ES2553605T3 - Procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contienen un marco de lectura abierto yfiD y/o un gen pflB intensificado - Google Patents
Procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contienen un marco de lectura abierto yfiD y/o un gen pflB intensificado Download PDFInfo
- Publication number
- ES2553605T3 ES2553605T3 ES04739070.3T ES04739070T ES2553605T3 ES 2553605 T3 ES2553605 T3 ES 2553605T3 ES 04739070 T ES04739070 T ES 04739070T ES 2553605 T3 ES2553605 T3 ES 2553605T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- threonine
- yfid
- production
- strains
- reading frame
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 title abstract description 28
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 title abstract description 14
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 title abstract description 14
- 101100326957 Bacillus subtilis (strain 168) catD gene Proteins 0.000 title abstract description 7
- 101100337717 Escherichia coli (strain K12) grcA gene Proteins 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 5
- 101150111581 pflB gene Proteins 0.000 title abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 title abstract 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 title description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000606766 Haemophilus parainfluenzae Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001478308 Paracoccus alcaliphilus Species 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000865057 Thermococcus litoralis DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un procedimiento para la producción de L-treonina mediante fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae, en el que a) en los microorganismos que ya producen L-treonina se sobre-expresan el ORF yfiD y/o el gen pflB o las secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos, y dichos microorganismos se cultivan en un medio en condiciones en las que la L-treonina está enriquecida en el medio o en las células, y b) la L-treonina se aísla, con lo que opcionalmente constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones permanecen en el producto aislado o se separan por completo.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
estabilidad de los plásmidos pueden añadirse al medio, sustancias adecuadas de acción selectiva, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tales como aire, por ejemplo. La temperatura del cultivo cultura es normalmente alrededor de 25 °C a 45 °C y preferiblemente en torno a 30 °C hasta 40 °C. El cultivo se continúa hasta que se haya formado un máximo de L-aminoácidos o, para ser más exactos, de L-treonina. Este objetivo se logra normalmente en el espacio de 10 horas a 160 horas.
El análisis de los L-aminoácidos se puede llevar a cabo mediante cromatografía de intercambio de aniones con subsiguiente derivatización con ninhidrina tal como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 11901206 (1958)), o puede tener lugar mediante HPLC de fase inversa tal como se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
El procedimiento de acuerdo con la invención sirve preferiblemente para la producción fermentativa de L-treonina.
La presente invención se elucidará con mayor detalle en lo que sigue sobre la base de realizaciones a modo de ejemplo.
Medios mínimos (M9) y medios completos (LB) que se utilizan para Escherichia coli se describen por J. H. Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de ADN del plásmido de Escherichia coli y también todas las técnicas relacionadas con la restricción, ligamiento, tratamiento Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevan a cabo de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press. La transformación de Escherichia coli se lleva a cabo, a menos que se describa de otro modo, de acuerdo con Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación en el transcurso de la producción de cepas y transformantes es 37 ºC.
Ejemplo 1
1. 1 Construcción del plásmido de expresión pTrc99AyfiD
El marco de lectura abierto yfiD de E. coli K12 se amplifica utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y también oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto yfiD en
E. coli K12, MG1655 (número de acceso AE000344, Blattner et al. (Science 277: 1453-1474 (1997)), se sintetizan cebadores de la PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Los cebadores contienen secuencias para las enzimas de restricción que están marcadas mediante subrayado en la secuencia de nucleótidos representada más adelante. El cebador yfiD1 contiene el sitio de restricción para XbaI; el cebador yfiD2 contiene el sitio de restricción para HindIII.
El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655 empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando “Qiagen Genomic-tips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 431 pb se puede amplificar con los cebadores específicos bajo condiciones de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) con Vent-ADNpolimerasa (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) (SEQ ID Nº 3).
El producto de la PCR se restringe con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y se examina en un gel de agarosa al 0,8% después de haberse purificado (kit de purificación, QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con las enzimas HindIII y XbaI, y se liga con el fragmento yfiD restringido. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF’ (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se transforma con la tanda de ligamiento, y células portadoras de plásmidos se seleccionan en agar LB al que se han añadido 50 μg/ml de ampicilina. La clonación con éxito se puede demostrar después del aislamiento del ADN del plásmido mediante escisión control con las enzimas HindIII/XbaI y HpaI. El plásmido se designa pTrc99AyfiD (Figura 1).
