempo (figura 1). El ensayo CellTiter se basa en la reduccion de la disolucion de ensayo por enzimas deshidrogenasa a un colorante de formazano que se correlaciona directamente con el numero de celulas.
El tratamiento con danazol a las 24 horas parecio ser eficaz solo a dosis muy altas. Se observaron disminuciones significativas (valor de p < 0,05) en el ensayo de DO a concentraciones de danazol de 10 pM o superiores. La DO detectada en los pocillos de control negativo fue 0,414 ± 0,06 y el tratamiento con danazol 10 pM disminuyo la DO a 0,288 ± 0,037 mientras que 100 pM a 0,162 ± 0,017, que equivale a inhibiciones en porcentaje del 30 % y del 65 %, respectivamente.
A las 48 horas, la inhibicion observada fue significativa incluso a niveles de 1 pM. La lectura del control negativo obtenida despues de 48 horas en cultivo aumento a 0,629 ± 0,095 y se redujo a 0,378 ± 0,037 por 1 pM, 0,241 ± 0,012 por 10 pM y 0,19 ± 0,033 por 100 pM (o inhibiciones en porcentaje del 40 %, 61 % y 70 %, respectivamente).
Despues de 72 horas, todos los tratamientos con danazol probados mostraron una reduccion significativa en la proliferacion de HUVEC. La DO obtenida en los pocillos de control negativo fue 1,113 ± 0,054 y despues de un tratamiento 0,1 pM se redujo a 0,798 ± 0,037, 1 pM a 0,484 ± 0,022, 10 pM a 0,229 ± 0,016 y 100 pM a 0,156 ± 0,018 (inhibiciones del 28 %, 57 %, 80 % y 86 %, respectivamente).
5 El examen de la DO obtenida a partir de todas las dosis de danazol 100 pM fue coherente en todos los momentos de tiempo, indicando una detencion completa de la proliferacion celular a esta concentracion.
En resumen, el danazol mostro una fuerte inhibicion de la proliferacion de celulas endoteliales.
B. Formacion de tubos por HUVEC Protocolo:
10 Para investigar la formacion de estructuras similares a capilares por HUVEC, se adquirio el ensayo Angiogenesis System: Endothelial Cell Tube Formation de BD Biosciences (San Jose, CA) y se uso segun el protocolo del fabricante. En resumen, se sembraron 100.000 HUVEC sobre soportes Matrigel rehidratados en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos en presencia de 5 % de SBF para inducir la formacion de tubos. Se anadio danazol a concentraciones finales de 1 pM, 10 pM o 50 pM y se anadio LY294002 (control positivo) a 50 pM. Despues de 18 15 horas, los pocillos se fotografiaron usando una camara digital Kodak DCS Pro sLr/N (Rochester, NY) montada en un microscopio invertido. Se incluyeron pocillos tratados con etanol para determinar si el velmculo tema algun efecto sobre la diferenciacion celular.
Resultados, observaciones y discusion:
Para esclarecer si el danazol puede prevenir la formacion de estructuras similares a tubos por HUVEC se usaron 20 placas de 96 pocillos que conteman soportes Matrigel. Las celulas endoteliales, cuando se cultivan en presencia de sustancias angiogenicas y se les proporciona un armazon de matriz extracelular, se diferenciaran en estructuras vagamente parecidas a vasos capilares. Las HUVEC cultivadas con danazol mostraron menos estructuras organizadas con interconexiones delgadas y menos definidas que los controles (vease la figura 2, en la que A = control, B = danazol 1 pM, C = danazol 10 pM, D = danazol 50 pM y E = LY294002 50 pM). El tratamiento con 25 danazol 50 pM condujo a colonias aisladas de HUVEC localizadas en el soporte con muy pocas conexiones delgadas o separaciones de la luz del vaso. El efecto del danazol fue muy similar al del compuesto de control positivo LY294002. Para garantizar que el velmculo usado no tema ningun efecto, los pocillos se trataron con etanol a concentraciones correspondientes a la maxima dosis de danazol usado y no se observo efecto sobre la formacion de tubos (datos no mostrados). Estos datos indican que el danazol es un inhibidor eficaz de la formacion de tubos a 30 50 pM. El danazol no tuvo efecto sobre la formacion de tubos a 1 pM o 10 pM.
C. Invasion de HUVEC Protocolo:
Se adquirieron camaras de invasion de BioCoat Matrigel de BD Biosciences (San Jose, CA). Se rehidrataron los insertos a 37 °C con 500 pl de HBSS durante 2 horas antes de su uso en una estufa de incubacion humidificada. Las 35 HUVEC tratadas con tripsina se lavaron dos veces con EGM-2 caliente que contema 0,1 % de SBF y se anadieron a la camara superior del inserto de invasion a 100.000 celulas en un volumen total de 250 pl. Se anadieron danazol y compuestos de control al deposito superior a concentraciones finales de 10 pM y 100 pM. Se anadieron a la camara inferior 750 pl de EGM-2 complementado con 5 % de SBF para iniciar la invasion y se incubaron las placas durante 24 horas. Se retiraron de la camara superior las celulas no invasivas con hisopos de algodon humedecidos y a 40 continuacion los insertos se lavaron dos veces con HBSS. Se sumergieron los insertos en calcema AM 10 pM preparada en HBSS y se incubaron durante 4 horas. Se determino la fluorescencia en un lector de microplacas a 485 nm de excitacion y 595 nm de emision. LY294002 y el compuesto estructuralmente similar pero inactivo LY303511 sirvieron de controles positivo y negativo, respectivamente, para este experimento.
Resultados:
45 Los resultados se presentan en la figura 3. Todos los datos se presentan como un experimento representativo realizado por triplicado. Las diferencias entre los subconjuntos se analizaron usando la prueba de la t de Student en Microsoft Excel. P < 0,05 se considero estadfsticamente significativo.
Se usaron insertos porosos recubiertos con Matrigel para determinar si el danazol podfa interferir con la invasion o migracion de celulas endoteliales (figura 3). En el sistema usado para el estudio se detecto un aumento significativo 50 en las celulas mediante un colorante fluorescente despues de la adicion de SBF a la camara opuesta a las celulas endoteliales (5674 UF ± 77 a 7143 ± 516). El danazol a concentraciones de 10 pM y 100 pM no tuvo efecto, mientras que LY294002 mostro atenuacion casi completa de la invasion de celulas (5814 ± 153). Estos datos indican que los factores presentes en el SBF inducen la produccion por HUVEC de proteasas que digieren la matriz extracelular, seguido de la migracion a lo largo de un gradiente quimiotactico. El danazol no tiene efecto inhibidor aparente sobre 55 la invasion y la migracion de HUVEC en este modelo.
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D. Miaracion de HUVEC
Protocolo:
Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol sobre la migracion de HUVEC en un ensayo de miaracion por raspado. Se sembraron HUVEC del pase 8, numero de lote 8750 (obtenidas de Lonza), en placas de 6 pocillos (ICS BioExpress) en medio completo de medio de crecimiento endotelial-2 (EGM-2) (obtenido de Lonza). Se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48-72 horas para conseguir monocapas confluentes. A continuacion, se “rasparon” las monocapas con una punta de pipeta de 1000 pl y se lavaron dos veces con medio EGM-2 caliente. Se aspiro el medio de lavado final y se sustituyo con medio EGM-2 fresco o medio EGM-2 fresco que contema un intervalo de concentraciones de las concentraciones de danazol (Sigma, n° D8399). Se sacaron fotograffas de las monocapas danadas y se incubaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante otras 24 horas. Se fotografiaron de nuevo los pocillos. Se midieron los huecos en cada fotograffa usando el software Adobe Photoshop, y las mediciones de los huecos se presentan como el numero de pfxeles en el hueco.
Resultados:
Los resultados de tres experimentos separados se presentan en la Tabla 1 a continuacion. Como puede apreciarse de la Tabla 1, se encontro que el danazol, a concentraciones de 50 pM, 75 pM y 100 pM, inhibe significativamente la miaracion de HUVEC en este ensayo. El medio de cultivo EGM-2 usado en este ensayo contiene una mezcla de factores de crecimiento en comparacion con el SBF usado en el modelo de Matrigel descrito en la seccion C anterior. Esta diferencia en los factores de crecimiento puede explicar la diferencia de los resultados obtenidos usando los dos modelos.
