ES2549860T3 - Diagnóstico y pronóstico de estados patológicos relacionados con la dipepitidil peptidasa - Google Patents

Diagnóstico y pronóstico de estados patológicos relacionados con la dipepitidil peptidasa Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad metabólica de la diabetes de tipo II, que comprende: medir al menos un parámetro de una o más porciones discriminadas parcialmente o completamente separadas o aisladas de más de una isoforma de la dipeptidil peptidasa (DDP) IV (DPPIV) a partir de la muestra de un paciente, en el que el al menos un parámetro es la cantidad, la concentración, la actividad, la expresión o el tipo o la cantidad de la modificación post-traduccional de la más de una isoforma de la DPPIV; y correlacionar dicho parámetro medido de la DPP de la más de una isoforma de la DPPIV con la presencia, la ausencia o la gravedad de dicha enfermedad.

Description

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fracciones pueden ser analizadas adicionalmente a través de cualquiera de los ensayos descritos para su uso después del isoelectroenfoque, es decir, una SDS-PAGE, a separación de segunda dimensión en un chip plano y ensayos de la actividad enzimática.
La discriminación y la medición no están limitadas a ningún orden en particular. La discriminación puede tener lugar antes o después de la medición del parámetro, o junto con la medición. Por ejemplo, la DPP específica puede ser separada físicamente en porciones mediante el uso de un procedimiento tal como una electroforesis, y después pueden medirse uno o más parámetros de algunas o de todas las porciones.
Alternativamente, cuando la medición y la discriminación se realizan a la vez, la DPP específica puede ser discriminada en porciones, por ejemplo, poniendo en contacto la muestra del paciente con anticuerpos específicos para las diferentes isoformas de la DPP, estando unido cada uno de los anticuerpos a un marcador detectable diferente, mientras que se miden las señales de cada marcador detectable.
En otra forma de realización, las porciones o las isoformas pueden ser discriminadas mediante el uso de un sistema de detección doble. Por ejemplo, pueden ponerse en contacto las isoformas de la DPP con un anticuerpo unido a una fase sólida que se une a todas o a la mayoría de las isoformas de la DPP y uno o más anticuerpos o lectinas específicos para una porción más pequeña de las isoformas de la DPP. Cada uno de los anticuerpos o lectinas más específicos contienen un marcador detectable único. Las isoformas pueden ponerse en contacto con ambos anticuerpos, o con el anticuerpo y las lectinas simultáneamente o en cualquier serie, por ejemplo, ponerse en contacto con el anticuerpo unido y después con el anticuerpo / lectina más específico, o con el anticuerpo / lectina más específico y después con el anticuerpo unido.
Las DPP pueden ser discriminadas en dos o más porciones. El número de porciones depende del grado de discriminación deseado, y del procedimiento de discriminación realizado. No hay ninguna limitación sobre el número de porciones en las que pueden discriminarse las DPP, pero, por ejemplo, las DPP pueden discriminarse en 2 o más porciones, tal como en 2, en 3, en 4, en 5, en 6, en 7, en 8, en 9, en 10, en 11, en 12, en 18, en 24, en 36, en 48, en 96, en 100, en 200, en 300, en 384, en 400, en 500 o en 1.536 porciones. Por ejemplo, en algunas formas de realización, es conveniente discriminar las isoformas de la DPP en, por ejemplo, 96 porciones, para permitir la manipulación y la medición del parámetro en placas estándar de 96 pocillos.
Para una completa discriminación de las isoformas, cada porción de DPP no debería contener más de una isoforma de la DPP, y algunas porciones pueden no contener ninguna isoforma de la DPP. Para una discriminación parcial de las isoformas, al menos una porción de las DPP debería contener más de una isoforma de la DPP, mientras que otras porciones pueden no contener ninguna isoforma de la DPP, una isoforma de la DPP, o más de una isoforma de la DPP.
