ES2553893T3 - ADN polimerasas mutantes con capacidad mejorada de polimerización activada por pirofosforolisis (PAP) - Google Patents

Abstract

ADN polimerasa, que comprende R-X1-X2-X3-K-L-X4-X5-X6-Y-X7-X8-X9-X10-X11, en la que: X1 se selecciona de entre el grupo que consiste de E, Q, G, K y T, X2 es L, I o Y, X3 se selecciona de entre el grupo que consiste de T, M, D, S, G, A, Q y L, X4 es K, R o Q, X5 es N, S o G, X6 es S, X7 se selecciona de entre el grupo que consiste de V, I, L, A, T, X8 es D o E, X9 se selecciona de entre el grupo que consiste de P, A, G, K, T y S, X10 es L o I, X10 es P o L, en la que la polimerasa presenta una actividad mejorada de polimerización activada por pirofosforolisis (PAP) respecto a una polimerasa de otro modo idéntica en la que X6 es T.

Description

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producir una forma no observada normalmente en la naturaleza. De esta manera, un ácido nucleico aislado de ADN polimerasa mutante, en una forma lineal, o un vector de expresión formando in vitro mediante el ligamiento de moléculas de ADN que normalmente no se encuentran unidas, se consideran ambas recombinantes para los fines de la presente invención. Se entiende que una vez se ha preparado un ácido nucleico recombinante y se ha reintroducido en una célula huésped, se replicará de manera no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped y no mediante manipulaciones in vitro; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez se han producido recombinantemente, aunque posteriormente se repliquen no recombinantemente, todavía se consideran recombinantes para los fines de la invención. Una "proteína recombinante" es una proteína generada utilizando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante tal como se ha ilustrado anteriormente. Una proteína recombinante se distingue típicamente de la proteína natural en por lo menos una característica.

La expresión "ácido nucleico" se refiere a nucleótidos (por ejemplo ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos 2'-terminadores, dideoxinucleótidos, etc.) y polímeros (por ejemplo que comprenden ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN), híbridos de ADN-ARN, oligonucleótidos, polinucleótidos, genes, ADNc, aptámeros, ácidos nucleicos antisentido, ARN interfirientes (ARNi), balizas moleculares, sondas de ácidos nucleicos, ácidos péptido-nucleicos (APN), conjugados APN-ADN, conjugados APN-ARN, etc.) que comprenden dichos nucleótidos unidos entre sí covalentemente, de manera lineal o ramificada.

Un ácido nucleico es típicamente de cadena sencilla o de doble cadena y generalmente contiene enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, tal como se indica de manera generan en la presente memoria, se incluyen análogos de ácidos nucleicos que pueden presentar esqueletos alternativos, incluyendo, por ejemplo y sin limitación, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925, 1993) y referencias citadas en la misma, Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800, 1970; Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579, 1977, Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487, 1986; Sawai et al., Chem. Lett. 805, 1984; Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988; y Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 1419, 1986), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437, 1991, y la patente US nº 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321, 1989), enlaces O-metilfosforoamidita (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogue: A Practical Approach, Oxford University Press, 1992), y esqueletos y enlaces de ácido péptido-nucleico (ver Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895, 1992; Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008, 1992; Nielsen, Nature 365:566, 1993; Carlsson et al., Nature 380:207, 1996). Entre otros análogos de ácidos nucleicos se incluyen aquellos con esqueletos cargados positivamente (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097, 1995), esqueletos no iónicos (patentes US nº 5.386.023, nº 5.637.684, nº 5.602.240, nº 5.216.141 y nº 4.469.863; Angew Chem. Intl. Ed. English 30: 423, 1991; Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988; Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597, 1994; capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghvi y P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395, 1994; Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17, 1994; Tetrahedron Lett. 37:743, 1996) y esqueletos no ribosídicos, incluyendo los indicados en las patentes US nº 5.235.033 y nº 5.034.506, y los capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ed. Y.S. Sanghvi y P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se encuentran incluidos en la definición de ácidos nucleicos (ver Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., páginas 169 a 176, 1995). También se describen varios análogos de ácidos nucleicos en, por ejemplo, Rawls C. y E. News, 2 de junio de 1997, página 35. Estas modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato pueden llevarse a cabo para facilitar la adición de fracciones adicionales, tales como marcajes, o para alterar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en medios fisiológicos.