TABLA 1
Compuesto(s)
Concentracion de danazol Pfxeles medios % de inhibicion medio DE EEM
Diluyente de control (etanol)
1264,00
Danazol
10 pM 1004,00 21,14 14,87 8,59
Danazol
25 pM 1184,00 5,50 8,80 5,08
Danazol
50 pM 895,33 27,64 17,63 10,18
Danazol
75 pM 317,33 74,62 6,80 3,93
Danazol
100 pM 178,67 85,90 0,92 0,53
Ejemplo 2: efecto del danazol sobre la permeabilidad vascular de monocapas de HUVEC Protocolo:
Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol sobre la permeabilidad de monocapas de HUVEC. Se sembraron HUVEC del pase 5-10, numero de lote 7016 (obtenidas de Lonza), sobre insertos de tamano de poro de 1 micrometro localizados en los pocillos de una placa de 24 pocillos (insertos de cultivo celular Thincert de 24 pocillos de Greiner BioOne, n° 662610, o ISC BioExpress, n° T-3300-15) usando medio de crecimiento endotelial-2 (EGM-2) (obtenido de Lonza). Se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48-72 horas para conseguir la confluencia y desarrollar monocapas firmes. A continuacion se retiro el medio y se sustituyo con medio fresco o medio fresco que contema un intervalo de concentraciones de danazol (Sigma, n° D8399). Se anadieron a los pocillos apropiados factor de necrosis tumoral a (TNFa; Pierce Biotechnology, n° RTNFAI) e interleucina-1p (IL-1P; Sigma, n° I-9401) a concentraciones finales de 10 ng/ml cada uno. TNFa e IL-1 p inducen la permeabilidad; pueden producir un aumento de la permeabilidad de hasta diez veces. Finalmente, se anadio a cada pocillo estreptavidina conjugada con peroxidasa de rabano picante (HRP) (Pierce Biotechnology, n° N100, 1,25 mg/ml) a una dilucion final de 1:250. La HRP es una molecula grande que tiene un peso molecular de aproximadamente 44.000. Los volumenes finales fueron 300 pl en las camaras superiores y 700 pl en las camaras inferiores de cada pocillo. Se incubaron las placas durante 24 horas adicionales en la estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Despues de esta incubacion, se retiraron y se desecharon los insertos. El examen visual de las celulas sobre los insertos indico que todas las monocapas estaban todavfa intactas.
Para evaluar el flujo continuo de HRP, se transfirieron 15 pl de las disoluciones resultantes en las camaras inferiores a placas de ELISA de 96 pocillos (cada reaccion se realizo por triplicado). A continuacion, se anadieron a cada
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pocillo 100 |jl de disolucion de tetrametilbencidina (TMB) (Pierce), y se desarrollo el color durante 5 minutos a temperature ambiente. El desarrollo del color se detuvo anadiendo 100 jl de solucion acida 0,18 N. Se determino para cada pocillo la DO usando un lector de microplacas ajustado a 450 nm menos 530 nm. Se calculo el porcentaje de inhibicion de la permeabilidad frente a los controles, y las medias de tres experimented separados se presentan en la Tabla 2.
Como se puede apreciarse de la Tabla 2, el danazol a concentraciones de 25,0 jM o superiores aumento realmente la permeabilidad vascular. Una concentracion de 10,0 jM tuvo poco o ningun efecto sobre la permeabilidad vascular. El danazol a concentraciones de 0,1 jM a 5,0 jM, siendo las optimas de 0,1 jM a 0,5 jM, disminuyo la permeabilidad vascular. La curva de respuesta a la dosis es muy interesante, ya que existe un segundo pico de inhibicion a concentraciones de 0,001 jM (o quizas incluso inferiores) a 0,005 jM. Asf, el danazol presenta una curva de respuesta a la dosis muy sorprendente e inesperada para la permeabilidad vascular.
Como se muestra en el Ejemplo 1, se requerina una concentracion de 50 jM a 100 jM para obtener una inhibicion de la proliferacion, migracion y formacion de tubos de HUVEC despues de 18-24 horas de incubacion con danazol. Como se muestra en este Ejemplo 2, estas concentraciones optimas para inhibir la angiogenesis aumentanan espectacularmente la permeabilidad vascular despues de 24 horas (vease la Tabla 2). En cambio, las concentraciones optimas de uso para inhibir la permeabilidad vascular (0,1 jM a 0,5 jM) tienen efectos insignificantes sobre la angiogenesis a las 24 horas.
TABLA 2
Compuesto(s)
Concentracion de danazol % de inhibicion media DE EEM
Danazol
0,001 jM 19,35 5,39 3,11
Danazol
0,005 jM 16,37 8,04 4,64
Danazol
0,01 jM -2,74 14,56 8,40
Danazol
0,05 jM 7,67 8,83 5,10
Danazol
0,1 jM 35,59 23,08 11,54
Danazol
0,5 jM 30,95 12,01 6,01
Danazol
1,0 jM 21,20 31,13 13,92
Danazol
5,0 jM 14,63 15,30 7,65
Danazol
10,0 jM 14,29 36,85 13,03
Danazol
25,0 jM -1,06 22,60 11,30
Danazol
50,0 jM -377,36 384,50 171,95
TNFa + IL-1 p + danazol
0,1 jM 31,30 25,26 12,63
TNFa + IL-1 p + danazol
1,0 jM 29,22 16,17 7,23
TNFa + IL-1 p + danazol
10,0 jM 8,47 20,45 9,14
TNFa + IL-1 p + danazol
25,0 jM -39,93 15,53 7,76
TNFa + IL-1 p + danazol
50,0 jM -117,16 29,20 14,60
Ejemplo 3: efecto del danazol sobre la permeabilidad vascular
Se realizo un pase de celulas endoteliales retinianas humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA), de pase 9, en medio EGM-2 (Lonza, Walkersville, MD) hasta que se obtuvo el 80 % de confluencia. A continuacion, se liberaron las celulas del matraz de pases usando tripsina-EDTA, y se contaron las celulas en la suspension resultante para determinar tanto la viabilidad como el numero de celulas. La viabilidad de la suspension de celulas fue superior al 90 % en este experimento.
A continuacion, se sembraron las celulas sobre inserted (tamano de poro de 1 micrometro) localizados en los pocillos de una placa de 24 pocillos (inserted de cultivo celular Thincert de 24 pocillos de Greiner BioOne, n° 662610) en 300 jl de medio completo EGM-2 (obtenido de Lonza). A continuacion, se colocaron 700 jl de EGM-2 en la
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camara inferior, y se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 horas para conseguir monocapas confluentes. Las mediciones de resistencia electrica transendotelial (TER) se tomaron usando un electrodo sTx 100 unido a un voltio-ohm^metro EVOM2 (ambos de World Precision Instruments) para todos los insertos para confirmar la constitucion de una barrera semipermeable. Para realizar las mediciones, se coloco una sonda en cada pocillo con un electrodo en la camara superior y uno en la camara inferior.
A continuacion, se trataron las celulas por duplicado del siguiente modo. Se decanto cuidadosamente medio EGM-2 de los insertos y se sustituyo con medio IMDM que contema 0,5 % de suero bovino fetal y suplementos de EGM-2, excepto por VEGF e hidrocortisona (todos de Lonza). En algunos pocillos, el medio IMDM contema danazol (Sigma, n° D8399) en una dilucion en serie de 10 veces. Se incubaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C en 5 % de CO2 durante cuatro horas antes de anadir a la camara superior de cada pocillo 30 pl de una disolucion que contema 4 % de albumina de suero humano marcada con fluorescencia. Se incubaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 18 horas adicionales.