En ciertas formas de realización de la invención, las muestras de pacientes se obtienen a partir de un individuo en más de un punto temporal. Dicha toma de muestras "en serie" es muy adecuada para la determinación de la aparición temprana de las típicas anomalías médicas, y facilita por tanto unas estrategias terapéuticas de remedio más tempranas que podrían dar lugar a un tratamiento más eficaz de la enfermedad o incluso a la evitación de la enfermedad. Dicha toma de muestras en serie también es muy adecuada para los aspectos de la invención relacionados con la monitorización de la progresión de una enfermedad, por ejemplo, de la diabetes de tipo II, en un paciente. Esto es especialmente útil para la evaluación de la eficacia de cualquier tratamiento que pueda estar siguiendo el paciente en relación con la enfermedad. La toma de muestras en serie o la toma de muestras repetida también puede ser útil para la determinación del riesgo individual de desarrollar la enfermedad o la afección.
La toma de muestras en serie puede ser llevada a cabo con cualquier cronología deseada, tal como cada hora, dos veces al día, una vez al día, una vez a la semana, una vez al mes, una vez al trimestre (es decir, cada tres meses), dos veces al año, una vez al año, una vez cada dos años o menos frecuentemente. La comparación entre los niveles medidos y el nivel de referencia puede llevarse a cabo cada vez que se mide una muestra nueva, o pueden conservarse los datos relativos a los niveles para un análisis menos frecuente.
La medición o la discriminación tiene lugar preferiblemente ex vivo o in vitro. En una forma de realización, tanto la medición como la discriminación tienen lugar ex vivo.
Como apreciará el experto en la materia, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden incluir la medición de cualquiera de una diversidad de parámetros de la DPP o que no son de la DPP (que pueden ser o no parámetros relacionados con la enfermedad) para determinar la integridad y/o las características de la muestra del paciente. Por ejemplo, pueden medirse los niveles de estrógenos, que generalmente son mayores en las hembras, como un marcador de género, u otras mediciones de la química sanguínea tales como los niveles de colesterol.
Pueden medirse otros parámetros relacionados con enfermedad que no son de la DPP para confirmar el diagnóstico
o el pronóstico. En algunas formas de realización, el parámetro que no es de la DPP es el nivel de hemoglobina A1C, y la enfermedad es la diabetes. Unos niveles de hemoglobina A1C por debajo del 7 % de la hemoglobina global son indicativos de ausencia de diabetes; unos niveles por encima del 7 % de la hemoglobina global son indicativos de la presencia de diabetes. El parámetro que no es de la DPP puede medirse antes o después del parámetro de la DPP, o pueden medirse simultáneamente.
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Con objeto de correlacionar el parámetro medido de la DPP con un estado patológico o una afección, el parámetro medido de la DPP puede compararse con una referencia, es decir, un estándar o un control interno. Un aumento, una disminución o un cambio en el parámetro de la DPP, tanto individualmente como aditivamente, en comparación con una referencia, tanto positiva como negativa, puede correlacionarse con un estado patológico.
Alternativamente, puede compararse el parámetro de la DPP de una porción de las enzimas discriminadas con un parámetro de otra porción de enzimas discriminadas, o puede compararse con la medición total de dos o más porciones discriminadas.
Por supuesto, el parámetro medido debería compararse con un parámetro correspondiente. Por ejemplo, si se mide la cantidad de DPP, entonces el valor de la cantidad de DPP debería compararse con el valor de la cantidad de DPP de una referencia o de otra porción. Si se mide la expresión de la DPP, debería compararse con la expresión de la DPP de una referencia o de otra porción.
En ciertas formas de realización, se mide el parámetro de un intervalo continuo de porciones. Por ejemplo, para las isoformas separadas según su punto isoeléctrico, pueden medirse uno o más parámetros de dos o más porciones que se separan a un pH o a unos puntos isoeléctricos adyacentes.
Puede obtenerse un perfil del (los) parámetro(s) medido(s) a lo largo del intervalo continuo de porciones. Alternativamente, puede obtenerse un perfil del (los) parámetro(s) medido(s) basándose en las mediciones de un intervalo no continuo de porciones. El perfil puede basarse en todas las porciones o puede basarse en un subconjunto de porciones.
