ES2541936T3 - Proteínas mutantes de la proteína F de PIV-5 y de PIV-2 - Google Patents
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Abstract
Proteína mutante, cuya secuencia en aminoácidos comprende una secuencia que difiere de la de la proteína F de un virus PIV-5 o PIV-2: - por sustitución: - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 22, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 24, por el aminoácido P, y - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 132, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 133, por el aminoácido E, y - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 290, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 294, por el aminoácido A, y - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 447, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 445, por el aminoácido P, - y por sustitución: - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 147, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en posición 151, por un aminoácido hidrófobo seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V, y/o - del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 158, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en posición 162, por un aminoácido hidrófobo seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V, - y, opcionalmente: - por sustitución del sitio de escisión nativo de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimático, y/o por inserción en dicha proteína F de un sitio de escisión enzimático diferente del sitio de escisión nativo de esta proteína F, y/o - por supresión de una parte C-terminal de dicha proteína F, extendiéndose dicha parte C-terminal en dirección N-terminal a partir del último aminoácido en el extremo C-terminal de la proteína, pero sin extenderse más allá del dominio HR2 de dicha proteína F, la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5 o PIV-2 que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34.
Description
DESCRIPCIÓN
Proteínas mutantes de la proteína F de PIV-5 y de PIV-2
Campo técnico 5
La presente solicitud se refiere a proteínas mutantes de la proteína de fusión (proteína F) del virus Parainfluenza (PIV) que están actualmente catalogadas bajo PIV de tipo 5 (PIV-5 o PIV5) y PIV de tipo 2 (PIV-2 o PIV2).
La presente solicitud se refiere a productos que derivan de ellos, tales como: 10
* ácidos nucleicos, vectores, células,
* inhibidores de fusión de tipo anticuerpo, aptámeros, ARN interferente,
15
* mielomas, hibridomas,
* células madre y progenitoras.
La presente solicitud se refiere también a estas proteínas mutantes y productos que derivan de ellas para su 20 utilización en aplicaciones médicas y biotecnológicas.
Técnica anterior
El virus Parainfluenza (PIV) que está actualmente catalogado bajo PIV de tipo 5 (PIV-5 o PIV5) es un virus con 25 envoltura del género Rubulavirus de la familia de las Paramyxoviridae. PIV-5 se conocía anteriormente bajo el nombre de SV5 (Simian Virus 5), ya que su aislamiento se realizó inicialmente a partir de cultivos primarios de células de mono. El hospedante natural de PIV-5 parece ser sin embargo el perro, en el que causa una tos conocida con el nombre de tos de las perreras.
30
Después, se han obtenido algunos aislados de PIV-5 a partir de muestras extraídas en humanos, pero que han sido colocadas en cultivo sobre células animales. Además, no está asociado ningún síntoma o enfermedad al PIV-5 en el ser humano. La cuestión de saber si el ser humano es efectivamente un hospedante para PIV-5 está por lo tanto hoy día todavía sujeta a debate.
35
En cualquier caso, el virus PIV-5 es actualmente considerado como un virus animal.
El virus de la Parainfluenza (PIV) que está actualmente catalogado bajo el PIV de tipo (PIV-2 o PIV2) es también un virus con envoltura del género Rubulavisu de la familia de los Paramyxoviridae.
40
Hoy día, sólo se han identificado unos aislados humanos de PIV-2 (hPIV-2), de manera que el PIV-2 está considerado como un virus humano.
Los virus PIV-5 y PIV-2 son muy parecidos el uno del otro, tanto en términos de secuencias de ácidos nucleicos, como de secuencias proteicas, de organización, de estructura y de morfología. 45
Entre los virus de Parainfluenza humanos, el PIV-2 es el virus más parecido a PIV-5 que se ha encontrado en el ser humano.
El PIV-2 se puede considerar, y así se considera por lo menos por los inventores, como el equivalente humano de 50 PIV-5.
La infección por PIV-5 o PIV-2 conduce a la formación de estructuras plurinucleares denominadas sincitio, que resulta de la fusión de células del hospedante infectado.
55
La entrada de los virus PIV-5 y PIV-2 en la célula hospedante se realiza mediante la fusión de la envoltura viral con la membrana celular.
Esta fusión implica dos glicoproteínas virales: la proteína de fijación hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y la proteína de fusión (F). 60
La proteína de fusión F de PIV-5 y PIV-2 se sintetiza en forma de un simple precursor (F0) y se presenta en forma de un homotrímero glicosilado. La proteína de fusión F de PIV-5 y PIV-2 necesita una escisión proteolítica por unas furinas del hospedante para generar una forma "pre-activada" que consiste en dos subunidades unidas por unos puentes disulfuros: una gran subunidad F1 carboxi-terminal y una pequeña subunidad amino-terminal F2. 65
La sub-unidad F1 está compuesta de un péptido de fusión hidrófobo (FP) así como dos dominios repetidos en heptadas (HR-1 y HR-2), que presentan una conformación de tipo super-enrollado ("coiled-coil"). Después de la activación por HN, la proteína de fusión sufre un conjunto de cambios conformacionales que resultan en la inserción del péptido de fusión en la membrana celular diana. Tras lo cual se produce la interacción entre los dominios HR-1 y HR-2 que acercan la envoltura viral de la membrana celular (Russell et al. 2006). Estos dominios son conocidos por 5 formar un haz ("bundle") de seis hélices muy estable constituido de una estructura trimérica super-enrollada ("coiled-coil") en la que tres dominios HR-1 están unidos con tres dominios HR-2 en orientación antiparalela. Esta conformación representa la forma de post-fusión de la proteína F (Baker et al. 1999, Sergel-Germano et al. 2000, West et al. 2005).
10
La proteína de fusión F de PIV-5 y PIV-2 necesita una proteína HN que proviene del mismo tipo viral para que no haya promoción de la fusión (Yao et al. 1997). Sin embargo, la naturaleza precisa de las interacciones que existen entre F y HN no es todavía bien conocida.
No obstante, varios estudios han mostrado que algunas cepas de PIV-5 y de PIV-2 difieren en su necesidad de HN 15 para la activación de la fusión.
Por ejemplo, Ito et al. 1997 describen dos cepas de "SV5" (PIV-5) a saber W3A y WR, cuyas proteínas F difieren sólo por los tres aminoácidos (residuos 22, 443 y 516). La proteína F de la cepa W3A es capaz de inducir la fusión de manera autónoma, es decir en ausencia de la proteína HN, mientras que la proteína F de la cepa WR no es 20 capaz de ello.
Ito et al. 1997 indican que la actividad fusogénica de la proteína F de la cepa WR puede ser reestablecida sustituyendo el aminoácido de la posición 22 de esta proteína por un aminoácido prolina.
25
Ito et al. 2000 sugieren que el aminoácido E de la posición 132 y el aminoácido A de la posición 290 de la proteína F de las cepas W3A y WR podrían estar implicados en la capacidad de la proteína F de estas cepas para ser autónoma de la proteína HN.
Paterson et al. 2000 indican que la presencia del aminoácido prolina de la posición 22 de la proteína F de la cepa 30 W3A, la presencia del aminoácido 443 de la proteína F de la cepa WR podrían aumentar la capacidad fusogénica de estas cepas virales.
Russell et al. 2003 indican que el hecho de sustituir los residuos L447 y l449 de la proteína F de la cepa W3A por unos aminoácidos aromáticos podría aumentar la capacidad fusogénica de esta cepa viral. 35
Gardner y Dutch 2007 indican que la mutación I49A de la proteína F de un virus "SV5" (PIV-5) de tipo salvaje tendría un efecto pro-fusogénico.
Gardner et al. 2007 indican que la mutación V402A de la proteína F de un virus "SV5" (PIV-5) de tipo salvaje tendría 40 un efecto pro-fusogénico.
Kawano et al., 1990 (Virology 178: 289-292) se refiere a clones de ADNc que representan el gen de fusión (F) del virus PIV-2.
45
En lo referente a la proteína PIV-2, no parece haber documento en la técnica anterior que describiera la introducción de mutación(es) en la secuencia de la proteína F de este virus, a fin de intentar aumentar su autonomía y su capacidad fusogénica.
Por otra parte, existen otras numerosas proteínas virales capaces de fusión, tales como por ejemplo las proteínas 50 HA1/HA2 de Influenza, la proteína G de los Rhabdovirus, las proteínas gp41/gp120 del VIH. Los conocimientos actuales en cuestión de capacidades de fusogenicidad y de autonomía de estas diferentes proteínas virales siguen siendo hoy día muy limitados.
En cualquier caso, los conocimientos actuales en cuestión de proteínas de fusión virales no aportan un dominio 55 técnico que sea suficiente para considerar unas aplicaciones médicas y/o biotecnológicas efectivas.
Resumen de la invención
Los inventores han considerado que el hecho de disponer de una proteína de fusión que sea hiperfusogénica y que 60 tenga asimismo una gran autonomía en su capacidad de fusión permitiría aportar una solución a un cierto número de situaciones médicas y biotecnológicas.
Los inventores han realizado entonces una selección selectiva frente a la proteína F de PIV-5 y/o PIV-2 con respecto al conjunto de las demás proteínas de fusión virales, tales como las proteínas HA1/HA2 de Influenza, la proteína G 65 de los Rhabdovirus, las proteínas gp41/gp120 del VIH.
Después, han construido unas proteínas F mutantes, que son capaces de fusogenicidad en ausencia de la proteína HN.
Las proteínas mutantes de la invención demuestran una fuerte capacidad de fusogenicidad y una fuerte autonomía. 5 No necesitan la presencia de la proteína HN para inducir la fusión celular y la formación de sincitio.
Los inventores muestran además que es posible introducir en estas proteínas mutantes un sitio de escisión diferente del que presenta la proteína F en estado natural, y más particularmente un sitio de escisión específico del tejido.
10
Los inventores proponen además unas aplicaciones médicas (terapéuticas, preventivas, paliativas, pero también de diagnóstico) y/o biotecnológicas de las proteínas mutantes de la invención y/o de los productos que resultan o que derivan de ello.
Más particularmente, los inventores proponen utilizar las proteínas mutantes de la invención o los ácidos nucleicos 15 que los codifican, para tratar, prevenir o paliar, por vía in vivo o por vía ex vivo, las enfermedades o disfunciones para las cuales se desea inducir o aumentar la formación de sincitio, tales como los cánceres, (más particularmente los cánceres metastáticos, preferiblemente los melanomas metastáticos) o las deficiencias del desarrollo placentario.
Los inventores proponen además unos agentes que bloquean la proteína F de PIV-5 y/o PIV-2, tales como unos 20 anticuerpos, unas células dendríticas recombinantes, unos antisentidos, unas ARNsi, unos ácidos nucleicos aptámeros, para tratar, prevenir o paliar, por vía in vivo o por vía ex vivo, las enfermedades o disfunciones para las cuales se desea inhibir o bloquear la formación de sincitio, tales como las infecciones por virus con envoltura, las alergias, las enfermedades autoinmunes, los rechazos de injerto.
25
Los inventores proponen además unos medios de diagnóstico para detectar la formación excesiva, o por el contrario insuficiente, de sincitio.
Los inventores proponen además diferentes medios biotecnológicos para el cribado de principios activos capaces de disminuir la formación de sincitio. 30
Los inventores proponen además unas células cancerosas, más particularmente unos mielomas, que comprenden una proteína mutante de la invención. Los inventores proponen además unos hibridomas que comprenden una proteína mutante de la invención.