Despues de esta incubacion, se retiraron y se desecharon los insertos, y se transfirieron 200 pl del medio de la camara inferior a placas de fluorescencia negras de 96 pocillos (Falcon) por triplicado. A continuacion, se midio la fluorescencia de cada pocillo a una longitud de onda de excitacion de 340 nm y una longitud de onda de emision de 470 nm. A continuacion, se calculo la media de las unidades de fluorescencia (UF) para cada inserto, y se promediaron las lecturas duplicadas. Los resultados se presentan en la Tabla 3.
TABLA 3
Concentracion de danazol
UF media DE
Ninguna
767,13 8,38
0,01 pM
688,50 14,94
0,1 pM
743,90 8,95
1,0 pM
783,39 14,59
10,0 pM
768,99 18,85
Como puede apreciarse, la concentracion mas baja de danazol (0,01 pM) dio la mayor inhibicion (aproximadamente el 10 %). Los pocillos de control ejecutados sin celulas dieron mas de 4000 UF en la camara inferior, que muestra que las monocapas endoteliales retinianas eran selectivamente permeables.
Ejemplo 4: Efecto del danazol sobre la TER de tres monocapas de celulas endoteliales diferentes
Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol sobre la resistencia electrica transendotelial (TER) de las celulas endoteliales retinianas humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA). Para ello, se sembraron 150.000 celulas endoteliales retinianas humanas del pase 14 sobre insertos (tamano de poro de 1 micrometro) localizados en los pocillos de una placa de 24 pocillos (insertos de cultivo celular Thincert de 24 pocillos de Greiner BioOne, n° 662610) en 300 pl de medio completo EGM- 2 (obtenido de Lonza). A continuacion, se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. Despues de la incubacion, se decanto cuidadosamente el medio de cultivo y se sustituyo con tanto EGM-2 fresco como EGM-2 fresco que contema danazol a una concentracion final de 1 pM. Las placas se colocaron de nuevo en la estufa de incubacion y se cultivaron durante 144 horas adicionales. Los ensayos tambien se realizaron del mismo modo usando celulas endoteliales de cerebro humano del pase 8 y celulas endoteliales de vena umbilical humana del pase 8.
Se realizo una medicion de TER inicial para cada inserto usando un voltio-ohirnmetro EVOM2 conectado a un electrodo STX100 (ambos de World Precision Instruments). Las mediciones se realizaron tambien a las 24, 48, 72 y 144 horas. Los resultados se presentan en las Tablas 4, 5 y 6 a continuacion. Todos los datos se presentan como mediciones de TER/cm2 de inserto restando la TER de los insertos blancos.
TABLA 4
Celulas endoteliales retinianas humanas
Concentracion de danazol
0 horas 24 horas 48 horas 72 horas 144 horas
Ninguna
32,3 96,0 144,4 148,0 219,7
1,0 pM
21,7 132,3 182,3 217,7 234,8
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TABLA 5
Celulas endoteliales de cerebro humano
Concentracion de danazol
0 horas 24 horas 48 horas 72 horas 144 horas
Ninguna
41,4 115,7 176,3 154,0 151,5
1,0 pM
32,3 139,9 188,4 149,5 125,8
TABLA 6
Celulas endoteliales de vena umbilical humana
Concentracion de danazol
0 horas 24 horas 48 horas 72 horas 144 horas
Ninguna
82,3 217,2 276,3 226,8 227,3
1,0 pM
70,2 246,0 364,1 270,7 286,4
Como puede apreciarse, el danazol potencio las mediciones de TER (permeabilidad a los iones reducida) en las monocapas de celulas endoteliales retinianas y de vena umbilical. El danazol no pareda tener mucho efecto sobre la TER de las monocapas de celulas endoteliales de cerebro. La TER es una medicion de la resistencia electrica a traves de las monocapas celulares. Es una indicacion de la integridad de la barrera y se correlaciona con la permeabilidad a los iones.
Ejemplo 5: Efecto del danazol sobre la fosforilacion de Akt
Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol sobre la fosforilacion de Akt en celulas endoteliales retinianas humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA). Se cultivaron las celulas en un matraz de 25 cm2 hasta casi confluencia en medio EGM-2 (Lonza, Walkersville, MD) que contema 2 % de suero bovino fetal (Lonza). A continuacion, se liberaron las celulas del matraz de pases usando Tripsina/EDTA. Se contaron las celulas en la suspension resultante y se sembraron en una placa de 96 pocillos a 1 x 104 celulas/pocillo en medio EGM-2. Se incubo la placa a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. A continuacion, se anadieron 200 pl de medio EGM-2 (control) o diversas concentraciones de danazol, y se incubaron las placas durante 2 horas adicionales. Despues de esta incubacion, se fijaron inmediatamente las celulas con 4 % de formaldehndo, refrigerado, y se determino el grado de fosforilacion de Akt usando el kit Akt Cellular Activation of Signaling ELISA (kit CASE™ para AKT S473; SABiosciences, Frederick, MD) siguiendo los protocolos del fabricante. El kit CASE™ para AKT s473 cuantifica la cantidad de protema Akt activada (fosforilada) con respecto a protema Akt total en ensayos paralelos usando un formato de ELlSA convencional con deteccion colorimetrica. El sitio de fosforilacion de la Akt es la serina 473 y es reconocido por uno de los anticuerpos usados en uno de los dos ensayos paralelos para proporcionar una medida de la protema Akt activada. El otro anticuerpo usado en el otro ensayo paralelo reconoce la Akt para proporcionar una medida de la protema Akt total. Ambos anticuerpos primarios se detectan usando un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rabano picante. La adicion de disolucion de desarrollo del fabricante durante 10 minutos, seguida de la adicion de disolucion de parada del fabricante, produce el resultado que puede medirse colorimetricamente.
Los resultados se presentan en la Tabla 7 a continuacion. Como puede apreciarse en ella, todas las concentraciones de danazol provocaron un aumento de la fosforilacion de la Akt (activacion).
TABLA 7
TRATAMIENTO
PORCENTAJE DE AUMENTO EN LA FOSFORILACION DE AKT FRENTE AL CONTROL DESVIACION estAndar
Danazol 0,5 pM
73,8 % 92,9 %
Danazol 1,0 pM
66,7 % 11,7 %
Danazol 2,0 pM
101,6 % 9,1 %
Danazol 5,0 pM
40,5 % 17,7 %
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Danazol 10,0 pM
115,3 % 112,9 %
Danazol 20,0 pM
161,3 % 128,7 %
Danazol 50,0 pM
98,6 % 61,2 %
Se cree que estos resultados proporcionan una posible explicacion para la curva de respuesta a la dosis de la permeabilidad vascular obtenida en el Ejemplo 2. Como se muestra en el Ejemplo 2, las dosis bajas de danazol redujeron la permeabilidad, mientras que las dosis altas aumentaron la permeabilidad. Se cree que un cierto nivel de fosforilacion de la Akt en S473 reduce la permeabilidad (las concentraciones de 0,5-5,0 pM en este experimento), mientras que la hiperfosforilacion de la Akt en S473 produce el aumento de la permeabilidad (las concentraciones de 10-50 pM en este experimento).
Ejemplo 6: Efecto del danazol y antagonistas del receptor de esteroides sobre la TER de monocapas de celulas endoteliales retinianas
Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol y antagonistas del receptor de esteroides sobre la resistencia electrica transendotelial (TER) de celulas endoteliales retinianas humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA). Para ello, se recubrieron insertos en pocillos para cultivo de tejidos de Greiner (insertos de cultivo celular Thincert de 24 pocillos de Greiner BioOne, n° 662610) con 5 pg/cm2 de fibronectina (Sigma). A continuacion, se sembraron celulas endoteliales retinianas humanas del pase 12 en la camara superior de los pocillos a 120.000 celulas por inserto en un volumen de 300 pl de medio EGM-2 (Lonza). El volumen para la camara inferior fue 700 pl de medio EGM-2 (Lonza). Se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 horas para constituir las monocapas intactas. Al final de la incubacion, se realizaron las mediciones de TER para todos los insertos usando una sonda STX2 unida a un voltio- ohirnmetro EVOM2 (ambos de World Precision Instruments) para confirmar la integridad de la barrera endotelial. Todos los insertos mostraron resistencia elevada en comparacion con los insertos sin celulas.