Las diversas comparaciones que pueden realizarse entre las diversas porciones para determinar la correlación con un estado patológico son numerosas. Las técnicas para el análisis de los datos de los parámetros medidos o para comparar los datos con otros datos son bien conocidas por el experto en la materia. Consecuentemente, todas estas técnicas no se analizan con detalle en el presente documento. Una técnica ejemplar para el análisis de los datos con objeto de extraer la conclusión deseada (es decir, la presencia o la ausencia de un estado patológico) está ilustrada mediante referencia a la gráfica de la Fig. 14. En la Fig. 14, el eje y representa el nivel de un parámetro de la DPP (por ejemplo, la actividad, la expresión, la cantidad, la concentración, el tipo o la cantidad de modificación posttraduccional). El eje x representa la dimensión de discriminación (por ejemplo, el pI, el pH o el tipo de isoforma).
En referencia a la gráfica, se destacan tres áreas, el área "a," el área "b" y el área "c." Para cada área, puede medirse la medición total en un intervalo (por ejemplo, el área bajo la curva para un intervalo dado), proporcionando los valores "a" y "b", totalizando el valor "c". Otros valores que pueden medirse incluyen el valor del pico en un intervalo, el punto en el cual se alcanza el valor del pico en un intervalo, la actividad específica en cualquier punto del intervalo (por ejemplo, a un pI o pH específico), los puntos en los cuales el parámetro medido aumenta o disminuye (por ejemplo, un punto de inflexión), los cambios en el parámetro medido a lo largo del eje x en comparación con otras mediciones, y cualquier combinación de los mismos. Los valores pueden calcularse basándose en un perfil obtenido mediante la medición de un intervalo continuo de porciones, o pueden calcularse basándose en las mediciones de una única porción o de una pluralidad de porciones.
Con objeto de correlacionar un estado patológico con una de las mediciones, se podría comparar el intervalo "a" de valor(es) con el intervalo "b" de valor(es); el intervalo "a" de valor(es) con el intervalo "c" de valor(es); el intervalo "b" de valor(es) con el intervalo "c" de valor(es); el intervalo "a" de valor(es) con un control interno o con un estándar; el intervalo "b" de valor(es) con un control interno o un con estándar; y/o el intervalo "c" de valor(es) con un control interno o un con estándar.
Alternativamente, pueden realizarse mediciones cuantitativas individuales en cualquier intervalo o en cualquier proporción de dichas mediciones cuantitativas asociadas con una dimensión o dimensiones dadas de discriminación, y compararse con unos valores de referencia o con intervalos de valores conocidos para dichas mediciones, habiéndose establecido el intervalo de referencia a través de ensayos clínicos para proporcionar una escala con la cual se determine la presencia, la ausencia o la gravedad de la enfermedad. Las mediciones cuantitativas también pueden estar complementadas con la inclusión de un estándar interno o externo, realizarse simultáneamente o en serie con la dimensión de discriminación (por ejemplo, discriminaciones de la isoforma) que puede usarse para normalizar la lectura cuantitativa de los intervalos de referencia preestablecidos.
Según se usa en el presente documento, el término "estándar" se refiere a un valor, generalmente un valor promedio, mediano o medio, obtenido a partir de un segmento de la población. El estándar puede ser un estándar positivo o un estándar negativo, y puede obtenerse a partir de una población de edades emparejadas. Las poblaciones de edades emparejadas (a partir de las que pueden obtenerse los valores estándar) son idealmente de la misma edad que el individuo que se va a ensayar, pero también son aceptables poblaciones de edades aproximadamente emparejadas. Las poblaciones de edades aproximadamente emparejadas pueden ser de entre 1 20 años, incluyendo de aproximadamente 1, de aproximadamente 5, de aproximadamente 10, de aproximadamente 15 o de aproximadamente 20 años de la edad del individuo ensayado, o pueden ser grupos de diferentes edades que engloban la edad del individuo que se está ensayando. Las poblaciones de edades aproximadamente emparejadas pueden estar en incrementos de 2, de 3, de 4, de 5, de 6, de 7, de 8, de 9 o de 10 años (por ejemplo,
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Según se describe en el presente documento, los parámetros pueden medirse cuantitativamente (valores absolutos)
o cualitativamente (valores relativos). Los respectivos niveles del (los) parámetro(s) de la DPP relacionados con la enfermedad para una valoración dada pueden solapar o no. Según se describe en el presente documento, para algunas formas de realización, los datos cualitativos indican un nivel dado de estado patológico (leve, moderado o grave) y en otras formas de realización, los datos cuantitativos indican un nivel dado de estado patológico.
