ES2553383T3 - Procedimiento de integración localizada de múltiples copias de un gen de interés en una cepa de Yarrowia - Google Patents

Procedimiento de integración localizada de múltiples copias de un gen de interés en una cepa de Yarrowia Download PDF

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ES2553383T3
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Franck Fudalej
Cécile NEUVEGLISE
Jean-Marie Beckerich
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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Abstract

Procedimiento de integración localizada de por lo menos tres copias de un gen de interés en el genoma de una cepa de Yarrowia que comprende las etapas de: a) puesta en cultivo de una cepa de Yarrowia que comprende por lo menos tres deleciones seleccionadas de entre Ura3-302, Leu2-270, Gut2-744 y Ade2-844, correspondiendo el fenotipo asociado a cada una de estas deleciones a una auxotrofia para dicha cepa, independientemente el uno del otro de estos por lo menos tres genes; b) transformación de dicha cepa de Yarrowia auxótrofa con por lo menos tres vectores recombinantes que comprenden unos marcadores de selección que permiten, para dicha cepa de Yarrowia, la complementación de la auxotrofia resultante de cada una de dichas deleciones, comprendiendo dichos vectores recombinantes cada uno: i) la secuencia de dicho gen de interés, ii) un marcador de selección, y iii) dos secuencias de ADN que enmarcan la secuencia de dicho gen de interés y dicho marcador de selección, siendo dichas secuencias de ADN homólogas a las secuencias que corresponden a los extremos del sitio de integración localizado en el genoma de dicha cepa de Yarrowia de manera que se permita la integración localizada de dicho vector recombinante por recombinación homóloga; selección sobre un medio mínimo, de las levaduras que han integrado dichos por lo menos tres vectores recombinantes.

Description

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para una triacilglicerol hidrolasa. Una cepa de Yarrowia cuyo gen LIP8 está inactivado (después de inactivar LIP2) no presentará ningún halo de hidrólisis de la tributirina sobre placa YNBT y ninguna actividad lipasa (FICKERS et al., Fungal Genetics and Biology, vol. 42, p. 264-274, 2005).
El gen AXP (SEC ID nº 7 para Yarrowia lipolytica) se puede utilizar como locus de inserción. El gen AXP codifica para una proteasa ácida extracelular normalmente expresada cuando el pH del medio es inferior 4. Una cepa de Yarrowia cuyo gen AXP está inactivado (por ejemplo por deleción), presentará sobre placa YNBcaseína a pH ácido un halo de hidrólisis de la caseína disminuido y una actividad proteasa disminuida (GLOVER et al., Microbiology, vol. 143, p. 3045-54, 1997).
El gen XPR2 codifica para una proteasa alcalina extracelular expresada cuando el pH del medio es superior a 6. Una cepa de Yarrowia cuyo gen XPR2 (SEC ID nº 8 para Yarrowia lipolytica) está inactivado (por ejemplo por deleción), presentará en placa YNBcaseína a pH6 un halo de hidrólisis de la caseína disminuido y una actividad proteasa disminuida (DAVIDOW et al., J. Bacteriol., vol. 169, p. 4621-9, 1987).
A título de ejemplo, se puede citar la cepa de Yarrowia lipolytica depositada el 4 de febrero de 2008 de acuerdo con el tratado de Budapest en la Collection nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, Francia bajo el número CNCM-3912.
A título de ejemplo, se puede citar la cepa de Yarrowia lipolytica depositada el 4 de febrero de 2008 de acuerdo con el tratado de Budapest en la Collection nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, Francia bajo el número CNCM-3911.
Ventajosamente, dicha cepa de Yarrowia comprende cuatro genes que presentan independientemente entre sí una deleción asociada a un fenotipo de auxotrofia o de carácter dominante, preferentemente seleccionados de entre los genes URA3, LEU2, GUT2 y ADE2.