A continuacion, se decanto cuidadosamente el medio de cultivo y se sustituyo con EGM-2 fresco, con y sin varios aditivos. Los aditivos fueron danazol, hidroxiflutamida (antagonista del receptor de androgenos), fluvestrant (antagonista de estrogenos) y el inhibidor de la PI3 quinasa LY 294002 (control). Las disoluciones madre de todos los aditivos, excepto del danazol, se prepararon a 10 mM en DMSO. La disolucion madre de danazol fue 10 mM en etanol. Se prepararon diluciones 200 pM de trabajo de todos los aditivos en los mismos disolventes. A continuacion, se prepararon diluciones 200 nM de cada aditivo, y de diluciones equivalentes de etanol y DMSO (controles), en medio EGM-2, y se anadieron a los pocillos danazol y cada uno de los otros aditivos o medio (control) en las combinaciones y concentraciones finales mostradas en la tabla mas adelante. A continuacion, se colocaron de nuevo las placas en la estufa de incubacion, y se realizaron mediciones de TER para cada inserto como se ha descrito anteriormente a los 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos y 24 horas. Se calculo la TER restando la medicion basal (inserto vado) de la lectura de un inserto y dividiendo entre el area superficial del inserto (0,33 cm ). Los resultados se presentan en la Tabla 8 a continuacion.
TABLA 8
Tratamiento
TER a 30 minutos TER a 60 minutos TER a 120 minutos TER a 24 horas
Ninguno
216,22 249,25 234,23 312,31
Danazol 0,1 pM
255,26 267,27 249,35 366,37
Hidroxiflutamida 0,1 pM
177,18 186,19 201,20 297,30
Fluvestrant 0,1 pM
228,23 270,27 258,26 336,34
Hidroxiflutamida 0,1 pM seguido de danazol 0,1 pM
237,24 276,28 240,24 363,36
Fluvestrant 0,1 pM seguido de danazol 0,1 pM
195,20 309,31 255,26 393,39
LY294002 10,0 pM
297,30 354,35 276,28 345,35
LY294002 10,0 pM seguido de danazol 0,1 pM
243,24 342,34 270,27 336,34
Como puede apreciarse de la Tabla 8, el danazol y el fluvestrant aumentaron las mediciones de TER (permeabilidad reducida), mientras que la hidroxiflutamida redujo las lecturas (permeabilidad aumentada), en comparacion con el
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control (sin tratamiento). El danazol previno la reduccion producida por la hidroxiflutamida. Esto podna ser una prueba de que el danazol esta ocupando el receptor de androgenos en estas celulas. El danazol y el fluvestrant mostraron resultados aditivos en algunos momentos de tiempo.
Ejemplo 7: Efecto del danazol sobre la formacion de fibras de estres de actina
Las UIE de la via paracelular incluyen UA y UE. El citoesqueleto de actina esta unido a cada union y controla la integridad de las uniones a traves de la remodelacion de la actina. La reorganizacion del citoesqueleto de actina en fibras de estres produce la aplicacion de fuerzas mecanicas a las uniones que las separan, provocan la contraccion celular y cambios en la morfologfa. El proceso de polimerizacion de la actina es muy dinamico, que permite la rapida reorganizacion de las estructuras de actina y la transicion del fenotipo quiescente, caracterizado por el anillo de actina cortical grueso y la ausencia de fibras de estres, al fenotipo de celulas activadas con actina cortical delgada o sin ella y abundantes fibras de estres. El citoesqueleto de actina parece tambien estar implicado en la transcitosis, tal vez mediante la regulacion del movimiento de caveolas.
Se sembraron celulas endoteliales retinianas humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) en placas de ensayo Falcon Optilux (BD Biosciences) a 1000 celulas por pocillo en un volumen total de 200 |jl de medio EGM-2 (Lonza). Se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 horas. A continuacion, se retiro el medio y se sustituyo con 200 jl de medio IMDM complementado con 0,1 % de suero bovino fetal (todos de Lonza), y se cultivaron las celulas con estas condiciones de privacion de factor de crecimiento y suero durante una hora para suprimir la polimerizacion de la actina. A continuacion, se anadieron danazol (concentraciones finales de 0,1 jM o 10 jM) o el inhibidor de la PI3 quinasa LY294002 (concentracion final de 10 jM) (control positivo). Inmediatamente despues de la adicion de estos compuestos, se anadio TNFa (concentracion final de 50 ng/ml). Despues de la incubacion durante 30 minutos en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2, se aspiro el medio y se fijaron las celulas con 3,6 % de formaldehndo en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) durante diez minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS. Se permeabilizaron las celulas usando 0,1 % de Triton X-100 en PBS durante 5 minutos. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS, y se anadieron a las celulas 50 jl de una dilucion 1:40 de rodamina-faloidina (Invitrogen) en PBS para tenir la F-actina y se dejo sobre las celulas durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 100 jl de PBS y se observaron y fotografiaron las celulas usando un microscopio invertido con filtros de rodamina (ex530/em590).
Los resultados mostraron que el danazol afecto la capacidad de desarrollo de las fibras de estres. Cuando se trataron con danazol, las celulas mostraron diferentes patrones de tincion, en funcion de la dosificacion. A la dosis mas baja de danazol (0,1 jM) se observo tincion difusa por todo el citoplasma, posiblemente indicativo de un acontecimiento de estabilizacion o de un fenotipo de reposo. A la dosis mas alta de danazol (10,0 jM), se detectaron fibras de estres con puntos focales multiples. Estos hallazgos se correlacionan con los resultados previos (veanse los ejemplos previos) de que las dosis mas bajas de danazol inhiben la permeabilidad y las dosis mas altas de danazol aumentan la permeabilidad. El TNFa estimulo las celulas y condujo a un fuerte desarrollo de fibras de estres con puntos focales de tincion intensa. El danazol y LY294002 disminuyeron el numero de celulas que presentaron desarrollo de fibras de estres con el TNFa.
Ejemplo 8: Efecto del danazol sobre la formacion de fibras de estres de actina
Se sembraron celulas endoteliales retinianas humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) en placas de ensayo Falcon Optilux (BD Biosciences) recubiertas con 1 jg/cm2 de fibronectina a 3000 celulas por pocillo en un volumen total de 200 jl de medio EGM-2 (Lonza). Se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 horas. A continuacion, se retiro el medio y se sustituyo con 200 jl de medio Ultraculture complementado con 2,0 % de suero bovino fetal (todos de Lonza), y se cultivaron las celulas en estas condiciones de privacion de factor de crecimiento y suero durante toda la noche para suprimir la polimerizacion de la actina. A continuacion, se retiro el medio y se sustituyo con medio Ultraculture fresco complementado con 2,0 % de suero bovino fetal que contema danazol (0,1 jM, 1 jM o 10 jM) o el inhibidor de la PI3 quinasa LY294002 (10 jM) (control positivo). Despues de la incubacion con estos compuestos durante 30 minutos en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2, se anadio factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (concentracion final de 25 ng/ml). Despues de la incubacion durante 30 minutos adicionales en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2, se aspiro el medio y se fijaron las celulas usando 3,6 % de formaldehndo en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) durante diez minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS. Se permeabilizaron las celulas usando 0,1 % de Triton X-100 en PBS durante 5 minutos. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS, y se anadieron a las celulas 50 jl de una dilucion 1:40 de rodamina-faloidina (Invitrogen) en PBS para tenir la F-actina y se dejo sobre las celulas durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS. Para la tincion de contraste de los nucleos, se anadieron a cada pocillo 100 jl de una disolucion de DAPI 3 jM (4,6-diamino-2-fenilindol, dilactato (Invitrogen)). Despues de 5 minutos, se lavaron las celulas dos veces con 100 jl de PBS. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 100 jl de PBS y se observaron y fotografiaron las celulas usando un microscopio invertido usando rodamina (ex530/em590) y filtros para DAPI (ex350/em460).