Además, de dichas bases heterocíclicas naturales que se observan típicamente en los ácidos nucleicos (por ejemplo adenina, guanina, timina, citosina y uracilo), entre los análogos de ácidos nucleicos también se incluyen los que presentan bases heterocíclicas no naturales, muchas de las cuales se indican, o se hace referencia a ellas de otra manera, en la presente memoria. En particular, se describen en mayor detalle muchas bases no naturales en, por ejemplo, Seela et al., Helv. Chim. Acta 74:1790, 1991; Grein et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, 1994; y Seela et al., Helv. Chim. Acta 82:1640, 1999. A título ilustrativo adicional, se incluyen opcionalmente determinadas bases utilizadas en nucleótidos que actúan como modificadores de la temperatura de fusión (Tf). Por ejemplo, entre algunas de ellas se incluyen las 7-deazapurinas (por ejemplo 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, etc.), pirazolo[3,4d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo propinil-dU, propinil-dC, etc.) y similares. Ver, por ejemplo, la patente US nº

5.990.303. Entre otras bases heterocíclicas representativas se incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina, derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina, derivados 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina, 6-azacitosina, 5-fluorocitosina, 5-clorocitosina, 5-yodocitosina, 5-bromocitosina, 5metilcitosina, 5-propinilcitosina, 5-bromoviniluracilo, 5-fluorouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, 5-bromouracilo, 5trifluorometiluracilo, 5-metoximetiluracilo, 5-etiniluracilo, 5-propiniluracilo y similares.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad de secuencias" se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en la que la parte de la

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ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda incrementarse la puntuación acumulada de alineación. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de premio para una pareja de residuos correspondientes, siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no correspondientes, siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los resultados de palabras en cada dirección se detiene en el caso de que: la puntuación acumulada de alineación caiga en una cantidad X respecto al valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada vaya a cero o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuaciones negativas, o se alcance el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra de 3 y un valor esperado (E) de 10, y la matriz de puntuaciones BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alineaciones (B) de 50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza además un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se produzca por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia en el caso de que la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia sea inferior a aproximadamente 0,2, típicamente inferior a aproximadamente 0,01, y más típicamente inferior a aproximadamente 0,001.

Un "nucleósido" se refiere a un componente de los ácidos nucleicos que comprende una base o grupo básico (por ejemplo que comprende por lo menos un anillo homocíclico, por lo menos un anillo heterocíclico, por lo menos un grupo arilo y/o similar) unido covalentemente a una fracción sacárida (por ejemplo un azúcar ribosa, etc.), un derivado de una fracción sacárida, o un equivalente funcional de una fracción sacárida (por ejemplo un análogo tal como un anillo carbocíclico). Por ejemplo, en el caso de que un nucleósido incluya una fracción sacárida, la base típicamente se une a una posición 1' de dicha fracción sacárida. Tal como se ha indicado anteriormente, una base puede ser natural (por ejemplo una base purina, tal como adenina (A) o guanina (G), una base pirimidina, tal como timina (T), citosina (C) o uracilo (U)) o no natural (por ejemplo una base 7-deazapurina, una base pirazolo[3,4d]pirimidina, una base propinil-dN, etc.). Entre los nucleósidos ejemplares se incluyen ribonucleósidos, desoxirribonucleósidos, dideoxirribonucleósidos, nucleósidos carbocíclicos, etc.).

Un "nucleótido" se refiere a un éster de un nucleósido, por ejemplo un éster de fosfato de un nucleósido. Por ejemplo, un nucleótido puede incluir 1, 2, 3 o más grupos fosfato unidos covalentemente a una posición 5' de una fracción sacárida del nucleósido.

Un "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye por lo menos dos nucleótidos, típicamente más de tres nucleótidos, y más típicamente más de diez nucleótidos. El tamaño exacto de un oligonucleótido depende generalmente de muchos factores, incluyendo la función última o utilización del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, la clonación y digestión de restricción de secuencias apropiadas, o la síntesis química directa mediante un método tal como el método de fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; el método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; el método de triéster de Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981; los métodos de síntesis automatizada, o el método de soporte sólido de la patente US nº 4.458.066, u otros métodos conocidos de la técnica.

Un "ácido nucleico cebador" típicamente es un ácido nucleico que puede hibridarse con un ácido nucleico molde y permitir la extensión o elongación de cadena utilizando, por ejemplo, un biocatalizador que incorpora nucleótidos, tal como una polimerasa termoestable, bajo condiciones de reacción apropiadas. Un ácido nucleico cebador típicamente es un oligonucleótido natural o sintético (por ejemplo un oligodesoxirribonucleótido de cadena sencilla, etc.). Aunque se utilizan opcionalmente otras longitudes de ácido nucleico cebador, típicamente presentan longitudes de entre 15 y 35 nucleótidos. Los ácidos nucleicos de cebadores cortos generalmente requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con ácidos nucleicos de molde. Un ácido nucleico cebador que es por lo menos parcialmente complementario a una subsecuencia de un ácido nucleico molde típicamente resulta suficiente para hibridarse con el ácido nucleico molde para que pueda producirse la extensión. Un ácido nucleico cebador puede marcarse, si se desea, mediante la incorporación de un marcaje detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. A título ilustrativo, entre los marcajes se incluyen isótopos radioactivos, pigmentos fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (tales como los utilizados comúnmente en los ensayos de ELISA), biotina o haptenos y proteínas para los que se

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dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales. Se describen adicionalmente en la presente memoria muchos de estos marcajes y otros marcajes y/o son conocidos de la técnica. Además, un ácido nucleico cebador puede proporcionar simplemente un sustrato para un biocatalizador incorporador de nucleótidos de una manera independiente del molde.

