ES2553975T3

ES2553975T3 - Proceso para tratamiento de ácidos nucleicos residuales presentes en la superficie de materiales consumibles de laboratorio

Info

Publication number: ES2553975T3
Application number: ES11776585.9T
Authority: ES
Inventors: Marie Pressel; Didier Metz
Original assignee: EMD Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2015-12-15
Anticipated expiration: 2031-10-18
Also published as: FR2966056B1; EP2629806B1; CN103096937B; EP2629806A1; WO2012052913A1; US20120095178A1; JP2013545726A; FR2966056A1; JP5758006B2; CN103096937A; US8765054B2

Abstract

Un método de descontaminación de los ácidos nucleicos residuales amplificables presentes en la superficie de un consumible, caracterizado por que el mismo comprende los pasos siguientes: (i) tratamiento de la superficie de dicho consumible con óxido de etileno en fase gaseosa; y a continuación (ii) tratamiento de dicha superficie con peróxido de hidrógeno en fase líquida a una concentración comprendida entre 25% y 60% y en el cual el peróxido de hidrógeno se calienta a una temperatura comprendida entre 50ºC y 70ºC, o en fase gaseosa, en el cual el peróxido de hidrógeno se vaporiza, y se lleva luego a una concentración mayor que 30%.

Description

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DESCRIPCION

Proceso para tratamiento de acidos nucleicos residuales presentes en la superficie de materiales consumibles de laboratorio

La presente invencion se refiere a un proceso para tratamiento de los acidos nucleicos residuales presentes en la superficie de materiales consumibles, mas particularmente materiales consumibles de laboratorio, en particular tubos y filtros utilizados en los experimentos para amplificacion de muestras de DNA o RNA.

Esta invencion tiene como objetivo abordar, mas particularmente, el problema planteado por la amplificacion espedfica o inespedfica de los acidos nucleicos residuales presentes en la superficie de dichos materiales consumibles, en las tecnicas de implementacion que utilizan reacciones en cadena de polimerasa (PCR) o reacciones de amplificacion mediada por transcripcion (TMA).

Estos acidos nucleicos residuales provienen generalmente de los entornos, pueden estar presentes en forma libre, o bien estar contenidos en celulas vivas tales como microorganismos, virus o protozoos.

Preambulo

Las reacciones de amplificacion de acido nucleico consisten en una sucesion de reacciones enzimaticas que implican la accion de una polimerasa que hace posible la smtesis de nuevas moleculas de acido nucleico a partir de una secuencia de acido nucleico presente inicialmente en el medio de reaccion.

La finalidad de estas reacciones enzimaticas es generalmente generar copias de la misma secuencia de acido nucleico presente inicialmente en pequena cantidad en una muestra. Las amplificaciones utilizadas mas frecuentemente son las que implican reacciones sucesivas de polimerizacion o transcripcion, tales como PCR y TMA. Tales metodos estan ampliamente descritos y son bien conocidos por las personas expertas en la tecnica. Utilizando cebadores espedficos, dichos metodos hacen posible la copia de la misma secuencia de acido nucleico un numero muy elevado de veces sobre la base de un solo molde de DNA o RNA.

En tales reacciones, es la secuencia de nucleotidos de los cebadores utilizados para iniciar la reaccion de polimerizacion lo que determina que secuencia de acido nucleico va a ser amplificada.

Las secuencias de acido nucleico obtenidas por las reacciones de amplificacion son utiles en numerosas aplicacio- nes en el campo de la biologfa molecular, tales como la clonacion de genes, la diagnosis de enfermedades geneti- cas, o la deteccion de virus o microorganismos ([Vosberg, H.P., (1989) The polymerase chain reaction: an improved method for the analysis of nucleic acids, Hum Genet. 83(l): 1-15].

Segun las condiciones en las que se llevan a cabo las reacciones enzimaticas, en particular el grado de severidad utilizado (concentracion de sales y temperatura de hibridacion), es posible amplificar secuencias de DNA o RNA cuya secuencia es mas o menos identica a la que se desea amplificar.