35
Las células cancerosas, más particularmente los mielomas de la invención, son capaces de fusionarse con otra célula, y más particularmente con un linfocito B, sin utilizar polietilenglicol (PEG), ni electroporación, ni ningún otro medio inductor de fusión. Las células cancerosas, más particularmente los mielomas de la invención, son capaces de fusión autónoma.
40
Los hibridomas de la invención pueden ser producidos por una fusión (de linfocitos B con mielomas) que no requiere la utilización de polietilenglicol (PEG), ni electroporación, ni ningún otro medio inductor de fusión. En efecto, los hibridomas de la invención pueden ser producidos utilizando al menos una célula cancerosa, más particularmente al menos un mieloma de la invención.
45
Los inventores proponen además unas células madres o progenitoras recombinantes, que expresan una proteína mutante de la invención, y sus aplicaciones en la producción de fibras musculares.
Otros aspectos de la invención se encuentran descritos en la parte "descripción detallada" más adelante.
50
Breve descripción de las figuras
El juego de figuras de la solicitud tal como se deposita, se ha depositado en colores. Es accesible mediante consulta en el dossier en la Oficina.
55
Figura 1A: secuencia de la proteína F de PIV-5 de referencia (SEC ID NO: 31; secuencia de la proteína F del aislado WR) y secuencia CDS correspondiente (SEC ID NO: 30; secuencia de ácidos nucleicos que codifican la proteína de la SEC ID NO: 31).
En negrita y subrayado dentro de la secuencia SEC ID NO: 31, se señalan los aminoácidos de las posiciones: 60
- 22 (L),
- 49 (I),
- 132 (E, mutación pre-existente en este aislado),
- 147 (T); 65
- 158 (T),
- 290 (A, mutación pre-existente en este aislado),
- 402 (V),
- 443 (P, mutación teóricamente pre-existente en este aislado),
- 447 (L),
- 449 (I), y 5
- 463 (A).
Figura 1B: secuencia de la proteína F de PIV-2 de referencia (SEC ID NO: 33; secuencia de la proteína F del aislado Greer) y secuencia CDS correspondiente (SEC ID NO: 32; secuencia de ácidos nucleicos que codifican la proteína de la SEC ID NO: 33). 10
En negrita y subrayado dentro de la secuencia de SEC ID NO: 33, se señalan los aminoácidos de posiciones:
- 24 (I),
- 53 (I), 15
- 133 (K),
- 151 (T),
- 162 (S),
- 294 (I),
- 406 (A), 20
- 428 (S),
- 439 (S),
- 445 (I),
- 474 (S).
25
Figura 2A: alineación de la proteína F de PIV-5 (aminoácidos 4 a 529 de la SEC ID NO: 31) sobre la de PIV-2 (aminoácidos 8 a 533 de la SEC ID NO: 33): la identidad proteica es del 47,7% entre estas dos proteínas. La secuencia consenso resultante de esta alineación se referencia bajo la SEC ID NO: 34.
Figura 2B: aminoácido(s) y mutación(es) dentro de la proteína F de PIV-2, que corresponde a los de la proteína F de 30 PIV-5
Figura 3: ilustración de la sustitución del sitio de escisión natural (SEC ID NO: 23) de la proteína F de PIV-5 por un sitio de escisión tejido-específico, en este caso por el sitio de una enzima expresada específicamente por el tejido metastático, a saber la metalo-proteasa matricial 9 (MMP-9). 35
Sitio consenso de un sitio MMP-9: secuencia de la SEC ID NO: 27 (sitio PXXhyS/T con X = cualquier aminoácido y Hy = cualquier aminoácido hidrófobo, es decir cualquier aminoácido de entre F, M, V, L, I).
Secuencia ilustrativa de un sitio MMP-9: secuencia de la SEC ID NO: 28, secuencia de la SEC ID NO: 29. 40
Figura 4: estructura del plásmido pcDNA3.1 en el que se ha clonado la secuencia que codifica la proteína F de PIV-5.
Amp: gen de resistencia a la ampicilina 45
pCMV: promotor del Citomegalovirus
MCS: sitio de clonación múltiple (Multiple Cloning Site)
F PIV5: proteína F de PIV-5
BGHpolyA: señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bovine Growth Hormone polyA)
50
Figuras 5A, 5B, 5C, 5D: visualización de las mutaciones realizadas por los inventores en la proteína F de PIV-5
Figura 6A: ilustración de las observaciones realizadas con microscopio durante ensayos de fusión semi-cuantitativos (grupo amplio de mutantes realizados por los inventores)
55
Figura 6B: diagrama que presenta los resultados de fusión obtenidos al final de los ensayos de fusión semi-cuantitativos (grupo amplio de mutantes realizados por los inventores)
Figura 7A: ilustración de las observaciones realizadas con microscopio durante ensayos de fusión semi-cuantitativos (grupo amplio de mutantes realizados por los inventores) 60
Figura 7B: diagrama que presenta los resultados de fusión obtenidos al final de los ensayos de fusión semi-cuantitativos (selección de mutantes realizados por los inventores)
Descripción detallada
En la presente solicitud, el término proteína incluye dentro de su alcance el término de glicoproteína. Este en particular el caso para las proteínas F y HN, que son en realidad unas glicoproteínas.
5
Proteína F de PIV-5 y PIV-2 (proteína no mutante):
Una secuencia de la proteína F de PIV-5 se presenta en la figura 1A (secuencia proteica de la SEC ID NO: 31; secuencia ácido nucleico codificante de la SEC ID NO: 30). Se trata de la secuencia del aislado WR, que es un aislado de simio. Estas secuencias son las disponibles en la base de datos Genbank bajo el número AB021962. 10
La muestra de aislado WR que los inventores han recibido de ATCC y que han utilizado para la construcción y la producción de las proteínas mutantes descritas en los ejemplos siguientes no presentaba sin embargo el aminoácido P en la posición 443 de la proteína F (al contrario de lo que se esperaba a la vista de la secuencia disponible en Genbank), sino el aminoácido S. Esta secuencia alternativa de la proteína F del aislado WR es por lo tanto idéntica a 15 la secuencia
SEC ID NO: 31, con la excepción del aminoácido en la posición 443 que es S y no P. con fines de brevedad, esta secuencia alternativa se anotará aquí como "SEC ID NO: 31 con S en 443".
20
La secuencia de SEC ID NO: 31 y la secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", preferiblemente la secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443 ", sirven de referencia de secuencia(s) de la proteína F de PIV-5 en el ámbito de la presente solicitud de patente.
Dicho esto, existen por supuesto unos aislados de PIV-5 diferentes del aislado WR, y en particular: 25
- otros aislados de simios, tales como por ejemplo el aislado W3A,
- unos aislados de otros animales no humanos, tales como:
30
* unos aislados caninos, por ejemplos los aislados caninos CPI+, CPI-, H221, 78524, T1,
* unos aislados porcinos, por ejemplo el aislado porcino SER,
- unos aislados denominados "humanos" que proceden de extracciones efectuadas sobre seres humanos pero que han sido puestos en cultivo sobre células animales (véase la parte introductiva anterior), tales como el aislado MIL, 35 el aislado DEN, el aislado LN, el aislado MEL, y el aislado que, en el documento WO 02 077211, está descrito como un "criptovirus".
Las variaciones de secuencias de las proteínas F de estos diferentes aislados PIV-5 son muy débiles.
40
Una descripción de estas variaciones se da en Chatziandreou et al. 2004, cuyo contenido, y más particularmente la tabla 3, y los comentarios que están asociados a ella durante este artículo, son incorporados como referencia en la presente solicitud de patente.
La tabla 3 de este artículo se reproduce aquí: 45
Tabla 1 (reproducida del artículo Chatziandreou et al. 2004):
- Cepa
- aa
- W3A (SEC ID NO: 35)
- WR (SEC ID NO: 31) MIL (SEC ID NO: 36) DEN (SEC ID NO: 37) LN (SEC ID NO: 38) MEL (SEC ID NO: 39) Criptovirus (SEC ID NO: 40) CPI+ (SEC ID NO: 41) CPI-(SEC ID NO: 42) H221 (SEC ID NO: 43) 78524 (SEC ID NO: 44) T1 (SEC ID NO: 45) SER (SEC ID NO: 46)
- G
- S 2
- T
- I I I I 3
- I
- R R R 4
- F
- S 7
- A
- S S T 17
- S
- G G G G 19
- P
- L 22
- S
- P P 71
- V
- M 76
- N
- Y Y Y 92
- E
- K K K K K K 132
- A
- T 134
- Cepa
- aa
- W3A (SEC ID NO: 35)
- WR (SEC ID NO: 31) MIL (SEC ID NO: 36) DEN (SEC ID NO: 37) LN (SEC ID NO: 38) MEL (SEC ID NO: 39) Criptovirus (SEC ID NO: 40) CPI+ (SEC ID NO: 41) CPI-(SEC ID NO: 42) H221 (SEC ID NO: 43) 78524 (SEC ID NO: 44) T1 (SEC ID NO: 45) SER (SEC ID NO: 46)
- A
- V V V 135
- A
- T 149
- V
- I 176
- I
- M 271
- T
- A 279
- A
- V 290
- T
- K K 307
- M
- I I I I I I I 310
- M
- R 346
- L
- F 366
- V
- M 370
- Y
- F F 377
- M
- I I 407
- Y
- H H H 408
- N
- D 417
- F
- L L 420
- V
- I 428
- S
- T T T T T T T 438
- S
- P P P P P P P P P P P P 443
- H
- N N 451
- I
- M 489
- L
- F F F F 498
- L
- S S 500
- V
- A A 507
- K
- R R 510
- V
- A A A A A A A A A A A T 516
- K
- N N N N N N N N N N N 529
- Stop
- Stop
- Q S S S S S S S 530
- H Y Y 533
- S Stop P 535
- Q R R R R R R R 536
- aa: posición del aminoácido
En la tabla anterior, una casilla vacía indica que la proteína F en cuestión presenta el mismo aminoácido que la proteína F de la cepa W3A indicada en la columna de la izquierda.
Los aminoácidos cuyas posiciones no están expresamente listadas en esta tabla son por supuesto idénticos a los 5 que les corresponden en la secuencia de la proteína F de W3A. Estos aminoácidos son en sí mismos idénticos a los que les corresponden en la secuencia de la proteína F del aislado WR (véase la secuencia de la SEC ID NO: 31).
Así, las secuencias de SEC ID NO: 35 a 46 son las secuencias que resultan de la sustitución en la secuencia de la SEC ID NO: 31 de los aminoácidos indicados en la tabla 1 para cada una de estas secuencias (y, llegado el caso, de 10 la adición de la secuencia de la SEC ID NO: 31 de los aminoácidos indicados en la parte C-terminal).
La proteína F del aislado W3A, así como la de los otros aislados anteriormente mencionados, presenta:
- en la posición 147, el aminoácido T, 15
- en la posición 158, el aminoácido T,
- en la posición 447, el aminoácido L, y
- en la posición 449, el aminoácido I.
Se observa así que los aislados W3A y WR no presentan la extensión citoplásmica que, en los otros aislados, se 20 extiende más allá de la posición 529. Según el aislado en cuestión, esta extensión citoplásmica contiene de dos a siete aminoácidos.
Se observa también que las secuencias de las proteínas F de estos aislados varían de menos del 5% (más particularmente, de como máximo el 3%) con respecto a la secuencia de la proteína F de la cepa WR (sin tener en 25 cuenta la extensión citoplásmica, es decir calculando este porcentaje sobre la longitud de la proteína F de WR); véase el final de la página 85 del artículo de Chatziandreou et al. 2004.