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Los resultados mostraron que el danazol afecto la capacidad de desarrollo de las fibras de estres. Cuando se trataron con danazol, las celulas mostraron diferentes patrones de formacion de fibras de estres, en funcion de la dosificacion aplicada. A la dosis mas baja de danazol (0,1 jM), se observo tincion difusa de la F-actina por todo el citoplasma. A una concentracion de danazol 1,0 jM, la tincion difusa persistfa, pero fueron visibles fibras de estres y puntos focales alrededor del penmetro de la mayona de las celulas. A la dosis mas alta de danazol (10,0 jM), no existfa ya ninguna tincion difusa, se vefan el desarrollo de fibras de estres y puntos focales. La tincion vista con las dosis mas bajas de danazol mostro un patron de tincion perinuclear, que indica una estabilizacion de microtubulos similar a la observada con el paclitaxel (un compuesto de taxol conocido por estabilizar y polimerizar microtubulos). Con VEGF hubo un fuerte desarrollo de fibras de estres. El danazol cambio el patron del VEGF de un modo dependiente de la dosis: (i) la dosis mas baja de danazol de 0,1 jM hizo las fibras de estres menos pronunciadas y aparecio cierta tincion difusa; (ii) la dosis de 1,0 jM mostro menos fibras de estres gruesas, pero se vieron puntos focales en las superficies de contacto; y (iii) la dosis mas alta de danazol de 10,0 jM mostro un fuerte desarrollo de fibras de estres con puntos focales. LY294002 previno el fuerte desarrollo de fibras de estres visto con VEGF y mostro tincion difusa.
Ejemplo 9: Efecto del danazol sobre la fosforilacion de cadherina del endotelio vascular (VE-cadherina)
Se cultivaron celulas endoteliales retinianas humanas del pase 12 (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) hasta la confluencia en placas de cultivo de tejido de 10 cm2 recubiertas de fibronectina (1 jg/cm2) usando medio de cultivo EGM-2 (Lonza) en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Cuando se consiguio la confluencia completa, se sustituyo el medio con medio Ultraculture complementado con 0,5 % de suero bovino fetal y L-glutamina (todos de Lonza), y se cultivaron las celulas en estas condiciones de privacion de factor de crecimiento y suero durante 24 horas. A continuacion, se retiro el medio y se sustituyo con medio Ultraculture fresco complementado con 0,5 % de suero bovino fetal y L-glutamina que contema danazol (0,1 jM, 1 jM o 10 jM) o etanol (vehmulo de control). Despues de la incubacion durante 15 minutos en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2, se anadio factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (concentracion final de 50 ng/ml), y se incubaron las placas durante 15 minutos adicionales en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2.
Se trataron inmediatamente las placas para lisar las celulas del siguiente modo. Se enfriaron, a 4 °C, PBS y tampon de lisis (PBS que contema 1 % de Triton X-100 complementado con las disoluciones de inhibidor de fosfatasa 1 y 2 (Sigma), inhibidor de proteasa (Sigma) y ortovanadato sodico a una concentracion final de 2 mM). Se lavaron las celulas dos veces con 5 ml del PBS helado y a continuacion se lisaron en 500 jl de tampon de lisis helado. Los extractos de protema resultantes se transfirieron a tubos de microcentnfuga de 1,7 ml, y los residuos celulares se eliminaron por centrifugacion a 4 °C a 10.000 rpm durante 10 minutos. A continuacion, se transfirieron 450 jl de la disolucion clarificada a tubos que conteman 25 jl de Dynabeads de protemas (Invitrogen), recubiertas con 10 jl de anticuerpo policlonal anti-VE-cadherina C-19 (Santa Cruz Biotechnology) (recubrimiento realizado siguiendo el protocolo del fabricante). A continuacion, se incubaron los extractos y las perlas durante la noche a 4 °C en un agitador orbital para capturar la VE-cadherina de los extractos. A continuacion, se lavaron las perlas cuatro veces con tampon de lisis helado. Para liberar la protema de las perlas, se calentaron durante 10 minutos a 75 °C en colorante de carga SDS que contema 20 % de colorante reductor (Invitrogen).
Las protemas liberadas se separaron en geles de poliacrilamida al 4-20 % (Invitrogen) a 120 voltios durante 1 hora. Para determinar la fosforilacion y la protema total en los geles, se realizo de forma secuencial la tincion de protemas con Pro-Q Diamond (Invitrogen) y SYPRO Ruby (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Se fotografiaron los geles y se realizo densitometna usando un puesto de formacion de imagenes Kodak. Los resultados se presentan en la Tabla 9 a continuacion.
TABLA 9
VE-Cadherina
Control negativo (control de etanol) Danazol 0,1 jM VEGF Danazol 0,1 jM seguido de VEGF
Intensidad relativa - resultados de ProQ (protema fosforilada)
1,00 1,51 1,89 1,38
Intensidad relativa - resultados de SYPRO (protema total)
1,00 0,89 0,84 0,83
Relacion protema fosforilada:total
0,215 0,365 (aumento de 1,70 veces) 0,481 (aumento de 2,24 veces) 0,358 (aumento de 1,66 veces)
Como puede apreciarse, el danazol produjo un aumento en la fosforilacion de la VE-cadherina. El VEGF produjo un aumento aun mayor en la fosforilacion de la VE-cadherina (hiperfosforilacion), que fue invertido por el danazol. La VE-cadherina es un componente de las UA, y la fosforilacion de la VE-cadherina puede tener una variedad de
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efectos en funcion del residuo. En general, la fosforilacion de la tirosina de la VE-cadherina conduce al desensamblaje de las UA y al aumento de la permeabilidad. Sin embargo, la fosforilacion de la serina 665, provoca una rapida aunque reversible internalizacion de la VE-cadherina asociada con una funcion de barrera reducida. Parece existir un bucle de retroalimentacion en el que la VE-cadherina internalizada impulsa un aumento de la p120 citoplasmica, una protema de armazon que forma complejos con las UA. Esta regulacion por incremento induce una disminucion de la RhoA activa en asociacion con un aumento de las GTPasas estabilizadoras de barrera como Rac1, Rap-1 y Cdc42. Se cree que el aumento en la fosforilacion de la VE-cadherina observado en este experimento tras un tratamiento con una dosis baja de danazol conduce a la activacion de las GTPasas estabilizadoras de barrera. Ademas, el danazol puede prevenir los acontecimientos de fosforilacion desestabilizadores inducidos por el VEGF.
Ejemplo 10: Efecto del danazol y antagonistas del receptor de esteroides sobre la TER de monocapas de celulas endoteliales retinianas
Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol y de los antagonistas del receptor de esteroides sobre la resistencia electrica transendotelial (TER) de celulas endoteliales retinianas humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA). Para ello, se recubrieron insertos en pocillos para cultivo de tejidos de Greiner (insertos de cultivo celular Thincert de 24 pocillos de Greiner BioOne, n° 662610) con 5 pg/cm2 de fibronectina. A continuacion, se sembraron celulas endoteliales retinianas humanas del pase 13 en la camara superior de los pocillos a 120.000 celulas por inserto en un volumen de 300 pl de medio EGM-2 (Lonza). El volumen para la camara inferior fue 700 pl de medio EGM-2 (Lonza). Se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 horas para constituir las monocapas intactas. Al final de la incubacion, se realizaron las mediciones de TER para todos los insertos usando una sonda STX 2 conectada a un voltio-ohirnmetro EVOM2 (ambos de World Precision Instruments) para confirmar la integridad de la barrera endotelial. Todos los insertos mostraron resistencia elevada en comparacion con los insertos sin celulas.
A continuacion, se decanto cuidadosamente el medio de cultivo y se sustituyo con EGM-2 fresco, con y sin varios aditivos. Los aditivos fueron danazol, hidroxiflutamida (antagonista del receptor de androgenos), fluvestrant (antagonista de estrogenos), testosterona, estradiol e inhibidor de la PI3 quinasa LY294002 (control). Las disoluciones madre de todos los aditivos, excepto danazol, se prepararon a 10 mM en DMSO. La disolucion madre de danazol fue 10 mM en etanol. Se prepararon diluciones de trabajo 200 pM de todos los aditivos en los mismos disolventes. A continuacion, se prepararon diluciones 200 nM de cada aditivo, y de diluciones equivalentes de etanol y DMSO (controles), en medio EgM-2, y se anadieron a los pocillos danazol y cada uno de los otros aditivos o medio (control) en las combinaciones y concentraciones finales mostradas en la tabla mas abajo. A continuacion, se colocaron de nuevo las placas en la estufa de incubacion, y se realizaron las mediciones de TER para cada inserto como se ha descrito anteriormente a los 5 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 24 horas. Se calculo la TER restando la medicion basal (inserto vado) de la lectura de un inserto y dividiendo entre el area superficial del inserto (0,33 cm2). Los resultados se presentan en la Tabla 10 mas adelante.