Un "ácido nucleico cebador extendido" se refiere a un ácido nucleico cebador al que se han añadido, o incorporado de otra manera (por ejemplo unido mediante enlace covalente), uno o más nucleótidos adicionales.

Un "ácido nucleico molde" se refiere a un ácido nucleico con el que puede hibridarse un ácido nucleico molde y extenderse. De acuerdo con lo anterior, entre los ácidos nucleicos molde se incluyen subsecuencias que son por lo menos parcialmente complementarias a los ácidos nucleicos cebadores. Los ácidos nucleicos molde pueden derivarse de esencialmente cualquier fuente. A título ilustrativo, los ácidos nucleicos molde se derivan o se aíslan opcionalmente a partir de, por ejemplo, microorganismos en cultivo, microorganismos no en cultivo, mezclas biológicas complejas, tejidos, sueros, sueros agrupados o tejidos, asociaciones multiespecie, restos biológicos antiguos, fosilizados u otros no vivos, aislados medioambientales, suelos, aguas subterráneas, instalaciones de gestión de residuos, entornos de aguas profundas, o similares. Además, entre los ácidos nucleicos molde se incluyen opcionalmente o se derivan a partir de, por ejemplo, moléculas individuales de ADNc, juegos clonados de ADNc, bibliotecas de ADNc, ARN extraídos, ARN naturales, ARN transcritos in vitro, ADN genómicos caracterizados

o no caracterizados, ADN genómicos clonados, bibliotecas de ADN genómico, ADN o ARN fragmentados enzimáticamente, ADN o ARN fragmentados químicamente, ADN o ARN fragmentados físicamente, o similares. Los ácidos nucleicos molde también pueden sintetizarse químicamente utilizando técnicas conocidas. Además, los ácidos nucleicos molde corresponden opcionalmente a por lo menos una parte de un gel o son complementarios al mismo. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "gen" se refiere a cualquier segmento de ADN asociado a una función biológica. De esta manera, entre los genes se incluyen secuencias codificantes y, opcionalmente, las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Entre los genes también se incluyen opcionalmente segmentos de ADN no expresado que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas.

Los ácidos nucleicos se "extienden" o se "elongan" al incorporar nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) en los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un ácido nucleico es extendido opcionalmente por un biocatalizador incorporador de nucleótidos, tal como una polimerasa, que típicamente añade nucleótidos en el extremo 3'-terminal de un ácido nucleico.

Un "nucleótido extensible" se refiere a un nucleótido al que puede añadirse o unirse covalentemente por lo menos otro nucleótido, por ejemplo en una reacción catalizada por un biocatalizador incorporador de nucleótidos tras la incorporación del nucleótido extensible en un polímero de nucleótidos. Entre los ejemplos de nucleótidos extensibles se incluyen los desoxirribonucleótidos y los ribonucleótidos. Un nucleótido extensible típicamente se extiende mediante la adición de otro nucleótido en una posición 3' de la fracción sacárida del nucleótido extensible.

Un nucleótido "no extensible" se refiere a un nucleótido que, tras la incorporación en un ácido nucleico, impide la extensión posterior del ácido nucleico, por ejemplo por, como mínimo, un biocatalizador incorporador de nucleótidos. Un nucleótido no extensible ejemplar adecuado para la utilización con la invención son los nucleótidos terminadores 2'.

Un "nucleótido terminador 2'" se refiere a un análogo de nucleótido que comprende un grupo de bloqueo (GB) en la posición 2' de la fracción sacárida del nucleótido. Un "grupo de bloqueo" se refiere a un grupo o fracción química que típicamente impide la extensión de un ácido nucleico (es decir, un nucleótido terminador 2' típicamente es no extensible por uno o más biocatalizadores incorporadores de nucleótidos). Es decir, tras la incorporación de un nucleótido terminador 2' en un ácido nucleico (por ejemplo en el extremo 3'-terminal del ácido nucleico), el grupo de bloqueo impide la extensión posterior del ácido nucleico por, como mínimo, el biocatalizador incorporador de nucleótidos seleccionado de entre una polimerasa CS5 G46E E678G, una polimerasa CS6 G46E E678G, una polimerasa Δ ZO5R, una ADN polimerasa Taq E615G, una polimerasa de Thermus flavus TFL, una polimerasa TMA-25, una polimerasa TMA30, una ADN polimerasa Tth, una polimerasa SPS-17 de Thermus, una polimerasa Ta E615G, una polimerasa ZO5R de Thermus, una ADN polimerasa de T7, una ADN polimerasa I de Kornberg, una ADN polimerasa Klenow, una ADN polimerasa Taq, una ADN polimerasa microcócica, una ADN polimerasa alfa, una transcriptasa inversa, una transcriptasa inversa del AMV, una transcriptasa inversa del M-MuLV, una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una ARN polimerasa de E. coli, una ARN polimerasa SP6, una ARN polimerasa T3, una ADN polimerasa T4, una ARN polimerasa de T7, una ARN polimerasa II, una transferasa terminal, una polinucleótido fosforilasa, una ADN polimerasa incorporadora de ribonucleótidos, y/o similares. Un grupo de bloqueo ejemplar es un grupo fosfato. En la presente memoria también se indican otros grupos de bloqueo representativos. Entre los nucleótidos terminadores 2' ejemplares se incluyen los nucleósidos 2'-monofosfato-3'-hidroxil-5'-trifosfato y los nucleósidos 2'-monofosfato-3'-hidroxil-5'-difosfato. Otros nucleótidos terminadores 2' también se describen en mayor detalle en la presente memoria y en, por ejemplo, las publicaciones de patente US nº 2007/0154914, nº 2005/0037991 y nº 2005/0037398.