Una proteína F de PIV-5 puede por lo tanto consistir en:
30
- la secuencia de la SEC ID NO: 31, o dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", o en
- una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 31 o de esta secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", pudiendo esta secuencia variante estar definida por:
5
* ser de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 o inferior de un máximo de 7 aminoácidos de la SEC ID NO: 31 o superior de un máximo de 7 aminoácidos a la de la SEC ID NO: 31 [dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443" presenta el mismo tamaño que la secuencia de la SEC ID NO: 31], preferiblemente de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 o superior de un máximo de 7 aminoácidos a la de la SEC ID NO: 31, y
10
* presentar una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 31 o a dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443" (siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 31 o, llegado el caso, de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443").
15
Las secuencias variantes de la proteína F de PIV-5 de SEC ID NO: 31 comprenden en particular las secuencias de las proteínas F de los aislados W3A, MIL, DEN, LN, MEL, criptovirus, CPI+, CPI-, H221, 78524, T1 y SER mencionados antes (véase la tabla 1 anterior y el artículo de Chatziandreou et al. 2004).
De manera similar, la secuencia que, en la presente solicitud, sirve de referencia para la proteína F de PIV-2 es la 20 secuencia de la cepa Greer que se representa en la figura 1B (secuencia proteica de la SEC ID NO: 33, secuencia ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 32).
Por supuesto, existen unos aislados PIV-2 diferentes del aislado Greer, tales como por ejemplo los aislados Toshiba, V98, V94. 25
La secuencia de la proteína F de estos otros aislados PIV-2 está muy próxima de la del aislado Greer, pero presenta algunas pequeñas variaciones que son unas variaciones inter-aislados. Así, una proteína F de PIV-2 puede por lo tanto consistir en:
30
- la secuencia de la SEC ID NO: 33, o en
- una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 33, pudiendo esta secuencia variante ser definida por:
* ser de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33 o inferior en un máximo de dos aminoácidos al de la SEC ID NO: 35 33 o superior en un máximo de dos aminoácidos al de la SEC ID NO: 33, preferiblemente de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33, siendo preferiblemente de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33, y
* presentar una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 33 (siendo esta identidad calculada sobre la 40 longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 33).
La secuencia consenso (SEC ID NO: 34) que resulta del alineamiento de la secuencia de la proteína F de PIV-5 (SEC ID NO: 31) sobre la de PIV-2 (SEC ID NO: 33) es la siguiente, y se puede leer en la figura 2A. Esta secuencia consenso puede ser retranscrita de la siguiente manera: 45
Indicando el símbolo "-" que les proteínas F de PIV-5 y de PIV-2 tienen en esta posición unos aminoácidos diferentes.
Esta secuencia consenso puede también ser formalizada de la siguiente manera:
5
con X = cualquier aminoácido. 10
La secuencia de la proteína F del aislado WR de PIV-5 es la secuencia de la SEC ID NO: 34 precedida de los aminoácidos MGT en el extremo N-terminal (véanse las figuras 1A y 2A).
La secuencia de la proteína F del aislado Greer de PIV-2 es la secuencia de la SEC ID NO: 34, precedida de los 15 aminoácidos MHHLHPM (SEC ID NO: 86) en el extremo N-terminal y seguida de los aminoácidos ENPAFFSKNNHGNIYGIS (SEC ID NO: 87) en el extremo C-terminal (véanse las figuras 1B y 2A).
La secuencia de las proteínas F de PIV-5 y PIV-2 se puede considerar como una secuencia que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34, preferiblemente como la secuencia de una proteína F de virus PIV que comprende 20 la secuencia de SEC ID NO: 34. Más particularmente, la secuencia de las proteínas F de PIV-5 y PIV-2 se puede considerar como:
a) la secuencia de la SEC ID NO: 34:
25
▪ precedida de 3 a 7 aminoácidos en el extremo N-terminal, más particularmente de 3 aminoácidos (tales como MGT) o de 7 aminoácidos (tales como MHHLHPM) en el extremo N-terminal, y
▪ eventualmente seguida de 18 aminoácidos en el extremo C-terminal, más particularmente de los aminoácidos ENPAFFSKNNHGNIYGIS en el extremo C-terminal, o 30
b) una secuencia variante de la secuencia descrita en a) anteriormente, siendo dicha secuencia variante:
▪ o bien:
35
i. de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 o inferior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31 o superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31, preferiblemente de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 o superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31, y
ii. que presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más 40 preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 31 o a dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443" (siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 31 o, llegado el caso, de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443");
▪ o bien: 45
i. de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33 o inferior en un máximo de dos aminoácidos al de la SEC ID NO: 33 o superior en un máximo de dos aminoácidos al de la SEC ID NO: 33, preferiblemente de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33, y
ii. que presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 33 (siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 33).
5
Proteínas mutantes de la invención:
La presente solicitud se refiere a una proteína mutante, cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que es susceptible de derivar de la de la proteína F de un virus PIV-5 o PIV-2:
10
- por sustitución:
- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 22, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 24, por el aminoácido P (mutación 22P en F de PIV-5; mutación 24P en F de PIV-2), y 15
- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 132, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 133 (mutación 132E en F de PIV-5; mutación 133E en F de PIV-2), por el aminoácido E, y
20
- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 290, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 294, por el aminoácido A (mutación 290A en F de PIV-5; mutación 294A en F de PIV-2), y
- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 449, o que, en la 25 secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 439, por el aminoácido P(mutación 449P en F de PIV-5; mutación 439P en F de PIV-2),
- y por sustitución:
30
- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en posición 147, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en posición 151, por un aminoácido hidrófobo seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V (mutación 147Hy en F de PIV-5; mutación 151Hy en F de PIV-2), y/o
- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en posición 158, o que, en la 35 secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en posición 162, por un aminoácido hidrófobo seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V (mutación 158Hy en F de PIV-5; mutación 162Hy en F de PIV-2),
- y, opcionalmente:
40
- por sustitución del sitio de escisión nativo (o natural) de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimática, y/o por inserción en dicha proteína F de un sitio de escisión enzimático diferente del sitio de escisión nativo (o natural) de esta proteína F, y/o
- por supresión de una parte C-terminal de dicha proteína F, extendiéndose dicha parte C-terminal en dirección N-45 terminal a partir del último aminoácido en el extremo C-terminal de la proteína, pero sin extenderse más allá del dominio HR2 de dicha proteína F.
Dichas posiciones de aminoácidos se calculan con respecto a la secuencia de la forma precursora (F0) de dicha proteína F (es decir la secuencia de la proteína F antes de la escisión), contando las posiciones del extremo N-50 terminal hacia el extremo C-terminal.
Las posiciones indicadas en la proteína F de PIV-2 son las posiciones que corresponden a las indicadas en la proteína F de PIV-5: véase la figura 2B, que da la tabla de las correspondencias de posiciones.
55
La secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5 o PIV-2 es tal como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, se puede definir como que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34 (secuencia consenso de las proteínas F de PIV-5 y PIV-2).
Proteína mutante de la proteína F de PIV-5: 60
Según un aspecto de la invención, una proteína mutante de la invención comprende una secuencia que es susceptible de derivar de la de la proteína F de un virus PIV-5.
- la secuencia de la SEC ID NO: 31 (secuencia de la proteína F del aislado WR de PIV-5 presentada en la figura 1A), 65 o de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", o en
- una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 31 o de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", esta secuencia variante:
* es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 529 aminoácidos), o es de un tamaño 5 superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 530, 531, 532, 533, 534, 535 o 536 aminoácidos), o es de un tamaño inferior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 522, 523, 524, 525, 526, 527 o 528 aminoácidos), y
* presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente 10 de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 31 o a dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 31 o (llegado el caso) de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443".
Preferentemente, la secuencia de dicha proteína F de PIV-5 consiste en: 15
- la secuencia de la SEC ID NO: 31 (secuencia de la proteína F del aislado WR de PIV-5 presentada en la figura 1A), o dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", o en
- una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 31 o de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 20 con S en 443", esta secuencia variante:
* es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 529 aminoácidos), o es de un tamaño superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31 (es decir que consiste en 530, 531, 532, 533, 534, 535 o 536 aminoácidos), y 25
* presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 31 o a dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 31, o, llegado el caso, de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443". 30
Unos ejemplos de tales secuencias variantes comprenden en particular la secuencia de la proteína F de uno de los aislados W3A, MIL, DEN, LN, MEL, Criptovirus, CPI+, CPI-, H221, 78524, T1 y SER presentada en la tabla 1 en la presente solicitud (véase anteriormente), es decir en una de las secuencias de la SEC ID NO: 35 a 46.
35
Preferentemente, la secuencia de dicha proteína F de PIV-5 consiste en la secuencia de la SEC ID NO: 31 (secuencia de la proteína F del aislado WR de PIV-5 presentada en la figura 1A), o en dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", muy preferiblemente en dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443".
Preferiblemente, dicha secuencia que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-5 es susceptible de 40 derivar de esta secuencia de proteína F por al menos dichas mutaciones 22P, 132E, 290A, 447P y 158Hy mencionadas anteriormente.
Preferiblemente, dicha secuencia que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-5 es susceptible de derivar de esta secuencia de proteína F por al menos dichas mutaciones 22P, 132E, 290A, 447P y 147Hy 45 mencionadas anteriormente.
Preferiblemente, dicha secuencia que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-5 es susceptible de derivar de esta secuencia de proteína F por al menos dichas mutaciones 22P, 132E, 290A, 447P, 147Hy y 158 Hy mencionadas anteriormente. 50
Dicha secuencia susceptible de derivar de la de la proteína F de PIV-5 puede no comprender mutación diferente que las mutaciones 22P, 132E, 290A, 447P y 147Hy/158Hy mencionadas antes, con respecto a dicha secuencia de la proteína F de PIV-5.
55
Alternativamente, dicha secuencia susceptible de derivar de la de la proteína F de PIV-5 puede ser susceptible de derivar de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 22P, 132E, 290A, 447P y 147Hy/158Hy mencionadas antes y por al menos una mutación diferente de estas mutaciones 22P, 132E, 290A, 447P mencionadas antes, preferiblemente por:
60
- al menos una mutación de pre-fusión seleccionada de entre:
- la sustitución del aminoácido en la posición 49 por el aminoácido A,
- la sustitución del aminoácido en la posición 402 por el aminoácido A,
- la sustitución del aminoácido en la posición 443 por el aminoácido P, 65
- la sustitución del aminoácido en la posición 449 por el aminoácido P, y/o por
- al menos una mutación de post-fusión seleccionada de entre:
- la sustitución del aminoácido en la posición 463 por un aminoácido hidrófobo.
5
Preferentemente, dicha secuencia, que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-5, es susceptible de derivar de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 22P, 132E, 290A, 447P y 147Hy/158Hy mencionadas antes, y por:
- al menos una mutación de pre-fusión seleccionada de entre: 10
- la sustitución del aminoácido en la posición 49 por el aminoácido A,
- la sustitución del aminoácido en la posición 402 por el aminoácido A, y/o par
- al menos una mutación de post-fusión seleccionada de entre: 15
- la sustitución del aminoácido en la posición 463 por un aminoácido hidrófobo.
Preferentemente, dicha secuencia, que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-5, es susceptible de derivar de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 22P, 132E, 290A, 447P y 147Hy/158Hy 20 mencionadas antes, y por al menos una mutación de post-fusión seleccionada de entre:
- la sustitución del aminoácido en la posición 463 por un aminoácido hidrófobo.
