MX2008011665A - Diagnóstico y pronóstico de los estados patológicos asociados a la dipeptidil-peptidasa. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para la diagnosis y prognosis de un estado de enfermedad, que comprende la medición de un parámetro de dipeptidil-dipeptidasas discriminadas de una muestra de paciente, y la correlación del parámetro con una enfermedad.

Description

DIAGNÓSTICO Y PRONÓSTICO DE LOS ESTADOS PATOLÓGICOS ASOCIADOS A LA DIPEPTIDIL-PEPTIDASA REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reivindica los beneficios a la fecha de presentación de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos N° 60/781.924, presentada en 13 de marzo de 2006, titulada "Método de Diagnosticar Enfermedades por el Perfil de Isoformas", la Solicitud Provisional de los Estados Unidos N° 60/804.397, presentada el 9 de junio de 2006, titulada "Separación y Caracterización de Isoformas de Dipeptidil Peptidasa IV usando Electroforesis de Flujo Libre (FFE)", y de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos, N° desconocido (Expediente N° P-7148), presentada el 2 de marzo de 2007, titulada "Separación y Caracterización de Isoformas y/o Isoenzimas de Dipeptidil Peptidasa IV usando Electroforesis (de Flujo Libre) de Matriz", la totalidad de cuyas descripciones se incorporan como referencias a este documento . CAMPO TÉCNICO La invención se refiere, en general, 1 diagnóstico y pronóstico de enfermedades o trastornos. TÉCNICA ANTERIOR Los actuales métodos para evaluar el riesgo de sufrir o diagnosticar enfermedades se basan, a menudo, en un diagnóstico por eliminación, un proceso de eliminación, o por cirugía o biopsias invasivas. Incluso después de establecer el diagnóstico definitivo, el pronóstico suele estar basado en factores subjetivos. En determinadas enfermedades tales como las metabólicas, los métodos por los que se puede establecer un diagnóstico objetivo son con frecuencia engorrosos, consumen mucho tiempo y son costosos. Por ejemplo, el método principal para diagnosticar la diabetes de tipo 2 es 1 ensayo de glucosa plasmática en ayunas, que evalúa los niveles de azúcar en el plasma sanguíneo. Este ensayo requiere que el paciente se mantenga en ayunas durante 8-14 horas y, a menudo, exige múltiples extracciones de sangre durante un período de horas a días. Además, y aun cuando el ensayo de glucosa plasmática en ayunas es útil para el diagnóstico de la presencia de la diabetes de tipo 2, la capacidad del ensayo para ofrecer un pronóstico de la enfermedad es muy limitada. En medicina, existe una búsqueda constante de formas menos invasivas, físicamente menos onerosas y más precisas de diagnosticar y tratar enfermedades y trastornos. A medida que avanza la comprensión de los procesos biológicos, y la bioquímica asociada a los mismos, han evolucionado algunas teorías acerca de qué composiciones pueden ser identificadas como marcadoras o indicadoras de determinadas enfermedades o trastornos. Se ha analizado la utilidad de las proteasas y peptidasas, como clase, en el diagnóstico y como dianas para tratar pacientes. Sobre la base de antecedentes generales, las proteasas/peptidasas se han clasificado típicamente de acuerdo con una serie de criterios tales como sitio de acción, preferencia por sustratos, y mecanismos. Por ejemplo, la aminopeptidasa actúa preferentemente en los residuos N-terminales de un polipéptido, las carboxipeptidasas lo hacen en el extremo C-terminal, y las endopeptidasas actúan en regiones situadas entre estos dos extremos. Las dipeptidil peptidasas (DPPs) son peptidasas que escinden específicamente una unidad dipeptídica, es decir, una unidad compuesta por dos aminoácidos, a partir de sus sustratos específicos. Existe una serie de DPPs diferentes, y la preferencia por sustrato se expresa con frecuencia en términos del residuo aminoácido inmediatamente N-terminal con respecto al sitio de escisión. Por ejemplo, DPP-I (IUBMB Enzyme Nomenclature EC 3.4.14.1) es una peptidasa lisosómica de tipo cisteína que libera un dipéptido N-terminal, Xaa-Yaa- I - Zaa, excepto cuando Xaa es Arg o Lys, o Yaa o Zaa es Pro. DPP-II ( IUBMB Enzyme Nomenclature EC 3.4.14.2) es una peptidasa lisosómica de tipo serina que libera un dipéptido N-terminal , Xaa-Yaa- | -, preferentemente cuando Yaa es Ala o Pro. DPP-III {IUBMB Enzyme Nomenclature EC 3.4.14.3) es una peptidasa citosólica que posee una amplia actividad sobre péptidos, aunque es altamente selectiva para Arg-Arg-Z, es donde Z es cualquier aminoácido, a pH 9,2. DPP-IV (IUBMB Enzyme Nomenclature EC 3.4.14.4) es una peptidasa de tipo serina, unida a la membrana, que libera un dipéptido N-terminal de Xaa-Yaa- | - Zaa-, preferentemente cuando Yaa es Pro, con la condición de que Zaa no sea Pro ni hidroxiprolina . Las DPPs intervienen en una extensa gama de actividad fisiológicamente importante, y se han asociado con la regulación del sistema neurológico, del sistema endocrino, del sistema inmunológico y del sistema digestivo. La actividad de DPP se ha puesto de manifiesto es numerosas funciones intra- y extracelulares tales como degradación de proteínas y activación enzimática. En relación con las DPPs específicas mencionadas anteriormente, la DPP-IV ha sido extensamente estudiada, junto con sus isoformas e isoenzimas u homólogos estructurales relacionados, y con aquellas proteínas que exhiben una actividad semejante a la de DPP-IV. Las proteínas que exhiben una actividad semejante a la de DPP-IV se han denominado actividad y/u homólogos estructurales dipeptidil peptidasa IV, o " DASH" (en sus siglas en inglés) . La DPP-IV es una proteína de membrana tipo II a la que se hace referencia con una variedad de nombres que incluyen, sin estar limitados a ellos, DPP4, DP4, DAP-IV, FAP ß, proteína 2 complejante de adenosin-desaminasa, proteína fijadora de la adenosin-desaminasa (ADAbp) , dipeptidil aminopept idasa IV; dipept idil-aminopept idasa Xaa-Pro; Gly-Pro naftilamidasa ; dipeptidil aminopept idasa IV post-prolina ; antígeno linfocitario CD26; glicoproteína GP110; dipeptidil peptidasa IV; glicil-prolina aminopeptidasa ; X-prolil dipeptidil aminopeptidasa; pep X; antígeno leucocitario CD26; glicil-prolil dipeptidilaminopeptidasa; dipeptidil-péptido hidrolasa; glicilprolil aminopeptidasa; dipeptidilaminopeptidasa IV; DPP IV/CD26; amino acil-prolil dipeptidil aminopeptidasa; molécula desencadenante de células T Tpl03; X-PDAP. (Burgess y col., Pat. EE.UU. N° 7.169.926) . Se ha informado sobre una serie de proteínas DASH tales como seprasa, la proteína a de activación de fibroblastos, DPP6, DPP8, DPP9, atractina, dipeptidasas ácidas N-acetiladas y a-enlazadas I, II y L, Prolina dipeptidasa de células quiescentes, serin proteasa especifica del timo y DPP IV-ß (Busek y col., Int. J. Biochem. Cell Biol . 36:408-421 (2004) ) . La DPP-IV se expresa de forma constitutiva en las células epiteliales y endoteliales de una variedad de tejidos diferentes, incluidos el intestino, hígado, pulmón, riñon y placenta (Hartel y col., Histochemistry 89 (2): 151-161 (1988); Yaron y Naider, Crítical Rev. Biochem. Mol. Biol. 28 (1) : 31-31 1993) ) . La DPP-IV se expresa en los linfocitos T circulantes y se ha demostrado que es sinónimo del antígeno de superficie celular CD26 (Sedo y col., Arthritis Res. Ther. 7:253-269 (2005) ) . Además de una forma unida a la membrana, la DPP-IV existe también en una forma soluble, y se puede detectar actividad DPP-IV en fluidos corporales tales como plasma sanguíneo y líquido sinovial (Sedo y col., Arthritis Res. Ther. 7:253-269 (2005); Gorrell, Clinical Sci. 108:211-292 (2005)) . Se cree que la DPP-IV juega un papel importante en el metabolismo de los neuropépt idos , la activación de células T, la adhesión celular, la digestión de péptidos que contienen prolina en el riñon y los intestinos, la infección por VIH y la apoptosis, así como en la regulación de la tumorigenicidad de ciertas células del melanoma (Mattem y col., Scand. J.

Immunol. 33:131 (1991) ; Pethiyagoda y col., Clin. Exp.

Metástasis 18 (5) : 391-400 (2000)) . Los sustratos naturales de DPP-IV incluyen varios quimioquinas , citoquinas, neuropépt idos , hormonas circulantes y péptidos bioactivos (Lambeir y col., J. Biol. Chem. 276(32) : 29839-29845 (2001)) . Se ha sugerido que la DPP-IV desempeña un papel clave en la regulación del metabolismo de las hormonas peptidicas y en el transporte de aminoácidos (Hildebrandt y col., Clin. Sci . (Lond.) 99(2) :93-104 (2000)) .

La expresión de DPP-IV aumenta en las células T tras la estimulación mitogénica o antigénica, lo que parece indicar una función en el sistema inmunológico (Mattem y col., Scand.

J. Immunol. 33:131 (1991)) . Asimismo, se ha demostrado que otras diversas funciones de los linfocitos T tales como la producción de citoquinas, la proliferación celular mediada por IL-2 y la actividad auxiliar de las células B, son dependientes de la actividad de DPP-IV (Schon y col., Scand.

J. Immunol. 29:121 (1989)) . Adicionalmente , la DPP-IV parece tener una función co-estimulante durante la activación y proliferación de las células T (von Bonin y col., Immunol.