La presente solicitud se refiere asimismo a la cepa de Yarrowia lipolytica depositada el 4 de febrero de 2008 de acuerdo con el tratado de Budapest en la Collection nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, Francia bajo el número CNCM-3913.
Según un modo de realización preferido del procedimiento según la invención, éste permite la integración localizada de 3 a 10 copias del gen de interés, preferentemente de 4 a 8 copias y, de manera particularmente preferida, de 5 a 7 copias de dicho gen de interés.
Ventajosamente, el procedimiento según la invención comprende la transformación de dicha cepa de Yarrowia auxótrofa con tres a diez vectores recombinantes, preferentemente de 4 a 8 vectores recombinantes y, de manera particularmente preferida, de 5 a 7 vectores recombinantes.
Los vectores recombinantes utilizados en la etapa b) podrán comprender además uno o varios marcadores de selección distintos de los que permiten, para dicha cepa de Yarrowia, la complementación de la auxotrofia y, llegado el caso, del carácter dominante resultante de las deleciones entre por lo menos los tres genes.
Las secuencias que codifican para el marcador de selección y las del gen de interés comprenden además los elementos necesarios para su expresión en una cepa de Yarrowia.
Dichos elementos corresponden en particular a unas secuencias promotoras y terminadoras activas en una cepa de Yarrowia. Preferentemente las secuencias promotoras y terminadoras utilizadas pertenecen a unos genes diferentes con el fin de minimizar los riesgos de recombinación no deseada en el genoma de la cepa de Yarrowia.
Dichas secuencias promotoras son bien conocidas por el experto en la materia y pueden corresponder en particular a unos promotores inducibles o constitutivos. A título de ejemplo de promotores que se pueden utilizar en el procedimiento según la invención, se puede citar en particular el promotor de un gen de Yarrowia lipolytica que está reprimido en gran medida por la glucosa y que es inducible por los ácidos grasos o los triglicéridos tal como el promotor POX2 del gen de acil CoA oxidasa 2 de Yarrowia lipolytica y el promotor del gen LIP2 descrito en la solicitud PCT WO 01/83773. Se puede utilizar también el promotor del gen FBA1 del gen de la fructosa-bisfosfato aldolasa (US 2005/0130280), el promotor del gen YAT1 del gen transportador del amonio (US 2006/0094102 A1), el promotor del gen GPAT del gen de la glicerol-3-fosfato O-aciltransferasa (US 2006/0057690 A1), el promotor del gen TEF (US 2001/6265185) y el promotor híbrido hp4d (WO 9641889).
Dichas secuencias terminadoras son también bien conocidas por el experto en la materia y se pueden citar a título de ejemplo de secuencias terminadoras que se pueden utilizar en el procedimiento según la invención la secuencia terminadora del gen PGK1, la secuencia terminadora del gen LIP2 descrito en la solicitud PCT WO 01/83773.
Cuando el producto del gen de interés está destinado a ser segregado por la célula huésped, dicho inserto comprende además unas señales de control de la secreción de dicho producto. Se puede utilizar con este fin unas
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3. Deleción del gen LEU2 (marcado ∆leu2-958), obtención de las cepas mutantes FF2-lu, FF-2lug, FF2-lua y FF2luag y construcción del marcador LEU2∆BamHI.
3.1 Deleción del gen LEU2 (∆leu2-958)
Para obtener estas cepas, se puede proceder de la siguiente manera: a partir del mutante FF-lu, se ha construido la cepa FF2-lu Leu-, Ura-. De manera similar, se pueden construir unas cepas derivadas de FF-lua, FF-lug, FF-luag que presentan la deleción ∆leu2-958. A partir del mutante FF-lug, se puede construir la cepa FF2-lug Leu-, Ura-, gly-, a partir del mutante FF-lua, se puede construir la cepa FF2-lua Leu-, Ura-, ade-y a partir del mutante FF-luag, se puede construir la cepa FF2-luag Leu-, Ura-, ade-, gly-.