En ciertos aspectos de la invención, la comparación se realiza para determinar la magnitud de la diferencia entre los valores medidos y los de referencia, por ejemplo, la comparación del "número de veces" o porcentaje de diferencia entre el valor medido y el valor de referencia. Una diferencia en un número de veces que es aproximadamente 2 veces menor o mayor que una diferencia en número de veces mínimo sugiere o indica, por ejemplo, la presencia de una enfermedad. Una diferencia en un número de veces puede ser determinada mediante la medición de la cantidad absoluta, de la concentración, de la actividad o de la expresión de una DPP, y la comparación con el valor absoluto de una referencia, o puede medirse una diferencia en el número de veces mediante la diferencia relativa entre un valor de referencia y el valor de una muestra, cuando ningún valor es una medición de una cantidad, concentración, actividad o expresión absoluta, y/o cuando ambos valores se miden simultáneamente. Alternativamente, las diferencias en el número de veces pueden medirse dentro de los propios datos del ensayo, por ejemplo, mediante la comparación del número de veces de diferencia de "a’ con respecto a "c’ en comparación con "b" con respecto a "c",
o cualquier otra proporción de parámetros mensurables del sistema de ensayo. Consecuentemente, la magnitud de la diferencia entre el valor medido y el valor de referencia que sugiere o que indica un diagnóstico en particular dependerá del parámetro en particular que se está midiendo para producir el valor medido, y del valor de referencia usado.
Según se describe en el presente documento, existe una correlación entre el perfil de actividad de la DPP-IV obtenido a partir de un intervalo continuo de isoformas de la DPP-IV separadas por el pI, y la presencia, la ausencia
o la gravedad de la diabetes de tipo II. Esta correlación se usa en un procedimiento para el diagnóstico o el pronóstico de la diabetes de tipo II que comprende la medición de uno o más parámetros de la DPP-IV de porciones discriminadas de la DPP-IV a partir de la muestra de un paciente, y correlacionando dicho parámetro medido de la DPP-IV con la presencia, la ausencia o la gravedad de la diabetes de tipo II en el paciente. En ciertas formas de realización, el parámetro de la DPP-IV es la actividad de la DPP-IV. En ciertas formas de realización, las porciones de la DPP-IV son discriminadas según su pI.
El parámetro de la DPP-IV puede compararse con un estándar poblacional o con un control interno. Cualquier diferencia con respecto a un estándar poblacional negativo o un control interno negativo puede ser correlacionada con la presencia o la gravedad de la diabetes. Cuanto mayor sea el grado de diferencia entre el parámetro medido de la DPP-IV y la referencia negativa, más grave será el pronóstico. Asimismo, cualquier diferencia con respecto a un estándar poblacional positivo o un control interno positivo puede ser correlacionada con la ausencia de diabetes. Como se ha analizado anteriormente, algunos parámetros incluyen la actividad, la cantidad, la expresión o la concentración.
Las porciones de la DPP-IV pueden ser discriminadas mediante cualquier característica o procedimiento divulgados en el presente documento. En algunas formas de realización ejemplares, las porciones de la DPP-IV son discriminadas según su pI. En ciertas formas de realización, las porciones de la DPP-IV se separan mediante una electroforesis de flujo libre.
La Fig. 10 muestra la comparación entre el perfil de actividad de la DPP-IV entre porciones discriminadas según su pI de la DPP-IV en plasma procedentes de un paciente sano y de uno diabético. Los presentes inventores han demostrado que, en los pacientes diabéticos, el perfil de actividad de la DPP-IV cambia a un mayor pH. Cualquier diferencia en el perfil de actividad de la DPP-IV en cualquier punto o puntos con respecto al valor de cualquier paciente sano mostrada aquí, o cualquier diferencia en el perfil de actividad de la DPP-IV en cualquier punto o puntos con respecto al valor obtenido a partir de un control negativo interno o de un estándar poblacional, puede ser correlacionada con la diabetes.