Rev. 161:43-53 (1998)) . La DPP-IV interviene en otros procesos biológicos, incluida una función de anclaje a la membrana para la localización de la enzima extracelular adenosin desaminasa (ADA) (Franco y col., Immunol. Rev. 161:21-42 (1998)) y la participación en la adhesión a la matriz celular por medio de su unión al colágeno y la fibronectina (Loster y col., Biochem. Biophys. Res. Commun . 217 (1) : 341-348 (1995)). También se estima que la DPP-IV juega un papel en la regulación endocrina y la fisiología metabólica. Por ejemplo, la DPP-IV escinde el dipéptido His-Ala amino-terminal del péptido 1 semejante al glucagón (GLP-1), generando un antagonista del receptor de GLP-1, y de esta forma acorta la respuesta fisiológica al GLP-1. La DPP-IV se ha implicado en el control del metabolismo de la glucosa porque sus sustratos incluyen las hormonas insulinotrópicas GLP-1 y el péptido gástrico inhibitorio (GIP) , que resultan inactivados por la eliminación de sus dos aminoácidos N-terminales (Mannucci y col., Diabetologia 48:1168-1172 (2005)). . Además de su función fisiológica normal, se ha estudiado el papel de las DPPs en diferentes estados patológicos, incluidos el cáncer, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades metabólicas y las enfermedades infecciosas. Por ejemplo, se ha sugerido que la DPP-IV es una molécula de adhesión para las células de los carcinomas de mama con metástasis pulmonares y de próstata (Johnson y col., J. Cell. Biol. 121:1423 (1993)) . Se ha detectado una alta actividad de DPP-IV en homogenatos tisulares de pacientes con hipertrofia prostética benigna y en los prostasomas (Vanhoof y col., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 30:333 (1992)) . Se han detectado elevados niveles de expresión de DPP-IV en los fibroblastos de la piel humana en pacientes con las enfermedades autoinmunes psoriasis, artritis reumatoide (AR) y liquen plano (Raynaud y col., J. Cell. Physiol. 152:378 (1992) ) . La DPP-IV se ha asociado con una serie de enfermedades metabólicas tales como la obesidad, y con la regulación del apetito. Por ejemplo, una de las enfermedades metabólicas asociadas con la DPP-IV más extensamente estudiada es la diabetes de tipo 2. Mannucci y col. definen y describen las relaciones entre hiperglucemia crónica y DPP-IV en la diabetes. Esta investigación llega a la conclusión de que la actividad de DPP-IV circulante está directamente correlacionada con el grado de hiperglucemia en la diabetes de tipo II. Otros estudios analizan la relación entre DPP-IV y diversas hormonas que intervienen en la cascada hormonal que regula los niveles de azúcar en sangre. Estos estudios llegan a la conclusión de que la DPP-IV degrada una hormona que es importante para la secreción de insulina. De manera especifica, se ha señalado que la DPP-IV degrada el péptido 1 semejante al glucagón (GLP-1), lo que da como resultado una disminución de la secreción de insulina y, por lo tanto, un incremento del azúcar en sangre. Basándose en este fenómeno, se están desarrollando inhibidores de DPP-IV para el tratamiento de la diabetes de tipo II (Green y col., Diab. Vasc. Dis. Res. 3 (3) : 159-165 (2006) ) . Aparentemente, la DPP-IV es esencial para la penetración e infectividad de los virus VIH-1 y VIH-2 en las células T CD4 * (Wakselman y col., J. Dermatol. Sel. 22:152-160 (2000)) . Por lo tanto, se ha sugerido que la supresión de DPP-IV podría suprimir también este mecanismo. Recientemente, algunas vías de investigación de DPP se han centrado en la manipulación de los niveles de DPP como un medio para desarrollar tratamientos y terapias de los estados patológicos y trastornos asociados con la DPP. Sin embargo, y hasta la fecha, son pocos los tratamientos y terapias surgidos de estos trabajos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Todavía se está a la busca del desarrollo de terapias e instrumentos diagnósticos basados en la DPP y en su papel en procesos biológicos. Una realización de la invención que se describe en este documento se dirige un método para pronosticar o diagnosticar un estado patológico o trastorno asociado con la DPP. Específicamente, se miden uno o múltiples parámetros de porciones discriminadas de una DPP específica, y se correlaciona la medición con la presencia, ausencia o gravedad del estado patológico o trastorno. Otra realización de la invención que se describe en este documento se dirige a un método para pronosticar o diagnosticar un estado patológico o trastorno asociado con la DPP. Específicamente, se miden uno o múltiples parámetros de porciones discriminadas de isoformas de DPP, y se correlaciona la medición con la presencia, ausencia o gravedad del estado patológico o trastorno. Una realización adicional de la invención descrita se dirige a un método para diagnosticar o pronosticar una diabetes de tipo II. Específicamente, se mide al menos un parámetro de una o múltiples porciones discriminadas de isoformas de DPP-IV de la muestra de un paciente, y la medición se correlaciona con la presencia, ausencia o gravedad de la diabetes de tipo II. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fig. 1 muestra el flujo de trabajo de una separación de isoformas por electroforesis de flujo libre. Figs . 2A y B son gráficos que muestran los resultados de un ensayo de actividad de DPP-IV porcina después de IEF-FFE nativa. Fig. 2B muestra la actividad especifica (U/ng de enzima) de isoformas discriminadas de DPP-IV porcina. Fig. 3 es un gel de acrilamida de IEF teñido con plata de las fracciones 27 a 47 de una separación por FFE nativo (pH 3-10) de DPP-IV porcina. Figs. 4A y B muestran el análisis de huella peptidica de bandas de proteínas tripsinizadas escindidas de gel IEF para las isoformas más ácidas (4A) y ligeramente más básicas (4B) . El análisis de PMF identifica todas las isoformas como DPP-IV. Figs. 5A y B muestran la confirmación de picos seleccionados de DPP-IV con MALDI TOF / TOF. Figs. 6A y B muestran la actividad DPP-IV de isoformas de DPP-IV discriminadas por FFE del plasma humano en dos sujetos sanos. Fig. 7 muestra el perfil de actividad DPP-IV de isoformas discriminadas por FFE de un sujeto humano normal. Fig. 8 muestra el perfil de actividad DPP-IV de isoformas discriminadas por FFE de un sujeto humano diabético, con un nivel de glucosa de 538 mg/dl. Fig. 9 muestra un ejemplo del desvio del perfil de DPP-IV resultante de la desialilación de isoformas discriminadas por FFE de un paciente humano sano. La actividad se representa en RFU/min. Las barras oscuras representan la muestra tratada; las barras sombreadas representan la muestra no tratada. Fig. 10 muestra la comparación de actividad DPP-IV entre isoformas de DPP-IV discriminadas por pl en plasma de un paciente sano (barras claras) y uno diabético (barras oscuras), asi como las isoformas desialiladas de un paciente diabético (linea oscura) . La linea punteada representa el pH al que se discriminó cada porción. Fig. 11 es un trazado de evasión del pH frente a la actividad DPP-IV de las isoformas de DPP-IV discriminadas por pl entre pacientes sanos y diabéticos. S04, Sil, S07 y S02 son sanos; los restantes son diabéticos. Fig. 12 es un trazado del pH al que las isoformas de DPP-IV discriminadas por pl de cada sujeto alcanzan una actividad DPP-IV del 90%. S04, Sil, S07 y S02 son sanos; los restantes son diabéticos. Fig. 13 es un trazado del pH al que las isoformas de DPP-IV discriminadas por pl de cada sujeto alcanzan una actividad DPP-IV del 60%. S04, Sil, S07 y S02 son sanos; los restantes son diabéticos. Fig. 14 es un gráfico que muestra las diversas formas en las que los parámetros medidos de isoformas de DPP discriminadas pueden ser correlacionados con la enfermedad. MEJOR FORMA DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Los métodos descritos en este documento sirven para evaluar el riesgo, diagnosticar o pronosticar un estado patológico o trastorno asociado a la dipeptidil peptidasa (DPP) . En particular, los métodos descritos se refieren a un método para evaluar el riesgo, diagnosticar o pronosticar un estado patológico o trastorno asociado con un parámetro particular de DPP. De acuerdo con realizaciones del método descrito, se mide un parámetro de una porción discriminada de DPP. A continuación, se correlaciona la medición con la presencia, ausencia o gravedad de dicho estado patológico o trastorno . A los efectos de esta solicitud, los términos "proteasa" y "peptidasa" son intercambiables en su uso, y hacen referencia a enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces peptidicos de amina. Las dipeptidil peptidasas (DPPs) son proteasas que escinden una unidad dipeptidica de un polipéptido .

Tal como se usa en este documento, la expresión "porciones discriminadas de una DPP especifica" hace referencia a una DPP especifica (por ejemplo, una o múltiples isoformas de una familia especifica de DPP, por ejemplo, DPP-I, DPP-II, DPP-III, DPP-IV, etc.) de la muestra de un paciente que han sido distinguidas, separadas o aisladas entre si de alguna manera. En una realización, la DPP especifica se somete a alguna condición que distinguirá al menos una isoforma de la DPP especifica de al menos otra isoforma de la DPP. Cada porción discriminada puede contener una o múltiples isoformas de la DPP especifica, y algunas porciones pueden no contener isoformas de DPP. En otra realización, la DPP (que puede incluir DPP de una familia o más de una familia) se somete a alguna condición que distinguirá al menos una isoforma de la DPP de al menos otra isoforma de la DPP. De manera especifica, las isoformas individuales de DPP pueden ser completa o sólo parcialmente discriminadas en porciones y entre si. De esta manera, una porción discriminada puede contener una o múltiples isoformas, o cada porción discriminada puede contener únicamente una isoforma. De forma análoga, una porción discriminada puede contener una isoforma, en tanto que otras porciones contienen más de una isoforma. Además, algunas porciones discriminadas pueden no contener isoformas de DPP, con la condición de que una o múltiples porciones adicionales contenga (n) una o múltiples isoformas de DPP. Tal como se usa en este documento, el término "isoforma" de una DPP se refiere a una cualquiera de múltiples formas de una o más enzimas DPP que difieren entre si físicamente, pero teniendo todas ellas en común una actividad catalítica característica, una estructura primaria / secuencia de aminoácidos homologa, o se derivan de los mismos loci genéticos. La actividad catalítica de las isoformas de DPP no necesita ser idéntica en cuanto al grado o velocidad de catálisis, sólo en un perfil de sustrato común. De manera similar, la estructura primaria de las isoformas no necesita ser idéntica, sino que puede ser consecuencia de adiciones, deleciones o mutaciones menores en la secuencia de aminoácidos de la enzima. Las isoformas pueden tener una estructura primaria similar o idéntica, y pueden tener la misma actividad catalítica o actividad (es ) catalítica ( s ) diferentes. La estructura primaria de las isoformas puede diferir de manera significativa, aunque conservando la misma actividad catalítica. Las isoformas pueden tener una estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria igual o diferente, pero seguir siendo isoformas entre si mientras conserven una estructura primaria y/o actividad enzimática iguales o similares y/o sean derivadas de los mismos loci genéticos. Las isoformas pueden derivar del mismo locus genético, o de diferentes loci genéticos. Pueden ser resultado de diferentes alelos; múltiples loci genéticos; corte y empalme alternativos del ARN mensajero producido por el mismo gen; o el resultado de una modificación post-traslacional , tal como la adición de polisacáridos , fosfato, sulfhidrilo, ácido siálico u otros grupos. Las "isoformas", cuando se usan en este documento, incluyen también isozimas. Tal como se usa en este documento, el término "isozima" (o, alternativamente, "isoenzima") es un tipo de isoforma que hace referencia a cualquiera de las múltiples formas de una enzima que surge de una diferencia determinada genéticamente de la estructura primaria / secuencia de aminoácidos. Cualquier grupo de enzimas que comparta la misma actividad catalítica, loci genéticos o estructura primaria son isoformas entre sí. Se conocen múltiples isoformas de DPP. Por ejemplo, DPP-I existe en al menos 2 isoformas derivadas de variantes de transcripción que codifican desde el mismo gen {Entrez Gene GeneID: 1075) . De modo similar, se han comunicado múltiples isoformas para DPP-II ( DiCarlantonio y col., Gamete Res. 15 (2) : 161-175 (2005)), DPP-III (Mazzocco y col., FEBS Journal 273 (5) : 1056-1064 (2006)) y DPP-IV (Schmauser y col. , Glycobiol. 9 (12) : 1295-1305) (1999)). Por ejemplo, cualquier enzima que escinda los enlaces dipeptidicos post-prolina es una isoforma de DPP-IV. El experto en la técnica es consciente de las numerosas isoformas de DPP. A modo de ilustración, pero no de limitación, las isoformas de DPP-IV incluyen, pero no están limitadas a DPP-IV; las diversas formas sialiladas de DPP-IV; DPP-IV unida a la membrana; DPP-IV soluble; y cualquiera de los homólogos de actividad y/o estructura (DASH) de la dipeptidil peptidasa IV tales como seprano, la proteina a de activación de fibroblastos, DPP6, DPP8, DPP9, atractina, las dipeptidasas I, II y L ácidas -enlazadas y N-acetiladas , la prolin dipeptidasa de células quiescentes, la serin proteasa especifica del timo y DPP IV-ß. Los parámetros DPP que pueden ser medidos incluyen cantidad, concentración, actividad, expresión o cantidad o tipo de la modificación post-traslacional . "Cantidad" de DPP incluye la presencia, ausencia o cantidad de DPP. "Actividad" de DPP incluye la presencia, ausencia, cantidad, grado o velocidad de actividad enzimática, incluida la actividad especifica. "Expresión" de DPP incluye la presencia, ausencia, velocidad o cantidad de expresión de DPP. "Concentración" de DPP es la cantidad de isoforma de DPP por unidad de volumen presente en una porción . El parámetro DPP se puede medir directa o indirectamente, y puede ser cualitativo o cuantitativo. La actividad de DPP se puede medir usando cualquier ensayo capaz de medir cuantitativa o cualitativamente la actividad de DPP. Ensayos adecuados para medir la actividad de DPP incluyen ensayos que detectan la presencia o cantidad de un producto de hidrólisis de la actividad de DPP en un sustrato marcado de manera detectable. La marca puede ser detectable de forma directa o indirecta, y puede ser fluorogénica , quimioluminiscente , colorimétrica o radioactiva. Las marcas fluorogénicas incluyen 7-amino-4-metil-cumarina (A C) y 7-amino-4-trifluorometil-cumarina (AFC) . Tal como lo entenderán los expertos en la técnica, el modo de detección de la señal dependerá del sistema de detección exacto usado en el ensayo. El sistema de detección puede detectar variaciones de masa, cambios de la secuencia de aminoácidos o longitud de los péptidos, variaciones cromogénicas , o cambios fluorogénicos . El método de detección puede emplear programas de detección secundarios que incluyen reacciones enzimáticas secundarias resultantes en el cambio detectable, entre una amplia variedad de programas de detección descritos en la técnica. Por ejemplo, si se utiliza un reactivo de detección marcado radioactivamente, la señal se medirá usando una tecnología capaz de cuantificar la señal de la muestra biológica, o de comparar la señal de la muestra biológica con la señal de una muestra de referencia tal como el conteo de escintilación, la autorradiografía (combinada, típicamente, con la densitometría de rastreo), y similares. Si se utiliza un sistema de detección quimioluminiscente , la señal será detectada típicamente usando un luminómetro. Si se utiliza un sistema de detección fluorescente, la fluorescencia se puede medir usando un espectrofluorómetro . Los métodos para detectar la señal de sistemas de detección son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, la actividad de DPP se mide a través de un ensayo que detecta la presencia o la cantidad de un producto de hidrólisis de la actividad de DPP en un sustrato marcado de forma detectable. La actividad de DPP-IV se puede medir usando un ensayo que detecta la hidrólisis de cualquier sustrato marcado de manera detectable que es capaz de ser catalizado por DPP-IV, es decir, X-Y-R, en donde X es cualquier aminoácido; Y es Pro (prolina) , Ala (alanina) o Arg (arginina) ; y R es cualquier marca detectable directa o indirectamente . La cantidad de DPP se puede medir usando cualquier ensayo capaz de medir cuantitativa o cualitativamente la cantidad de una o múltiples isoformas de DPP. Ensayos adecuados para medir la cantidad de DPP incluyen, pero sin estar limitados a ellos, el análisis de transferencia western, espectrofotometría de proteínas, radioinmunoensayo, ensayos de unión competitiva, y ensayos ELISA. En este sentido, los anticuerpos que son específicos para una o múltiples isoformas resultan especialmente útiles. La concentración de DPP se puede medir usando cualquier ensayo capaz de medir cuantitativa o cualitativamente la concentración de una o múltiples isoformas de DPP. Ensayos adecuados para medir la cantidad de DPP incluyen, pero sin estar limitados a ellos, el análisis de transferencia western, espectrofotometría de proteínas, radioinmunoensayo, ensayos de unión competitiva, y ensayos ELISA. En este sentido, los anticuerpos que son específicos para una o múltiples isoformas resultan especialmente útiles. La expresión de DPP se puede medir usando cualquier ensayo capaz de medir cuantitativa o cualitativamente la expresión de una o múltiples isoformas de DPP. Ensayos adecuados para medir la expresión de DPP detectan, por lo general, el ARNm o la proteina de DPP e incluyen el análisis de transferencia northern y el análisis de transferencia western, o variaciones de los mismos (por ejemplo, Análisis Far Western, chips de microarray (chips de ADN o genéticos) ) .