Dicho aminoácido hidrófobo seleccionado en sustitución del aminoácido en posición 463 se selecciona 25 ventajosamente de entre V, I o L, preferiblemente V.
Tabla 4: selección de las proteínas mutantes de la invención (proteínas mutantes de la proteína F de PIV-5)
- N° de Fus Entre paréntesis: naturaleza de la o de las mutaciones de post-fusión en sus tres mutaciones de autonomía (22P, 132E, 290A) y de la mutación de prefusión 447P
- Resultado de fusión (véase la figura 6B) SEC ID NO:
- 7,1 (147V)
- Aproximadamente 5 62
- 7,2 (158V)
- Aproximadamente 6,5 63
- 7,3 (147V y 158V)
- Aproximadamente 7 64
30
Las mutaciones indicadas en la tabla 4 se pueden introducir en la proteína F de cualquier aislado PIV-5, es decir del aislado WR o de un aislado variante. Por lo tanto, se pueden introducir más particularmente en la secuencia de la proteína F de la SEC ID NO: 31 presentada en la figura 1A (proteína F de WR disponible en la base de datos de Genbank bajo el número AB021962).
35
Como se ha indicado anteriormente, la muestra del aislado WR que los inventores han recibido de ATCC y que han utilizado para la construcción y la producción de las proteínas mutantes descritas en los ejemplos siguientes no presentaba sin embargo el aminoácido P en la posición 443 de la proteína F (contrariamente a lo que se esperaba a la vista de la secuencia disponible en Genbank), sino el aminoácido S. Las mutaciones indicadas en la tabla 4 pueden por lo tanto ser introducidas en dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443" (SEC ID NO: 62, 40 63, 64).
Proteína mutante de la proteína F de PIV-2:
Según otro aspecto de la invención, une proteína mutante de la invención comprende una secuencia que es 45 susceptible de derivar de la de la proteína F de un virus PIV-2.
La secuencia de dicha proteína F de PIV-2 es tal como se ha definido anteriormente. Puede consistir en particular en:
50
- la secuencia de la SEC ID NO: 33 (secuencia de la proteína F del aislado Greer de PIV-2 presentada en la figura 1B), o en
- una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 33, esta secuencia variante:
55
* es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33 (es decir que consiste en 551 aminoácidos), o es de un tamaño superior en un máximo de 2 aminoácidos al de la SEC ID NO: 33 (es decir que consiste en 552 o 553 aminoácidos), o es de un tamaño inferior en un máximo de 2 aminoácidos al de la SEC ID NO: 33 (es decir que consiste en 549 o 550 aminoácidos), y
5
* presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de SEC ID NO: 33, siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 33.
Preferentemente, la secuencia de dicha proteína F de PIV-2 consiste en: 10
- la secuencia de la SEC ID NO: 33 (secuencia de la proteína F del aislado Greer de PIV-2 presentada en la figura 1B), o en
- una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 33, esta secuencia variante: 15
* es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33 (es decir que consiste en 551 aminoácidos), o es de un tamaño superior en un máximo de 2 aminoácidos al de la SEC ID NO: 33 (es decir que consiste en 552 o 553 aminoácidos), y
20
* presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 33, siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 33.
Más preferiblemente, la secuencia de dicha proteína F de PIV-2 consiste en: 25
- la secuencia de la SEC ID NO: 33 (secuencia de la proteína F del aislado Greer de PIV-2 presentada en la figura 1B), o en
- una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 33, esta secuencia variante: 30
* es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33 (es decir, que consiste en 551 aminoácidos), y
* presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 33, siendo esta identidad calculada sobre la 35 longitud de la secuencia de SEC ID NO: 33.
Muy preferiblemente, la secuencia de dicha proteína F consiste en la secuencia de la SEC ID NO: 33 (secuencia de la proteína F del aislado Greer de PIV-2 presentada en la figura 1B).
40
Preferiblemente, dicha secuencia que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-2 es susceptible de derivar de esta secuencia de proteína F por al menos dichas mutaciones 24P, 133E, 294A, 445P y 162Hy mencionadas anteriormente.
Preferiblemente, dicha secuencia que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-2 es susceptible de 45 derivar de esta secuencia de proteína F por al menos dichas mutaciones 24P, 133E, 294A, 445P y 151Hy mencionadas anteriormente.
Preferiblemente, dicha secuencia que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-2 es susceptible de derivar de esta secuencia de proteína F por al menos dichas mutaciones 24P, 133E, 294A, 445P, 162Hy y 151Hy 50 mencionadas anteriormente.
Dicha secuencia susceptible de derivar de la de la proteína F de PIV-5 puede no comprender una mutación diferente de las mutaciones 24P, 133E, 294A, 445P y 151Hy/162Hy mencionadas anteriormente, con respecto a dicha secuencia de la proteína F de PIV-2. 55
Alternativamente, dicha secuencia susceptible de derivar de la de la proteína F de PIV-2 puede ser susceptible de derivar de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 24P, 133E, 294A, 445P y 151Hy/162Hy mencionadas anteriormente y por al menos una mutación diferente de estas mutaciones 24P, 133E, 294A, 445P mencionadas antes, preferiblemente por: 60
- al menos una mutación de pre-fusión seleccionada de entre:
- la sustitución del aminoácido en la posición 53 por el aminoácido A,
- la sustitución del aminoácido en la posición 406 por el aminoácido A, 65
- la sustitución del aminoácido en la posición 428 por el aminoácido P,
- la sustitución del aminoácido en la posición 439 por el aminoácido P, y/o por
- al menos una mutación de post-fusión seleccionada de entre:
5
- la sustitución del aminoácido en la posición 474 por un aminoácido hidrófobo.
Preferentemente, dicha secuencia, que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-2 es susceptible de derivar de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 24P, 133E, 294A, 445P y 151Hy/162Hy mencionadas anteriormente y por: 10
- al menos una mutación de pre-fusión seleccionada de entre:
- la sustitución del aminoácido en la posición 53 por el aminoácido A,
- la sustitución del aminoácido en la posición 406 por el aminoácido A, y/o por 15
- al menos una mutación de post-fusión seleccionada de entre:
- la sustitución del aminoácido en la posición 474 por un aminoácido hidrófobo.
20
Preferentemente, dicha secuencia, que es susceptible de derivar de la de dicha proteína F de PIV-2, es susceptible de derivar de esta secuencia de la proteína F por dichas mutaciones 24P, 133E, 294A, 445P y 151Hy/162Hy mencionadas anteriormente y por al menos una mutación de post-fusión seleccionada de entre:
- la sustitución del aminoácido en la posición 474 por un aminoácido hidrófobo; 25
Dicho aminoácido hidrófobo seleccionado en sustitución del aminoácido en posición 474 se selecciona ventajosamente de entre V, I o L, preferiblemente V.
Tabla 5: selección de las proteínas mutantes de la invención (proteínas mutantes de la proteína F de PIV-2) 30
- Naturaleza de la o de las mutaciones de postfusión de las tres mutaciones de autonomía (24P, 133E, 294A) y de la mutación de prefusión 445P
- SEC ID NO:
- 151V
- 88
- 162V
- 89
- 151V y 192V
- 90
La mutaciones indicadas en la tabla 5 se pueden introducir en la proteína F de cualquier aislado PIV-2, es decir del aislado Greer o de un aislado variante. Por lo tanto, pueden ser más particularmente introducidas en la secuencia de la proteína F de la SEC ID NO: 33 presentada en la figura 1B (proteína F de Greer; SEC ID NO: 88 a 90). 35
SEC ID NO: 88
SEC ID NO: 89
SEC ID NO: 90 5
Sitio de escisión:
10
Conforme a la presente invención, una proteína mutante de la invención puede comprender una secuencia que es susceptible de derivar de la de la proteína F de un virus PIV-5 o PIV-2 por:
- las mutaciones mencionadas anteriormente, y además por
15
- sustitución del sitio de escisión nativo de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimática, y/o por inserción en dicha proteína F de un sitio de escisión enzimática diferente del sitio de escisión nativo de esta proteína F, preferentemente por sustitución del sitio de escisión nativo de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimática.
El sitio de escisión de una proteína F de PIV-5 o PIV-2 es el sitio de escisión de las dos subunidades (FI y F2) de 20 esta proteína F.
En la forma nativa de la proteína F de PIV-5 y PIV-2, este sitio de escisión es un sitio escindido por furinas.
En la forma nativa de la proteína F de PIV-5, este sitio de escisión consiste en la secuencia RRRRR (SEC ID NO: 25 23). Se sitúa en las posiciones 98 a 102 de la forma nativa de la proteína F de PIV-5 (véase la figura 1A; véase la figura 9). Un ejemplo de fragmento de secuencia de la proteína F de PIV-5 que comprende el sitio de escisión nativo (o natural) de la proteína F de PIV-5 es: IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (SEC ID NO: 24).
En la forma nativa de la proteína F de PIV-2, el sitio de escisión consiste en la secuencia KTRQKR (SEC ID NO: 25). 30 Se sitúa en las posiciones 101 a 106 de la forma nativa de la proteína F de PIV-2 (véase la figura 1B). Un ejemplo de fragmento de secuencia de la proteína F de PIV-2 que comprende el sitio de escisión nativo (o natural) de la proteína F de PIV-2 es LTPLIENLSKISTVTDTKTRQKRFAGVVVGLAALGVA (SEC ID NO: 26).
Preferentemente, dicho sitio de escisión diferente del sitio de escisión nativo es un sitio de escisión específico de 35 tejido.
Preferentemente, dicho sitio de escisión diferente del sitio de escisión nativo es un sitio de escisión para una enzima expresada específicamente por uno o más tejidos tumorales, muy preferiblemente un sitio de escisión para una enzima expresada específicamente por uno o más tejidos metastásicos.
Por ejemplo, dicho sitio de escisión diferente del sitio de escisión nativo puede ser un sitio de escisión para una 5 metalo-proteasa, tal como el sitio de escisión para la metalo-proteasa matricial 9 (MMP-9); véase el ejemplo 2 siguiente.
Un sitio de escisión para la metalo-proteasa matricial 9 (MMP-9) puede comprender o consistir en la secuencia PXXHyS/T (SEC ID NO: 27) con X = cualquier aminoácido, y con Hy = cualquier aminoácido hidrófobo (es decir 10 cualquier aminoácido de entre F, M, V, L, I).
Por ejemplo, un sitio de escisión para la metalo-proteasa matricial 9 (MMP-9) puede comprender o consistir en la secuencia PRRIT (SEC ID NO: 28) y/o la secuencia IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (SEC ID NO: 29).
15
Ácidos nucleicos de la invención:
La presente solicitud se refiere también a un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica une proteína mutante según la invención (según el código genético universal y teniendo en cuenta la degeneración de este código), y a un ácido nucleico complementario de tal ácido nucleico (ácido nucleico de misma longitud perfectamente complementaria). 20
Tales ácidos nucleicos derivan de la secuencia de la SEC ID NO: 30 (secuencia que codifica la proteína F de PIV-5 nativa), o de una secuencia alternativa que codifica dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", o de una secuencia variante que codifica una proteína F variante, o bien de la secuencia de la SEC ID NO: 32 (secuencia que codifica la proteína F de PIV-2 nativa) o de una secuencia variante que codifica una proteína F variante. 25
Vectores de la invención:
La presente solicitud se refiere también a un vector de ácido nucleico, más particularmente a un vector de transfección, transducción o transformación, que comprende al menos un ácido nucleico según la invención. 30
Tal vector puede ser ventajosamente un vector de expresión.