Por ejemplo, a partir del mutante FF-lu se ha construido la cepa Y. lipolytica mutante correspondiente que presenta una deleción del gen LEU2 más importante que para el marcador genético leu2-270. La primera etapa es la construcción de la cepa FF2-lu :: URA3 protótrofa para el uracilo (Leu-, Ura+) por deleción del gen leu2-270 por el casete de interrupción leu2 :: URA3ex transformando el casete NotI procedente del plásmido pPTLeu2-Ura3Ex (JME958) que contiene este marcador y seleccionando las Ura+ sobre YNBcasa. Se seleccionan los auxótrofos para el uracilo (Leu+, Ura-) por escisión del marcador URA3ex transformando con el vector replicativo pRRQ2 que contiene la recombinasa Cre y el marcador LEU2 (Cre-LEU2) y seleccionando los transformantes auxótrofos para el uracilo, Leu+. La pérdida del plásmido pRRQ2 se realiza mediante un cultivo sobre medio rico YPD y mediante el aislamiento de un clon (Leu-, Ura-). Se puede utilizar el mismo método para obtener los mutantes FF2-lua, FF2-lug y FF2-luga.
La representación esquemática de la construcción del mutante FF2-lu se resume en la tabla 4 siguiente.
Tabla 4: Etapas de transformación requeridas para la producción del mutante FF2-lu
Etapa
Operaciones de transformación
Mutante a transformar
Casete de transformación Mutante transformado
a1
FF-lu, Leu-, Ura-JMY195, Po1d PTLeu2-Ura3Ex FF-IU+, leu-, Ura+ leu2-PUexT
a2
FF-IU+, Leu-, Ura+, leu2-URA3 Vector pRRQ2, selección Leu+, verificación Ura-, pérdida del plásmido pRRQ2 sobre YPD, aislamiento de Leu- JMY1516, Lieu-, Ura-, leu2-958 FF2lu
El casete de interrupción para el gen LEU2 se ha construido por amplificación de la región aguas arriba (región P; Yali0C44989..Yali0C46081, 1092 pb) y de la región aguas abajo (región T; Yali0C47036..Yali0C47932, 897 pb) lo cual permite la deleción del ORF del gen LEU2 (Yali0C46082..Yali0C47035, 954 pb) y que no deja más que una homología muy reducida con el marcador de selección LEU2ex (O bp con la región P y 207 bp en la región T) con el fin de minimizar las conversiones génicas. El marcador de selección Leu2Ex presentaba una fuerte homología con el marcador genético leu2-270 (401 bp con la región P y 710 bp en la región T) ya que éste corresponde a una simple deleción StuI de 681 bp del gen LEU2. Los marcadores de selección ex se presentan en la tabla 11.
Las regiones P y T se han amplificado con los cebadores PILeu2, P2Leu2, TILeu2 y T2Leu2 (tabla 9).
Los cebadores P2 y T1 contienen el sitio raro I-SceI para la inserción del marcador de selección escindible Ura3ex. El cebador T1 contiene también el sitio raro I-CeuI para la inserción del casete de expresión. Los cebadores P1 y T2 contienen el sitio raro NotI para la clonación en pHSS6-NotI (JME800). El fragmento PT se ha clonado en JME800 digerido por NotI y se ha desfosforilado para dar el plásmido pLeu2-PT en la orientación 1 (sentido 1, JME811) o en la orientación 2 (sentido 2, JME812). El sentido se define según la orientación del sitio I-SceI: o bien el sentido 1 con el sitio I-SceI como sentido, o bien el sentido 2 con el sitio I-SceI, como complementario. El plásmido de interrupción pPTLeu2-Ura3Ex (JME958) se ha obtenido mediante la inserción del marcador Ura3ex en el sitio I-SceI del plásmido JME811.