El tipo o grado de modificación post-traslacional se puede medir cualquier ensayo capaz de medir cuantitativa o cualitativamente la modificación de una o múltiples isoformas de DPP. Ensayos adecuados para medir el tipo o grado de modificación post-traslacional incluyen fijación de lectina, análisis de transferencia western, espectrofotometria de proteínas, radioinmunoensayo, ensayos de unión competitiva, y ensayos ELISA. Es posible medir uno o más de un parámetro. Por ejemplo, se puede medir un único parámetro (por ejemplo, cantidad, concentración, actividad, expresión, cantidad o tipo de modificación post-traslacional). De manera alternativa, se pueden medir dos o más parámetros, por ejemplo, la cantidad y la concentración, cantidad y actividad, cantidad y expresión, concentración y actividad, concentración y expresión, o actividad y expresión. Igualmente, se pueden medir cantidad, actividad y expresión; cantidad, concentración y expresión; o concentración, actividad y expresión. Si se efectúan dos o más mediciones, se les puede realizar simultánea o consecutivamente. Por ejemplo, la cantidad se puede medir antes o después de la actividad. Si se realizan tres o más mediciones, también se pueden llevar a cabo consecutiva o simultáneamente. Por ejemplo, la cantidad se puede medir antes del tipo de modificación post-traslacional y actividad, en donde el tipo de modificación post-traslacional y la actividad se miden simultáneamente, o la cantidad, tipo de modificación post-traslacional y actividad se miden de forma simultánea o consecutiva con respecto a las demás. De igual modo, si se efectúan más mediciones, éstas se pueden llevar a cabo simultánea o consecutivamente con respecto a las demás, o se las puede agrupar de cualquier manera posible, de modo que cada grupo sea determinado de forma simultánea o consecutiva con respecto a los restantes grupos. En otras palabras, cada una de las mediciones se puede agrupar de manera factorial o distributiva, y cada grupo puede ser medido, con respecto a todos los restantes grupos, ya sea consecutiva o simultáneamente . Además de múltiples mediciones, cualquier medición determinada, ya sea de uno o múltiples parámetros, puede realizarse más de una vez, es decir, repetirse para cualquier muestra de un paciente determinado. Adicionalmente, se puede emprender cualquier combinación de mediciones con respecto a las porciones. Por ejemplo, se puede medir un único parámetro para una, algunas o todas las porciones. Del mismo modo, se puede medir más de un parámetro para una, algunas o todas las porciones. Un único parámetro se puede medir para una o todas las porciones, en tanto que otro parámetro se mide para otras o todas las porciones. Por ejemplo, se puede medir la cantidad en solamente una porción, mientras que la actividad se puede medir en todas ellas. De la misma manera, se puede medir la actividad de solamente una porción, en tanto que se mide la cantidad de todas ellas. Al medir uno o múltiples parámetros DPP, la muestra del paciente se puede dividir en una serie de partes alícuotas, usando partes alícuotas separadas para medir diferentes parámetros DPP, o efectuar mediciones repetidas. De forma adicional o alternativa, cada una de las porciones de DPP discriminadas puede ser dividida en una serie de partes alícuotas para la medición de diferentes parámetros DPP o mediciones repetidas. Las mediciones repetidas no sólo son necesarias para los métodos según la invención, sino que muchas realizaciones de la misma utilizarán ensayos repetidos, en especial duplicados y triplicados. De manera alternativa, la muestra del paciente, o una parte alícuota de la misma, se puede analizar para determinar los niveles de múltiples parámetros DPP en una sola reacción, usando un ensayo capaz de medir los niveles individuales de diferentes parámetros DPP en un único ensayo tal como un ensayo de tipo array o un ensayo que utilice la tecnología de detección multiplexada (por ejemplo, un ensayo que use reactivos de detección marcados con distintos marcadores fluorescentes) . Tal como se usa en este documento, la expresión "enfermedad o trastorno asociado a DPP" hace referencia a aquellas enfermedades o trastornos que se caracterizan por una diferencia en uno o más parámetros DPP particulares mensurables. Las enfermedades o trastornos asociados a DPP no están necesariamente causados por un cambio de DPP, sino que se pueden diagnosticar o monitorizar midiendo uno o múltiples parámetros DPP. Los estados patológicos y trastornos asociados a DPP incluyen, sin estar limitados a ellos, enfermedades metabólicas , enfermedades autoinmunes, cánceres e infecciones víricas . La(s) enfermedad (es ) metabólica ( s ) , de acuerdo con la expresión usada en este documento, son trastornos del metabolismo e incluyen tanto enfermedades adquiridas como genéticas. Una serie de ellas aparece descrita en la obra de Harrison, "Principios de Medicina Interna". En general, las enfermedades metabólicas se dividen en tres clases principales: enfermedades de almacenamiento de glucógeno (es decir, las enfermedades que afectan al metabolismo de los hidratos de carbono tales como la diabetes de tipo II), trastornos de oxidación de los ácidos grasos (es decir, los trastornos que afectan al metabolismo de los componentes grasos tales como la enfermedad de Fabry) , y los trastornos mitocondriales (es decir, los trastornos que afectan a la mitocondria tales como el Síndrome de Leigh) . Los estados patológicos del metabolismo que se pueden detectar con la presente invención incluyen, sin estar limitados a ellos: diabetes de tipo II, hipoglucemia, hiperglucemia , enfermedad de Graves, Síndrome de Cushing, alcaptonuria , albinismo, histidinemia , hiperornitinemia , enfermedad de Wilson, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Krabbe, Síndrome de Paget, enfermedad urinaria del jarabe de arce o fenilcetonuria . En un ejemplo de realización, la DPP es DPP-IV, y la enfermedad es diabetes de tipo II. Enfermedades autoinmunes que se pueden detectar con la presente invención incluyen, sin estar limitadas a ellas: artritis reumatoide, liquen plano, psoriasis, uveitis, anemias hemolíticas, fiebre reumática, enfermedad de Crohn, Síndrome de Guillain-Barre , psoriasis, tiroiditis, enfermedad de Graves, miastenia grave, glomerulonefritis , hepatitis autoinmune o lupus eritematoso sistémico. En determinadas realizaciones, la enfermedad autoinmune es psoriasis, artritis reumatoide o liquen plano, y la DPP es DPP-IV. Los cánceres que se pueden detectar con la presente invención incluyen, sin estar limitados a ellos: tumores sólidos y carcinomas primarios y metastáticos de mama; colon, recto; pulmón; orofaringe; hipofaringe; esófago; estómago; páncreas; hígado; vesícula biliar; conductos biliares; intestino delgado; vías urinarias, incluidos riñon, vejiga y urotelio; tracto genital femenino, incluidos cuello uterino, útero, ovarios, coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional; tracto genital masculino, incluidos próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de las células germinales; glándulas endocrinas, incluidos tiroides, suprarrenales y pituitaria; piel, incluidos hemangiomas, melanomas, sarcomas que surgen del hueso o tejidos blandos, y sarcoma de Kaposi; tumores cerebrales, nervios, ojos y meninges, incluidos astrocitomas , gliomas, glioblastomas , retinoblastomas , neuromas, neuroblastomas , schwannomas, y meningiomas; tumores sólidos surgidos de enfermedades malignas hematopoyéticas tales como leucemias y que incluyen cloromas, plasmacitomas , placas y tumores de micosis fungoides y linforna/leucemia de células T cutáneas, linfomas incluidos tanto Hodgkin como no-Hodgkin. Las infecciones víricas que se pueden detectar con la presente invención incluyen, sin estar limitadas a ellas, las infecciones causadas por familias de virus que son patógenas para el ser humano y otros animales, tales como: adenovirus, birnavirus, bunyavirus, coronavirus, flavivirus, herpes virus, orto-mixovirus , papovirus, parvovirus, picornavirus , reovirus, retrovirus (por ejemplo, VIH), rabdovirus, o togavirus. En ciertas realizaciones, la DPP es DPP-IV y la enfermedad vírica es VIH. Tal como se usa en este documento, el término "paciente" hace referencia a cualquier organismo vivo que tiene necesidad de diagnóstico, pronóstico, monitorización de la evolución de la enfermedad o evaluación de riesgo de un estado patológico o trastorno asociado a DPP-IV, en donde el paciente posee la fisiología asociada a la expresión de DPP. Estos pacientes incluyen, pero no están limitados a ellos, seres humanos, primates superiores, otros mamíferos (por ejemplo, mamíferos domesticados tales como gatos, perros y caballos, roedores tales como ratas y ratones, y animales salvajes tales como leones, tigres y osos), aves (por ejemplo, pollos, periquitos) y otros animales. Tal como se usa en este documento, la expresión "muestra de paciente" o "muestra biológica" hace referencia a cualquier muestra tomada o procedente de un paciente que cabe esperar que contenga la enzima diana, e incluye muestras tanto celulares como acelulares. Muestras de paciente incluyen, pero sin estar limitadas a ellas, muestras de tejidos tales como músculo, hígado, pulmón, bazo, tejido adiposo, mamario y tumoral; sangre y productos de la sangre tales como sangre entera, plasma, suero y células hemáticas; y otros fluidos biológicos tales como orina, saliva, lágrimas, moco, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial y fluido seminal. Las muestras de paciente pueden contener también una combinación de fluidos y/o tej idos . Las muestras se pueden obtener del paciente por cualquier método clínicamente aceptable tal como punción venosa, espinal, amniocentesis y biopsia de tejido. Aunque las muestras se pueden utilizar directamente, tal como han sido obtenidas del paciente, un aspecto de la invención prevé el procesamiento de las muestras antes de discriminar la DPP en porciones (por ejemplo, discriminar las isoformas de DPP en porciones), o medir el parámetro DPP. El procesamiento incluye, sin estar limitado a estos procedimientos, homogeneización, dilución, concentración, tratamiento con ultrasonidos, congelación, mezcla de un conservante u otro agente, o combinaciones de estos métodos.