Como puede apreciarse en la Tabla 10, el danazol aumento las mediciones de TER, la hidroxiflutamida redujo las lecturas, la testosterona redujo las lecturas muy ligeramente, y el fluvestrant no tuvo esencialmente ningun efecto, en comparacion con el control (sin tratamiento). El danazol previno la reduccion producida por la hidroxiflutamida y la muy ligera reduccion vista con la testosterona. Al igual que con los resultados del Ejemplo 6, esto podna ser una prueba de que el danazol esta ocupando el receptor de androgenos en estas celulas.
TABLA 10
Tratamiento
TER a 5 minutos TER a 30 minutos TER a 60 minutos TER a 24 Horas
Ninguno
250,30 262,31 251,00 287,09
Danazol 0,1 pM
280,03 311,56 313,06 348,35
Hidroxiflutamida 0,1 pM
190,44 207,46 215,97 267,27
Hidroxiflutamida 0,1 pM seguido de danazol 0,1 pM
230,48 275,53 262,01 312,31
Fluvestrant 0,1 pM
223,47 251,50 243,99 279,28
Fluvestrant 0,1 pM seguido de danazol 0,1 pM
219,47 279,53 273,02 343,34
Testosterona 10 nM
257,51 240,49 225,98 267,27
Testosterona 100 nM seguido de danazol 0,1 pM
273,52 287,54 259,01 283,28
Estradiol 10 nM
246,50 245,50 250,00 328,33
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Estradiol 10 nM seguido de danazol 0,1 jM
276,53 307,56 282,03 363,36
Ejemplo 11: Efecto del danazol sobre la formacion de fibras de estres de actina
Se sembraron celulas endoteliales microvasculares de glomerulo renal humano del pase 6 (ACBRI 128, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo del Applied Cell Biology Research Institute), Kirkland, WA) y celulas endoteliales retinianas humanas del pase 12 (ACBRI 181, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo del Applied Cell Biology Research Institute), Kirkland, WA) en portaobjetos de vidrio de 16 camaras recubiertos con 5 |jg/cm2 de fibronectina a 2000 celulas por pocillo en un volumen total de 200 jl de medio EGM-2 (Lonza). Se cultivaron las placas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 horas con cambios diarios de medio. A continuacion, se anadieron los compuestos de prueba (danazol, TNFa y S1P), diluidos en solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS; Lonza), para dar las siguientes concentraciones finales: danazol (1 jM) (Sigma), TNFa (1 ng/ml) (Sigma) y S1P (1 jM) (Sigma). Se incubaron los portaobjetos con los compuestos de prueba durante 15 minutos, 30 minutos o 24 horas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Despues de esta incubacion, se aspiro el medio y se fijaron las celulas usando 3,6 % de formaldetudo en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) durante diez minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS. Se permeabilizaron las celulas usando 0,1 % de Triton X-100 en PBS durante 5 minutos. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS, y se anadieron a las celulas 50 jl de una dilucion 1:40 de rodamina-faloidina (Invitrogen) en PBS para tenir la F-actina y se dejo sobre las celulas durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se lavaron todos los pocillos dos veces con 100 jl de PBS. A continuacion, se anadieron a cada pocillo 100 jl de PBS y se observaron y fotografiaron las celulas usando un microscopio invertido usando un filtro para rodamina (ex530/em590).
Los resultados mostraron que el danazol afecto la capacidad de desarrollo de las fibras de estres en las celulas endoteliales microvasculares de glomerulo renal. Cuando se trataron con danazol solo, las celulas mostraron tincion perinuclear a los 15 minutos, tincion difusa portodas las celulas con bordes rugosos en muchas de las celulas a las 3 horas y tincion similar a los controles no tratados a las 24 horas. Con TNFa solo, se vieron en todo momento fibras de estres, aumentando con el tiempo el numero de celulas que mostraban fibras de estres y el grosor de las fibras. El danazol disminuyo en todo momento la formacion de fibras de estres y el grosor de las fibras, y los anillos de actina cortical y los bordes rugosos fueron visibles a partir de las 3 horas. Las celulas tratadas con S1P sola mostraron anillos corticales de actina, iniciandose el desarrollo a los 15 minutos y siendo mas fuerte a las 3 horas. Las celulas volvfan a una morfologfa similar a la de los controles no tratados a las 24 horas. El danazol parecio potenciar los anillos corticales. Ademas, se observo tincion difusa, especialmente a los 15 minutos y a las 24 horas.
Para las celulas endoteliales retinianas tratadas con danazol solo, las celulas mostraron tincion perinuclear a los 15 minutos, tincion difusa por todas las celulas con bordes rugosos en muchas de las celulas a las 3 horas y tincion similar a los controles no tratados a las 24 horas. Con la TNFa solo, se vieron en todo momento fibras de estres, aumentando el numero de celulas que mostraron fibras de estres y el grosor de las fibras de 15 minutos a 3 horas y reduciendose despues de 24 horas de incubacion. El danazol disminuyo en todo momento la formacion de fibras de estres y/o el grosor de las fibras. Se observo tincion difusa a los 15 minutos y a las 24 horas, y los anillos de actina cortical fueron visibles a las 3 horas. Las celulas tratadas con S1P sola mostraron anillos corticales de actina, iniciandose el desarrollo a los 15 minutos y siendo mas fuerte a las 3 horas. Las celulas volvfan a una morfologfa similar a la de los controles no tratados a las 24 horas. El danazol parecio potenciar los anillos corticales a las 3 horas. Ademas, se observo tincion difusa, especialmente a los 15 minutos y a las 24 horas.
La S1P (esfingosina-1-fosfato) desempena una funcion muy importante en la formacion y el mantenimiento del endotelio vascular. La S1P es una entrada de senalizacion constitutiva que facilita la organizacion y la funcion de barrera del endotelio vascular a traves de sus efectos sobre el citoesqueleto de actina. En particular, la S1P participa en la formacion de fibras de actina cortical y en la organizacion de las uniones adherentes. El agotamiento de s1p conduce a fuga vascular y edema, y la S1P puede invertir la disfuncion endotelial y restaurar la funcion de barrera.
En este experimento, el danazol mostro la capacidad de fortalecer los efectos protectores de la S1P en tanto celulas endoteliales glomerulares como retinianas. El danazol tambien invirtio la formacion de fibras de estres inducidas por TNFa en estos dos tipos de celulas endoteliales. Se ve tincion perinuclear difusa en las celulas tratadas con danazol solo.
Ejemplo 12: Efecto del danazol sobre la ECIS
Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol sobre la resistencia electrica transendotelial (TER) de las celulas endoteliales microvasculares de glomerulo renal humano (ACBRI 128, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo del Applied Cell Biology Research Institute), Kirkland, WA) o de las celulas endoteliales retinianas humanas (ACBRI 181, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo del Applied Cell Biology Research Institute), Kirkland, WA). Se midio la resistencia electrica usando el sistema de deteccion por impedancia electrica celula-sustrato (ECIS) (ECISZ0, obtenido de Applied Biophysics) con placas con electrodos multiples de 8 pocillos (8W10E). Cada pocillo de las placas se recubrio con 5 jg/cm2 de fibronectina en HBSS anadiendo la fibronectina en
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En las celulas endoteliales retinianas, el danazol 1,0 jM solo mostro un aumento de la ECIS en comparacion con las celulas no tratadas que se inicio aproximadamente 1,5-2,0 horas despues del tratamiento y persistio durante 5 horas. La S1P sola mostro un aumento de la ECIS en comparacion con las celulas no tratadas que se inicio dentro de los primeros 15 minutos despues del tratamiento y persistio durante aproximadamente 3 horas. El danazol y la S1P en combinacion aumentaron la ECIS en comparacion con S1P sola y celulas no tratadas, y este aumento de la ECIS persistio durante aproximadamente 90 horas. Por tanto, el danazol mostro la capacidad de potenciar los efectos tempranos de la S1P y de mantener una mayor resistencia durante todo el experimento cuando estaba presente S1P.