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Una "fracción" o "grupo" se refiere a una de las partes en las que algo, tal como una molécula, se divide (por ejemplo un grupo funcional, un grupo sustituyente, o similar). Por ejemplo, un nucleótido típicamente comprende un grupo básico (por ejemplo adenina, timina, citosina, guanina, uracilo o un grupo básico de análogo), una fracción sacárida (por ejemplo una fracción que comprende un anillo sacárido o un análogo del mismo) y uno o más grupos fosfato.

Un ácido nucleico se encuentra “operablemente ligado” en el caso de que se encuentre en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o un intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecte a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre posicionado de manera que facilite la traducción.

La expresión "célula huésped" se refiere a organismos unicelulares tanto procarióticos como eucarióticos (por ejemplo bacterias, levaduras y actinomicetos) y células individuales de plantas o animales de orden superior cultivados en cultivo celular.

El término "vector" se refiere a un trozo de ADN, típicamente de doble cadena, en el que puede haberse insertado un trozo de ADN foráneo. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias polinucleótidas de "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula huésped. El ADN foráneo se define como ADN heterólogo, que es ADN no presente naturalmente en la célula huésped, que, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica un marcador seleccionable o cribable, o codifica para un transgén. El vector se utiliza para transportar el ADN foráneo o heterólogo al interior de una célula huésped adecuada. Una vez dentro de la célula huésped, el vector puede replicarse independientemente o concurrentemente con el ADN cromosómico del huésped, y pueden generarse varias copias del vector y su ADN insertado. Además, el vector puede contener además los elementos necesarios que permiten la transcripción del ADN insertado para formar una molécula de ARNm o de otro modo provocar la replicación del ADN insertado en múltiples copias de ARN. Algunos vectores de expresión adicionalmente contienen elementos de secuencia contiguos al ADN insertado que incrementan la semivida del ARNm expresado y/o permiten la traducción del ARNm en una molécula de proteína. De esta manera, pueden sintetizarse rápidamente muchas moléculas de ARNm y del polipéptido codificado por el ADN insertado.

La expresión "tasa de extensión de ácidos nucleicos" se refiere a la tasa a la que un biocatalizador (por ejemplo un enzima, tal como una polimerasa, ligasa o similar) extiende un ácido nucleico (por ejemplo un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente o independiente del molde mediante la unión (por ejemplo covalentemente) de uno o más nucleótidos al ácido nucleico. A título ilustrativo, determinadas ADN polimerasas mutantes descritas en la presente memoria presentan tasas de extensión de ácidos nucleicos mejoradas respecto a las formas no modificadas de dichas ADN polimerasas, de manera que pueden extender cebadores a tasas más altas que dichas formas no modificadas bajo un conjunto dado de condiciones de reacción.

Una "mezcla" se refiere a una combinación de dos o más componentes diferentes. Una "mezcla de reacción" se refiere a una mezcla que comprende moléculas que pueden participar y/o facilitar una reacción determinada. Por ejemplo, una "mezcla de reacción de secuenciación de ADN" se refiere a una mezcla de reacción que comprende los componentes necesarios para una reacción de secuenciación del ADN. De esta manera, una mezcla de reacción de secuenciación del ADN resulta adecuada para la utilización en un método de secuenciación del ADN para determinar la secuencia de ácidos nucleicos de un ácido nucleico molde o diana, aunque la mezcla de reacción inicialmente puede ser incompleta, de manera que el inicio de la reacción de secuenciación está controlada por el usuario. De esta manera, la reacción puede iniciarse después de la adición de un componente final, tal como el enzima, proporcionando una mezcla de reacción de secuenciación de ADN completa. Típicamente una reacción de secuenciación de ADN contendrá un tampón, adecuado para la actividad de polimerización, nucleótidos extensibles y por lo menos un nucleótido terminador 2'. La mezcla de reacción también puede contener un ácido nucleico cebador adecuado para la extensión en un ácido nucleico molde por parte de un enzima polimerasa. El ácido nucleico cebador o uno de los nucleótidos generalmente se marca con una fracción detectable, tal como un marcaje fluorescente. Generalmente, la reacción es una mezcla que comprende cuatro nucleótidos extensibles y por lo menos un nucleótido terminador 2'. Típicamente, la polimerasa es una ADN polimerasa termoestable (por ejemplo una ADN polimerasa CS5 G46E E678G, una ADN polimerasa CS6 G46E E678G, una ADN polimerasa Taq E615G, una ADN polimerasa Δ ZO5R, una ADN polimerasa CS5 G46E L329A E678G, etc.) y el nucleótido terminador 2' es un nucleósido 2'-monofosfato-3'-hidroxil-5'-trifosfato.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. INTRODUCCIÓN