Adicionalmente, se pueden procesar muestras que contienen células u otros tejidos en los que la DPP cabe esperar que esté unida a la membrana, de manera que se libere la DPP de la membrana celular, permitiendo de esta forma que sea utilizada en cualquiera de los métodos reconocidos por la técnica para separar/aislar proteínas/enzimas de una muestra. Los métodos para liberar proteínas unidas a la membrana son bien conocidos en la técnica e incluyen congelación/descongelación, homogeneización, tratamiento con ultrasonidos, y liberación química o enzimática de la enzima activa de la membrana. En algunos ejemplos, la muestra del paciente se recoge en un recipiente que contiene EDTA, inhibidores de proteasas o algún otro componente adecuado para el transporte, conservación y tratamiento de una muestra biológica. Cuando la muestra del paciente es un fluido, su procesamiento puede incluir la forma de eliminación de células nucleadas y/o no nucleadas tales como eritrocitos, leucocitos y plaquetas en las muestras de sangre (por ejemplo, para obtener plasma), o pueden incluir también la eliminación de determinadas proteínas tales como ciertas proteínas de la cascada de coagulación de la sangre (por ejemplo, para obtener suero) . Por ejemplo, se puede recoger sangre en un recipiente con heparina, citrato o inhibidores de proteasas, o es posible hacerla entrar en contacto con heparina, citrato o inhibidores de proteasas tras su recolección. El procesamiento adicional puede incluir concentrar o diluir una muestra con el fin de, por ejemplo, normalizar el contenido en proteínas totales antes de la discriminación o la medición. Los protocolos para llevar a cabo estas actividades son bien conocidos en la técnica. Después de establecer la correlación entre la medición del parámetro DPP con el estado patológico o trastorno, el resultado puede ser comunicado a un operador. El resultado incluye la presencia, ausencia o gravedad del estado patológico o trastorno. Un "operador" puede ser un médico, enfermera, ayudante médico, técnico en medicina, técnico de laboratorio o alguien encargado del funcionamiento de una máquina o aparato que lleva a cabo una o más etapas de la invención, o cualquier persona que reciba la información de diagnóstico o pronóstico, incluido el propio paciente. Por ejemplo, la información de diagnóstico o pronóstico puede ser comunicada automáticamente al paciente o a su representante legal a través de fax, teléfono, mensaje de texto o correo electrónico . Se puede utilizar cualquier medio para transmitir el resultado, los cuales incluyen, pero no están limitados a los mismos, mostrar el estado patológico en un medio tal como una pantalla electrónica, una pantalla digital, o un sustrato imprimible; realizar una señal audible tal como un zumbido, una campana, una voz generada electrónicamente, o una voz pregrabada; a través del teléfono, mensaje de texto, correo electrónico o fax. Las isoformas pueden ser parcial o completamente discriminadas en porciones de DPP antes o simultáneamente con la medición de cualquier parámetro DPP. Por ejemplo, suponiendo que haya más de dos tipos de isoformas de DPP presentes en una muestra, las isoformas pueden ser discriminadas en solamente dos porciones, cada una de las cuales incluye más de un tipo de isoforma (es decir, discriminación parcial); o las isoformas se pueden discriminar el porciones en las que cada una de ellas contiene únicamente un tipo de isoforma (es decir, discriminación completa). De la misma manera, las isoformas se pueden discriminar parcialmente en dos o más porciones, una de las cuales contiene solamente un tipo de isoforma, y otras porciones que contienen más de un tipo de isoforma. Las porciones de DPP pueden ser discriminadas por cualquier medio, incluida la separación o aislamiento físico, u otros métodos de identificación o distinguir las isoformas entre sí. Por ejemplo, la discriminación puede basarse en la diferencia de propiedades bioquímicas tales como movilidad electroforética o punto isoeléctrico (pl); estabilidad térmica; peso molecular; secuencia de aminoácidos, en el caso de isoformas que difieren en su estructura primaria; afinidad o avidez por anticuerpos; grado o tipo de modificaciones post-traslacionales; y propiedades cinéticas tales como Km o constante de velocidad.

Los anticuerpos o lectinas especificas para diferentes isoformas de DPP se pueden utilizar para separar físicamente las porciones de DPP, o distinguir las porciones sin una separación física. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para cada isoforma de DPP diferente pueden portar una marca detectable diferente, que no requiere separación física para discriminar las porciones. De manera alternativa, los anticuerpos se pueden utilizar sobre un soporte o columna para separar físicamente diferentes isoformas de DPP en porciones. Los métodos de separación incluyen enfoque isoeléctrico, que separa en base al pl; métodos electroforéticos , en una matriz tal como un gel o filtro, o exentos de gel, capaces de distinguir basándose en la carga eléctrica y/o el peso molecular; grado de fijación de lectina o variedad de ésta que muestra afinidad por las isoformas; fijación de anticuerpos; y métodos cromatográficos de afinidad o discriminación por tamaño. Como se usa en este documento, la expresión "punto isoeléctrico" (pl) es el pH al que una molécula no es portadora de una carga eléctrica neta. También se hace referencia al pl como un pH isoeléctrico. Así, a los efectos de esta solicitud, las expresiones "pl" y "pH isoeléctrico" se usan de forma intercambiable. En un ejemplo de realización, las porciones de DPP se discriminan en base al pl, y la DPP especifica es DPP-IV. Los métodos de enfoque isoeléctrico incluyen electroforesis de flujo libre, electroforesis de enfoque isoeléctrico, o cromato-enfoque, u otros métodos de separación mediados por fase sólida, facilitados por el flujo de un sistema de tampón que modifica el pH durante el tiempo después de la fase sólida. Una electroforesis de enfoque isoeléctrico, se inyecta una muestra de interés, o se administra directamente, en un bloque de gel, filtro u otro medio que contiene un gradiente de pH inmovilizado. El gradiente de pH es paralelo a la dirección del campo eléctrico y la proteina o proteínas de la muestra se separan entre sí por migración, en una dirección, a través de los diferentes entornos de pH, antes de alcanzar un entorno de pH que es equivalente a su pl . Una vez que una proteína ha alcanzado su pl, permanecerá inmóvil dentro del material de matriz. En este punto, es posible obtener una muestra del material de matriz, que se utiliza en análisis adicionales tales como electroforesis sobre gel de dodecilsulfato sódico poliacrilamida (SDS-PAGE) (Zuo y col., Analytical Biochem. 284:266-218 (2001)), una separación de la segunda dimensión en un chip planar (Becker y col., J. Micromech. Microeng. 8:24-28 (1998)), un ensayo para detectar la actividad enzimática tal como fluorometria, o un ensayo apropiado para medir cualquiera de los parámetros DPP. La electroforesis de flujo libre es un método de electroforesis que no utiliza una matriz sólida tal como los geles de acrilamida en la electroforesis tradicional, ni las fases de separación que se emplean en cromatografía. En su lugar, los analitos se separan de acuerdo con su carga y/o movilidad electroforática en un flujo laminar continuo o una solución tampón en un campo eléctrico aplicado perpendicularmente a la dirección del flujo. Ejemplo de una máquina que lleva a cabo la electroforesis de flujo libre es el Sistema de Electroforesis de Flujo . Libre BD® (Becton Dickenson, modelo n° 441117) . Usando este sistema, las muestras discriminadas se recogen en 96 capilares al final de una cámara de separación, que permite que el fraccionamiento continuo fluya hacia una división de la recolección, en la que el caudal se mantiene separado físicamente separado en una pluralidad de fracciones. Este método es adecuado para separar muestras a través de al menos tres principios de separación: enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis de zona (ZE) e isotacoforesis (ITP). Cuando han sido recogidas, las fracciones se pueden analizar adicionalmente por medio de cualquiera de los ensayos descritos para ser usados después del enfoque isoeléctrico, es decir, SDS-PAGE, separación de segunda dimensión en un chip planar, y ensayos de actividad enzimática . La discriminación y medición no se hallan limitadas a ningún orden particular. La discriminación puede tener lugar antes o después de la medición de los parámetros, o simultáneamente con la medición. Por ejemplo, la DPP especifica puede separarse físicamente en porciones usando un método tal como la electroforesis y, a continuación, se pueden medir uno o múltiples parámetros de algunas o de todas las porciones. Alternativamente, cuando la medición y la discriminación se llevan a cabo de forma simultánea, la DPP específica se puede discriminar en porciones, por ejemplo, poniendo en contacto la muestra del paciente con anticuerpos específicos para diferentes isoformas de DPP, en donde cada uno de los anticuerpos está unido a una marca detectable diferente, mientras se miden las señales de las marcas detectables.

En otra realización, las porciones o isoformas pueden discriminarse usando un sistema de detección dual. Por ejemplo, las isoformas de DPP pueden ponerse en contacto con un anticuerpo unido a una fase sólida, que se fija a todas o a la mayor parte de las isoformas de DPP, y uno o múltiples anticuerpos o lectinas especificas para una porción menor de isoformas. Cada uno de los anticuerpos o lectinas más específicos contiene una marca detectable única. Las isoformas pueden ponerse en contacto tanto con los anticuerpos o el anticuerpo y las lectinas de forma simultánea, o en serie, por ejemplo, haciéndolas contactar con el anticuerpo fijado y, entonces, con el anticuerpo / lectina más específica, o con el anticuerpo / lectina más específica y, seguidamente, con el anticuerpo fijado. La DPP se puede discriminar en dos o más porciones. El número de porciones depende del grado de discriminación deseado y del método de discriminación que se realiza. No existen limitaciones para el número de porciones en el que se puede discriminar la DPP, pero, por ejemplo, la DPP se puede discriminar en 2 o más porciones, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 36, 48, 96, 100, 200, 300, 384, 400, 500 ó 1536 porciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, es conveniente discriminar las isoformas de DPP en, por ejemplo, 96 porciones, para permitir manipular y parametrizar la medición en placas estándares de 96 pocilios.