El casete de interrupción se ha obtenido por digestión NotI y purificación de la banda de 3351 pb. Las cepas se han trasformado mediante el método con acetato de litio. Los transformantes Ura+ se han seleccionado sobre medio YNBcasa.
3.2 Construcción del marcador LEU2n (LEU2ex∆BamHI)
Para la construcción de los casetes de expresión y de los casetes de integración, los marcadores de selección no deben contener los sitios únicos utilizados para la clonación de los genes de intereses (BamHI, HindIII, KpnI y AvrII). Para la construcción del marcador LEU2n (LEU2ex∆BamHI), se han utilizado los cebadores Leu2-LI y Leu2-L2 para crear un "linker" que aporta la modificación ggaatT en ggaatC y que posee el sitio ApaI (Tabla 9). El plásmido pKSLPR-Leu2 (JME509) ha sido digerido por un lado por ApaI y ScaI y, por otro lado, por BamHI y ScaI. Las bandas ApaI-ScaI de 1471 pb y BamHI-ScaI de 3300 pb se han purificado sobre gel de agarosa. Una ligación de 3 vías se
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Tabla 7: lista de los vectores de integración
Locus
Nombre del vector Orientación 1-Scel N°colección Marcador Nombre del vector N°colecció n
LIP2
pPTLip2 Sens 1 JME806 URA3ex pPTLip2-Ura3ex JME815
GUT2-0.5ex
pPTLip2-Gut2-0.5ex JME816
Sens 2
JME807
URA3
pPTUra3 Sens 1 JME809 LEU2nex pPTUra3-Leu2nex JME817
Sens 2
JME810
LEU2
pPTLeu2 Sens 1 JME811 ADE2ex pPTLeu2-Ade2ex JME818
URA3ex
pPTLeu2-Ura3ex JME958
Sens 2
JME812
ADE2
pPTAde2 Sens 1 JME813 GUT2-0.5ex pPTAde2-Gut2-0.5ex JME819
URA3ex
pPTAde2-Ura3ex JME844
Sens 2
JME814 JME814
5 7. Principio de construcción de los vectores de integración para la expresión de proteína de interés.
La clonación de un gen de interés se realiza sólo en 2 etapas de clonación. La primera etapa es una sub-clonación en el vector de expresión pVC para obtener el vector pVC-gen de interés bajo el control del promotor POX2 (pueden ser utilizados otros promotores fuertes tales como por ejemplo el promotor hp4d o unos promotores inducibles). Este
10 vector pVC-gen de interés está digerido por I-CeuI para aislar y purificar el casete de expresión. La segunda etapa es la clonación de este casete de expresión I-CeuI en los vectores de integración. El casete de integración/casete de expresión se aísla y se purifica después de la digestión por NotI antes de la transformación en Y. lipolytica (Figura 3).
15 Ejemplo 2: Construcción y utilización de un casete de integración/expresión para la inserción localizada de un gen que codifica para una proteína de interés terapéutico no producida por Y. lipolytica.
Se ha tomado como ejemplo la proteína L-asparaginasa de Erwinia chrysanthemi.
20 Se introduce el gen que codifica para esta proteína en el vector pVC-pPOX2 en el sitio HindIII/AvrII. Para ello, se realiza una fusión por PCR entre la secuencia preproLIP2 y la parte de la secuencia del gen que codifica para la forma madura de la proteína L-asparaginasa. Las PCR se realizan con los cebadores preproLip2 y Lip2KR para amplificar la secuencia pre-pro-LIP2 y con los cebadores Laspsens y Lasprev para amplificar la secuencia que codifica para la proteína madura. Después, mezclando los 2 productos de PCR obtenidos, se realiza la fusión con
25 los cebadores preproLip2 y Lasprev. El cebador preproLip2 contiene el sitio HindIII y el cebador Lasprev el sitio AvrII para la clonación del producto de la fusión en el pCV-pPOX2. Se obtiene entonces el vector pVC-pPOX2-preproLip2-LAsp (JME898) que contiene el casete de expresión de la proteína L asparaginasa (Tabla 8).