La presente invención proporciona nuevas ADN polimerasas que presentan una capacidad mejorada de polimerización activada por pirofosforolisis (PAP). Las ADN polimerasas de la invención presentan la capacidad de

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En algunas realizaciones, X1-X9 y X11-X16 son cualquier aminoácido. En algunas realizaciones,

X1 es R o L

X3 es L, I o Y

X5 es R o L

X6 es I o se encuentra ausente

X7 es G o se encuentra ausente

X8 es K, R o Q

X9 es N, S o G

X10 es T o A

X11 es Y o E

X13 es D o E

X15 es L, I o A

X16 es P, L o W (SEC ID nº 40).

En algunas realizaciones de dichas ADN polimerasas, el aminoácido en la posición X10 se selecciona de entre el grupo que consiste de (G), (L), (M), (F), (W), (K), (Q), (E), (S), (P), (V), (I), (C), (Y), (H), (R), (N) y (D) (SEC ID nº 42). En algunas realizaciones, X10 es S (SEC ID nº 43).

En algunas realizaciones de SEC ID nº 2, X2, X4, X12 y X14 son cualesquiera aminoácidos presentes en posiciones correspondientes en cualquier ADN polimerasa, por ejemplo ADN polimerasas de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. Z05, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Deinococcus radiodurans, Hot Spring family B/clone 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Escheria coli, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Hot Spring family A y bacteriófago T7. En algunas realizaciones, X2 se selecciona de entre el grupo de entre Glu (E), Gln (Q), Gly (G), Lys (K), Thr (T), y Met (M) (SEC ID nº 56). En algunas realizaciones, X4 se selecciona de entre el grupo de entre Thr (T), Met (M), Asp (D), Ser (S), Gly (G), Ala (A), Gln (Q) y Leu (L) (SEC ID nº 57). En algunas realizaciones, X12 se selecciona de entre el grupo de entre Val (V), Ile (I), Leu (L), Ala (A), Thr (T) y Gly (G) (SEC ID nº 58). En algunas realizaciones, X14 se selecciona de entre el grupo de entre Pro (P), Ala (A), Gly (G), Lys (K), Thr (T) y Ser (S) (SEC ID nº 59).

Una forma no modificada de ADN polimerasas que puede mutar (tal como se muestra en, por ejemplo, SEC ID nº 24) también descrita es aquella que presenta un dominio de polimerasa funcional que comprende el motivo de aminoácidos siguiente:

R-X1-X2-X3-K-L-X4-X5-X6-Y-X7-X8-X9-X10-X11 (SEC ID nº 24), en el que X6 es T.

En algunas realizaciones, X1-X5 y X7-X11 son cualquier aminoácido. En algunas realizaciones,

X2 es L, I o Y

X4 es K, R o Q

X5 es N, S o G

X6 es T

X8 es D o E

X10 es L o I

X11 es P o L (SEC ID nº 44).

En algunas realizaciones, la forma no modificada de ADN polimerasas que puede mutar (tal como se muestra en, por ejemplo, SEC ID nº 25) es aquella que presenta un dominio de polimerasa funcional que comprende el motivo de aminoácidos siguiente:

X1-X2-X3-X4-K-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16, en el que X10 es T o A.

En algunas realizaciones, X1-X9 y X11-X16 son cualquier aminoácido.

En algunas realizaciones,

X1 es R o L

X3 es L, I o Y

X5 es R o L

X6 es I o se encuentra ausenteX7 es G o se encuentra ausente

X8 es K, R o Q

X9 es N, S o G

X10 es T o A

X11 es Y o E

X13 es D o E

X15 es L, I o A

X16 es P, L o W (SEC ID nº 48).

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pesos moleculares de los péptidos mediante métodos estándares, tales como FAB-EM. A continuación, se compara la masa determinada de cada fragmento con los pesos moleculares de los péptidos esperados de la digestión de la secuencia predicha y se determina rápidamente la corrección de la secuencia. Debido a que este enfoque de mutagénesis a la modificación de proteínas es dirigido, la secuenciación del péptido alterado no debería resultar necesaria en el caso de que los datos de la EM concuerden con la predicción. En caso de que resulte necesario para verificar un residuo modificado, puede utilizarse la EM/EM-CAD en tándem para secuenciar los péptidos de la mezcla en cuestión, o puede purificarse el péptido diana para degradación de Edman subtractiva o digestión con carboxipeptidasa Y, según la localización de la modificación.