Preferentemente, se trata de un vector que permite la expresión de dicho al menos un ácido nucleico en una célula animal (célula animal no humana y/o célula humana), más preferiblemente: 35
- en una célula humana, ventajosamente en una célula humana patológica, más particularmente una célula humana tumoral, más preferiblemente una célula de melanoma metastática, o
- en una célula placentaria. 40
Tal vector de expresión puede ser ventajosamente un vector adenoviral.
Este vector adenoviral puede comprender unos elementos de regulación de la expresión de dicho ácido nucleico, preferiblemente un promotor, que permite una expresión de dicho ácido nucleico en células tumorales, 45 preferentemente en células metastásicas, más preferiblemente en células de melanoma metastásicas.
Preferentemente, esta expresión es específica. Ventajosamente, esta expresión es suficientemente específica para permitir la expresión de dicho ácido nucleico en dichas células tumorales o metastásicas, sin que haya por tanto expresión significativa en células no tumorales (incluso no-metastásicas). 50
Ventajosamente, tal vector adenoviral es un vector adenoviral oncolítico.
Alternativamente, un vector de expresión de la invención puede ser un vector adenoviral que comprende unos elementos de regulación de la expresión de dicho ácido nucleico, preferiblemente un promotor, que permite una 55 expresión de dicho ácido nucleico en células placentarias, preferentemente en células placentarias patológicas que presentan una insuficiencia de fusogenicidad.
Preferentemente, esta expresión es específica. Ventajosamente, esta expresión es suficientemente específica para permitir la expresión de dicho ácido nucleico en dichas células placentarias, sin que haya por tanto expresión 60 significativa en células no placentarias.
Un vector de la invención puede alternativa o complementariamente ser un vector que permite la inserción de dicho al menos un ácido nucleico en el genoma de una célula animal (célula animal no humana y/o célula humana), más preferiblemente de una célula humana, ventajosamente de una célula humana patológica, más particularmente de 65 una célula humana tumoral, preferiblemente una célula humana metastásica, más preferiblemente en células de
melanoma metastásicas. Tal vector está más particularmente destinado a la terapia génica de los tumores, particularmente de los tumores metastásicos, más particularmente de los melanomas metastásicos.
La presente solicitud se refiere también a un vector que comprende al menos un ácido nucleico de la invención, y que permite la inserción de dicho al menos un ácido nucleico en el genoma de una célula animal (célula animal no 5 humana y/o célula humana), más preferiblemente de una célula humana, ventajosamente de una célula placentaria, preferiblemente una célula placentaria humana. Tal vector está más particularmente destinado a la terapia génica de las enfermedades o estados que impliquen una deficiencia del desarrollo placentario.
Células de la invención: 10
La presente solicitud se refiere también a una célula, que comprende al menos una proteína mutante según la invención, y/o al menos un ácido nucleico, ADN o ARN según la invención, y/o al menos un vector según la invención.
15
Tal célula puede ser una célula humana o una célula animal no humana.
Preferentemente, tal célula es una célula tumoral, preferiblemente una célula metastásica, más preferiblemente una célula de melanoma metastásica.
20
Tal célula encuentra en particular unas aplicaciones como célula de capacidad fusogénica capaz de inducir la formación de sincitio, tal como se describe a continuación.
Alternativamente, una célula de la invención puede ser una célula no tumoral del sistema inmunitario humano o animal no humano, preferiblemente una célula dendrítica no tumoral humana o animal no humana, expresando dicha 25 célula en su superficie al menos una proteína mutante según la invención. Tal célula encuentra en particular aplicaciones como agente capaz de inducir la producción de inhibidor de la fusión celular, por ejemplo por inmunización activa, tal como se describe a continuación.
Aplicaciones médicas (pro-fusión): 30
Una proteína mutante de la invención, y/o un ácido nucleico, ADN o ARN de la invención, y/o un vector de la invención, y/o una célula de la invención, pueden ser utilizados en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique la presencia y/o la proliferación de células patológicas y/o no favorables al estado de salud del organismo, más particularmente en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación 35 de una enfermedad o de un estado que implique una insuficiencia de fusogenicidad celular, preferiblemente en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado neoplásico, tal como un tumor, un tumor metastásico, ventajosamente un melanoma metastásico.
Tales enfermedades o estados pueden ser tratados y/o prevenidos y/o paliados por disminución o supresión de 40 estas células patológicas y/o no favorables.
Una proteína mutante de la invención expresada en la superficie de tales células inducirá la fusión de estas células, y a continuación la formación de sincitio, que conduce a la destrucción (o por lo menos a la disminución del número) de estas células. 45
Una proteína mutante de la invención, y/o un ácido nucleico, ADN o ARN de la invención, y/o un vector de la invención, y/o una célula de la invención, se pueden utilizar en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique una deficiencia del desarrollo placentario.
50
Tales enfermedades o estados pueden ser tratados y/o prevenidos y/o paliados por inducción o estimulación de la fusión celular placentaria.
La presente solicitud se refiere por lo tanto también a una composición farmacéutica o a un medicamento que comprende al menos una proteína mutante de la invención y/o al menos un ácido nucleico, ADN, ARN de la 55 invención, y/o al menos un vector de la invención y/o una célula de la invención.
Tal composición farmacéutica o tal medicamento puede, en particular, estar destinado al tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique la presencia y/o la proliferación de células patológicas y/o no favorables al estado de salud del organismo, tal como se ha indicado anteriormente (por 60 ejemplo, tumor, tumor metastásico, melanoma metastásico), o al tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique una insuficiencia de fusogenicidad celular (por ejemplo, deficiencia del desarrollo placentario).
Tal composición farmacéutica o tal medicamento pueden comprender además al menos un vehículo farmacéutica 65 y/o fisiológicamente aceptable.
Una proteína mutante de la invención (o un ácido nucleico, ADN, ARN, o un vector de expresión de la invención), se puede utilizar para ser expresada por una célula humana o una célula animal no humana, preferiblemente para ser expresada en la superficie de tal célula.
5
Esta célula puede ser una célula patológica, preferiblemente una célula tumoral, más preferiblemente una célula metastásica, más preferiblemente una célula de melanoma metastásico, o puede ser una célula no-tumoral, por ejemplo una célula sana.
Más particularmente, unas células patológicas que han sido extraídas de un paciente humano o de un sujeto animal 10 no-humano enfermo, pueden ser tratadas ex vivo (o in vitro) mediante la puesta en contacto con al menos una proteína mutante de la invención y/o al menos un ácido nucleico, ADN o ARN de la invención y/o al menos un vector de expresión de la invención a fin de hacerle expresar una proteína mutante de la invención.
Alternativa o complementariamente, unas células no patológicas pero localizadas cerca de las células patológicas 15 del paciente o sujeto pueden ser extraídas para someterlas a este tratamiento.
Las células así tratadas ex vivo (o in vitro) pueden entonces estar destinadas a ser re-administradas a dicho paciente o sujeto.
20
Tales células son útiles para el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de la patología que padece dicho paciente o sujeto, por ejemplo un tumor, un tumor metastásico o un melanoma metastásico.
Alternativamente, esta célula puede ser una célula placentaria, más particularmente una célula placentaria que sufre una insuficiencia de fusogenicidad. Una vez tratada por expresión de una proteína mutante de la invención en su 25 superficie, tal célula puede estar destinada al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una deficiencia del desarrollo placentario.
La presente solicitud se refiere por lo tanto más particularmente a una proteína mutante según la invención, a un ácido nucleico, ADN o ARN según la invención, a un vector según la invención, a una célula según la invención, para 30 una utilización en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado neoplásico, preferiblemente de un tumor, más preferiblemente de un tumor metastásico, muy preferiblemente de un melanoma metastásico.
La presente solicitud se refiere también más particularmente a una proteína mutante según la invención, a un ácido 35 nucleico, ADN o ARN según la invención, a un vector según la invención, a una célula según la invención, para una utilización en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una deficiencia del desarrollo placentario.
Inhibidores de fusión según la invención:
40
La presente solicitud se refiere también a unos productos que tienen la capacidad de disminuir o bloquear la fusión celular. Estos productos son unos inhibidores de una o varias proteínas mutantes de la invención.
Tales inhibidores se pueden utilizar en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, preferiblemente en el tratamiento y/o la prevención y/o la 45 paliación de una infección por virus con envoltura (tal como una infección por VIH, Influenza, Parainfluenza, Rhabdovirus), de una alergia, de una enfermedad autoinmune o de un rechazo de injerto.
Preferentemente, un inhibidor según la invención es:
50
- un anticuerpo dirigido contra una proteína mutante según la invención, o un fragmento Fab o F(ab')2 de tal anticuerpo, o
- un ácido nucleico aptámero o un péptido aptámero que se une específicamente a al menos una proteína mutante según la invención, o a un ácido nucleico, ADN, ARN según la invención, o 55
- una célula del sistema inmunitario recombinante, preferiblemente una célula dendrítica recombinante, que expresa en su superficie al menos una proteína mutante según la invención, o
- un ácido nucleico anti-sentido de un ácido nucleico según la invención, o 60
- un pequeño ARN interferente (small interfering RNA; siRNA) que comprende un ARN bicatenario de 19 a 22 nucleótidos, capaz de unirse (de hibridarse) a un ácido nucleico según la invención.
La presente solicitud se refiere por lo tanto también a una célula no-tumoral del sistema inmunitario humano o animal 65 no humano, preferiblemente a una célula dendrítica humana o animal no humana, expresando dicha célula en su
superficie al menos una proteína mutante según la invención, así como a la utilización de esta célula en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, preferiblemente en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una infección por virus con envoltura (tal como una infección por VIH, Influenza,Parainfluenza, Rhabdovirus), de una alergia, de una enfermedad autoinmune o de un rechazo de injerto. 5
La presente solicitud se refiere también a un anticuerpo dirigido contra una proteína mutante según la invención, o contra varias de las proteínas mutantes de la invención. Preferentemente, este anticuerpo es un anticuerpo específico de dicha o dichas proteínas mutantes de la invención. Ventajosamente, este anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Un inhibidor de la invención puede ser un fragmento conservante de tal anticuerpo, tal como un 10 fragmento Fab o F(ab')2.
Tal anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar destinado a bloquear o inhibir un mecanismo de fusión celular, por ejemplo administrando este anticuerpo o fragmento de anticuerpo a un paciente o sujeto que lo necesita.
15
Alternativa o complementariamente, una proteína mutante de la invención puede estar destinada a ser la misma administrada a dicho paciente o sujeto a fin de inducir una inmunización activa contra esta proteína, es decir a fin de inducir la producción por dicho paciente o sujeto de anticuerpos anti-proteína mutante. Si es necesario o deseado, se pueden administrar uno o varios adyuvantes de vacuna de manera conjunta o diferida en el tiempo con esta o estas proteínas mutantes. 20
La presente solicitud se refiere por lo tanto también a una vacuna terapéutica y/o preventiva y/o paliativa, que comprende al menos una proteína mutante de la invención a título de agente inmunógeno, y ventajosamente al menos un adyuvante de inmunización. Tal vacuna puede estar destinada al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, preferiblemente en el 25 tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una infección por virus con envoltura (tal como una infección por VIH, Influenza, Parainfluenza, Rhabdovirus), de una alergia, de una enfermedad autoinmune, o de un rechazo de injerto.