Para una completa discriminación de las isoformas, cada porción de DPP debe contener no más de una isoforma de DPP, y algunas porciones pueden no contener isoformas de DPP. Para la discriminación parcial de las isoformas, al menos una porción de DPP debe contener más de una isoforma de DPP, en tanto que otras porciones pueden no contener isoformas de DPP, una isoforma de DPP, o más de una isoforma de DPP. En ciertas realizaciones de la invención, las muestras del paciente se obtienen de un individuo en más de una ocasión. Esta toma de muestras "seriada" es muy apropiada para determinar el inicio precoz de una enfermedad, antes de la aparición de las anomalías médicas típicas, y facilitan, de este modo, estrategias terapéuticas precoces conducentes a un tratamiento más eficaz de la enfermedad o, incluso, a la evitación de la enfermedad. Este muestreo seriado es muy adecuado también para los aspectos de la invención relacionados con la monitorización de la progresión de una enfermedad, por ejemplo, la diabetes de tipo II, en un paciente. Resulta especialmente útil para evaluar la eficacia de cualquier tratamiento al que se haya sometido al paciente en relación con la enfermedad. El muestreo seriado, o la toma repetida de muestras, puede ser de utilidad también para determinar el riesgo individual de desarrollar la enfermedad o el trastorno. El muestreo seriado se puede llevar a cabo a intervalos de tiempo predeterminados, por ejemplo, cada hora, cada medio día, a diario, semanalmente, mensualmente, trimestralmente (es decir, cada tres meses), cada medio año, anualmente, cada dos años, o con menor frecuencia. La comparación entre los niveles medidos y el nivel de referencia se puede efectuar cada vez que se tome una nueva muestra, o los datos relativos a dichos niveles se pueden reservar para análisis menos frecuentes . La medición o discriminación tienen lugar, preferentemente, ex vivo o in vitro. En una realización, tanto la medición como la discriminación tienen lugar ex vivo . Como lo podrá apreciar un experto en la técnica, los métodos descritos en este documento pueden incluir la medición de cualquiera de diversos parámetros DPP o no-DPP (que pueden o no ser parámetros relacionados con la enfermedad) , para determinar la integridad y/p las características de la muestra del paciente. Por ejemplo, los niveles de estrogenos, que normalmente son más elevados en el sexo femenino, se pueden medir como marcador de sexo, u otras mediciones químicas en la sangre tales como los niveles de colesterol . Se pueden medir otros parámetros no-DPP relacionados con la enfermedad para confirmar el diagnóstico o el pronóstico. En algunas realizaciones, el parámetro no-DPP es el nivel de hemoglobina AlC, y la enfermedad es diabetes. Niveles de hemoglobina AlC por debajo del 7% de la hemoglobina total son indicativos de la ausencia de diabetes; niveles superiores al 7% de la hemoglobina total son indicativos de la .presencia de diabetes. El parámetro no-DPP se puede medir antes o después del parámetro DPP, o se pueden medir simultáneamente. Con el fin de correlacionar el parámetro DPP medido con un estado patológico o trastorno, el parámetro DPP se puede comparar con una referencia, es decir, un estándar o un control interno. Un aumento, descenso o desviación de un parámetro DPP, ya sea individual o aditivo, en comparación con la referencia, ya sea positivo o negativo, puede correlacionarse con un estado patológico. De forma alternativa, el parámetro DPP de una porción de las enzimas discriminadas puede ser comparado con el parámetro de otra porción de enzimas discriminadas, o se puede comparar con la medición total de dos o más porciones discriminadas . Evidentemente, el parámetro medido se debe comparar con un parámetro correspondiente. Por ejemplo, si se mide la cantidad de DPP, entonces el valor de la cantidad de DPP se debe comparar con el valor de la cantidad de DPP de una referencia o de otra porción. Si se mide la expresión de DPP, debe ser comparada con la expresión de DPP de una referencia o de otra porción. En determinadas realizaciones, se mide el parámetro de una gama continua de porciones. Por ejemplo, para isoformas separadas en base al punto isoeléctrico, se pueden medir uno o más parámetros de dos o más porciones que se separan a pH o puntos isoeléctricos adyacentes. Se puede obtener un perfil del o de los parámetros medidos a lo largo de la gama continua de porciones. De forma alternativa, se puede obtener un perfil del o de los parámetros medidos basado en las mediciones de una gama no continua de porciones. El perfil puede estar basado en todas las porciones, o puede estarlo en un subconjunto de porciones. Las diversas comparaciones que se pueden establecer entre las distintas porciones para determinar la correlación con un estado patológico son numerosas. Los métodos para analizar los datos establecidos con los parámetros medidos, o para comparar los datos con otros datos son bien conocidos por el experto en la técnica. En consecuencia, en este documento no se analiza en detalle ninguno de esos métodos. Un ejemplo de técnica para analizar los datos, con el fin de extraer la conclusión deseada (es decir, la presencia o ausencia de un estado patológico) se ilustra haciendo referencia al gráfico de la Fig. 14. En la Fig. 14, el eje y muestra el nivel de un parámetro DPP (por ejemplo, actividad, expresión, cantidad, concentración, tipo o cantidad de modificación post-traslacional ) . El eje x muestra la dimensión de la discriminación (por ejemplo, pl, pH o tipo de isoforma ) . Haciendo referencia al gráfico, se destacan tres áreas, área "a", área "b" y área "c". Para cada una de ellas, se puede medir la medición total dentro de una gama (por ejemplo, área bajo la curva para un rango determinado), dando los valores "a" y "b", con el valor total de "c". Otros valores que se pueden medir incluyen el valor máximo dentro de un rango, la actividad especifica en cualquier punto del rango (por ejemplo, a un pl o pH especifico) , los puntos en los que el parámetro medido aumenta o disminuye (por ejemplo, un punto de inflexión) , desviaciones del parámetro medido a lo largo del eje x en comparación con otras mediciones, y cualquier combinación de los anteriores. Los valores se pueden calcular sobre la base de un perfil obtenido por la medición de una gama continua de porciones, o se pueden calcular basándose en mediciones de una única o una pluralidad de porciones. Al objeto de correlacionar un estado patológico con una de las mediciones, se puede comparar un rango de valor (es) "a" con el rango de valor (es) "b"; el rango de valor (es) "a" con el rango de valor (es) "c"; el rango de valor (es) "a" con un control interno o estándar; el rango de valor (es) "b" con un control interno o estándar; y/o el rango de valor (es) "c"-con un control interno o estándar. De forma alternativa, se pueden llevar a cabo mediciones cuantitativas discretas en cualquier intervalo o cualquier razón de estas mediciones cuantitativas asociadas con una dimensión o dimensiones determinadas de discriminación, comparándolas con valores de referencia o rangos conocidos para tales mediciones, en donde el rango de referencia se ha establecido por medio de ensayos clínicos para proporcionar una escala con la que determinar la presencia, ausencia o gravedad de la enfermedad. Las mediciones cuantitativas pueden estar complementadas, asimismo, por la inclusión de un estándar interno o externo, realizado simultáneamente o en serie con la dimensión de discriminación (por ejemplo, discriminaciones de isoformas) , que se pueden utilizar para homologar la lectura cuantitativa frente a los rangos de referencia preestablecidos. Como se usa en este documento, el término "estándar" hace referencia a un valor, por lo general, un valor medio, mediano o valor promedio, obtenido de un segmento de la población. El estándar puede ser un estándar positivo o un estándar negativo, y se puede obtener de una población de edad equiparable. Poblaciones de edad equiparable (a partir de las que se pueden obtener valores estándares) son, de manera ideal, de la misma edad que el individuo examinado, pero también son aceptables poblaciones de edad aproximadamente equiparable- Las poblaciones de edad aproximadamente equiparable pueden estar dentro del intervalo de 1 a 20 años, incluidos aproximadamente 1, aproximadamente 10, aproximadamente 15 o aproximadamente 20 años de la edad del individuo examinado, o pueden ser grupos d edades diferentes que comprenden la edad del individuo examinado. Las poblaciones de edad aproximadamente equiparable pueden mostrar incrementos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 años (por ejemplo, un grupo de "incremento de 5 años" que sirve como fuente para valores estándares para un individuo de 62 años podría incluir individuos de 58 a 62 años de edad, individuos de 59 a 63 años de edad, individuos de 60 a 64 años de edad, individuos de 61 a 65 años de edad, o individuos de 62 a 66 años de edad) . Un estándar positivo hace referencia a un valor, por ejemplo, un valor medio, que se obtiene de un segmento de la población con el estado patológico particular. Un estándar negativo se refiere a un valor, por ejemplo, un valor medio, que se obtiene de un segmento de la población sin el estado patológico particular. Como se usa en este documento, la expresión "control interno" hace referencia a un valor obtenido de una muestra o muestras de un único paciente o un grupo de pacientes, cuyo estado patológico es conocido. Un control interno puede ser un control positivo, un control negativo, o un control del mismo paciente. Por ejemplo, el control interno puede ser un control positivo de uno o múltiples pacientes con el estado patológico particular; o puede ser un control negativo de uno o múltiples pacientes con el estado patológico particular. Por último, un control interno puede ser un valor obtenido de un paciente para ser diagnosticado, ya sea de una muestra derivada de un sitio físicamente diferente (es decir, sangre frente a hígado) , en un momento diferente para medir la progresión de la enfermedad, o de dos o más muestras que han sido procesadas de forma diferente antes de la medición, o recogidas en recipientes separados que pueden ser del mismo tipo o de tipos diferentes (por ejemplo, dos tubos de plasma EDTA o un tubo de plasma EDTA y un tubo de suero) . El valor del control interno se puede obtener de manera simultánea o contemporánea con la medición del paciente que debe ser diagnosticado, o se puede obtener en algún otro momento . Los resultados de la comparación entre el o los valores medidos o entre el o los valores medidos y el o los valores de referencia se usan para diagnosticar o ayudar en el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad, para estratificar a los pacientes de acuerdo con la gravedad de su enfermedad, o para monitorizar la progresión de una enfermedad en un paciente en particular. Por lo tanto, si la comparación indica una diferencia (es decir, un incremento o descenso) entre el o los valores medidos y el o los valores de referencia, que sugiere/indica una enfermedad, entonces se contribuye o se establece el diagnóstico apropiado. Por el contrario, si la comparación del o de los niveles medidos con el o los niveles de referencia no indica diferencias que permitan sugerir o indicar un diagnóstico patológico, entonces no se contribuye o no se establece el diagnóstico apropiado . Cuando se mide más de un parámetro DPP relacionado con una enfermedad, pero las diversas mediciones no sugieren o indican de manera unánime un diagnóstico de enfermedad, se usa la sugerencia o indicación "mayoritaria" (por ejemplo, cuando el método utiliza cuatro parámetros DPP relacionados con una enfermedad, tres de los cuales sugieren/indican enfermedad) . Un resultado de este tipo se consideraría sugestivo o indicativo de un diagnóstico de enfermedad para el individuo. El proceso de comparar un valor medido y un valor de referencia se puede llevar a cabo de cualquier forma conveniente para el tipo de valor medido y de valor de referencia para el parámetro DPP relacionado con la diabetes en cuestión. La "medición" se puede realizar usando técnicas de medición cuantitativa o cualitativa, y el modo de comparar un valor medido y un valor de referencia puede variar en función de la tecnología de medición empleada. Por ejemplo, cuando se usa un ensayo cualitativo para medir los niveles de actividad de DPP, los niveles se pueden comparar visualmente, comparando la intensidad del producto de la reacción fluorescente, o comparando los datos de un espectrofotómetro (por ejemplo, comparando los datos numéricos o gráficos, tales como gráficos de barras, derivados del dispositivo de medición) . Sin embargo, se espera que los valores medidos usados en los métodos de la invención sean, con mucha frecuencia, valores cuantitativos (por ejemplo, mediciones cuantitativas de concentración, tales como nanogramos de isoforma de DPP por mililitro de muestra, o cantidad absoluta). En otros ejemplos, los valores medidos son cualitativos. Al igual que sucede con las mediciones cuantitativas, la comparación se puede llevar a cabo examinando los datos numéricos, y representaciones de los mismos (por ejemplo, examen de representaciones gráficas tales como gráficos de barras o lineas). El proceso de comparación puede ser manual (por ejemplo, inspección visual efectuada por el responsable del método) , o puede ser automatizada. Por ejemplo, un dispositivo de ensayo (tal como un luminómetro para medir señales quimioluminiscentes ) puede incluir circuitos y software que le permitan comparar un valor medido con un valor de referencia para el o los parámetros DPP. Alternativamente, se puede utilizar un dispositivo separado (por ejemplo, un ordenador digital) para comparar el o los valores medidos con el o los valores de referencia. Los dispositivos automatizados de comparación pueden incluir valores de referencia almacenados para el o los parámetros DPP relacionados con la enfermedad que se miden, o pueden comparar el o los valores medidos con valores de referencia derivados de muestras de referencia medidas de forma contemporánea . En algunas realizaciones, los métodos según la invención utilizan una comparación "sencilla" o "binaria" entre el o los niveles medidos y el o los valores de referencia, por ejemplo, la comparación entre un nivel medido y un nivel de referencia determina si el nivel medido es mayor o menor que el nivel de referencia. En algunas realizaciones, cualquier diferencia de valor puede indicar enfermedad. Tal como se ha descrito en este documento, los parámetros se pueden medir de manera cuantitativa (valores absolutos) o cualitativa (valores relativos ).. Los correspondientes niveles de parámetro (s) DPP relacionado ( s ) con la enfermedad para una evaluación determinada pueden o no solaparse. Como se describe en este documento, para algunas realizaciones, los datos cuantitativos indican un nivel dado de estado patológico (leve, moderado o grave) y, en otras realizaciones, los datos cuantitativos indican un nivel determinado de estado patológico. En ciertos aspectos de la invención, la comparación se lleva a cabo para determinar la magnitud de la diferencia entre los valores medidos y de referencia, por ejemplo, comparación del número de veces o la diferencia porcentual entre el valor medido y el valor de referencia. Una diferencia en número de veces que es aproximadamente 2 veces más bajo o más alto que alguna diferencia mínima indica o sugiere, por ejemplo, la presencia de una enfermedad. La diferencia en número de veces se puede determinar midiendo la cantidad, concentración, actividad o expresión absoluta de una DPP y compararla con el valor absoluto de una referencia, o se puede medir una diferencia en número de veces por la diferencia relativa entre un valor de referencia y un valor de muestra, en donde ninguno de los valores es una medición de la cantidad, concentración, actividad o expresión absoluta, y/o en donde ambos valores se miden simultáneamente. De manera alternativa, las diferencias en número de veces se pueden medir dentro de los propios datos experimentales, por ejemplo, comparando la diferencia en número de veces de "a" con respecto a "c", o de "b" frente a "c", o cualquier otra relación de este tipo de parámetros mensurables dentro del sistema experimental. En consecuencia la magnitud de la diferencia entre el valor medido y el valor de referencia que sugiere o indica un diagnóstico particular dependerá del parámetro particular que se mide para producir el valor medido y del valor de referencia utilizado. Como se ha descrito en este documento, existe una correlación entre el perfil de actividad de DPP-IV obtenido de un rango continuo de isoformas de DPP-IV separadas por pl, y la presencia, ausencia o gravedad de la diabetes de tipo II. Esta correlación se utiliza en un método para el diagnóstico o pronóstico de la diabetes de tipo II, que comprende medir uno o múltiples parámetros DPP-IV de porciones discriminadas de DPP-IV de la muestra de un paciente, y correlacionar dicho parámetro DPP-IV medido con la presencia, ausencia o gravedad de la diabetes de tipo II en el paciente. En ciertas realizaciones, el parámetro DPP-IV es la actividad de DPP.-IV. En determinadas realizaciones, las porciones de DPP-IV se discriminan en base al pl . El parámetro DPP-IV se puede comparar con un estándar poblacional o un control interno. Cualquier diferencia con respecto a un estándar poblacional negativo o un control interno negativo puede correlacionarse con la presencia o la gravedad de una diabetes. Cuanto mayor es el grado de diferencia entre el parámetro DPP-IV medido y la referencia negativa, más grave es el pronóstico. De la misma forma, cualquier diferencia con respecto a un estándar poblacional positivo o un control interno positivo puede correlacionarse con la ausencia de diabetes. Como se ha analizado anteriormente, los parámetros incluyen actividad, cantidad, expresión o concentración. Las porciones de DPP-IV se pueden discriminar por medio de cualquier característica o método descrito en este documento. En ejemplos de realización, las porciones de DPP-IV se discriminan en base al pl . En ciertas realizaciones, las porciones de DPP-IV se separan por electroforesis de flujo libre. La Fig. 10 muestra la comparación del perfil de actividad de DPP-IV entre porciones de DPP-IV discriminadas por pl en plasma en un paciente sano y uno diabético. Los presentes inventores han demostrado que, en los pacientes diabéticos, el perfil de actividad de DPP-IV en cualquier punto o puntos del valor de cualquier paciente sano mostrado en este documento, o cualquier diferencia del perfil de actividad de DPP-IV en cualquier punto o puntos del valor obtenido de un control interno o estándar de población negativo, puede correlacionarse con diabetes. De esta forma, una desviación del perfil de actividad de DPP-IV de cualquier estándar negativo que se muestra en este documento o de un estándar poblacional negativo a pH mayor es indicativa de diabetes. De igual modo, una desviación del perfil de actividad de DPP-IV con respecto a un control interno negativo a un pH mayor es indicativa de la presencia de diabetes de tipo II. Cuanto más pronunciada es la desviación del perfil de actividad, más grave es la enfermedad . Un estándar positivo, asociado con una medición extrema "opuesta" de una muestra o población sana, se puede representar por la medición de la isoforma más extrema dentro del intervalo de pl en cuestión. Un estándar positivo de este tipo se podría establecer, por ejemplo, por medio del tratamiento de la muestra del paciente con métodos químicos o enzimáticos para eliminar por completo todas las glicosilaciones , en el caso de que la ausencia total de glicanos representara la condición de isoforma mensurable más alejada de las isoformas contenidas en las muestras sanas típicas. Es necesario señalar que no es posible obtener una isoforma extrema, resultante de este tratamiento, dentro de las muestras reales, pero se la puede utilizar para establecer el intervalo más alejado posible de pH, a los efectos de proporcionar un control mensurable para el ensayo.