Por lo tanto, un cambio en el perfil de actividad de la DPP-IV con respecto al estándar negativo mostrado en el presente documento, o al estándar poblacional negativo hacia un pH mayor, es indicativo de diabetes. Asimismo, un cambio en el perfil de actividad de la DPP-IV con respecto a un control negativo de control hacia un pH mayor es indicativo de la presencia de diabetes de tipo II. Cuanto más pronunciado sea el cambio en el perfil de actividad, más grave será la enfermedad.
Un estándar positivo asociado con una medición "opuesta" extrema de una muestra o población sana puede ser representado por la medición de la isoforma más extrema en el intervalo de pI en cuestión. Dicho estándar positivo podría ser establecido, por ejemplo, mediante el tratamiento de la muestra del paciente con procedimientos químicos
o enzimáticos para eliminar completamente todas las glucosilaciones, en el caso de que la ausencia completa de todos los glucanos representara la condición de la isoforma mensurable más alejada de las isoformas contenidas en las muestras sanas típicas. Debería apreciarse que una isoforma extrema resultante de este tratamiento nunca puede ser realmente posible en las muestras reales, pero todavía puede usarse para establecer el intervalo más lejano posible de pH, con el fin de proporcionar un control mensurable para el ensayo. Como alternativa, esta isoforma positiva "extrema" podría ser un control externo, que podría medirse por separado o medirse después de
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La Fig. 13 muestra el pH al cual la actividad acumulada de las porciones discriminadas según su pI de la DPP-IV procedentes de pacientes individuales alcanzó el 60 % de la actividad total, comenzando la suma de la actividad de las isoformas en el extremo ácido del intervalo de pH medido. Los pacientes sanos alcanzaron el 60 % de la actividad de la DPP-IV a aproximadamente un pH de 3,9. Por el contrario, los pacientes diabéticos no alcanzaron el 60 % de la actividad de la DPP-IV pasta aproximadamente un pH de 4,15 y superior. La actividad acumulada de la DPP-IV a partir de los pacientes enfermos no alcanzó el 60 % de la actividad total acumulada de la DPP-IV hasta que se tuvieron en cuenta las isoformas discriminadas a unos pH incluso mayores.
Por lo tanto, puede usarse el pH al cual la actividad acumulada de las porciones discriminadas según su pI de la DPP-IV procedentes de una muestra alcanza el 60 % de la actividad total de la muestra para correlacionar la medición de la actividad de la DPP-IV con la enfermedad. Por lo tanto, si el porcentaje de la actividad total de la DPP-IV de todas las porciones medidas del intervalo continuó presentes en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH a, y por debajo de, aproximadamente un pH de 4,15, no excede aproximadamente el 60 %, entonces se detecta la presencia de diabetes. Si al menos aproximadamente el 40 % de la actividad total de la DPP-IV de todas las porciones medidas del intervalo continuo está presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de un pH a, y por encima de, aproximadamente un pH de 4,15, entonces se detecta la presencia de diabetes. Cuanto mayor sea el pH por encima de un pH de 4,15 al que se alcanza un 60 % de la actividad, será indicativo de un pronóstico más grave.
Si al menos aproximadamente el 60 % de la actividad total de la DPP-IV de todas las porciones medidas del intervalo continuo está presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH a, y por debajo de, aproximadamente un pH de 3,9, entonces se detecta la ausencia de diabetes Si el porcentaje de actividad total de la DPP-IV de todas las porciones medidas del intervalo continuo presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH a, y por encima de, aproximadamente un pH de 3,9, no excede aproximadamente el 40 %, entonces se detecta la ausencia de diabetes.
EJEMPLO 1
Mediante el uso de la electroforesis en forma libre (FFE) (sistema de electroforesis de flujo libre BD™), que separa las proteínas según su carga, se separaron las isoformas de la DPP-IV en porciones y se caracterizaron. Se prefiere el aislamiento de las isoformas de las proteínas para el análisis del papel de las modificaciones específicas sobre la actividad. El análisis de la actividad indica que el aumento en la actividad específica se correlaciona con un aumento en el pI de la isoforma. Esto sugiere que las modificaciones post-traduccionales pueden jugar un papel en la regulación de la actividad de la DPP-IV. La FFE puede facilitar estudios adicionales que pueden correlacionar la(s) modificación(es) de la enzima con el estado patológico.