10
5
10
15
20
25
30
35
El resultado del experimento se presenta en la Tabla 1. Tabla 1
- Cepa
- DO (660 nm) L-treonina g/l
- MG442
- 5,6 1,4
- MG442/pTrc99A
- 3,8 1,3
- MG442/pTrc99AyfiD
- 5,5 2,5
2.1 Producción de L-treonina con la cepa MG442/pTrc99ApflB
La cepa de E. coli MG442 productora de L-treonina se describe en la memoria descriptiva de la patente US-A
4.278.765 y se deposita en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628.
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de expresión pTrc99ApflB descrito en el Ejemplo 1.2 y con el vector pTrc99A, y células portadoras de plásmidos se seleccionan en agar LB con 50 μg/ml de ampicilina. De este modo, surgen las cepas MG442/pTrc99ApflB y MG442/pTrc99A. Colonias sencillas seleccionadas se multiplican subsiguientemente de manera adicional en medio mínimo que tiene la siguiente composición: 3,5 g/l de Na2HPO4*2H2O, 1,5 g/l de KH2PO4, 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de MgSO4*7H2O, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de L-treonina se examina en cultivos en tandas de 10 ml, que están contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Para este fin, 10 ml de medio de pre-cultivo que tiene la siguiente composición: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4*7H2O, 15 g/l de CaCO3, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina, se inoculan e incuban durante 16 horas a 37 ºC y a 180 rpm en una incubadora ESR fabricada por Kühner AG (Birsfelden, Suiza). 250 μl de una vez de este pre-cultivo se inoculan en 10 ml de medio de producción (25 g/l de (NH4)2SO4, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4*7H2O, 0,03 g/l de FeSO4*7H2O, 0,018 g/l de MnSO4*1H2O, 30 g/l de CaCO3, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina) y se incuban durante 48 horas a 37 ºC. Con vistas a completar la inducción de la expresión del gen pflB, se añaden 100 mg/l de isopropil-β-Dtiogalactopiranósido (IPTG) en tandas paralelas. La formación de L-treonina por parte de la cepa MG442 inicial se examina de la misma manera, no existiendo, sin embargo, adición alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (OD) de la suspensión de cultivo a una longitud de onda de medición de 660 nm con un fotómetro LP2W fabricado por Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania).
Subsiguientemente se determina la concentración de L-treonina que se ha formado en el sobrenadante del cultivo filtrado en condiciones estériles con un analizador de aminoácidos fabricado por Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemania), mediante cromatografía de intercambio de iones y reacción post-columna con detección de ninhidrina.
El resultado del experimento se presenta en la Tabla 2.
Tabla 2
- Cepa
- Aditivos DO (660 nm) L-treonina g/l
- MG442
- - 5,6 1,4
- MG442/pTrc99A
- - 3,8 1,3
- MG442/pTrc99ApflB
- - 5,6 1,9
- MG442/pTrc99ApflB
- IPTG 5,2 2,2
Breve descripción de las Figuras:
Los datos de longitud han de interpretarse como datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones que se utilizan tienen el siguiente significado:
- ● Amp:
- gen de resistencia a ampicilina
- ● lacI:
- gen para la proteína represora del promotor trc
- ● Ptrc;
- región del promotor trc, inducible por IPTG
- 12
- ●
- yfiD: región codificadora del marco de lectura abierto yfiD
- ●
- pflB: región codificadora del gen pflB
- ●
- 5S: región de ARNr de 5S
● rrnBT: región del terminador de ARNr 5 Las abreviaturas para las enzimas de restricción tienen el siguiente significado:
- ●
- HindIII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenze Rc
- ●
- HpaI: endonucleasa de restricción de Haemophilus parainfluenzae
- ●
- PauI: endonucleasa de restricción de Paracoccus alcaliphilus
- ●
- XbaI: endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris
10
13
Claims (1)
-
imagen1 imagen2 imagen3
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10316109 | 2003-04-09 | ||
| DE10316109A DE10316109A1 (de) | 2003-04-09 | 2003-04-09 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| PCT/EP2004/003207 WO2004090149A1 (en) | 2003-04-09 | 2004-03-26 | Process for the production of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhance yfidd orf and/or pfld gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2553605T3 true ES2553605T3 (es) | 2015-12-10 |
Family