La presente solicitud se refiere también a: 30
- un ácido nucleico aptámero o un péptido aptámero que se une específicamente a al menos una proteína mutante de la invención, o a un ácido nucleico, ADN, ARN de la invención,
- una célula del sistema inmunitario recombinante, preferiblemente una célula dendrítica recombinante, que expresa 35 en su superficie al menos una proteína mutante de la invención,
- un ácido nucleico antisentido de un ácido nucleico de la invención,
- un pequeño ARN interferente (small interfering RNA; siRNA) que comprende un ARN bicatenario de 19 a 22 40 nucleótidos, capaz de unirse (hibridarse) a un ácido nucleico de la invención, y ventajosamente bloquear o inhibir la transcripción de este ácido nucleico.
Tales productos son también unos inhibidores de la invención. Pueden por lo tanto estar destinados al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad 45 celular, tal como se ha indicado anteriormente. Están más particularmente destinados al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una enfermedad o de un estado que implique al menos un gen expresor o hiper-expresor de la proteína F.
La presente solicitud se refiere por lo tanto también a una composición farmacéutica o a un medicamento que 50 comprende al menos un inhibidor de la invención.
Tal composición farmacéutica o tal medicamento pueden estar destinados en particular al tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, tal como se ha indicado anteriormente. 55
Tal composición farmacéutica o tal medicamento pueden además comprender al menos un vehículo farmacéutica y/o fisiológicamente aceptable.
La presente solicitud se refiere más particularmente a un inhibidor según la invención, para una utilización en el 60 tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, siendo dicha enfermedad o estado una infección por virus con envoltura (preferiblemente una infección por VIH y/o Influenza y/o Parainfluenza y/o Rhabdovirus), una alergia, una enfermedad autoinmune o un rechazo de injerto.
65
La presente solicitud se refiere más particularmente a una proteína mutante según la invención, para una utilización a título de agente inmunógeno en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, siendo dicha enfermedad o estado una infección por virus con envoltura (preferiblemente una infección por VIH y/o Influenza y/o Parainfluenza y/o Rhabdovirus), una alergia, una enfermedad autoinmune o un rechazo de injerto. 5
La presente solicitud se refiere más particularmente a una vacuna o composición vacunal, más particularmente una vacuna o composición vacunal destinada al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, siendo dicha enfermedad o estado una infección por virus con envoltura (preferiblemente una infección por VIH y/o Influenza y/o Parainfluenza y/o Rhabdovirus), una 10 alergia, una enfermedad autoinmune o un rechazo de injerto. Tal vacuna o composición vacunal comprende al menos una proteína mutante según la invención, y opcionalmente al menos un adyuvante fisiológicamente aceptable.
Aplicaciones de diagnósticos y pronósticos: 15
La presente solicitud se refiere también a un método, más particularmente un método in vitro, para el diagnóstico o el pronóstico de una enfermedad o de un estado que implique:
- una formación insuficiente de sincitio, tal como un tumor, un tumor metastásico, un melanoma metastásico o una 20 deficiencia del desarrollo placentario, o por el contrario
- una formación excesiva de sincitio, tal como una infección por virus con envoltura (preferiblemente una infección por VIH y/o Influenza y/o Parainfluenza y/o Rhabdovirus), una alergia, una enfermedad autoinmune o un rechazo de injerto. 25
El método de diagnóstico o pronóstico de la invención comprende la detección de al menos una proteína mutante según la invención o de al menos un ácido nucleico según la invención, por ejemplo en una muestra biológica tal como una muestra biológica que ha sido extraída del paciente o sujeto objeto de dicho diagnóstico o pronóstico.
30
Esta detección se puede realizar, por ejemplo, por secuenciación de las proteínas o ácidos nucleicos contenidos en dicha muestra.
Esta detección se puede realizar, por ejemplo, por detección de dicha al menos una proteína mutante de la invención con la ayuda de un anticuerpo, de un péptido aptámero, o de un oligonucleótido aptámero que se une a 35 dicha al menos una proteína mutante, más particularmente con la ayuda de un anticuerpo, péptido aptámero, u oligonucleótido aptámero de la invención.
Esta detección se puede realizar, por ejemplo, por detección de dicho al menos un ácido nucleico de la invención con la ayuda de un ácido nucleico, de un péptido aptámero, o de un oligonucleótido aptámero que se une a dicho al 40 menos un ácido nucleico, más particularmente con la ayuda de un ácido nucleico complementario de un ácido nucleico de la invención, de un péptido aptámero, o de un oligonucleótido aptámero de la invención.
La presente solicitud se refiere también a dicho anticuerpo, péptido aptámero, oligonucleótido aptámero, ácido nucleico complementario, para su utilización en un método de diagnóstico o pronóstico de una formación 45 insuficiente, o por el contrario excesiva de sincitio.
Aplicaciones biotecnológicas (cribado):
La presente solicitud se refiere también a un método, más particularmente a un método in vitro, para el cribado de un 50 compuesto capaz de disminuir o bloquear la formación de sinticio. El método de la invención comprende la puesta en contacto de un compuesto candidato con unas células que expresan al menos una proteína mutante según la invención, a fin de determinar si este compuesto candidato disminuye o bloquea la fusión de dichas células (por ejemplo, comparando el nivel de fusión alcanzado en presencia de dicho compuesto candidato con el alcanzado en su ausencia). 55
Tales compuestos son unos principios activos candidatos para el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, tales como las infecciones por virus con envoltura, las alergias, las enfermedades autoinmunes o los rechazos de injerto.
60
Aplicaciones biotecnológicas (mieloma, hibridoma):
La presente solicitud se refiere también a una célula tumoral, más particularmente mieloma, que comprende al menos una proteína mutante según la invención, preferiblemente que comprende al menos tal proteína mutante en su superficie, y/o que comprende al menos un ácido nucleico según la invención, y/o que comprende al menos un 65 vector según la invención, más particularmente un vector de expresión según la invención.
Tal célula tumoral, más particularmente tal mieloma, se puede utilizar en particular en la producción de un hibridoma (por fusión de esta célula tumoral con un linfocito B), más particularmente en la producción de un hibridoma productor de anticuerpo.
5
La presente solicitud se refiere también a un hibridoma, más particularmente a un hibridoma productor de anticuerpo, que comprende al menos una proteína mutante según la invención, y/o al menos un ácido nucleico según la invención, y/o al menos un vector según la invención. Tal hibridoma puede ser producido en particular mediante la puesta en contacto de al menos un linfocito B con al menos una célula tumoral, más particularmente un mieloma, que comprende al menos una proteína mutante según la invención, preferiblemente que comprende al 10 menos tal proteína mutante en su superficie, y/o que comprende al menos un ácido nucleico según la invención, y/o que comprende al menos un vector según la invención. Tal célula tumoral presenta una capacidad fusogénica intrínseca: es por lo tanto capaz de fusionar con dicho al menos un linfocito B, sin la utilización de polietilenglicol (PEG) o de medios de electroporación o de ninguno de los medios que, en la técnica anterior, son clásicamente utilizados para inducir la fusión de una célula tumoral a un linfocito B con el objetivo de producir un hibridoma. 15
Aplicaciones biotecnológicas (células madres o progenitoras):
La presente solicitud se refiere también a una célula madre o progenitora, que comprende al menos una proteína mutante según la invención, preferiblemente que comprende al menos tal proteína mutante en su superficie, y/o que 20 comprende al menos un ácido nucleico según la invención, y/o que comprende al menos un vector según la invención, más particularmente un vector de expresión según la invención.
Tal célula madre o progenitora presenta una capacidad fusogénica intrínseca: es por lo tanto capaz de formar por fusión unas sincitios. 25
Si esta célula madre o progenitora presenta además una capacidad de diferenciación en la célula muscular, es entonces capaz de formar una fibra muscular (por fusión celular y formación de un sincitio).
La presente solicitud se refiere por lo tanto también a tal célula madre o progenitora para su utilización en la 30 producción, por ejemplo en la producción in vitro, de una fibra muscular.
Esta producción se puede realizar, por ejemplo colocando una pluralidad de dichas células madres o progenitoras en contacto entre sí sobre, o en un medio de cultivo que permite la proliferación de células madres o, llegado el caso, progenitoras, de manera que la capacidad fusogénica de dichas células madre o progenitoras puedan ejercer, 35 induciendo así la formación de un sincitio, más particularmente de una fibra muscular. Unos ejemplos de medio de cultivo que permiten la proliferación de células madre o, llegado el caso, progenitoras, y que son además apropiados para la expresión de su eventual capacidad para diferenciarse en célula muscular, más particularmente en fibra muscular, son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo el medio MCDB.
40
Ejemplos de marcadores celulares que permiten observar la diferenciación de una célula madres o progenitora en célula muscular, más particularmente en fibra muscular, son también conocidos por el experto en la materia, por ejemplo CD56.
En la presente solicitud, el término "que comprende", con el que "que incluye" o "que contiene" es sinónimo, es un 45 término abierto, que no excluye la presencia de uno o varios elemento(s), ingrediente(s) o etapa(s) de método adicional(es) que no estuviera(n) explícitamente indicado(s), mientras que el término "que consiste" o "constituido de" es un término cerrado, que excluye la presencia de cualquier otro elemento adicional, etapa o ingrediente que no estuviera explícitamente expuesto. El término "que consiste esencialmente" o "esencialmente constituido de" es un término parcialmente abierto, que no excluye la presencia de uno o más elemento(s), ingrediente(s) o etapa(s) 50 adicional(es), en la medida en la que este(os) elemento(s), ingrediente(s) o etapa(s) adicional(es) no afectan materialmente las propiedades de base de la invención.
Por lo tanto, el término "que comprende" (o "comprende (comprenden)") incluye los términos "que consiste", "constituido", tanto como los términos "que consiste esencialmente" y "esencialmente constituido". 55
El contenido de los documentos y referencias bibliográficas citados en la presente solicitud se incorpora como referencia.
Los ejemplos siguientes son dados a título puramente ilustrativo, no limitan la invención de ninguna manera. 60
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: construcción de los mutantes y medición de su fusogenicidad
Materiales y métodos: 5
Células y virus
La línea celular LLC-MK2 (línea de células de riñón de Macaca mulatta) está disponible en American Type Culture Collection (ATCC) bajo el número CCL-7. La línea celular A549 (línea de células de carcinoma pulmonar humana) 10 está disponible en ATCC bajo el número CCL-185.
La línea recombinante HuH7-Tat (línea de células de hepatoma humano) está disponible por transducción de células de la línea HuH-7 por VIH-1 Tat.
15
La línea HuH-7 está disponible en la Colección Japonesa de los Biorrecursos de Investigaciones -Japanese Collection of Research Bioresources- bajo la referencia JCRB0403. La transducción de la línea HuH-7 por HIV-Tat se ha realizado con la ayuda del vector retroviral LXSN-tat transduciendo el plásmido Tat.
Las células LLC-MK2, A549 y HuH7-Tat se han cultivado en medio EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) o 20 DMEM (Dulbecco/Vogt Modified Eagles' essential minimal Medium) con el 5% de suero fetal de ternera.
La cepa PIV-5 WR se ha obtenido de ATCC (número ATCC VR-288), y se ha cultivado sobre unas células LLC-MK2 como se describe en Terrier et al. 2008.