Para obtener una amplificacion muy espedfica de una secuencia dada, es decir para direccionar exclusivamente acidos nucleicos que tengan una secuencia identica a la de los cebadores introducidos en el medio de reaccion, deben adoptarse condiciones de severidad alta. Inversamente, cuando se desea amplificar secuencias que tengan una cierta variabilidad con relacion a los cebadores utilizados, las condiciones de reaccion debenan ser de menor severidad.

En el contexto de tests universales para deteccion de microorganismos, investigaciones geneticas, o diagnosis de enfermedades infecciosas, es frecuente tener que buscar secuencias de acido nucleico que posean cierta variabilidad con relacion a la secuencia tipo buscada para tener en cuenta diferencias en secuencias entre individuos o especies. A este fin, a menudo es necesario recurrir a condiciones de menor severidad que permitan que la diversidad genetica sea tenida en cuenta.

No obstante, los tests realizados en condiciones de severidad baja presentan el riesgo de amplificar secuencias que procedan de acidos nucleicos residuales extranos a la muestra objeto de estudio. Resultado de esto es la aparicion de "positivos falsos", lo cual puede distorsionar sustancialmente los resultados de los tests.

En el caso de la deteccion universal de microorganismos, el riesgo de positivos falsos ligado a la presencia de acidos nucleicos residuales procedentes de los alrededores, es muy alto [Schmidt, T., Hummel, S., Hermann, B., 1995, Evidence of contamination in PCR laboratory disposables; Naturwissenschaften 82].

En las tecnicas forenses, cuando se desea establecer la identidad de un criminal sobre la base de su huella genetica, existe tambien un riesgo no nulo de que los tubos o el equipo utilizados en el laboratorio puedan estar contaminados por el DNA de otra persona, o incluso por el del operador. Por ello, es diffcil establecer el perfil de DNA del criminal con certeza.

Por estas razones, es muy importante que los dispositivos dedicados a la amplificacion de acidos nucleicos esten completamente libres de los acidos nucleicos residuales amplificables.

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En general, los consumables utilizados en las reacciones de biolog^a molecular, que incluyen los implicados en reacciones de amplificacion de DNA o RNA, se fabrican en una sala limpia, antes de ser sometidos a un paso final de esterilizacion convencional para asegurar la ausencia de microbios.

Sin embargo, estos metodos de esterilizacion convencionales no son suficientes para eliminar todos los acidos nucleicos amplificables de las superficies de los consumables.

Los consumables exentos de DNA, RNA, DNasa, RNasa y otros inhibidores de PCR pueden recibir la marca "limpio para PCR". Esto no significa sin embargo que los mismos esten exentos de acidos nucleicos bacterianos que procedan de los alrededores. Pueden utilizarse enzimas tales como endonucleasas o productos qmmicos tales como psoraleno a fin de hacer las moleculas de acido nucleico residual no amplificables.

No obstante, tales productos o enzimas pueden tener una interaccion negativa con los reactivos y las muestras utilizados en las reacciones de amplificacion.

Otros metodos para la eliminacion de acidos nucleicos residuales amplificables utilizan radiacion ionizante (ultravioleta (UV), gamma (y), rayos X y beta (p)), pero, para ser mas eficaces, la duracion de la exposicion tiene que ser varias horas, lo cual hace el proceso costoso, y, sobre todo, degrada o debilita los materiales de los que estan hechos los consumibles. Adicionalmente, la manipulacion de la radiacion ionizante esta sujeta a regulacion estricta, lo cual limita su posibilidad de implementacion.

Diversos metodos de descontaminacion de consumibles han sido descritos en la tecnica anterior.

La Solicitud de Patente Internacional WO 93/20241 describe el uso de complejos de quelatos metalicos de piridina y fenantrolina para desactivar las secuencias de acido nucleico residual en superficies de laboratorio.

La Solicitud de Patente Internacional WO 2007/044520 describe el uso de una solucion diluida de peroxido de hidrogeno para descontaminar consumibles de laboratorio.

En 2007, Shaw et al. ("Comparison of the effects of sterilization techniques on subsequent DNA profiling", lnt. J. of Legal Medicine, vol. 122, no. 1, enero 2008, paginas 29-33,) describieron que, en una comparacion de radiacion UV, gamma y beta y tratamiento con oxido de etileno para descontaminar consumibles de laboratorio, el ultimo tratamiento daba los mejores resultados.