C. Vectores de expresión y células huésped

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la invención proporciona además ácidos nucleicos recombinantes codificantes de cualquiera de las ADN polimerasas indicadas en la presente memoria. En algunas realizaciones, la invención comprende un vector que presenta un ácido nucleico codificante de una ADN polimerasa dada a conocer en la presente memoria. Cualquier vector que contenga replicón y secuencias de control que se derivan de una especie compatible con la célula huésped puede utilizarse en la práctica de la invención. Generalmente, entre los vectores de expresión se incluyen regiones de ácidos nucleicos reguladoras de la transcripción y de la traducción operablemente ligadas con el ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa mutante. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo húesped particular. Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Además, el vector puede contener un elemento retrorregulador positivo (ERP) para incrementar la semivida del ARNm transcrito (ver Gelfand et al., patente US nº 4.666.848). Las regiones de ácidos nucleicos reguladoras de transcripción y traducción generalmente resultarán apropiadas para la célula huésped utilizada para expresar la polimerasa. Se conocen de la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados, y secuencias reguladoras adecuadas, para una diversidad de células huésped. En general, entre las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluirse, por ejemplo, secuencias de promotor, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y parada transcripcional, secuencias de inicio y parada traduccional y secuencias intensificadoras o activadoras. En realizaciones típicas, entre las secuencias reguladoras se incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada transcripcional. Entre los vectores típicamente también se incluye una región policonectora que contiene varios sitios de restricción para la inserción de ADN foráneo. En determinadas realizaciones, se utilizan "señalizadores de fusión" para facilitar la purificación y, si se desea, la eliminación posterior de la secuencia de etiqueta/señalizadora, por ejemplo una "etiqueta de His". Sin embargo, éstas generalmente no resultan necesarias al purificar una proteína termoactiva y/o termoestable a partir de un huésped mesofílico (por ejemplo E. coli), en el que puede utilizarse una "etapa térmica". La construcción de vectores adecuados que contiene ADN codificante de secuencias replicación, secuencias reguladoras, genes de selección fenotípica y las polimerasas mutantes de interés se prepara utilizando procedimientos estándares de ADN recombinante. Los plásmidos aislados, vectores víricos y fragmentos de ADN se corta, adaptan y ligan entre sí en un orden específico para generar los vectores deseados, tal como es bien conocido de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2a ed. 1989)).

En determinadas realizaciones, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de las células huésped transformadas. Los genes de selección son bien conocidos de la técnica y varían según la célula huésped utilizada. Entre los genes de selección adecuados pueden incluirse, por ejemplo, genes codificantes de la resistencia a ampicilina y/o a tetraciclina, que permite que las células transformadas con estos vectores crezcan en presencia de estos antibióticos.

En un aspecto de la presente invención, se introduce en una célula un ácido nucleico codificante de una ADN polimerasa, solo o en combinación con un vector. Por "se introduce en" o equivalentes gramaticales en la presente memoria se hace referencia a que los ácidos nucleicos entran en las células de una manera adecuada para la integración, amplificación y/o expresión posteriores del ácido nucleico. El método de introducción está dictado en gran medida por el tipo celular diana. Entre los métodos ejemplares se incluyen la precipitación con CaPO4, la fusión de liposomas, Lipofectin®, la electroporación, la infección vírica y similares.

Típicamente se utilizan procariotas como células huésped para las etapas de clonación iniciales de la presente invención. Resultan particularmente útiles para la producción rápida de grandes cantidades de ADN, para la producción de ADN molde de cadena sencilla utilizado para la mutagénesis dirigida a sitio, para el cribado de muchos mutantes simultáneamente y para la secuenciación de ADN de los mutantes generados. Entre las células huésped procarióticas adecuadas se incluyen E. coli K12 cepa 94 (ATCC nº 31.446), E. coli cepa W3110 (ATCC nº 27.325), E. coli K12 cepa DG116 (ATCC nº 53.606), E. coli X1776 (ATCC nº 31.537) y E. coli B; sin embargo, pueden utilizarse como huéspedes muchas otras cepas de E. coli, tales como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 y muchas otras especies y géneros de procariotas, incluyendo bacilos tales como Bacillus subtilis, otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y diversas especies de Pseudomonas.

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enfoques de preparación de muestras para dichos ensayos en cualquiera de entre una diversidad de textos estándares, incluyendo, por ejemplo, Berger, Sambrook, Ausubel 1 y 2, e Innis, supra.

Diversos ensayos comerciales de amplificación de ácidos nucleicos que se adaptan opcionalmente para la utilización con los reactivos y métodos de la invención generalmente difieren en sus métodos de amplificación y en sus secuencias diana de ácidos nucleicos. Entre los ejemplos de dichos ensayos comerciales se incluyen ensayos de sondas de hibridación (por ejemplo utilizando el sistema LightCycler®) y los ensayos AMPLICOR® y COBAS AMPLICOR® (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA), que utilizan reacciones en cadena de polimerasa (PCXR), el ensayo LCx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA), que utiliza reacciones en cadena de ligasa (LCR); el ensayo BDProbeTec™ ET (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, N.J., USA), que utiliza la amplificación por desplazamiento de cadena (ADC), y el ensayo APTIMA™ (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA, USA), que utiliza la amplificación mediada por la transcripción (AMT).