25
Extracción de ARN, RT-PCR y clonación
El ARN viral se ha extraído del sobrenadante obtenido a partir de una infección de células LLC-MK2 por PIV-5, con la ayuda del kit Absolutely RNA® microprep kit (Stratagene, USA), siguiendo las instrucciones dadas por el fabricante. La transcripción inversa se ha realizado con la ayuda de hexámeros aleatorios pd(N)6 (Amersham 30 Biosciences, GB) y de una transcriptasa reversa (Reverse Transcriptase; RT) del virus de la mieloblastosis aviar (Avian Myeloblastosis Virus; AMV) (transcriptasa reversa AMV-RT disponible de Promega).
La amplificación de la secuencia completa de F PIV-5 se ha realizado con un par de cebadores concebido a partir de la secuencia nucleotídica de PIV-5 disponible en las bases de datos (número de acceso GenBank AB021962). 35
El par de cebadores utilizado es el siguiente:
Cebador sentido (SEC ID NO: 1):
40
5' TTGCGGCCGCATGGGTACTATAA 3'
Cebador antisentido (SEC ID NO: 2):
5' CCGCTCGAGTTATGATAAACAAAATTCTCC 3' 45
La amplificación se ha realizado según el protocolo siguiente: 95°C durante 2 min, después 39 ciclos (95°C/30 s 55°C/1 min 72°C/3 min) y una elongación final de 10 min a 72°C. El ADN complementario de F PIV-5 se ha clonado en el plásmido de expresión pcDNA3.1(+) a nivel de los sitios NotI y XhoI a nivel del sitio múltiple de clonación (véase la figura 4). 50
Los productos PCR y los plásmidos se han purificado, respectivamente por los kits Nucleospin® ExtractII y Nucleospin® plasmid (Macherey Nagel, Germany), siguiendo las instrucciones indicadas por el fabricante.
El conjunto de las secuenciaciones realizadas en este estudio se ha realizado por MWG Biotech (Ebersberg, 55 Germany).
Mutagénesis dirigida por amplificación en cadena por polimerasa (PCR)
Se han realizado las proteínas mutantes de la proteína F de PIV-5 por mutación dirigida dentro del plásmido 60 pcDNA3.1 que codifica la proteína de fusión F PIV-5. La(s) mutación(es) se han generado por PCR con la ayuda de cebadores complementarios, siguiendo el protocolo indicado por el fabricante (QuickChange® Site-Directed Mutagenesis system disponible de Stratagene). La lista de cebadores utilizados se da en la tabla 2 siguiente. El conjunto de los plásmidos se controló por secuenciación.
65
Tabla 2: lista de cebadores
- Mutación
- Región diana en PIV-5 Secuencias de los cebadores utilizadas para la mutagénesis por PCR SEC ID NO:
- L22P
- F2 Sentido 5' GGAGCAGGCAGCCTTGATCCAGCTGCTCTCATGCAAATCGG 3' 3
- Antisentido
- 5' CCGATTTGCATGAGAGCAGCTGGATCAAGGCTGCCTGCTCC 3' 4
- K132E
- HR1 - Mutación pre-existente -
- V290A
- HR3 - Mutación pre-existente -
- I49A
- F2 Sentido 5' GGCCTCATCAGCATTCGCTGTTGTGAAGTTAATGCC 3' 5
- Antisentido
- 5' GGCATTAACTTCACAACAGCGAATGCTGATGAGGCC 3' 6
- V402A
- entre HR3 y HR2 Sentido 5' CAGCCAAGTTCATCTCCTGCAACTGTCATTGACATGTAC 3' 7
- Antisentido
- 5'GTACATGTCAATGACAGTTGCAGGAGAGTGAACTTGGCTG3' 8
- S443P
- hacia arriba de HR2 Sentido 5' GCTTGAATCATCTCAGATCTTGTCCATTGATCCGTTGGATATATCCC 3' 9
- Antisentido
- 5' GGGATATATCCAACGGATCAATGGACAAGATCTGAGATGATTCAAGC 3' 10
- L447P
- hacia arriba de HR2 Sentido 5' CTCAGATCTTGTCCATTGATCCGCCGGATATATCCCAGAATCTAGCTGCG 3' 11
- Antisentido
- 5' CGCAGCTAGATTCTGGGATATATCCGGCGGATCAATGGACAAGATCTGAG 3' 12
- I449P
- hacia arriba de HR2 Sentido 5' CTTGTCCATTGATCCGTTGGATCCATCCCAGAATCTAGCTGCGGTG 3' 13
- Antisentido
- 5'CACCGCAGCTAGATTCGTTGGATTTCTCCCAGAATCTAGCTGCGG3' 14
- I449F
- hacia arriba de HR2 Sentido 5' GCCCATTGATCCGTTGGATTTCTCCCAGAATCTAGCTGCGG 3' 15
- Antisentido
- 5'CCGCAGCTAGATTCTGGGAGAAATCCAACGGATCAATGGGC 3' 16
- T147V
- HR1 Sentido 5'CTCAAAAATGCAATCCAAAAAGTAAATGCAGCAGTTGCAGATG3' 17
- Antisentido
- 5' CATCTGCAACTGCTGCATTTACTTTTTGGATTGCATTTTTGAG 3' 18
- T158V
- HR1 Sentido 5' GCAGATGTGGTCCAGGCCGTACAATCACTAGGAACGGC 3' 19
- Antisentido
- 5' GCCGTTCCTAGTGATTGTACGGCCTGGACCACATCTGC 3' 20
- A463V
- HR2 Sentido 5' GTGAATAAGAGTCTAAGTGATGTACTACAACACTTAGCACAAAGTG 3' 21
- Antisentido
- 5' CACTTTGTGCTAAGTGTTGTAGTACATCACTTAGACTCTTATTCAC 3' 22
La mutación 443P está teóricamente preexistente en la proteína F del aislado WR. Sin embargo, en la muestra de este aislado que los inventores han recibido de ATCC, esta mutación no estaba presente. Por lo tanto, tuvo que ser 5 introducida por los inventores.
Transfección de las células
Las células se transfectaron por los plásmidos con la ayuda del reactivo ExGen500 (Fermentas), siguiendo las 10 instrucciones indicadas por el fabricante. Se añadieron de uno a tres microgramos de ADN plasmídico sobre las células (del 70 al 80% confluencia) durante 48h. La eficacia de la transfección se estimó con la ayuda de un plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (Green Fluorescence Protein; GFP).
Inmunofluorescencia por microscopía confocal 15
Les células transfectadas se fijaron con la ayuda de paraformaldehído (1% v/v) en tampón fosfato (Phosphate Buffer Saline; PBS), después se lavaron dos veces. Los tapices celulares se incubaron en presencia de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína de fusión F PIV-5, en este caso el anticuerpo monoclonal F1a descrito en Randall et al. 1987, diluido al 1/10 en PBS durante 3h. El anticuerpo monoclonal F1a se obtuvo por inmunización de 20 ratones contra un aislado de PIV-5 (en este caso el aislado LN), preparación de los hibridomas y selección de los anticuerpos anti-F específicos.
Después, los tapices celulares se lavaron e incubaron con un anticuerpo secundario anti-ratón IgG-Alexa Fluor® 633 (Invitrogen) diluido al 1/200 en PBS durante 30 minutos. Después, del aclarado, las células se incubaron durante 10 25 minutos con Dapi (4',6'-Di-Amidino-2-fenolindol) al 1/1000 mezclado o no con aglutinina de gérmenes de trigo (Wheat Germ Agglutinin; WGA) acoplada a Alexa Fluor® 488 (WGA-Alexa Fluor® disponible de Invitrogen) al 1/200 en tampón fosfato (Phosphate Buffer Saline; PBS). Las imágenes se tomaron con la ayuda de un microscopio confocal TCS SP2 (Leica).
30
Citometría de flujo
La citometría de flujo se realizó como se describe anteriormente en la bibliografía (Horvat y Lamb 1992). Se transfectaron unas células A549 por los plásmidos que codifican los diferentes Fus y se depositaron sobre hielo. Los
tapices celulares se aclararon mediante tampón fosfato PBS (Phosphate Buffer Saline; PBS) que comprende el 1% de azida de sodio. Un anticuerpo monoclonal anti-proteína F de PIV-5 (en este caso el anticuerpo monoclonal F1a) se añadió después sobre las alfombras (1/500 en tampón fosfato PBS al 1% en suero fetal de ternero), y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Las alfombras se aclararon e incubaron después en presencia de un anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a Alexa Fluor® 488 al 1/1000 (Invitrogen). Después de los aclarados, las células se 5 despegaron suavemente con la ayuda de 500 µl de tampón fosfato PBS a 0,5 mM en EDTA (ácido etilen-diamina-tetraacético). Las células se transfirieron en tubos dedicados a la citometría de flujo que contienen 500 µl de una solución de paraformaldehído 1%. La intensidad de la fluorescencia de 5000 células se midió sobre un citómetro de flujo seleccionador de células (Fluorescence-activated cell sorting; FACS), en este caso en el FACSVantage™ SE flow de Becton Dickinson. 10
Ensayo de fusión semi-cuantitativo (resultados de fusión establecidos en función del tamaño del sincitio y del número de núcleo)
Los tapices transfectados por los diferentes plásmidos de expresión Fus y observados en inmunofluorescencia han 15 permitido un análisis semi-cuantitativo. Este análisis consistió en determinar un resultado de fusión para cada uno de los mutantes según los siguientes criterios:
La fusión o no (simples aglomerados), señalada con -/+;
20
El tamaño del sincitio, anotado en una escala de 1 a 5;
El número de núcleos, anotado en una escala de 1 a 5.
El resultado así calculado es la adición de las dos notas; la nota máxima teórica es por lo tanto de 10 y corresponde 25 a un sintitio de tamaño máximo con un número máximo de núcleo.
Ensayo de fusión cuantitativo (medición de la actividad luciferasa)
Con el fin de cuantificar la fusión célula-célula, de las células A549 "donantes" (2,5 millones de células por pocillo de 30 placa de 6 pocillos) se co-transfectaron con 2 µg de plásmido pcDNA3.1 que codifica las diferentes proteínas mutantes Fus así como 50 ng de un plásmido que expresa la luciferasa bajo la dependencia de la larga repetición terminal del VIH-1 (Long Terminal Repeat; LTR) (Lavillette et al. 2007).
A título de control negativo, se co-transfectaron unas células con 2 µg de plásmido pcDNA3.1 vacío. 35
Doce horas después de la co-transfección, las células "donantes" se despegaron con la ayuda de tampón fosfato (PBS) a 0,5 mM en EDTA, y se contaron y después se recolocaron en nuevas placas de 6 pocillos (105 células/pocillo). Unas células "indicadoras" HuH7-Tat (4.105 células/pocillo) se despegaron con la ayuda del tampón PBS-EDTA, después se aclararon y se añadieron a las células "donantes". 40
Se midió la actividad luciferasa a 72h de co-cultivo con la ayuda de un kit de medición de la actividad luciferasa, en este caso el Luciferase Assay system (E1500) kit de Promega, siguiendo las indicaciones dadas por el fabricante.
Resultados: 45
Unas proteínas mutantes construidas y producidas por los inventores son presentadas en la tabla 3 siguiente.
En esta tabla 3, los inventores han organizado las diferentes mutaciones según la función que se les atribuye, a saber: 50
- implicación en función de autonomía frente a HN: posiciones 22, 132 y 290 de la proteína F de PIV-5;
- implicación en función de pre-fusión: posiciones 49, 402, 443, 447 y 449 de la proteína F de PIV-5;
55
- implicación en función de post-fusión: posiciones 147, 158 y 463 de la proteína F de PIV-5.