EP 1.792.631 y WO 2005/007884 describen tambien el uso de oxido de etileno para descontaminar consumibles de laboratorio de DNA residual.

Archer et al. ("Validation of a dual cycle ethylene oxide treatment technique to remove DNA from consumables used in forensic laboratories", Forensic Science International: Genetics, Elsevier BV, Pafses Bajos, vol. 4, no. 4, 1 julio 2010, paginas 239-243) describen tambien como se utilizo el tratamiento con un ciclo dual de oxido de etileno para descontaminar consumibles de laboratorio.

Actualmente, para esterilizar sus consumibles, la solicitante utiliza un proceso para tratamiento con peroxido de hidrogeno comercializado bajo el nombre Sterrad® (Johnson & Johnson). El peroxido de hidrogeno es un gas oxidante que hace posible la destruccion por oxidacion de los componentes celulares de microorganismos, en particular protemas, y en menor proporcion acidos nucleicos. El proceso Sterrad® utiliza peroxido de hidrogeno al 90%, en forma gaseosa, a baja temperatura. Conforme a este proceso, se aplica una fase de vacfo en la camara en la cual estan situados los consumibles a tratar, de tal modo que la fase gaseosa penetra y atraviesa todas las partes de los dispositivos a tratar. Al final del ciclo, se aplica de nuevo una fase de vacfo, mientras que las moleculas de peroxido de hidrogeno se ionizan por aplicacion de un campo electrico y formacion de un plasma. Una de las ventajas del proceso Sterrad® es que los dispositivos pueden esterilizarse, mientras los mismos estan pre- empaquetados en bolsitas de plastico. Las bolsitas comprenden una cara de un material sintetico no tejido (Tyvek®) que es permeable al peroxido de hidrogeno.

Sin embargo, la solicitante encontro que este proceso no destrrna totalmente los acidos nucleicos residuales contenidos en los dispositivos. Asf pues, el proceso Sterrad® satisface solo parcialmente las necesidades de la solicitante.

Debena indicarse que la solicitante esta especializada en la fabricacion de dispositivos de filtracion con membrana que comprenden membranas de filtracion destinadas a tests de deteccion de microorganismos. Estos tests de deteccion de microorganismos se llevan a cabo tipicamente por amplificacion PCR despues de filtrar una muestra lfquida a traves de dichos dispositivos que se han esterilizado.

Estos dispositivos consisten a menudo en dispositivos complejos que comprenden conducciones, tanques, y una membrana de filtracion, lo que hace su tratamiento mas diflcil.

La solicitante ha aplicado repetidamente una y otra vez el proceso Sterrad® para tratar de eliminar por completo los acidos nucleicos residuales que quedan en los dispositivos. Sin embargo, las amplificaciones segrnan demostrando todavfa que los acidos nucleicos de los microorganismos no se habfan eliminado por completo (Figura 3B).

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La solicitante ha emprendido por ello investigaciones a fin de mejorar los procesos arriba mencionados, con el proposito de desarrollar un proceso para tratar los acidos nucleicos residuales presentes en dichos dispositivos, con las condiciones de (i) no deteriorar los materiales de los que estan hechos los dispositivos, en particular, las membranas y los filtros (por ejemplo: polipropileno, PES, PVDF) y (ii) no producir como consecuencia el efecto de inhibicion de las reacciones de amplificacion de los acidos nucleicos, para las cuales estan destinados tales dispositivos.

Despues de numerosos ensayos, la solicitante ha determinado que un tratamiento de descontaminacion en dos pasos de las superficies a tratar permite cumplir las condiciones arriba mencionadas.

El proceso desarrollado comprende un primer paso de tratamiento con oxido de etileno en fase gaseosa, seguido por un segundo paso de tratamiento con peroxido de hidrogeno en fase lfquida a una concentracion comprendida entre 25% y 70% y calentado a 50°C-70°C, o en fase gaseosa, en el cual el peroxido de hidrogeno se vaporiza, y se lleva luego a una concentracion mayor que 30%. La solicitante ha encontrado que la combinacion de estos dos pasos ha hecho posible una descontaminacion mas completa que las de las tecnicas anteriores.