A partir de este vector, se extrae el casete de expresión gracias a una digestión por la enzima de restricción I-CeuI y
30 se purifica. Este casete se inserta entonces en los diferentes vectores de integración en el sitio I-CeuI. Los diferentes vectores de integracion/expresión obtenidos se describen en la Tabla 8.
Tabla 8: Vector de integración/expresión obtenido:
Descripción
Nombre del vector N°colección
Vector de expresión
pVC=pPOX2-LAsp JME898
Vector Int. locus Ura3
pPTUra3-Leu2nEx-LAsp JME923
Vector Int. locus Ade2
pPTAde2-Gut2-0.5Ex-LAsp JME924
Vector Int. locus Ade2
pPTAde2-Ura3Ex-LAsp JME925
Vector Int. locus Leu2
pPTLeu2-Ade2Ex-LAsp JME926
Vector Int. locus Lip2
pPTLip2-Ura3Ex-LAsp JME927
Vector Int. locus Ade2
pPTAde2-Gut2-10Ex(s1)-LAsp JME941
Vector Int. locus Ade2
pPTAde2-Gut2-1.0Ex(s2)-LAsp JME942
Vector Int. locus Ade2
pPTAde2-Gut2-1.5Ex(s1)-LAsp JME943
Vector Int. locus Ade2
pPTAde2-Gut2-l .SEx(s2)-LAsp JME944
Los casetes de integración/expresión se obtienen por digestión de la enzima de restricción NotI de los diferentes vectores de integración/expresión. Estos casetes son después extraídos y purificados con el fin de eliminar las secuencias de ADN exógeno E coli.
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Ejemplo 3: Transformación de los casetes de integración/expresión de la proteína L-asparaginasa en Y. lipolytica.
Se pueden introducir sucesivamente por ejemplo 4 copias del casete de expresión de la L-asparaginasa en los 4 locus antes citados en la cepa FF-luga.
1 Inserción de la primera copia en el locus ADE2.
El primer casete de expresión se ha introducido por transformación de la cepa FF-luga en el locus ADE2 utilizando el casete de integración/expresión PTAde2-Gut2-1.0Ex-LAsp procedente del vector JME941. La selección de los transformantes se realiza sobre un medio selectivo YNBcasa suplementado con uracilo y con adenina y que contiene como única fuente de carbono un 1% de glicerol. Los transformantes obtenidos son insertados en este mismo medio selectivo y se verifica la integración en el locus por PCR utilizando los cebadores Verlade2 y Ver2ade2 que se encuentran aguas arriba y aguas abajo de las secuencias de integración.
La tasa de transformación obtenida es de 8,2·103 transformantes por µg de ADN transformado. La verificación por PCR de la integración en el locus Ade2 ha mostrado que el 100% de los transformantes han integrado el casete de expresión LAsp de este locus.
Se han conservado 2 transformantes denominados 5LAsp1 y 6LAsp1 (tabla 5). Las primeras cifras al principio del nombre dan el número del transformante y la segunda cifra al final del nombre da el número de copia del casete de expresión LAsp.
2 Inserción de la segunda copia en el locus LIP2.
El segundo casete de expresión se ha introducido por transformación del transformante 5LAsp1 en el locus LIP2 utilizando el casete de integración/expresión PTLip2-Ura3Ex-LAsp procedente del vector JME927. La selección de los transformantes se realiza sobre un medio selectivo YNBcasa suplementado con adenina y que contiene como única fuente de carbono un 1% de glucosa. Los transformantes obtenidos son aislados sobre este mismo medio selectivo y la integración en el locus se verifica por PCR utilizando los cebadores Ver1lip2 y Ver2lip2 que se encuentran aguas arriba y aguas abajo de las secuencias de integración.