En determinadas realizaciones, se utilizan, por ejemplo, sondas 5'-nucleasa en diversas reacciones de 5'-nucleasa. Muchos ensayos de 5'-nucleasa son bien conocidos por el experto en la materia. También se describen ejemplos de dichas reacciones en las patentes US nº 6.214.979, nº 5.804.375, nº 5.487.972 y nº 5.210.015.

A modo de ilustración breve, en una reacción de 5'-nucleasa, se pone en contacto un ácido nucleico diana con un cebador y una sonda (por ejemplo una sonda 5'-nucleasa) bajo condiciones en las que el cebador y la sonda se hibridan con una cadena del ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana, el cebador y la sonda también se ponen en contacto con una polimerasa de ácidos nucleicos que presenta actividad de 5' a 3' nucleasa. Las polimerasas de ácidos nucleicos que presentan actividad de 5' a 3' nucleasa pueden cortar la sonda hibridada con el ácido nucleico diana después del cebador. El extremo 3' del cebador proporciona el sitio de unión inicial para la polimerasa. La polimerasa unida corta fragmentos de la sonda al entrar en contacto con el extremo 5' de la sonda.

El cebador y la sonda pueden diseñarse de manera que se hibriden en estrecha proximidad al ácido nucleico diana, de manera que la unión de la polimerasa de ácidos nucleicos al extremo 3' del cebador la ponga en contacto con el extremo 5' de la sonda en ausencia de extensión de cebador. La expresión "corte independiente de la polimerización" se refiere a dicho proceso. Alternativamente, en el caso de que el cebador y la sonda se hibriden con regiones espaciadas a mayor distancia del ácido nucleico diana, la polimerización típicamente se produce antes de que la polimerasa de ácidos nucleicos entre en contacto con el extremo 5' de la sonda. A medida que progresa la polimerización, la polimerasa corta progresivamente fragmentos del extremo 5' de la sonda. Este corte continua hasta que el resto de la sonda ha sido desestabilizado en grado suficiente para que se disocie de la molécula molde. La expresión "corte dependiente de la polimerización" se refiere a dicho proceso.

Una ventaja del corte independiente de la polimerización radica en la eliminación de la necesidad de amplificar el ácido nucleico. Con la condición de que el cebador y la sonda se unan contiguamente al ácido nucleico, pueden producirse rondas secuenciales de hibridación de la sonda y el corte de fragmentos. De esta manera, puede generarse una cantidad suficiente de fragmentos, permitiendo la detección en ausencia de polimerización.

En cualquiera de los procesos, se proporciona una muestra que se cree que contiene el ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana contenido en la muestra puede en primer lugar transcribirse inversamente en ADNc, en caso necesario, y después desnaturalizarse, utilizando cualquier método de desnaturalización adecuado, incluyendo métodos físicos, químicos o enzimáticos, los cuales son conocidos por el experto en la materia. Un enfoque físico ejemplar para llevar a cabo la separación de cadenas implica el calentamiento del ácido nucleico hasta que ha sido completamente (>99%) desnaturalizado. La desnaturalización por calor típica implica temperaturas de entre aproximadamente 85ºC y aproximadamente 105ºC (típicamente de entre aproximadamente 85ºC y aproximadamente 98ºC, y más típicamente de entre aproximadamente 85ºC y aproximadamente 95ºC), durante periodos de tiempo de entre aproximadamente 1 segundo y aproximadamente 10 minutos (por ejemplo de entre unos cuantos segundos y aproximadamente 1 minuto). A modo de alternativa a la desnaturalización, el ácido nucleico puede existir en forma de cadena sencilla en la muestra, tal como en el caso de que la muestra comprenda virus de ARN o ADN de cadena sencilla.

La cadena de ácido nucleico diana desnaturalizado típicamente se incuba con un cebador y una sonda bajo condiciones de hibridación que permiten que el cebador y la sonda se unen a la cadena de ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, pueden utilizarse dos cebadores para amplificar el ácido nucleico diana. Los dos cebadores típicamente se seleccionan de manera que sus posiciones relativas a lo largo del ácido nucleico diana sean tales que un producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, en el caso de que el producto de extensión se separe de su molde (complemento), sirva como molde para la extensión del otro cebador, rindiendo una cadena réplica de longitud definida.

Debido a que las cadenas complementarias típicamente son más largas que la sonda o el cebador, las cadenas presentan más puntos de contacto y, de esta manera, una mayor probabilidad de unión entre sí durante un periodo

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(por ejemplo balizas moleculares), la detección de marcajes incorporados en los cebadores de amplificación o los ácidos nucleicos amplificados mismos, por ejemplo tras la separación electroforética de los productos de amplificación de marcajes no incorporados, ensayos basados en la hibridación (por ejemplo ensayos basados en matrices) y/o la detección de reactivos secundarios que se unen a los ácidos nucleicos. Estos enfoques generales también se describen en, por ejemplo, Sambrook, y Ausubel 1 y 2, supra.