La FFE se realizó mediante el uso del sistema de electroforesis de flujo libre BD™ como sigue: se obtuvo DPP-IV porcina en Sigma™ (1 -100 mg) se diluyeron (generalmente a 1:5) en un medio de separación con un pH apropiado. Las proteínas diluidas se cargaron después en la entrada de muestras más catódica de la cámara de FFE Becton™, y se separaron mediante la aplicación de 1.200 -1.500 V y de 20 -25 mA, con un caudal medio de separación de aproximadamente 60 ml/h mediante el uso de un gradiente de pH de 3 -10.
Los tampones y los medios para el isoelectroenfoque (IEF)-FFE se prepararon de acuerdo con los protocolos de los fabricantes (manual de aplicación de la FFE de Becton™) mediante el uso de las condiciones naturales, con un gradiente de pH de 3 -10. La electroforesis en gel de poliacrilamida con isoelectroenfoque (PAGE) (IEF) se llevó a cabo con geles hechos a medida con T:4 %, o mediante el uso de blancos Precoats™ (Serva) equilibrados al intervalo de pH apropiado. Se realizó una tinción con plata para detectar las bandas proteicas, y el resultado se muestra en la Fig. 3.
Los ensayos de actividad se llevaron a cabo como sigue: se añadieron 45 μl de tampón de ensayo (Tris-Cl 100 mM [pH 8,0]; 0,05 % v/v de DMSO) a una muestra de proteína de 5 μl, y se midió el aumento en la fluorescencia a partir del T inicial. La actividad se expresó como el incremento en las unidades de fluorescencia relativa (RFU)/min resultantes de la hidrólisis del sustrato de Gly-Pro-AMC (250 μM) a 30 ºC. Los resultados se muestran en las Figs. 2 A y2 B.
La digestión de las proteínas con tripsina se realizó mediante la escisión de las bandas teñidas con Sypro Ruby que fueron visualizadas después de la PAGE (IEF) o de la SDS-PAGE y la posterior digestión de acuerdo con las recomendaciones del kit (Pierce/Sigma).
La desorción / ionización de la matriz asistida por láser (MALDI) MS se llevó a cabo como sigue: los péptidos digeridos "in gel" se extrajeron (según las indicaciones) y se limpiaron mediante el uso de puntas de pipeta ZipTip® (Millipore). Los péptidos digeridos se mezclaron a 1:1 con matriz (solución saturada de ácido α-ciano-4hidroxicinámico en acetonitrilo al 60 %) y se puntearon en un objetivo de acero inoxidable (Bruker Daltonics).
Se usaron las huellas de masa peptídica (PMF) del tiempo de vuelo de la MALDI (TOF) iniciales para la identificación de las proteínas digeridas, seguido de una identificación mediante TOF / TOF de los péptidos específicos (ambas mediante el uso de Mascot). Los resultados se muestran en las Figs. 4 A y 4 B.
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E07753293
09-10-2015
EJEMPLO 2
Los experimentos descritos en el Ejemplo 2 siguieron al mismo protocolo presentado en el Ejemplo 1, excepto porque la muestra proteica derivaba de plasma humano procedente de pacientes sanos.
Las muestras de plasma humano (anticoaguladas con EDTA) se obtuvieron a partir de dos individuos, y las isoformas de la DPP-IV se separaron en porciones según se ha descrito en el Ejemplo 1. La actividad se midió como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se analizaron los patrones de la actividad de la DPP-IV para observar si existía un perfil de actividad similar al de las isoformas porcinas de la DPP-IV. Los resultados se presentan en las Figs. 6 A y 6
B.
A partir de los resultados indicados en las Figs. 6 A y 6 B, se observó una diseminación de la actividad similar a la observada con la DPP-IV porcina para la actividad de la DPP-IV en plasma humano. Se observó un aumento de la actividad a los valores de pH más altos (con un máximo aproximadamente a un pH de 5,2). Sería necesaria una cuantificación precisa de la proteína (DPP-IV) para la determinación de la actividad específica.