Las celulas endoteliales glomerulares mostraron un patron diferente. El danazol solo no tuvo efecto sobre la ECIS hasta aproximadamente 30 horas despues del tratamiento. El danazol solo aumento la ECIS en comparacion con celulas no tratadas desde aproximadamente las 30 hasta aproximadamente las 90 horas, produciendose el mayor aumento entre aproximadamente 60-90 horas. La S1P sola tampoco tuvo ningun efecto sobre la ECIS hasta aproximadamente 30 horas despues del tratamiento. La S1P sola aumento la ECIS en comparacion con celulas no tratadas desde aproximadamente las 30 hasta aproximadamente las 60 horas. La combinacion de danazol y S1P no tuvo ningun efecto sobre la ECIS hasta aproximadamente 30 horas despues del tratamiento. Esta combinacion aumentaba la ECIS en comparacion con las celulas no tratadas, la S1P solo y el danazol solo. En particular, la combinacion aumento la ECIS en comparacion con las celulas no tratadas desde aproximadamente las 30 hasta aproximadamente las 70 horas, aumento la ECIS en comparacion con la S1P solo desde aproximadamente las 30 hasta las 75 horas y aumento la ECIS en comparacion con el danazol solo desde aproximadamente las 30 hasta aproximadamente las 50 horas.
Ejemplo 13: Efecto del danazol sobre la ECIS
Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol sobre la resistencia electrica transendotelial (TER) de celulas endoteliales microvasculares de glomerulo renal humano (ACBRI 128, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo del Applied Cell Biology Research Institute), Kirkland, WA). Se midio la resistencia electrica usando el sistema de deteccion por impedancia electrica celula-sustrato (ECIS) (ECISZ0, obtenido de Applied Biophysics) con placas con electrodos multiples de 8 pocillos (8W10E). Cada pocillo de las placas se recubrio con 5 jg/cm2 de fibronectina en HBSS anadiendo la fibronectina en un volumen de 50 jl por pocillo e incubando las placas durante 30 minutos en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Se elimino la disolucion de fibronectina, y se anadieron a cada pocillo 200 jl de medio de cultivo EGM-2 (Lonza). Se conectaron las placas al sistema ECISZ0 y se estabilizaron electricamente. Se aspiro el medio EGM-2 y se sustituyo con 200 jl de medio de cultivo EGM-2 que contema 40.000 celulas del pase 6 por pocillo. Se volvieron a conectar las placas al sistema ECISZ0 y se incubaron durante 24 horas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Se aspiro el medio EGM-2 y se sustituyo con 200 jl de medio de cultivo EGM-2 fresco por pocillo. Se volvieron a conectar las placas al sistema ECISZ0 y se incubaron durante 24 horas adicionales en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Se aspiro el medio EGM-2 y se sustituyo con 200 jl de medio de cultivo EGM-2 fresco sin dexametasona por pocillo. Se volvieron a conectar las placas al sistema ECISZ0 y se incubaron durante la noche en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Por ultimo, se aspiro el medio EGM-2 y se sustituyo con 200 jl de medio de cultivo EGM-2 fresco sin dexametasona por pocillo. Se volvieron a conectar las placas al sistema ECISZ0 y se incubaron 2 horas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Se prepararon disoluciones concentradas de los compuestos de prueba en HBSS y se colocaron en la estufa de incubacion para equilibrarlas. A continuacion, se anadieron los compuestos de prueba a los pocillos apropiados a las siguientes concentraciones finales: danazol (1 jM) (Sigma) y dexametasona (1 jM) (Sigma). Se monitorizo la ECIS (resistencia) durante 90 horas.
El danazol solo aumento la ECIS en comparacion con las celulas no tratadas a partir de aproximadamente las 3 horas y persistiendo durante aproximadamente 90 horas. El mayor aumento fue de aproximadamente las 12 a aproximadamente las 15 horas. Cuando se comparo con la dexametasona, el danazol mostro un patron similar, pero la potenciacion de la ECIS (TER) no fue tan grande.
Ejemplo 14: Efecto del danazol sobre la RhoA
La remodelacion del citoesqueleto de las celulas endoteliales es fundamental para muchas funciones del endotelio. La familia Rho de protemas pequenas de union a GTP ha sido identificada como la reguladora clave de la dinamica
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del citoesqueleto de F-actina. La familia Rho consiste en tres isoformas, RhoA, RhoB y RhoC. La activacion de la actividad de RhoA conduce a la formacion de fibras de estres prominentes en las celulas endoteliales. La estimulacion de las celulas endoteliales con trombina aumenta la fosforilacion de Rho GTP y de miosina, de acuerdo con la contractilidad celular aumentada. La inhibicion de RhoA bloquea esta respuesta y la perdida de la funcion de barrera, que demuestra una funcion cntica de la Rho en la permeabilidad vascular.
Este experimento se realizo usando un ensayo de activacion de Rho comercialmente disponible (GLISA) adquirido de Cytoskeleton, Denver, Colorado, siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se cultivaron celulas endoteliales retinianas humanas del pase 8 o 12 (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos recubiertas de fibronectina (1 pg/cm2) usando medio de cultivo EGM-2 (Lonza) durante 24 horas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2 (30.000 celulas/pocillo en un volumen total de 3 ml). A continuacion, se aspiro el medio y se sustituyo con medio Ultraculture complementado con 0,1 % de suero bovino fetal, L-glutamina, piruvato sodico, penicilina/estreptomicina e ITSS (insulina, transferrina selenio sodio) (todos de Lonza) para privar a las celulas de suero y reducir el nivel basal de RhoA. Se cultivaron las celulas durante 24 horas en una estufa de incubacion a 37 °C con 5 % de CO2. Se colocaron los compuestos de prueba diluidos en HBSS en la estufa de incubacion para equilibrarlos antes de anadirse a las celulas. A continuacion, se anadieron a los pocillos de cultivo apropiados 150 pl de cada compuesto de prueba, y se incubaron las placas en la estufa de incubacion durante 15 minutos adicionales. A continuacion, se anadio trombina a los pocillos apropiados. Despues de 1 minuto, se lavaron las celulas una vez con 1,5 ml de solucion salina tamponada con fosfato y a continuacion se lisaron con 100 pl de tampon de lisis GLISA complementado con inhibidores de proteasas. Se rasparon los extractos, se transfirieron a tubos de microcentnfuga y se transfirieron a hielo para conservar la forma activa de la RhoA. A continuacion, se eliminan los residuos de todos los extractos por centrifugacion a 10.000 rpm durante 2 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos y se colocaron de nuevo en hielo. Se retiraron alfcuotas de cada extracto para el ensayo GLISA y para las determinaciones de protemas. Todas las concentraciones de protemas estuvieron dentro del 10 %, y se usaron los extractos a las concentraciones conseguidas (equivale a 15 pg de protema total por pocillo). El ensayo de GLISA se realizo usando los reactivos suministrados en el kit.
Los resultados para las celulas endoteliales retinianas del pase 12 se presentan en la Tabla 11 a continuacion. Como era de esperar, los niveles de Rho A activa inducidos por la trombina fueron muy altos. Todos los compuestos de prueba inhibieron la activacion de la Rho A inducida por trombina.
Los resultados para las celulas endoteliales retinianas del pase 8 se presentan en la Tabla 12 a continuacion. Como era de esperar, los niveles de Rho A activa inducidos por la trombina fueron muy altos. Todos los compuestos de prueba inhibieron la activacion de la Rho A inducida por trombina.