En otras realizaciones ilustrativas de utilización de las polimerasas modificadas descritas en la presente memoria se incluye la utilización de cebadores marcados para llevar a cabo la detección en tiempo real de los ácidos nucleicos diana. Los enfoques basados en cebadores a la detección en tiempo real de ácidos nucleicos diana que puede adaptarse para la utilización con las ADN polimerasas descritas en la presente memoria también se describen en, por ejemplo, Huang et al., Biotechnol. Lett. 26(11):891-895, 2004; Asselbergs et al., Anal. Biochem. 318(2):221-229, 2003, y Nuovo et al., J. Histochem. Cytochem. 47(3):273-280, 1999.

V. KITS

La presente invención proporciona además kits para la extensión de ácidos nucleicos. Generalmente, el kit incluye por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa de la invención tal como se indica en la presente memoria. En determinadas realizaciones, el kit incluye además uno o más recipientes adicionales que proporcionan uno o más reactivos adicionales. Por ejemplo, en variaciones específicas, el recipiente o recipientes adicionales proporcionan nucleótidos libres, un tampón adecuado para la PAPA y/o un cebador hibridable, bajo condiciones de PAP, a un molde polinucleótido predeterminado. En algunas realizaciones, el cebador presenta un nucleótido terminador no extensible en el extremo 3'-terminal. En algunas realizaciones, el nucleótido terminador incluye por lo menos un marcaje (por ejemplo un isótopo radioactivo, un pigmento fluorescente, un grupo modificador de la masa,

o similar). En algunas realizaciones, el kit incluye además uno o más nucleótidos extensibles y, opcionalmente, por lo menos uno de los nucleótidos extensibles comprende un marcaje (por ejemplo un isótopo radioactivo, un pigmento fluorescente, un grupo modificador de la masa, o similar). Opcionalmente, el kit incluye además por lo menos una pirofosfatasa (por ejemplo una pirofosfatasa termoestable, etc.). Típicamente, el kit incluye además un juego de instrucciones para extender el ácido nucleico con las ADN polimerasas dadas a conocer en la presente memoria. En determinadas realizaciones, el kit incluye además un ácido nucleico molde y el ácido nucleico cebador, en el que el ácido nucleico cebador es complementario a por lo menos una subsecuencia del ácido nucleico molde. Opcionalmente, el ácido nucleico molde o el ácido nucleico cebador se une a un soporte sólido. En algunas de dichas realizaciones, el cebador comprende un marcaje, tal como un isótopo radioactivo, un pigmento fluorescente, un grupo modificador de la masa, o similar.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: identificación y caracterización de las ADN polimerasas mutantes

El presente ejemplo muestra la identificación y caracterización de ADN polimerasas mutantes con una activación mejorada del cebador bloqueado con 2'-PO4. Se identificó una mutación en las polimerasas de la familia CS que proporciona una capacidad mejorada de eliminar el grupo de bloqueo de un cebador bloqueado con 2'-fosfato al hibridar el cebador con su molde perfectamente complementario. Brevemente, las etapas en dicho procedimiento de cribado incluían la generación de una biblioteca, la expresión y purificación parcial de los enzimas mutantes, el cribado de los enzimas para la propiedad deseada, la purificación mediante secuenciación y la caracterización adicional de mutantes seleccionados, y la generación, purificación y caracterización de las mutaciones en diferentes fondos genéticos. Se describe en mayor detalle cada una de estas etapas a continuación.

La mutación identificada mediante este procedimiento era T606S. Se introdujo seguidamente esta mutación en polimerasas de familia CS relacionadas, incluyendo G46E L329A E678G CS5 (GLE-CS5) y G46E L329A D640G S671F E678G CS5 (GLDSE-CS5). Las polimerasas mutantes resultantes se caracterizaron mediante el análisis de su rendimiento en una serie de experimentos de ciclado térmico cinético (CTC).

La mutación identificada, T606S, resultó en una capacidad mejorada de activar y extender el cebador bloqueado con 2'-PO4 al hibridarse con un molde perfectamente correspondiente, en el contexto de la mutación E678G, lo que permitió la incorporación de ribonucleótidos y otros nucleótidos 2'-modificados, pero que también resultó en una capacidad alterada de extender los moldes cebados. Las mutaciones S671F y D640G, así como Q601R e I669F, mejoraron esta propiedad de capacidad alterada de extensión de cebadores.

Generación de biblioteca clonal: el dominio de polimerasa de la ADN polimerasa CS5 E678G se sometió a PCR con tendencia a errores entre los sitios de restricción Bgl II y Hind III. Los cebadores utilizados para dicha amplificación se proporcionan a continuación:

Cebador directo: 5’-GCAGCGAACTACTCCTGTGA-3’ (SEC ID nº 31) y

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