En particular, la solicitante ha encontrado, utilizando tests comparativos, que el efecto de los dos pasos para tratamiento del dispositivo era eliminar cualquier amplificacion indeseable, incluso cuando los acidos nucleicos residuales estan contenidos inicialmente en microorganismos, lo cual no puede conseguirse cuando se lleva a cabo solo uno de los pasos de tratamiento.

Los diferentes modos de la invencion y las ventajas resultantes de los mismos se detallan a continuacion.

Figura 1: Un grafico que compara diferentes tratamientos de descontaminacion aplicados a DNA residual contenido inicialmente en microorganismos (S. epidermis). Las superficies de los consumibles (tubos de 1,5 ml) estaban contaminadas con el mismo numero de celulas de S. epidermis antes de recibir los tratamientos respectivos NS (gris claro): ausencia de tratamiento. EO (gris medio): tratamiento con oxido de etileno en fase gaseosa. EO + H2O2 (I) (negro): tratamiento conforme a la invencion con oxido de etileno en fase gaseosa seguido por peroxido de hidrogeno en solucion lfquida (30%). Neg (gris oscuro): control negativo no contaminado por S. epidermis. Las superficies asf tratadas se lavaron luego y se llevo a cabo una reaccion PCR (40 ciclos) sobre los productos de lavado, para el proposito de detectar posible DNA residual procedente de S. epidermis. Las curvas representan la cantidad de DNA amplificado, detectada por fluorescencia.

Figura 2: Un grafico que compara los diferentes tratamientos de descontaminacion aplicados a RNA residual contenido inicialmente en microorganismos (P. aeruginosa). Las superficies de los consumibles (tubos de 1,5 ml) se contaminaron con el mismo numero de celulas de P. aeruginosa antes de recibir uno de los tratamientos respectivos. 2A: EO (gris medio): tratamiento con oxido de etileno en fase gaseosa. y (gris oscuro): tratamiento con radiacion gamma). NS (gris claro): ausencia de tratamiento. 2B: EO + H2O2 (I) (negro): tratamiento con oxido de etileno en fase gaseosa y luego con peroxido de hidrogeno en solucion (30%). y + H2O2 (I) (gris oscuro): tratamiento por irradiacion gamma y a continuacion con peroxido de hidrogeno en solucion (30%). NS + H2O2 (I) (gris claro): tratamiento con peroxido de hidrogeno en solucion (30%) solo. NS. (gris claro): ausencia de tratamiento. Las superficies asf tratadas se lavaron luego y se llevo a cabo una reaccion TMA (76 ciclos) sobre los productos de lavado, con el proposito de detectar posible RNA residual procedente de P. aeruginosa. Las curvas representan la cantidad de RNA amplificado, detectada por fluorescencia.

Figura 3: Un grafico que compara los diferentes tratamientos de descontaminacion aplicados a RNA residual contenido inicialmente en microorganismos (P. acnes). Las superficies de los consumibles se contaminaron con el mismo numero de celulas de P. acnes antes de recibir uno de los tratamientos respectivos. 3A: EO + H2O2 (I) (negro): tratamiento por oxido de etileno en fase gaseosa seguido por peroxido de hidrogeno en fase gaseosa (Sterrad®). NS (gris claro): ausencia de tratamiento. 3B: H2O2 (g) + H2O2 (g) (negro): tratamiento que comprende dos ciclos de tratamiento con peroxido de hidrogeno en fase gaseosa (Sterrad®). NS (gris claro): ausencia de tratamiento. Las superficies asf tratadas se lavaron luego y se llevo a cabo una reaccion TMA (76 ciclos) sobre los productos de lavado, con el proposito de detectar posible RNA residual procedente de P. acnes. Las curvas representan la cantidad de RNA amplificado, detectada por fluorescencia.

Figura 4: Un grafico que compara diferentes tratamientos de descontaminacion aplicados a DNA residual contenido inicialmente en microorganismos (G. stearothermophilus). Los consumibles (unidades de filtracion que comprendfan varios filtros) estaban contaminados con el mismo numero de esporas de G. stearothermophilus antes de recibir uno de los tratamientos respectivos. NS (gris claro): ausencia de tratamiento. H2O2 (g) (negro): tratamiento conforme a la invencion con oxido de etileno en fase gaseosa seguido por peroxido de hidrogeno en fase gaseosa (90%).