TABLA 11
Tratamiento
DO media Porcentaje de inhibicion frente a control sin tratar Porcentaje de inhibicion frente a trombina
No tratado
0,455 — —
Danazol 1,0 pM
0,424 6,82 —
Dexametasona 1,0 pM
0,428 5,83 —
Inhibidor de PI3 cinasa 10,0 pM LY 294002
0,370 18,70 —
Inhibidor de Src-1* 1,0 pM
0,349 23,21 —
0,1 U/ml de trombina
1,013 — —
0,1 U/ml de trombina + danazol 1,0 pM
0,859 — 27,57
0,1 U/ml de trombina + dexametasona 1,0 pM
0,826 — 33,48
0,1 U/ml de trombina + inhibidor de PI3 cinasa 10,0 pM LY294002
0,685 58,73
0,1 U/ml de trombina + inhibidor de Src-1 1,0 pM
0,534 85,85
* Obtenido de Sigma.
TABLA 12
Tratamiento
DO media Porcentaje de inhibicion frente a control sin tratar Porcentaje de inhibicion frente a trombina
No tratado
0,102 — —
Danazol 1,0 pM
0,027 73,89 —
Inhibidor de PI3 cinasa 10,0 pM LY 294002
0,056 45,32 —
0,1 U/ml de trombina
0,561 — —
0,1 U/ml de trombina + danazol 1,0 pM
0,373 — 41,02
0,1 U/ml de trombina + inhibidor de PI3 cinasa 10,0 pM LY294002
0,433 27,86
Ejemplo 15: Modelo animal de hiperpermeabilidad vascular
Conejos blancos de Nueva Zelanda recibieron 0,215 mg/kg de danazol por via oral dos veces al dfa durante 7 dfas. 5 A continuacion, se inyecto a los conejos por via intravftrea, una vez, factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) para producir fuga vascular en la retina. A continuacion, 24 horas despues, se les inyecto fluorescema sodica, y se midio la fluorescencia de los ojos usando un Fluorotron (Ocumetrics) (promedio de cinco mediciones). Un solo conejo de control (placebo) tuvo 250 unidades de fluorescencia en la retina, que indica fuga vascular aqrn. Un unico conejo tratado con danazol dio 16 unidades de fluorescencia, que representa una reduccion del 94 % en la 10 fuga vascular producida por el danazol.
Ejemplo 16: Composiciones farmaceuticas
Las composiciones farmaceuticas de la invencion incluiran danazol y un segundo farmaco en capsulas de gelatina para administracion oral en las siguientes cantidades expuestas en la Tabla 13:
Tabla 13
Cantidad de Danazol
Identidad del segundo farmaco Cantidad del segundo farmaco
5-50 mg
FTY720 (fingolimod) 25-625 ng
5-50 mg
Atorvastina 1-40 mg
5-50 mg
Acetazolamida 25-500 mg
5-50 mg
Glicina 0,7-175 g
5-50 mg
Losartan 2,5-50 mg
5-50 mg
Valsartan 4-80 mg
5-50 mg
Sunitinib 3,75-25 mg
5-50 mg
Cetirizina 0,25-5 mg
5-50 mg
Benfotiamina 5-300 mg
5-50 mg
Sulodexida 2,5-100 mg
5-50 mg
Enalapril 0,25-20 mg
5-50 mg
Clopidogrel 7,5-150 mg
5-50 mg
Simvastina 0,5-40 mg
5-50 mg
Fluvestrant 3,5-1100 mg
Los ingredientes no medicinales incluiran almidon de ir^z, monohidrato de lactosa, estearato de magnesio, talco y dioxido de titantio.
Ejemplo 17: Composiciones farmaceuticas de liberacion sostenida
Las composiciones farmaceuticas de liberacion sostenida de la invencion que permiten una administracion oral diaria 5 incluiran danazol y un segundo farmaco en capsulas de gelatina en las cantidades expuestas en la Tabla 13 anterior. El danazol y el segundo farmaco se incorporaran en liposomas multilamelares compuestos de polietilenglicol-12 (PEG-12) dioleato de glicerilo o dimiristato de glicerilo PEG-12. Los liposomas compuestos de lfpidos son compatibles con capsulas de gelatina blandas y duras. Para metodos de fabricacion de estas formulaciones de liberacion sostenida, vease solicitud PCT WO 2002/087543.
10 Ejemplo 18: Composiciones farmaceuticas
Las composiciones farmaceuticas de liberacion sostenida de la invencion que permiten una administracion oral diaria incluiran danazol y un segundo farmaco en capsulas, en las cantidades expuestas en la Tabla 14:
Tabla 14
Cantidad de Danazol
Identidad del segundo farmaco Cantidad del segundo farmaco
1-15 mg
FTY720 (fingolimod) 5-625 ng
1-15 mg
Atorvastina 0,2-40 mg
1-15 mg
Acetazolamida 5-500 mg
1-15 mg
Glicina 0,15-175 g
1-15 mg
Losartan 0,5-50 mg
1-15 mg
Valsartan 0,8-80 mg
1-15 mg
Sunitinib 0,75-25 mg
1-15 mg
Cetirizina 0,05-5 mg
1-15 mg
Benfotiamina 1-300 mg
1-15 mg
Sulodexida 0,5-100 mg
1-15 mg
Enalapril 0,05-20 mg
1-15 mg
Clopidogrel 1,5-150 mg
1-15 mg
Simvastina 0,1-40 mg
1-15 mg
Fluvestrant 0,7-1100 mg
15 Los granulos de danazol y el segundo farmaco se prepararan e incorporaran en capsulas de gelatina dura. Otros ingredientes en los granulos incluiran PEG 6000, Poloxamero 188 y Metolosa HS 90. Para metodos de preparacion de estas formulaciones de liberacion sostenida, vease Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2008/0249076.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Danazol o una sal farmaceuticamente aceptable de danazol para su uso en la inhibicion de la hiperpermeabilidad vascular, en el que el danazol o la sal farmaceuticamente aceptable de danazol se administra por via oral en una dosis diaria de 10mgMa a aproximadamente 90 mg/dfa o por via topica o v^a local a una concentracion de 0,0001 |jM a 5 jM.
  2. 2. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 1, en el que el danazol o la sal farmaceuticamente aceptable de danazol se administra por via oral en una dosis diaria de 10 mg/dfa a aproximadamente 90 mg/dfa.
  3. 3. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 1, en el que el danazol o la sal farmaceuticamente aceptable de danazol se administra por via topica o via local a una concentracion de 0,0001 jM a 5 jM.
  4. 4. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 3, en el que el danazol o la sal farmaceuticamente aceptable de danazol se administra por via topica o via local al ojo.
  5. 5. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 1, en el que el danazol o la sal farmaceuticamente aceptable de danazol esta en una forma de dosificacion solida.
  6. 6. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 1, en el que el danazol o la sal farmaceuticamente aceptable de danazol esta en una forma de dosificacion lfquida.
  7. 7. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 5 o 6, en el que la forma de dosificacion comprende ademas un transportador farmaceuticamente aceptable.
  8. 8. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 3 o 4, en el que la concentracion del danazol o una sal farmaceuticamente aceptable de danazol es de 0,1 jM a 1,0 jM.
  9. 9. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 3 o 4, en el que la concentracion del danazol o una sal farmaceuticamente aceptable de danazol es de 0,1 jM a 0,5 jM.
  10. 10. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 3 o 4, en el que la concentracion del danazol o una sal farmaceuticamente aceptable de danazol es aproximadamente 0,1 jM.
  11. 11. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 3 o 4, en el que el danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol esta en una forma de dosificacion seleccionada entre el grupo que consiste en soluciones, suspensiones, dispersiones, gotas, geles, hidrogeles y pomadas.
  12. 12. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 11, en el que la forma de dosificacion comprende ademas un potenciador de la absorcion o permeacion.
  13. 13. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 11, en el que la forma de dosificacion comprende ademas un agente espesante o potenciador de la viscosidad para aumentar el tiempo de residencia del danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol.
  14. 14. El danazol o sal farmaceuticamente aceptable de danazol para el uso de la Reivindicacion 11, en el que la forma de dosificacion comprende ademas un transportador farmaceuticamente aceptable.
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