En los Ejemplos 1 y 2 se demuestra que las isoformas de las proteínas pueden ser separadas mediante el uso de una FFE (IEF), y se permite la caracterización bioquímica de las isoformas separadas. El modelo porcino de DPP-IV muestra múltiples isoformas (identificadas mediante el uso de una espectrometría de masas) que muestra las diferentes actividades específicas. La DPP-IV humana (separada del plasma) muestra una tendencia similar cuando es analizada después de una FFE. Las modificaciones post-traduccionales (PTM) pueden jugar un papel en la regulación de la actividad específica de la DPP-IV. La FFE puede facilitar la identificación y las implicaciones de las potenciales PTM para las isoformas individuales de la DPP-IV, así como para otras proteínas.
La DPP-IV se midió como se ha descrito previamente. Los resultados, presentados en las Figs. 6 A y 6 B, cuando se comparan con los resultados de los experimentos con la DPP-IV porcina, indican que la DPP-IV humana muestra una tendencia de actividad similar cuando es analizada después de la FFE, al igual que la similarmente analizada DPP-IV porcina.
Tomados en conjunto, los resultados de los ejemplos 1 y 2 sugieren que las modificaciones post-traduccionales (PTM) pueden jugar un papel en la regulación de la actividad específica de la DPP-IV, y que la FFE puede facilitar la identificación y las implicaciones de las potenciales PTM en las isoformas individuales de la DPP-IV, así como en otras proteínas.
EJEMPLO 3
Los experimentos descritos en el Ejemplo 3 siguieron el mismo protocolo al presentado en el Ejemplo 1, excepto por que la muestra proteica derivaba de plasma humano, y el IEF se llevó a cabo con un gradiente de pH de 3 -7. Específicamente, se obtuvieron 2 muestras de plasma humano tratadas con heparina, una de una persona con diabetes de tipo 2 (nivel de glucosa de 538 mg/dl) y otra de una persona sana.
Los resultados, presentados en las Figs. 7 y 8, indican que la muestra diabética presenta un perfil de una isoforma de la DPP con un mayor intervalo isoeléctrico.
EJEMPLO 4
Se discriminó el plasma de cuatro pacientes sanos y de cinco diabéticos según su pI. La FFE se llevó a cabo mediante el uso de la cámara de FFE Becton™ como sigue: se mezclaron 25 μl de plasma (diluido a 1:8) con 25 μl de glicerol, 25 μl de HPMC al 0,08 %, 125 μl de tampón de separación a pH 3 -7. Después se cargaron las proteínas diluidas en la entrada de muestras más catódica de la cámara de FFE Becton™, y se separaron mediante un isoelectroenfoque a intervalos (IIEF)-FFE mediante el uso de las condiciones naturales y a un intervalo de pH de 3 7 con la aplicación de 1.200 -1.500 V y de 20 -25 mA. El IIEF-FFE se llevó a cabo a 10 ºC con un tiempo de residencia que totalizaba 64 minutos. Se usó un caudal de tampón de 50 ml/h en intervalos de 5 minutos (5 minutos hacia delante, después 5 minutos hacia atrás) totalizando 60 minutos. La aplicación de la muestra se realizó a 6.000 μl/h durante 2 min con un caudal medio de 180 ml/h durante la aplicación de la muestra. Después de la aplicación de la muestra se aplicó el voltaje y el caudal medio se estableció para que fluyera a 50 ml/h en intervalos de 5 minutos (5 min hacia delante, después 5 min hacia atrás) totalizando 60 min. La muestra se recogió después de la separación por intervalos mediante el aumento del flujo de tampón hacia delante hasta 300 ml/h durante 2 minutos, pausando y recolectando después durante 2 minutos en 96 pocillos. La actividad de la DPP-IV se ensayó según se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en las Figs. 10 y 11.
En la Fig. 10, las barras claras representan el valor obtenido a cada pI de un paciente sano, y las barras oscuras representan el valor promedio obtenido a cada pI de un paciente diabético.
Se observan los picos principales en los pacientes sanos, aproximadamente a un pH de 3,9 y aproximadamente a un pH de 4,1. Asimismo, se observan dos picos principales en los pacientes diabéticos, aproximadamente a un pH de 4,4 y aproximadamente a un pH de 4,8. El perfil plasmático diabético se ha desplazado hacia el pH mayor, o a la derecha del perfil plasmático de los pacientes sanos.
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