ID=33016224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04739070.3T Expired - Lifetime ES2553605T3 (es) | 2003-04-09 | 2004-03-26 | Procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contienen un marco de lectura abierto yfiD y/o un gen pflB intensificado |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7211415B2 (es) |
| EP (1) | EP1611245B1 (es) |
| DE (1) | DE10316109A1 (es) |
| DK (1) | DK1611245T3 (es) |
| ES (1) | ES2553605T3 (es) |
| HU (1) | HUE026598T2 (es) |
| PL (1) | PL1611245T3 (es) |
| WO (1) | WO2004090149A1 (es) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050181488A1 (en) * | 2004-02-12 | 2005-08-18 | Akhverdian Valery Z. | Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia |
| JP5432524B2 (ja) * | 2005-06-20 | 2014-03-05 | アーチャー−ダニエルズ−ミッドランド カンパニー | アスパラギン酸由来アミノ酸および化学物質の改善された生産のための改変グリオキシル酸シャント |
| WO2007119576A1 (en) * | 2006-03-23 | 2007-10-25 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
| KR100905381B1 (ko) | 2006-07-28 | 2009-06-30 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
| DE102006041167A1 (de) * | 2006-09-01 | 2008-03-06 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| WO2008072761A2 (en) * | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an l-amino acid |
| EP2060636A1 (de) * | 2007-11-14 | 2009-05-20 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| KR102115497B1 (ko) | 2009-04-30 | 2020-05-26 | 게노마티카 인코포레이티드 | 1,3-부탄다이올 생산 유기체 |
| US8283152B2 (en) * | 2009-08-28 | 2012-10-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-acetyl-homoserine using the microorganism |
| JP2013513384A (ja) * | 2009-12-10 | 2013-04-22 | ジェノマティカ・インコーポレイテッド | 合成ガスまたは他のガス状の炭素源およびメタノールを１，３−ブタンジオールへ変換するための方法および生物 |
| CN102041284A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-05-04 | 福建省麦丹生物集团有限公司 | 一种提高l-苯丙氨酸基因工程菌产酸率的方法 |
| CN103998616A (zh) | 2011-10-17 | 2014-08-20 | 威廉马什莱斯大学 | 用于合成脂肪酸的细菌和方法 |
| WO2014011054A1 (en) * | 2012-07-09 | 2014-01-16 | Jets As | Liquid ring screw pump end cover |
| US11053526B2 (en) | 2018-08-09 | 2021-07-06 | Evonik Operations Gmbh | Process for preparing L amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU875663A1 (ru) | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
| JPS63273469A (ja) | 1986-12-13 | 1988-11-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 乳糖資化性を有する新規微生物 |
| US5821093A (en) * | 1988-08-31 | 1998-10-13 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes |
| EP1015621B1 (de) | 1997-10-04 | 2005-03-09 | Degussa AG | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren der aspartat- und/oder glutamatfamilie und im verfahren einsetzbare mittel |
| ATE458040T1 (de) * | 1998-04-13 | 2010-03-15 | Univ Georgia | Pyruvate carboxylase überexpression zur verstärkten produktion von oxalacetat abgeleiteten verbindungen in mikrobiellen zellen |
| RU2144564C1 (ru) | 1998-10-13 | 2000-01-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ |
| RU2148642C1 (ru) | 1998-12-23 | 2000-05-10 | ЗАО "Научно-исследовательский институт АДЖИНОМОТО-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты |
| JP2003204788A (ja) | 1999-07-19 | 2003-07-22 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| RU2212447C2 (ru) | 2000-04-26 | 2003-09-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты) |
| AU2001258316A1 (en) | 2000-05-27 | 2001-12-11 | Degussa A.G. | Process for the fermentative preparation of l-threonine |
| EP1303590A1 (en) | 2000-07-18 | 2003-04-23 | Degussa AG | Process for the fermentative preparation of l-threonine |
| AU2001293795A1 (en) | 2000-09-30 | 2002-04-15 | Degussa A.G. | Fermentation process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae |
| WO2002036797A2 (en) | 2000-11-04 | 2002-05-10 | Degussa Ag | Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| KR100397423B1 (ko) | 2001-02-13 | 2003-09-13 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| WO2002077183A2 (en) | 2001-03-21 | 2002-10-03 | Elitra Pharmaceuticals, Inc. | Identification of essential genes in microorganisms |
| DE10116518A1 (de) | 2001-04-03 | 2002-10-17 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE60230040D1 (de) | 2001-07-06 | 2009-01-08 | Evonik Degussa Gmbh | Fermentationsverfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen aus der familie der enterobacteriaceae |
| DE10132946A1 (de) | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobactericeae |
| ES2313555T3 (es) | 2001-07-11 | 2009-03-01 | Evonik Degussa Gmbh | Proceso para la preparacion de l-treonina que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas. |