Descripcion detallada

La presente invencion se refiere a un metodo de tratamiento de los acidos nucleicos amplificables residuales, que estan presentes en la superficie de un objeto, por ejemplo, un consumible en biologfa molecular, combinando una fase de tratamiento con oxido de etileno gaseoso y una segunda fase de tratamiento con peroxido de hidrogeno en fase lfquida o gaseosa.

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Este metodo comprende preferiblemente los pasos siguientes:

(i) tratamiento de la superficie de dicho consumible con oxido de etileno en fase gaseosa; y a continuacion

(ii) tratamiento de dicha superficie con peroxido de hidrogeno en fase Kquida a una concentracion comprendida entre 25% y 60% y en el que el peroxido de hidrogeno se calienta a una temperatura comprendida entre 50°C y 70°C, o en fase gaseosa, en el cual el peroxido de hidrogeno se vaporiza, y se lleva luego a una concentracion mayor que 30%.

El termino "consumible" se utiliza en esta memoria para significar cualquier objeto utilizado en la manipulacion de los acidos nucleicos, desde su recogida en el ambiente al laboratorio en el que se llevan a cabo las amplificaciones. El consumible puede estar hecho de materiales diferentes.

Los consumibles a los que esta dirigida la invencion son mas particularmente dispositivos de filtracion de plastico que comprenden membranas de filtracion, preferiblemente de polipropileno, PES o PVDF, tales como los comercializados por la solicitante.

Los consumibles se implementan mas particularmente en el contexto de las manipulaciones para el proposito de realizar amplificaciones de acido nucleico, en particular por medio de tecnicas tales como PCR que se lleva a cabo preferiblemente sobre la base de muestras de DNA, o TMA que se lleva a cabo preferiblemente sobre muestras de RNA.

El primer paso i) del proceso se lleva a cabo generalmente por medios convencionales [Pittet et al. 1997, Swiss Noso, 4(1)] en una camara cerrada (v.g. Steri-Vac 5 XL, 3M) utilizando una concentracion de oxido de etileno gaseoso preferiblemente mayor que 75%, mas preferiblemente entre 60% y 99%, y todavfa mas preferiblemente entre 70% y 90% (v/v).

A no ser que se indique otra cosa, las concentraciones se expresan en porcentajes de volumen por volumen (% v/v).

Dado que el oxido de etileno es una molecula de pequeno tamano, su capacidad de penetracion es alta, lo cual, entre otras cosas, hace posible el tratamiento de consumibles pre-empaquetados en un empaquetamiento permeable al gas. Esta capacidad de penetracion explica su alta eficacia en la esterilizacion de objetos complejos, que son de diffcil acceso. El oxido de etileno alcanza tambien los constituyentes principales de la materia viva (DNA, proternas, vitaminas, enzimas), lo cual le confiere alta capacidad de esterilizacion. El tratamiento con oxido de etileno es asf activo contra todas las celulas vivas y por consiguiente tiene efecto esterilizante. La eficacia del tratamiento esta influenciada por varios parametros: la humedad relativa del gas, que es preferiblemente mayor que o igual a 30% y la temperatura, que esta comprendida preferiblemente entre 40°C y 60°C, y mas preferiblemente entre 50°C y 60°C.

La duracion del contacto entre el oxido de etileno gaseoso y la superficie de los consumibles vana entre 1 y 6 horas, conforme a la concentracion supuesta de esporas y microorganismos, y los materiales de los que estan hechos los consumibles. El tratamiento en fase gaseosa es mas eficaz cuando, previamente, se aplica vacfo a la camara de tratamiento, dentro o bien alrededor del consumible a tratar.

Conforme a la invencion, el paso ii) de tratamiento con peroxido de hidrogeno se lleva a cabo en fase lfquida, utilizando una solucion acuosa, o en fase gaseosa.

Cuando el peroxido de hidrogeno en el paso ii) se encuentra en fase lfquida, su concentracion esta comprendida entre 25% y 60%. Una concentracion mayor que o igual a 30% ha demostrado ser optima conforme a los experimentos realizados por los inventores (Tabla 3).