La tasa de transformación obtenida es de 1,1·104 transformantes por µg de ADN transformado. La verificación por PCR de la integración en el locus LIP2 ha mostrado que el 75% de los transformantes han integrado el casete de expresión LAsp en este locus. Alternativamente, la verificación de la integración del casete de expresión en el locus LIP2 se puede realizar por medición de la actividad lipasa, tal como se muestra en la figura 7.
Se han conservado 5 transformantes denominados 14LAsp2, 15LAsp2,16LAsp2, 17LAsp2 y 21 LAsp2 (Tabla 5).
3 Inserción de la tercera copia en el locus LEU2.
El tercer casete de expresión se ha introducido por transformación del transformante 15LAsp2 en el locus LEU2 utilizando el casete de integración/expresión PTLeu2-Ade2Ex-LAsp procedente del vector JME926. La selección de los transformantes se realiza sobre un medio selectivo YNBcasa que contiene como única fuente de carbono un 1% de glucosa. Los transformantes obtenidos son aislados sobre este mismo medio selectivo y se verifica la integración en el locus por PCR utilizando los cebadores Ver1leu2 y Ver2leu2 que se encuentran aguas arriba y aguas abajo de las secuencias de integración.
La tasa de transformación obtenida es de 1,6·104 transformantes por µg de ADN transformado. La verificación por PCR de la integración en el locus LEU2 ha mostrado que el 20% de los transformantes han integrado el casete de expresión LAsp en este locus.
Se ha conservado 1 transformante denominado 1LAsp3 (Tabla 5).
4 Inserción de la cuarta copia en el locus URA3.
El cuarto casete de expresión se ha introducido por transformación del transformante 1LAsp3 en el locus URA3 utilizando el casete de integración/expresión PTUra3-Leu2nEx-LAsp procedente del vector JME923. La selección de los transformantes se realiza sobre un medio selectivo YNB que contiene como única fuente de carbono un 1% de glucosa. Los transformantes obtenidos son aislados sobre este mismo medio selectivo y se verifica la integración en el locus por PCR utilizando los cebadores Ver1Ura3 y Ver2Ura3 que se encuentran aguas arriba y aguas abajo de las secuencias de integración.
La tasa de transformación obtenida es de 5,25·103 transformantes por µg de ADN transformado. La verificación por PCR de la integración en el locus URA3 ha mostrado que el 87% de los transformantes han integrado el casete de expresión LAsp en este locus, el 87% de los transformantes son Ura-(figura 6).
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Cebador
5'-3' S/R Sitios