| EP1407035B1 (en) | 2001-07-18 | 2006-04-12 | Degussa AG | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aspa gene |
| DE10135053A1 (de) * | 2001-07-18 | 2003-02-06 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| AU2002354853A1 (en) | 2001-07-18 | 2003-03-03 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| DE10154102A1 (de) | 2001-11-02 | 2003-05-15 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| EP1483393A1 (en) | 2002-03-13 | 2004-12-08 | Degussa AG | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae |
| EP1483392B1 (en) | 2002-03-13 | 2010-12-01 | Evonik Degussa GmbH | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae |
-
2003
- 2003-04-09 DE DE10316109A patent/DE10316109A1/de not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-03-26 WO PCT/EP2004/003207 patent/WO2004090149A1/en active Application Filing
- 2004-03-26 EP EP04739070.3A patent/EP1611245B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-26 HU HUE04739070A patent/HUE026598T2/hu unknown
- 2004-03-26 ES ES04739070.3T patent/ES2553605T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-26 PL PL04739070T patent/PL1611245T3/pl unknown
- 2004-03-26 DK DK04739070.3T patent/DK1611245T3/en active
- 2004-04-05 US US10/817,431 patent/US7211415B2/en active Active
-
2007
- 2007-02-14 US US11/705,715 patent/US20070141681A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1611245A1 (en) | 2006-01-04 |
| PL1611245T3 (pl) | 2016-02-29 |
| DE10316109A1 (de) | 2004-10-21 |
| WO2004090149A1 (en) | 2004-10-21 |
| HUE026598T2 (hu) | 2016-06-28 |
| US7211415B2 (en) | 2007-05-01 |
| EP1611245B1 (en) | 2015-09-09 |
| DK1611245T3 (en) | 2015-12-14 |
| US20070141681A1 (en) | 2007-06-21 |
| US20040235122A1 (en) | 2004-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2553605T3 (es) | Procedimiento para la producción de L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae que contienen un marco de lectura abierto yfiD y/o un gen pflB intensificado | |
| ES2343944T3 (es) | Proceso para la preparacion de l-aminoacidos usando cepas de la familia enterobacteriaceae con sobreexpresion fba. | |
| Dryden et al. | Localization and structural analysis of the ribosomal RNA operons of Rhodobacter sphaeroides | |
| ES2328230T3 (es) | Proceso para la preparacion de l-treonina utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas que contienen genes suca y sucb intensificados. | |
| CN100529057C (zh) | 通过埃希氏菌属细菌生产l-氨基酸的方法 | |
| Brahamsha et al. | Identification of multiple RNA polymerase sigma factor homologs in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120: cloning, expression, and inactivation of the sigB and sigC genes | |
| Haddadin et al. | Transcriptome profiles for high‐cell‐density recombinant and wild‐type Escherichia coli | |
| CN100436594C (zh) | 发酵制造s-腺苷甲硫氨酸的方法 | |
| ES2310588T3 (es) | Proceso para la produccion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas que contienen un gen dgsa atenuado. | |
| JP7475434B2 (ja) | Ｌ－トリプトファン産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌における使用 | |
| CN1254014A (zh) | 编码使大肠杆菌具有l－高丝氨酸抗性的蛋白质的dna以及用于生产l－氨基酸的方法 | |
| KR20000048340A (ko) | Ｌ-아미노산을 생산하는 신규한 유전자 및 생산 방법 | |
| ES2385651T3 (es) | Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos, que usa cepas de la familia de las Enterobacteriáceas | |
| ZA200510448B (en) | Feedback resistant acetohydroxy acid synthetase mutants | |
| Gao et al. | Mutations in genes encoding antibiotic substances increase the synthesis of poly‐γ‐glutamic acid in Bacillus amyloliquefaciens LL3 | |
| ES2311645T3 (es) | Un proceso para la produccion de l-aminoacidos usando cepas de la familia de enterobacteriaceae que contiene un gen ic1r mejorado. | |
| AU2005222636B2 (en) | Novel antibiotic alternatives | |
| KR100860932B1 (ko) | 신규한 프로모터 및 이의 용도 | |
| CN101597588B (zh) | 通过埃希氏菌属细菌生产l-氨基酸的方法 | |
| CN110257312B (zh) | 一种重组基因工程菌及其发酵产香兰素的应用 | |
| CN109251940B (zh) | 一种产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌的构建方法 | |
| ES2611015T3 (es) | Procedimiento para la obtención de L-aminoácidos bajo empleo de cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae | |
| US11365401B2 (en) | Oligosaccharyltransferase polypeptide | |
| CN108753998B (zh) | 鞭毛二级调控基因fliA或其表达产物作为靶点在抗菌药物开发中的应用 | |
| Paytubi et al. | Bacterial Hha-like proteins facilitate incorporation of horizontally transferred DNA |