El tratamiento en fase lfquida tiene la ventaja de solubilizar los acidos nucleicos residuales. Adicionalmente, el paso de una corriente lfquida a traves de los filtros, si viene al caso, hace posible alcanzar mas eficazmente los acidos nucleicos residuales situados en los materiales porosos que constituyen dichos filtros.

El peroxido de hidrogeno en fase lfquida se calienta a una temperatura entre 50°C y 70°C, preferiblemente mayor que 60°C.

Esta temperatura tiene la ventaja de no deteriorar los materiales de los que estan hechos los consumibles.

El peroxido de hidrogeno, en fase lfquida, se mantiene generalmente en contacto con la superficie a descontaminar, preferiblemente, durante un periodo de al menos 40 minutos, con preferencia entre 40 minutos y 1 hora. Este periodo es mayor que el correspondiente al tratamiento en fase gaseosa descrito mas adelante, y por lo general requiere una fase de secado a fin de eliminar el peroxido de hidrogeno de la superficie de los consumibles.

El tratamiento con peroxido de hidrogeno del paso ii) en fase gaseosa se lleva a cabo por vaporizacion del peroxido de hidrogeno, que se lleva a una concentracion mayor que 30%, preferiblemente mayor que 50%, y mas preferiblemente mayor que 80% del gas total.

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El peroxido de hidrogeno puede pasarse en estado de plasma por aplicacion de un campo electrico, preferiblemente a una temperature inferior a 70°C, mas preferiblemente inferior a 60°C, lo cual hace posible que el mismo se degrade y se desactive por tanto al final del tratamiento.

Las temperaturas arriba indicadas son menores que para los procesos de esterilizacion convencionales, y conservan mejor la calidad de los materiales de los que pueden estar hechos los consumibles, en particular las membranas o filtros que pueden componer los mismos.

Un proceso de este tipo puede implementarse en dispositivos dedicados espedficamente a tratamientos que utilizan peroxido de hidrogeno en fase gaseosa, tales como el proceso Sterrad® (ASP - Johnson & Johnson), conforme a las recomendaciones de los fabricantes de dichos dispositivos.

El proceso Sterrad® constituye una realizacion posible pero no limitante del paso ii). La implementacion del peroxido de hidrogeno en fase gaseosa tiene la ventaja de poder ser aplicada a consumibles pre-empaquetados en empaquetamientos permeables a los gases. Asf, cuando los dos pasos del proceso conforme a la invencion se llevan a cabo en fase gaseosa, el consumible puede estar empaquetado o pre-empaquetado antes de ser sometido a estos dos pasos.

Analogamente, cuando el tratamiento con peroxido de hidrogeno se lleva a cabo en fase gaseosa, los pasos i) y ii) pueden suceder uno a otro en la misma camara de tratamiento, lo cual limita el contacto de los consumibles con los acidos nucleicos residuales de los alrededores.

Los resultados obtenidos por los inventores se ilustran a continuacion en los ejemplos de la aplicacion. Las Figuras 1 a 4 muestran que el proceso conforme a la invencion hace posible obtener un tratamiento mas eficaz de los acidos nucleicos residuales, cualquiera que sea su origen (celular o libre), su naturaleza (RNA o DNA) o el modo de amplificacion considerado (PCR o TMA). Tal nivel de eficacia es resultado de la combinacion de los pasos i) y ii) conforme a la invencion y del orden el que se llevan a cabo los mismos.

El proceso conforme a la invencion da como resultado un consumible tratado, que esta exento de acidos nucleicos amplificables, lo que no era posible obtener con anterioridad, en particular en lo que respecta a los consumibles que comprenden uno o mas filtros o membranas, preferiblemente de polipropileno, PES o PVDF.

La invencion hace posible por tanto, en particular, la obtencion de un consumible en biologfa molecular, sea el mismo simple o complejo, que esta exento de acidos nucleicos de origen bacteriano (garantizado exento de DNA).

Ejemplos

Protocolo 1

Varios consumibles constituidos por tubos de polipropileno de 1,5 ml se contaminaron en paralelo con una cantidad conocida de DNA, RNA o microorganismos. Estos consumibles se esterilizaron luego con radiacion gamma (dosis de 0 a 60 kGy) o se trataron con oxido de etileno en fase gaseosa. Despues de la esterilizacion, la presencia de acidos nucleicos residuales se determina por PCR (respecto a DNA) y TMA (respecto a RNA) y se compara con un consumible de control no esterilizado.