Marcador GUT2
PG3PTS CCGGAATTCCTGACCAGTCTCACATCCGACC S EcoRI
PG3PTR
CCGGAATTCTAAAGCAGATACTCAACAACTCAGCAATAGTC R EcoRI
G3PB1S
GGAGCTACCGGCTCCGGTATCGC S ∆BamHI
G3PB1R
GCGATACCGGAGCCGGTAGCTCC R ∆BamHI
G3PB2S
CGGAAACGCTGGATCTTTCAACATCAAGGCC S ∆BamHI
G3PB2R
GGCCTTGATGTTGAAAGATCCAGCGTTTCCG R ∆BamHI
G3PES
GGAGCAGGAGTTCAACACCGGTGTCG S ∆EcoRI
G3PER
CGACACCGGTGTTGAACTCCTGCTCC R ∆EcoRI
∆GUT2
G3PD-P1 GCAGATCCACTGTCAAGCCG S
G3PD-P2
GCTAGGGATAAACAGGGTAATGCGGTAGGAAAGAGAAGTTCCGC G R I-SceI
G3PD-T1
GCATTACCCTGTTATCCCTAGCCGGACTATTTCCCCGCAGC S I-SceI
G3PD-T2
GCAGCCAGCAGCACGTAGTAG R
G3PD-Ver1
GAATGACGGGGGCAACGCAG S
G3PD-Ver2
CAGCAGCCACAAATAGCAGACTGCC R
pGUT2-1.0 y 1.5
P1KB CCGGAATTCCGTGACAACGGATGATGCTGTCACATGACG S EcoRI
P15KB
CCGGAATTCCTGTTGGCATGCACAGCTCCACTCAACG S EcoRI
PNHE1
TCCCGCTAGCCGAGGTATGCAAGGACGAGTGC R NheI
Locus ADE2
P1ADE2 ATAAGAATGCGGCCGCGCGAGCTGAGAGCCGATACCAAGGGAT GCGAG S NotI
P2ADE2
CATTACCCTGTTATCCCTACAGACACAGGTCCCAGGCGTCGGTT CTCG R I-SceI
T1ADE2
imagen17 S I-SceI/I-CeuI
T2ADE2
ATAGTTTAGCGGCCGCGGAAGCGTGTCAACGACATGTTCCCTCT TCATACC R NotI
Ver1Ade2
CGACGATAGAGCAGGTCTCACTOTTGGGAATGCTG S
Ver2Ade2
CTACAGTGACGAAGTGGACATCCCGGCTTGGACTG R
Marcador ADE2
ADE2S CGCGAATTCGCCTGCTTGAAAGAAGTGAGTGGTATGCTCGG S EcoRI
ADE2R
CGCGAATTCCATTGCCACGACCTGTTAAAAGACAAGATGACC R EcoRI
ADE2ES
GCTGGCCATCCGAATCCTGGCTGCTTACGACGCC S ∆EcoRI
ADE2ER
GGCGTCGTAAGCAGCCAGGATTCGGATGGCCAGC R ∆EcoRI
Locus Lip2
P1Lip2 ATAAGAATGCGGCCGCGTGGTACGTTTCGTCGCATCGGACGAG S NotI
P2Lip2
CATTACCCTGTTATCCCTAGAGAGCTGGTACTTGGGTATCAATTG AGG R I-SceI
T1Lip2
imagen18 S I-SceI/I-CeuI
T2Lip2
ATAGTTTAGCGGCCGCGTGGACACAAGGAAGTATGCGGTCGTCG R NotI
Lip2Ver1
CTCTGTCAGTGTTCGGATAAGTCCTTAGATCACC S
Lip2Ver2
CCTCACTTCTGTCACAGATGATGCATTCAACAC R
Locus Leu2
P1Leu2 ATAAGAATGCGGCCGCGACACTACTCTGGCTACAGCTTGCGGTA CTG S NotI
P2Leu2
CATTACCCTGTTATCCCTAGCTCGAATAACATTCACAGGCTTGGT G R I-SceI
T1Leu2
CTAGGGATAACAGGGTAATTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA GGTGT GTTTGTAGTGGAGGACAGTGGTACG S I-Scel/I-CeuI
T2Leu2
ATAGTTTAGCGGCCGCGTACTGAACCGACTTTGGTGCTTGCACT C R NotI
Leu2Ver1
CTCCACGCTAATGCCCATCATACTCTGTTTGGC S
Leu2Ver2
CCTGGCGTTACAAAGCCGAGGGAGACAGCCTTGAC R
Locus Ura3
P1Ura3 ATAAGAATGCGGCCGCGGTGACACTGCACTATTGGTTTGCTTCT GATG S NotI
P2Ura3
CATTACCCTGTTATCCCTAGTCGAGCTTCGTAGGAGGGCATTTTG GTGG R I-SceI
T1Ura3
imagen19 S I-SceI/I-CeuI
T2Ura3
ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGCTACGAGCGTCGGATTCACCACA G R NotI
Ura3Ver1
GGCACACTGCTCACTATCGCAGGCTGCAACAATG S
Ura3Ver2
CCTGACTCGTCTCGATACTCAAGACCTCATTGACGC R
22

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