Como alternativa, esta isoforma positiva "extrema" podría ser un control externo, que se podría medir por separado o después de haberla dispersado en la muestra analizada. En ciertas realizaciones, un control positivo de este tipo se puede utilizar también para ayudar en la homologación de las mediciones de las muestras resultantes. Por "desviación" de la actividad se entiende cualquier diferencia de la actividad de DPP-IV en una o múltiples porciones de DPP-IV. Por ejemplo, el valor medido de la actividad de DPP-IV puede diferir en algunas o en todas las porciones. Las tendencias del nivel de actividad de DPP-IV, por ejemplo, una mayor actividad a un pH más alto, son especialmente útiles para detectar la diabetes de tipo II. Los pacientes diabéticos y los sanos muestran también dos picos principales del perfil de actividad de DPP-IV cuando la DPP-IV se discrimina en base al pl . Los pacientes diabéticos tienden a mostrar picos a pH aproximadamente 4,4 y pH aproximadamente 4,8. Cada uno de estos picos está asociado con aproximadamente un 10% de la actividad total medida de las isoformas discriminadas por pl . Los pacientes sanos tienden a mostrar picos a pH aproximadamente 3,9 y pH aproximadamente 4,1. Por el término "pico" se entiende uno de un reducido número de los valores extremos para todos los valores medidos. Un valor pico puede estar asociado con una porción discriminada o un grupo de porciones discriminadas. Ese valor puede estar caracterizado, por lo tanto, por un valor discreto para una única porción discriminada o una integración de los valores discretos para un intervalo de porciones discriminadas. Por ejemplo, un perfil de valores como función de las porciones discriminadas puede contener solamente un pico, o puede contener más de un pico. En general, sólo se considerarán picos de 1, 2, 3, 4 ó 5 valores superiores. Opcionalmente, por ejemplo, el pico puede ser un valor relacionado, preferentemente del orden o próximo al perfil de una pluralidad de valores adyacentes, en donde los valores varían desde una magnitud en aumento a una en descenso. De esta forma, un pico máximo de la actividad de DPP-IV de isoformas de DPP-IV discriminadas por pl de, o próximo a pH 3,9 y/o de, o próximo a pH 4,1 puede estar correlacionado con la ausencia de diabetes. Del mismo modo, un pico de actividad de DPP-IV de isoformas de DPP-IV discriminadas por pl de, o próximo a pH 4,4 y/o de, o próximo a pH 4,8 puede estar correlacionado con la presencia de diabetes. Los picos que son al menos de aproximadamente un 10% de la actividad total medida del rango continuo de DPP-IV son especialmente útiles para la presencia de diabetes. Cuanto más alto es el pico de, o próximo a pH 4,4 y/o pH 4,8, más grave es el diagnóstico. La Fig. 11 es un trazado que muestra el perfil de actividad acumulativa de DPP-IV de isoformas discriminadas por pl de pacientes sanos y diabéticos. Cada punto en el trazado representa el porcentaje acumulativo de actividad total, como función del pH creciente del rango continuo de isoformas discriminadas. Como se ha explicado anteriormente, las isoformas de DPP se discriminan separándolas en porciones discretas discriminadas, cada una de las cuales está asociada con una estrecha banda particular de pH . La Fig. 12 muestra el pH al que la actividad acumulativa de porciones de DPP-IV discriminadas por pl de pacientes individuales alcanzaron el 90% de la actividad total para el rango medido, sumando, la actividad de las porciones de isoformas discriminadas y comenzando desde el extremo ácido del rango de pH medido. Los pacientes sanos alcanzaron el 90% de actividad de DPP-IV para las isoformas discriminadas a o por debajo de pH aproximadamente 4,2. Por el contrario, los pacientes diabéticos no alcanzaron el 90% de la actividad de DPP-IV para las isoformas discriminadas a y por debajo de pH aproximadamente 4,4. La actividad de DPP-IV acumulada de los pacientes más enfermos no alcanzó el 90% de la actividad total acumulada de DPP-IV hasta tomar en consideración las isoformas discriminadas a pH todavía más altos. Así, el pH al que la actividad acumulativa de porciones de DPP-IV discriminadas por pl de una muestra alcanza el 90% de la actividad total de las muestra se puede utilizar para correlacionar la medición de actividad de DPP-IV con la enfermedad. Por lo tanto, si el porcentaje de actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico, asociadas con un intervalo de pH de y menor que pH aproximadamente 4,4 no supera aproximadamente un 90%, entonces se detecta la presencia de diabetes. Si al menos aproximadamente un 10% de la actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo se encuentra presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un rango de pH de y mayor que pH aproximadamente 4,4, entonces se detecta la presencia de diabetes. Cuanto mayor es el pH por encima de pH 4,4 al que se alcanza el 90% de la actividad, más grave es el pronóstico . Si al menos un 90% aproximadamente de la actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo está presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un rango de pH menor que aproximadamente 4,2, entonces se detecta la ausencia de diabetes. Si el porcentaje de actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de o mayor que aproximadamente 4,2, no supera el 10%, entonces se detecta la ausencia de diabetes. La Fig. 13 muestra el pH al que la actividad acumulada de las porciones de DPP-IV discriminadas por pl de pacientes individuales alcanzó un 60% de la actividad total, sumando la actividad de las isoformas que se inician en el extremo ácido del rango medido de pH . Los pacientes sanos alcanzaron el 60% de la actividad de DPP-IV a un pH de aproximadamente 3,9. Por el contrario, los pacientes diabéticos no alcanzaron el 60% de la actividad de DPP-IV hasta un pH de aproximadamente 4,15 y mayor. La actividad acumulada de DPP-IV de los pacientes más enfermos no alcanzó el 60% de la actividad total acumulada de DPP-IV hasta tomar en consideración las isoformas discriminadas a pH todavía mayores. Así, el pH al que la actividad acumulada de porciones de DPP-IV discriminadas por pl alcanza el 60% de la actividad total de la muestra se puede utilizar para correlacionar la medición de actividad de DPP-IV con la enfermedad. Por lo tanto, si el porcentaje total de actividad de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo, presentes en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y menor que aproximadamente 4,15 no supera aproximadamente el 40% de la actividad de DPP-IV total de todas las porciones medidas del rango continuo, se encuentra presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y mayor que 4,15, entonces se detecta la presencia de diabetes. Cuanto mayor es el pH por encima de pH 4,15 al que se alcanza el 60% de actividad, más grave es el pronóstico. Si al menos aproximadamente un 60% de la actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo se encuentra presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y menor que aproximadamente 3,9, entonces se detecta la ausencia de diabetes. Si el porcentaje de actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y mayor que aproximadamente 3, 9, no supera aproximadamente el 40%, entonces se detecta la ausencia de diabetes. EJEMPLO 1 Usando electroforesis de flujo libre (FFE) (Sistema de Electroforesis de Flujo Libre BD®) y separando las proteínas en base a su carga, se separaron las isoformas de DPP-IV en porciones y se caracterizaron. Se prefiere el aislamiento de isoformas de proteínas para examinar el papel de modificaciones específicas sobre la actividad. El análisis de actividad indica que un incremento de la actividad específica se correlaciona con un aumento del pl de isoformas. Esto sugiere que las modificaciones post-traslacionales pueden jugar una función en la regulación de la actividad de DPP-IV. La FFE puede facilitar estudios adicionales que puedan correlacionar la o las modificaciones enzimáticas con el estado patológico. La FFE se llevó a cabo usando el Sistema de Electroforesis de Flujo Libre BD® de la forma siguiente: Se obtuvo DPP-IV porcina de Sigma® (1-100 mg) , que se diluyó (por lo general, 1:5) en un medio de separación de pH apropiado. A continuación, se cargaron las proteínas diluidas en la entrada de muestra más catódica de la cámara de FFE Becton®, y se separaron por la aplicación de 1200-1500 V y 20-25 mA, con un caudal de medio de separación de aproximadamente 60 ml/h, usando un gradiente de pH de 3-10. Se prepararon tampones de FFE de Enfoque Isoeléctrico (IEF) y los medios de acuerdo con los protocolos de los fabricantes (Becton® FFE Application Manual) , usando las condiciones nativas con un gradiente de pH de 3-10. Se llevó a cabo una electroforesis sobre gel de poliacrilamida con enfoque isoeléctrico (PAGE) (IEF) con geles preparados de manera personalizada con T: 4%, o utilizando Precoats® (Serva) en blanco equilibrados al intervalo apropiado de pH . Se practicó una tinción con plata para detectar las bandas de proteínas y el resultado se muestra en la Fig. 3. Se llevaron a cabo ensayos de actividad del modo siguiente: se agregaron 45 µ? de tampón de ensayo (Tris-Cl 100 mM [pH 8,0]; DIVISO al 0,5% en volumen) a una muestra de proteína de 5 µ?, y se midió el aumento de fluorescencia con respecto a T inicial. La actividad se expresó como el aumento de Unidades Relativas de Fluorescencia (RFU) /min, resultante de la hidrólisis del sustrato Gly-Pro-AMC (250 µ?) a 30°C. Los resultados se muestran en las Figs. 2A y 2B. La digestión con tripsina de las proteínas se realizó mediante escisión de bandas teñidas con Sypro Ruby que se visualizaron tras la PAGE (IEF) o la SDS-PAGE y la ulterior digestión según las instrucciones del kit ( Pierce/Sigma ) .