Los resultados obtenidos se han resumido en la Tabla 1 siguiente.

Tabla 1: Eficacia de los tratamientos de acido nucleico residual realizados por medio de oxido de etileno (EO) y por medio de radiacion gamma

Type: Microorganismos testados Gamma EO

DNA (PCR): E. Coli P. aeruginosa +++ Degradacion del DNA (30-40kGy) + Degradacion parcial

RNA (TMA): P. acnes P. aeruginosa + Degradacion parcial +++ Degradacion

Germenes (PCR): E. Coli P. aeruginosa + La dosis tiene que ser mayor que 60kGy + Degradacion parcial

Germenes (TMA): P. acnes P. aeruginosa Poco efecto (dependiendo de los microorganismos) Sin efecto

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Estos resultados demuestran que el tratamiento gamma no degrada por completo el RNA contenido en los microorganismos, ni el que se encuentra en forma libre.

Respecto al DNA, este se degrada solo parcialmente. El tratamiento con oxido de etileno es eficaz contra RNA en forma libre, pero no tiene efecto alguno sobre el RNA contenido en los microorganismos.

Protocolo 2

Varios consumibles del mismo tipo que los utilizados en el protocolo 1 se contaminaron con la misma cantidad conocida de DNA, RNA o microorganismos. Estos consumibles se trataron luego por un tratamiento con peroxido de hidrogeno realizado en solucion lfquida (respectivamente H2O2al 3% y 30%). El peroxido de hidrogeno se evapora al final del proceso en virtud de un paso de secado a vado a una temperatura de 60°C. Despues del tratamiento, la presencia de acidos nucleicos residuales se determino por PCR (respecto a DNA) y TMA (respecto a RNA) y se comparo con una muestra sin tratar.

Los resultados obtenidos se han resumido en la Tabla 2 siguiente, en la cual (-) significa efecto nulo, (++) significa una degradacion parcial de los acidos nucleicos y (+++) significa su degradacion completa.

Tabla 2: Eficacia de los tratamientos de acido nucleico residual realizados por medio de peroxido de hidrogeno en solucion al 3% y 30%

: Microorganismos testados H2O2 3%* H2O2 30%*

DNA (PCR): E. Coli P. aeruginosa + + + + +

RNA (TMA): P. acnes P. aeruginosa + + + + +

Germenes (PCR): E. Coli P. aeruginosa — —

Germenes (TMA): P. acnes P. aeruginosa — —

* Tiempo mmimo de accion sobre los acidos nucleicos 40 min a 60°C

Estos resultados demuestran que una concentracion de H2O2 de 30% hace posible degradar los acidos nucleicos libres mas eficazmente que una concentracion de H2O2 de 3%. Sin embargo, el tratamiento no tiene efecto alguno sobre los acidos nucleicos contenidos en los microorganismos.

Protocolo 3 (conforme a la invencion)

Varios consumibles del mismo tipo que los utilizados en el protocolo 1 se contaminaron con la misma cantidad conocida de DNA, RNA o microorganismos. Una parte de dichos consumibles se trato luego conforme a la invencion con oxido de etileno gaseoso seguido por el peroxido de hidrogeno al 3% o 30%. Una parte adicional se trato con radiacion gamma en lugar del oxido de etileno gaseoso y luego con peroxido de hidrogeno. En ambos casos, el peroxido de hidrogeno se evaporo en virtud de un paso de secado a vado a una temperatura de 60°C. Despues del tratamiento, se determino la presencia de acidos nucleicos residuales por PCR (para DNA) y TMA (para RNA) y se comparo con una muestra sin tratar.