Se efectuó una MS por Desorción/Ionización Láser asistida con matriz (MALDI) del modo siguiente: los péptidos se digirieron "en gel", se extrajeron (según las instrucciones) y se limpiaron usando Puntas de Pipeta ZipTip® (Millipore) . Los péptidos digeridos se mezclaron 1:1 con matriz (solución saturada de ácido a-ciano-4-hidroxi-cinámico en acetonitrilo al 60%) y se salpicaron sobre una diana de acero inoxidable (Bruker Daltonics) . Se utilizaron las Huellas Peptidicas (PMF) del Tiempo de Vuelo (TOF) Maldi inicial para identificar las proteínas digeridas, seguido de la identificación TOF/TOF de péptidos específicos (usando Mascot en ambos casos) . Los resultados se muestran en las Figs. 4A y 4B. EJEMPLO 2 Los experimentos descritos en el Ejemplo 2 siguieron el mismo protocolo expuesto para el Ejemplo 1, con la excepción de la muestra de proteínas procedió de plasma humano de pacientes sanos. Se obtuvieron muestras de plasma humano (anticoagulante EDTA) de dos individuos, y se separaron las isoformas de DPP-IV en porciones de la forma descrita en el Ejemplo 1. La actividad se midió del modo descrito en el Ejemplo 1. Se examinaron loa patrones de actividad de DPP-IV para ver si existí un perfil de actividad similar al de las isoformas de DPP-IV porcina. Los resultados se muestran en las Figs . 6A y 6B. A partir de los resultados expuestos en las Figs. 6A y 6B, se observó una dispersión de actividad de DPP-IV de plasma humano similar a la registrada con la DPP-IV porcina. Se observó un aumento de actividad con valores más altos de pH (máximo a pH aproximadamente 5,2) . Sería necesaria una cuantificación exacta de proteínas (DPP-IV) para determinar la actividad específica. A través de los Ejemplos 1 y 2 se demuestra que las isoformas de proteína se pueden separar usando FFE (IEF) y se posibilita la caracterización bioquímica de las isoformas separadas. El modelo de DPP-IV porcina muestra múltiples isoformas (identificadas usando Espectrofotometría de Masa), que exhiben diferentes actividades específicas. La DPP-IV humana (separada en plasma) muestra una . tendencia similar cuando se analizan tras la FFE. Las modificaciones post-traslacionales (PTMs) pueden jugar un papel en la regulación de la actividad específica de DPP-IV. La FFE puede facilitar la identificación y las implicaciones de las PTMs potenciales para las isoformas individuales de la DPP-IV así como de otras proteínas.

La DPP-IV se midió de la forma descrita anteriormente. Los resultados, que se presentan en las Figuras 6A y 6B, comparados con los resultados de los experimentos con DPP-IV porcina, indican que la DPP-IV humana exhibe una tendencia de actividad similar, cuando se analiza tras la FFE, a la de la DPP-IV porcina analizada de manera semejante. Tomados en conjunto, los resultados de los Ejemplos 1 y 2 sugieren que las modificaciones post-traslacionales (PTMs) pueden desempeñar una función en la regulación de la actividad especifica de DPP-IV, y que la FFE puede facilitar la identificación e implicaciones de las PTMs potenciales para las isoformas individuales de DPP-IV y de otras proteínas . EJEMPLO 3 Los experimentos descritos en el Ejemplo 3 siguieron el mismo protocolo que se presenta en el Ejemplo 1, con la excepción de que la muestra de proteína procedió de plasma humano, y se efectuó una IEF con un gradiente de pH de 3-7. De manera específica, se obtuvieron 2 muestras de plasma humano tratadas con heparina, una de una persona con diabetes de tipo II (nivel de glucosa de 538 mg/dl) y otra de una persona sana. Los resultados se presentan en las Figs. 7 y 8 e indican que la muestra diabética exhibe un perfil de isoformas de DPP-IV con un intervalo isoeléctrico más alto. EJEMPLO 4 Se discriminaron por pl los plasmas de cuatro pacientes sanos y cinco pacientes diabéticos. Se llevó a cabo una FFE usando la cámara de FFE Becton® de la forma siguiente: se mezclaron 25 µ? de plasma (diluido 1:8) con 25 µ? de glicerol, 25 µ? de HPMC al 0,08%, 125 µ? de Tampón de Separación a pH 3-7. Las proteínas diluidas se cargaron entonces en la entrada para muestras más catódicas de la cámara de FFE Becton®, y se separaron por Enfoque Isoeléctrico de Intervalo (IIEF)-FFE, usando las condiciones nativas y un intervalo de pH 3-7 con la aplicación de 1200-1500 V y 20-25 mA. La I IEF-FFE se llevó a cabo a 10°C con un tiempo de residencia total de 64 minutos. Se usó un caudal de tampón de 50 ml/h en intervalos de 5 minutos (5 minutos hacia delante, seguidos de 5 minutos hacia atrás), con un total de 60 min. La aplicación de la muestra se efectuó a 6000 µ?/h durante 2 min, con un caudal de medio de 180 ml/h durante la aplicación de la muestra. Tras la aplicación de la muestra, se aplicó el voltaje y el caudal de medio se fijó a 50 ml/h en intervalos de 5 minutos (5 minutos hacia delante, seguidos de 5 minutos hacia atrás), hasta un total de 60 min. La muestra se recogió tras la Separación de Intervalo aumentando el caudal de tampón hacia delante a 300 ml/h durante 2 minutos, haciendo una pausa y, a continuación, recogiendo durante 2 minutos en 96 pocilios. La actividad de DPP-IV se analizó de la forma descrita en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en las Figs. 10 y 11. En la Fig. 10, las barras claras representan el valor obtenido en cada pl de un paciente sano, y las barras oscuras representan el valor medio obtenido en cada pl de un paciente diabético. Se observan dos picos principales en los pacientes sanos, a aproximadamente pH 3,9 y aproximadamente pH 4,1. Del mismo modo, se observan dos picos principales en los pacientes diabéticos a aproximadamente pH 4,4 y aproximadamente pH 4,8. El perfil del plasma diabético está desviado hacia el pH más elevado, o a la derecha del perfil del plasma de los pacientes sanos. En este ejemplo, el Grupo 1 es de . pacientes sanos (S04, Sil, S07 y S02) y el Grupo 2 está compuesto por diabéticos diagnosticados: L205 - Glucosa en Sangre = -139 mg/dl; S09 -Glucosa en Sangre desconocida; S08 - Glucosa en Sangre = ~90 mg/dl, la enfermedad del paciente está tratada con medicamentos; S01 - GS = -150 mg/dl; y S139 - GS = -350 mg/dl . Se dividió una parte alícuota de plasma de un sujeto sano en una mitad se clesiaiiló con neu rami n. idasa y una mitad se dejó como control. Cada porción se separó bajo las condiciones descritas anteriormente en este Ejemplo, y se midió el perfil de i so formas por análisis en z i.má t; ico . La eliminación del ácido siálico dio como resultado una desviación del perfil desde aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente pH 5,0. Los resultados se representan en un gráfico de barras de la Fig . 9. La desial i lación tuvo como resultado también un incremento de dos a tres veces de la actividad específica, tal como muestra la Tabla 1.