Los resultados obtenidos se han resumido en la Tabla 3 siguiente, en la cual (-) significa ausencia de efecto, (++) significa una degradacion parcial de los acidos nucleicos y (+++) significa su degradacion completa. Estos resultados demuestran que, hasta cierto punto, el tratamiento gamma + H2O2 permite la degradacion de los acidos nucleicos, pero la eficiencia de este proceso es menos satisfactoria que el EO + H2O2 en particular para el RNA contenido en los microorganismos. El tratamiento con oxido de etileno seguido por solucion de peroxido de hidrogeno al 30% permite que el DNA y RNA contenidos en los microorganismos se degraden completamente, mientras que el mismo tratamiento pero solo con H2O2 al 3% es menos eficaz sobre el DNA y no actua en absoluto sobre el RNA.

Tabla 3: Eficacia de los tratamientos de los acidos nucleicos residuales obtenidos en los microorganismos

: Gamma + H2O2 3%* Gamma + H2O2 30%* Oxido de etileno + H2O2 3%* Oxido de etileno + H2O2 30%* Microorganismos testados

Germenes (PCR): + Reduce el nivel de positi- vidad + + + + Reduce el nivel de positividad + + + E. coli P. aeruginosa

Germenes (TMA): + Reduce el nivel de positi- vidad ++ Efectividad variable Poco o ningun efecto + + + P. acnes P. aeruginosa

* Contacto durante 1 hora a 60°C

Protocolo 4

Varios consumibles complejos que comprendfan varios filtros se contaminaron con la misma cantidad conocida de 5 microorganismos (G. stearothermophilus). Una parte de dichos consumibles se trato luego conforme al proceso de la invencion con oxido de etileno gaseoso y seguidamente con peroxido de hidrogeno gaseoso a aproximadamente 90%. Una parte adicional de los consumibles que serna como control no se trato. La presencia de acidos nucleicos residuales (DNA) se determino por PCR. La Figura 4 registra las cantidades de DNA amplificadas durante los diferentes ciclos de PCR. Puede observarse la ausencia de amplificacion en las muestras tratadas.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo de descontaminacion de los acidos nucleicos residuales amplificables presentes en la superficie de un consumible, caracterizado por que el mismo comprende los pasos siguientes:

(i) tratamiento de la superficie de dicho consumible con oxido de etileno en fase gaseosa; y a continuacion

(ii) tratamiento de dicha superficie con peroxido de hidrogeno en fase lfquida a una concentracion comprendida entre 25% y 60% y en el cual el peroxido de hidrogeno se calienta a una temperatura comprendida entre 50°C y 70°C, o en fase gaseosa, en el cual el peroxido de hidrogeno se vaporiza, y se lleva luego a una concentracion mayor que 30%.
2. Un metodo conforme a la reivindicacion 1, en el cual el oxido de etileno en el paso i) se utiliza con una concentracion comprendida entre 70% y 90% (v/v).
3. Un metodo conforme a la reivindicacion 1 o 2, en el cual el peroxido de hidrogeno en el paso ii) se encuentra en fase lfquida a una concentracion mayor que 30% (v/v).
4. Un metodo conforme a la reivindicacion 3, en el cual el peroxido de hidrogeno en fase lfquida se calienta a una temperatura mayor que 60°C.
5. Un metodo conforme a la reivindicacion 2 o 3, en el cual el peroxido de hidrogeno, en fase lfquida, se encuentra en contacto en el paso ii) con la superficie a descontaminar durante un periodo de al menos 40 minutos.
6. Un metodo conforme a la reivindicacion 1, en el cual el tratamiento con peroxido de hidrogeno se lleva a cabo en fase gaseosa.
7. Un metodo conforme a la reivindicacion 6, en el cual el peroxido de hidrogeno se vaporiza, y se lleva luego a una concentracion mayor que 50%, y preferiblemente mayor que 80%.
8. Un metodo conforme a la reivindicacion 7, en el cual el peroxido de hidrogeno se hace pasar en estado de plasma por aplicacion de un campo electrico a una temperatura inferior a 60°C.
9. Un metodo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente un paso de evaporacion entre los pasos i) y ii).
10. Un metodo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual el consumible en biologfa molecular esta empaquetado con anterioridad en un paquete parcialmente no tejido.
11. Un metodo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el cual el vacro se aplica antes de uno de los pasos i) y ii).
12. Un metodo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el cual el oxido de etileno residual se elimina mediante los pasos i) y ii).
13. Un metodo conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el cual el peroxido de hidrogeno residual se elimina de la superficie del consumible despues del paso ii).