Aparentemente, un exceso de siali lación reduce la eficacia (también conocida como actividad especifica) de la DPP-IV. Asi, una de las razones por las que los pacientes con muy diferentes estados patológicos pueden mostrar diferentes perfiles de isoformas se debe a una modificación post-traslacional tal como la sialilación. Para explicar los gradientes de pH reales de las múltiples muestras, se semi-integraron las lecturas de pH frente al % de actividad local (a ese pH) . A continuación, se agregó la actividad porcentual junto con el intervalo de pH. Esto se muestra en la Fig. 11. Básicamente, esto permite la visualización del pH al que se alcanzó un cierto "umbral" de actividad . Los datos de pacientes sanos y diabéticos se muestran al 60% en la Fig. 12 y al 90% en la Fig. 13. Todos los pacientes sanos se encuentran dentro de un estrecho intervalo a pH 4,2 para la actividad al 90%, en tanto que los pacientes diabéticos se hallan dentro de un amplio intervalo a pH mayor que 4,4 y superior con un aumento de gravedad de la enfermedad. Para la actividad al 60%, todos los pacientes sanos se encuentran dentro de un estrecho intervalo a pH aproximadamente 3,9, mientras que los pacientes diabéticos están en un intervalo amplio por encima de pH 4,15. Aunque la invención del presente documento ha sido descrita haciendo referencia a realizaciones particulares, se debe entender que estas realizaciones son meramente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención. Por lo tanto, se debe entender que es posible efectuar numerosas modificaciones a las realizaciones ilustrativas y que se pueden diseñar otras disposiciones, sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para el diagnóstico o el pronóstico de un estado patológico o trastorno, caracterizado por un parámetro particular de dipeptidil peptidasa (DPP), que comprende: medir al menos un parámetro de una o múltiples porciones discriminadas de una DPP especifica de una muestra de paciente; y correlacionar dicho parámetro DPP medido con la presencia, ausencia o gravedad de dicho estado patológico o trastorno . 2. El método según la reivindicación 1, en el que cada porción contiene una o múltiples isoformas de DPP. 3. El método según la reivindicación 2, en el que cada porción contiene una isoforma de DPP. 4. El método según la reivindicación 1, en el que una o múltiples porciones no contienen isoformas de DPP, y otras porciones contienen una o múltiples isoformas de DPP. 5. El método según la reivindicación 1, en el que dicho estado patológico se selecciona del grupo consistente en un estado patológico del metabolismo, cáncer, una infección vírica, y una enfermedad autoinmune. 6. El método según la reivindicación 5, en el que dicho estado patológico es diabetes del tipo II. 7. El método según la reivindicación 1, en el que dicho parámetro se selecciona del grupo consistente en cantidad, concentración, actividad, expresión, tipo de modificación post-traslacional y cantidad de modificación post-traslacional . 8. El método según la reivindicación 7, en el que dicho parámetro es actividad de DPP, y dicha medición se lleva a cabo por medio de un ensayo que detecta la presencia o la cantidad de un producto de hidrólisis de la actividad de DPP sobre un sustrato detectable directa o indirectamente. 9. El método según la reivindicación 8, en el que dicha DPP específica es DPP-IV y dicho parámetro es actividad de DPP-IV. 10. El método según la reivindicación 9, en el que dicho sustrato es X-Y-R, en donde X es cualquier aminoácido, Y es prolina, alanina o arginina, y R es cualquier marca detectable . 11. El método según la reivindicación 1, en el que dicho parámetro se mide usando un anticuerpo o lectina especifica para una o más isoformas de DPP. 12. El método según la reivindicación 1, en el que se mide más de un parámetro DPP. 13. El método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra de paciente se selecciona del grupo consistente en tejido, sangre, plasma, suero, saliva, lágrimas, moco, orina, liquido amniótico, liquido sinovial, fluido seminal, liquido cefalorraquídeo, y sus combinaciones. 14. El método según la reivindicación 1, que comprende, además, comunicar la presencia ausencia o gravedad del estado patológico a un operador. método según la reivindicación 14, en el que dicha comunicación comprende mostrar el estado patológico en un medio seleccionado del grupo consistente en una pantalla electrónica, una pantalla digital, un sustrato imprimible, y una señal audible. 16. El método según la reivindicación 1, que comprende, además, discriminar porciones de DPP de una DPP especifica presente en la muestra del paciente. 17. El método según la reivindicación 16, en el que dicha discriminación se lleva a cabo antes de dicha medición. 18. El método según la reivindicación 16, en el que dicha discriminación se lleva a cabo simultáneamente con dicha medición. 19. El método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra de paciente se procesa antes de dicha medición. 20. El método según la reivindicación 19, en el que dicho procesamiento se selecciona del grupo consistente en homogeneización, dilución, concentración, congelación, y sus combinaciones . 21. El método según la reivindicación 16, en el que dicha discriminación se lleva a cabo por separación o asilamiento físico. 22. El método según la reivindicación 21, en el que dicha discriminación se lleva a cabo usando un formato exento de gel. 23. El método según la reivindicación 22, en el que dicho formato exento de gel se selecciona del grupo consistente en electroforesis de flujo libre y elect roforesis libre de matriz. 24. El método según la reivindicación 16, en el que dichas porciones de DPP se discriminan en base al punto isoeléctrico de las isoformas de DPP. 25. El método según la reivindicación 16, en el que hay al menos dos de dichas porciones de DPP. 26. El método según la reivindicación 1, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro medido con el parámetro correspondiente de un estándar. 27. El método según la reivindicación 1, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro medido con el parámetro correspondiente de un control interno. 28. El método según la reivindicación 25, en el que dicho parámetro se mide para dichas al menos dos porciones. 29. El método según la reivindicación 28, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro de al menos una porción con el parámetro total medido correspondiente a al menos dos porciones. 30. El método según la reivindicación 29, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro de al menos una porción con el parámetro total medido correspondiente a todas las porciones. 31. El método según la reivindicación 28, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro medido de al menos una porción con el parámetro medido correspondiente de al menos otra porción. 32. El método según la reivindicación 28, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro total medido para dos o múltiples porciones con el parámetro total correspondiente a un estándar. 33. El método según la reivindicación 28, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro total medido para dos o múltiples porciones con el parámetro total correspondiente a un control interno. 34. El método según la reivindicación 1, en el que dicha DPP especifica es DPP-IV. 35. Un método para el diagnóstico o el pronóstico de un estado patológico o trastorno, caracterizado por un parámetro de dipeptidil peptidasa (DPP) que comprende: medir al menos un parámetro de' una o múltiples isoformas discriminadas de DPP de una muestra de paciente; y correlacionar dicho parámetro DPP medido con la presencia, ausencia o gravedad de dicho estado patológico o trastorno . 36. El método según la reivindicación 35, en el que dicho estado patológico se selecciona del grupo consistente en un estado patológico del metabolismo, cáncer, una infección vírica, y una enfermedad autoinmune. 37. El método según la reivindicación 35, en el que dicho parámetro se selecciona del grupo consistente en cantidad, concentración, actividad, expresión, tipo de modificación post-traslacional y cantidad de modificación post-traslacional . 38. El método según la reivindicación 35, en el que se mide más de un parámetro DPP. 39. El método según la reivindicación 35, en el que dicha muestra de paciente se selecciona del grupo consistente en tejido, sangre, plasma, suero, saliva, lágrimas, moco, orina, líquido amniótico, líquido sinovial, fluido seminal, líquido cefalorraquídeo, y sus combinaciones. 40. El método según la reivindicación 35, que comprende, adicionalmente, comunicar la presencia, ausencia o gravedad del estado patológico a un operador. 41. El método según la reivindicación 35, que comprende, además, discriminar isoformas de DPP en la muestra del paciente. 42. El método según la reivindicación 41, en el que dicha discriminación se lleva a cabo antes de dicha medición. 43. El método según la reivindicación 41, en el que dicha discriminación se lleva a cabo simultáneamente con dicha medición. 44. El método según la reivindicación 41, en el que dicha muestra de paciente se procesa antes de dicha medición. 45. El método según la reivindicación 41, en el que dicha discriminación se lleva a cabo por separación o asilamiento físico. 46. El método según la reivindicación 45, en el que dichas porciones de DPP se discriminan en base al punto isoeléctrico de las isoformas de DPP. 47. El método según la reivindicación 35, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro medido con el parámetro correspondiente de un estándar. 48. El método según la reivindicación 35, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro medido con el parámetro correspondiente de un control interno. 49. El método según la reivindicación 35, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro de al menos una isoforma con el parámetro total medido, correspondiente a dos o múltiples otras isoformas. 50. El método según la reivindicación 49, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro de al menos una isoforma con el parámetro total medido, correspondiente a todas las isoformas. 51. El método según la reivindicación 35, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro medido de al menos una isoforma con el parámetro medido correspondiente a al menos otra isoforma. 52. El método según la reivindicación 35, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro total medido para dos o más isoformas con el parámetro total correspondiente de un estándar. 53. El método según la reivindicación 35, en el que dicha correlación comprende comparar el parámetro total medido para dos o más isoformas con el parámetro total correspondiente de un control interno. 54. Un método para el diagnóstico o el pronóstico de una diabetes de tipo II, que comprende: medir al menos un parámetro de una o múltiples porciones discriminadas de isoformas de DPP-IV de una muestra de paciente; y correlacionar dicho parámetro medido con la presencia, ausencia o gravedad de dicho estado patológico o trastorno. 55. El método según la reivindicación 54, en el que cada porción medida contiene una o múltiples isoformas de DPP-IV. 56. El método según la reivindicación 54, en el que cada porción medida contiene una isoforma de DPP-IV. 57. El método según la reivindicación 54, en el que una o múltiples porciones no contienen isoformas de DPP-IV, y otras porciones contienen una o múltiples isoformas de DPP-IV. 58. El método según la reivindicación 54, en el que dicho parámetro se selecciona del grupo consistente en cantidad, concentración, actividad, expresión, tipo de modificación post-traslacional y cantidad de modificación post-traslacional. 59. El método según la reivindicación 58, en el que dicho parámetro es actividad de DPP-IV. 60. El método según la reivindicación 59, en el que dicha actividad de DPP-IV se mide a través de un ensayo que detecta la presencia o la cantidad de un producto de hidrólisis de la actividad de DPP-IV sobre un sustrato marcado. 61. El método según la reivindicación 60, en el que dicho sustrato es X-Y-R, en donde X es cualquier aminoácido, Y es alanina, prolina o arginina, y R es cualquier marca detectable . 62. El método según la reivindicación 54, en el que dicho parámetro se mide usando un anticuerpo o lectina especifica para una o múltiples isoformas de DPP. 63. El método según la reivindicación 54, en el que se mide más de un parámetro DPP-IV. 64. El método según la reivindicación 54, en el que dicha muestra de paciente se selecciona del grupo consistente en sangre, plasma, suero y sus combinaciones. 65. El método según la reivindicación 54, que comprende, además, comunicar la presencia, ausencia o gravedad de la diabetes de tipo II a un operador. 66. El método según la reivindicación 54, que comprende, adicionalmente , discriminar la DPP-IV en porciones . 67. El método según la reivindicación 66, en el que dicha discriminación se lleva a cabo antes de dicha medición. 68. El método según la reivindicación 54, en el que dichas isoformas de DPP-IV se discriminan en base al punto isoeléctrico . 69. El método según la reivindicación 68, en el que el parámetro medido es la actividad de DPP-IV. 70. El método según la reivindicación 69, en el que se mide la actividad de un rango continuo de porciones. 71. El método según la reivindicación 70, que comprende, además, obtener un perfil de actividad a lo largo del rango continuo de porciones. 72. El método según la reivindicación 71, en el que la presencia de la diabetes se correlaciona con una característica de perfil de actividad seleccionada del grupo consistente en: a. el porcentaje de actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo, presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de o menor que aproximadamente pH 4,4, no supera aproximadamente el 90%; el porcentaje de la actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo, presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y menor que aproximadamente pH 4,15 no supera aproximadamente el 60%; al menos, aproximadamente un 10% de la actividad total de DPP-IV d todas las porciones medidas del rango continuo está presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y mayor que aproximadamente pH 4,4; al menos, aproximadamente un 40% de la actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo está presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y mayor que aproximadamente pH 4,15; un pico del perfil de actividad de DPP-IV a aproximadamente pH 4,4, en donde dicho pico está asociado con al menos aproximadamente un 10% de la actividad total medida del rango continuo; un pico del perfil de actividad de DPP-IV a aproximadamente pH 4,8, en donde dicho pico está asociado con al menos aproximadamente un 10% de la actividad total medida del rango continuo; g. una desviación del perfil de actividad de DPP-IV a un pH superior, comparado con un control interno negativo; h. una desviación del perfil de actividad de DPP-IV a un pH superior, comparado con un estándar negativo; y i. combinaciones de los mismos. 73. El método según la reivindicación 71, en el que la ausencia de diabetes se correlaciona con una característica del perfil de actividad seleccionada del grupo consistente en : a. al menos, aproximadamente un 90% de la actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo se encuentra presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y menor que aproximadamente pH 4,2; b. al menos, aproximadamente un 60% de la actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo está presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y menor que aproximadamente pH 3,9; el porcentaje de actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo, presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y mayor que aproximadamente pH 4,2, no supera aproximadamente el 10%; el porcentaje de la actividad total de DPP-IV de todas las porciones medidas del rango continuo, presente en las isoformas discriminadas a un punto isoeléctrico asociado con un intervalo de pH de y mayor que aproximadamente pH 3,9, no supera aproximadamente el 40%; una desviación del perfil de actividad de DPP-IV a pH menor, comparado con un control interno positivo; una desviación del perfil de actividad de DPP-IV a pH menor, comparado con un estándar positivo; y combinaciones de los mismos.