En las figuras 5A, 5B, 5C y 5D, se ilustran las posiciones de las mutaciones de la tabla 3.
Así, se han construido unas proteínas mutantes, producidas y ensayadas por los inventores. 60
Tabla 3: lista de proteínas realizadas
- Autonomía Pre-fusión Post-fusión
- L22P K132E V290A I49A V402A S443P L447P I449P I449F T147V T158V A463V
- Fus1 (SEC ID NO: 47)
- + +
- Fus1.1 (SEC ID NO: 48)
- + + +
- Fus1.2 (SEC ID NO: 49)
- + + +
- Fus2 (SEC ID NO: 50)
- + + +
- Fus3 (SEC ID NO: 51)
- + + +
- Fus3.1 (SEC ID NO: 52)
- + + + +
- Fus3.2 (SEC ID NO: 53)
- + + + + +
- Fus3.3 (SEC ID NO: 54)
- + + + +
- Fus4 (SEC ID NO: 55)
- + + + +
- Fus5 (SEC ID NO: 56)
- + + + +
- Fus6 (SEC ID NO: 57)
- + + + +
- Fus6.1 (SEC ID NO: 58)
- + + + + +
- Fus6.2 (SEC ID NO: 59)
- + + + + +
- Fus6.3 (SEQ D NO: 60)
- + + + + + +
- Fus7 (SEC ID NO: 61)
- + + + +
- Fus7.1 (SEC ID NO: 62)
- + + + + +
- Fus7.2 (SEC ID NO: 63)
- + + + + +
- Fus7.3 (SEC ID NO: 64)
- + + + + + +
- Fus8 (SEC ID NO: 65)
- + + + +
- Fus9 (SEC ID NO: 66)
- + + + +
- Fus10 (SEC ID NO: 67)
- + + + + +
- Fus10.4 (SEC ID NO: 68)
- + + + + + + + +
- Fus10.5 (SEC ID NO: 69)
- + + + + + + + + +
- Fus11 (SEC ID NO: 70)
- + + + + +
- Fus8.1 (SEC ID NO: 71)
- + + + + +
- Fu8.2 (SEC ID NO: 72)
- + + + + +
- Fus8.4 (SEC ID NO: 73)
- + + + + + +
- Fus8.5 (SEC ID NO: 74)
- + + + + + +
- Fus8.6 (SEC ID NO: 75)
- + + + + + +
- Fus8.7 (SEC ID NO: 76)
- + + + + + + +
- Fus10.1 (SEC ID NO: 77)
- + + + + + +
- Fus10.2 (SEC ID NO: 78)
- + + + + + + +
- Fus10.3 (SEC ID NO: 79)
- + + + + + + + +
La secuencia de la proteína F de PIV-5 que ha sido utilizada durante la construcción y la producción de estas proteínas mutantes eran una secuencia alternativa de la proteína F de aislado WR. Esta secuencia alternativa era 5 idéntica a la secuencia de SEC ID NO: 31 (secuencia Genbank), con la excepción del aminoácido en la posición 443 que era S y no P (secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443").
Las secuencias de la SEC ID NO: 47 a 79 son por lo tanto las secuencias que resultan de la sustitución, dentro de dicha secuencia alternativa "SEC ID NO: 31 con S en 443", de los aminoácidos indicados para cada una de estas 10 secuencias en la tabla 3 anterior.
Una ilustración de las observaciones que han sido realizadas con microscopio durante unos ensayos de fusión semi-cuantitativos se presenta en la figura 6A.
15
Los resultados obtenidos al final de los ensayos de fusión semi-cuantitativos son presentados en la figura 6B.
Las proteínas mutantes Fus 6, Fus 6.1, Fus 6.2 y Fus 6.3 han llevado a la aglutinación de numerosas células, pero ninguna fusión celular.
20
Las proteínas mutantes Fus 3.3, Fus 3.1, Fus2, Fus 1.1, Fus 1.2 y Fus 1 dan un resultado de fusión nulo.
Las proteínas mutantes Fus9, Fus7, Fus 3, Fus5 y Fus4 dan resultados bajos de fusión.
Más allá del resultado de fusión de Fus4, destacan un conjunto de proteínas mutantes con resultados de fusión 25 significativo, a saber:
- el grupo de las proteínas mutantes que tienen en común comprender las tres mutaciones de autonomía y la mutación de pre-fusión 449P, tales como las proteínas mutantes Fus8, Fus10, Fus10.4, Fus10.5, Fus11, Fus8.1, Fus8.2, Fus8.4, Fus8.5, Fus8.6, Fus8.7, Fus10.1, Fus10.2, Fus10.3, y 30
- el grupo de las proteínas mutantes que tienen en común comprender las tres mutaciones de autonomía, la mutación de pre-fusión 447P y al menos una mutación de post-fusión (147V o 158V), tales como Fus7.1, Fus7.2 y Fus7.3.
Las figuras 7A y 7B presentan una ilustración de las observaciones realizadas con microscopio y presentan los 5 resultados de fusión para una selección de las proteínas mutantes ensayadas, a saber el grupo de las proteínas mutantes que tienen en común comprender
- las tres mutaciones de autonomía,
10
- la mutación de pre-fusión 447P, y
- al menos una mutación de postfusión en posición 147 y/o 158 para presentar a esta(s) posición(es) un aminoácido hidrófobo tal como V, I o L, por ejemplo la mutación de postfusión 147V y/o la mutacion de postfusión 158V,
15
tales como las proteínas mutantes Fus7.1, Fus7.2 y Fus7.3.
EJEMPLO 2: Sustitución del sitio de escisión natural por el sitio de una enzima expresada específicamente por el tejido tumoral metastásico
20
Las proteínas mutantes de la invención, y más particularmente las descritas en el ejemplo 1 anterior, se modificaron más adelante por sustitución del sitio de escisión natural de la proteína F nativa, por ejemplo para sustituirlo por un sitio de escisión específico de tejido.
A título ilustrativo, el sitio de escisión natural de la proteína F de PIV-5 puede estar sustituido por el sitio de una 25 enzima expresada específicamente por el tejido tumoral metastásico, a saber la metalo-proteasa matricial 9 (MMP-9).
RRRRR (SEC ID NO: 23).
30
Un ejemplo de fragmento de secuencia de la proteína F que comprende el sitio de escisión natural de la proteína F de PIV-5 es:
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (SEC ID NO: 24).
35
La secuencia consenso de un sitio de escisión MMP-9 es:
PXXHyS/T (SEC ID NO: 27)
con X = cualquier aminoácido, y 40
con Hy = cualquier aminoácido hidrófobo (es decir cualquier aminoácido de entre F, M, V, L, I).
Un ejemplo de sitio de escisión MMP-9 es:
45
PRRIT (SEC ID NO: 28).
Un ejemplo de fragmento de secuencia de la proteína F mutante de la invención que comprende un sitio de escisión MMP-9 es:
50
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (SEC ID NO: 29).
Materiales y métodos:
Las proteínas mutantes de la proteína F de PIV-5 se han producido como se describe en el ejemplo 1 anterior. 55
La sustitución del sitio de escisión natural por el sitio de escisión seleccionado, en este caso, el sitio de escisión MMP-9 de la SEC ID NO: 28, se ha realizado de la siguiente manera:
La sustitución del sitio de escisión se ha realizado para 3 mutagénesis dirigidas sucesivas dentro del plásmido 60 pcDNA3.1 que codifica la proteína de fusión F PIV-5. Las mutaciones se han generado por PCR con la ayuda de cebadores complementarios, siguiendo el protocolo indicado por el fabricante (QuickChange® Site-Directed Mutagenesis system disponible de Stratagene). El conjunto de los plásmidos se ha controlado por secuenciación.
1ª MUTACIÓN R98P
SENTIDO 5' CCAGTTGATTCCAACTCCGAGGAGACGCCGGTTTGC 3' (SEC ID NO: 80)
ANTISENTIDO 5' GCAAACCGGCGTCTCCTCGGAGTTGGAATGAACTGG 3' (SEC ID NO: 81) 5
2ª MUTACIÓN R1011
SENTIDO 5' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCCGGTTTGCAGGAGTGGTG 3' (SEC ID NO: 82)
10
ANTISENTIDO 5'CACCACTCCTGCAAACCGGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (SEC ID NO: 83)
3ª MUTACIÓN R102T
SENTIDO 5' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCACGTTTGCAGGAGTGGTGATTGG 3' (SEC ID NO: 84) 15
ANTISENTIDO 5' CCAATCACCACTCCTGCAAACGTGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (SEC ID NO: 85)
Transfección de las células
20
Se han transfectado las células por los plásmidos con la ayuda del reactivo ExGen500 (Fermentas), siguiendo las instrucciones indicadas por el fabricante. Se añadieron de uno a tres microgramos de ADN plasmídico sobre las células (del 70 al 80% de confluencia) durante 48h. La eficacia de la transfección se estimó con la ayuda de un plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (Green Fluorescence Protein; GFP).
25
Inmunofluorescencia por microscopía confocal
Les células transfectadas se fijaron con la ayuda de paraformaldehído (1% v/v) en tampón fosfato (Phosphate Buffer Saline; PBS), después se lavaron dos veces. Los tapices celulares se incubaron en presencia de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína de fusión F PIV-5, en este caso el anticuerpo monoclonal F1a descrito en 30 Randall et al. 1987, diluido al 1/10 en PBS durante 3h. El anticuerpo monoclonal F1a se obtuvo por inmunización de ratones contra un aislado PIV-5 (en este caso el aislado LN), preparación de los hibridomas y selección de los anticuerpos anti-F específicos.
Los tapices celulares se lavaron después y se incubaron con un anticuerpo secundario anti-ratones IgG-Alexa 35 Fluor® 633 (Invitrogen) diluido al 1/200 en PBS durante 30 minutos. Después del aclarado, las células se incubaron durante 10 minutos con Dapi (4',6'-Di-Amidino-2-fenilindol) al 1/1000 mezclado o no con la aglutinina de germen de trigo (Wheat Germ Agglutinin; WGA) acoplada a Alexa Fluor® 488 (WGA- Alexa Fluor® disponible de Invitrogen) al 1/200 en tampón fosfato (Phosphate Buffer Saline; PBS). Las imágenes se adquirieron con la ayuda de un microscopio confocal TCS SP2 (Leica). 40
Referencias bibliográficas
Baker et al. 1999, Mol Cell. 3(3):309-19.
45
Chatziandreou et al. 2004, Journal of General Virology 85: 3007-3016.
Horvat y Lamb 1992, J. Virol. 66(4): 2443-2455.
Ito et al. 1997, J Virol. 71(12): 9855-9858. 50
Ito et al. 2000, J Gen Virol. 81(Pt 3):719-727.
Gardner y Dutch 2007, J. Virol. 81(15):8303-14.
55
Gardner et al. 2007, Biochemistry 46(17):5094-5105.
Lavillette D. et al. 2007, J. Virol. 81(16): 8752-8765
Paterson et al. 2000, Virology 270(1):17-30. 60
Randall et al. 1987, J. Gen. Virol. 68(Pt11): 2769-2780
Russell et al. 2003, J. Cell Biol. 163(2):363-74.
65
Terrier et al. 2008, Journal of Clinical Virology, 2008, 43(1): 86-92.
West et al. 2005, J Virol. 79(3):1543-1551.
Claims (39)
- REIVINDICACIONES1. Proteína mutante, cuya secuencia en aminoácidos comprende una secuencia que difiere de la de la proteína F de un virus PIV-5 o PIV-2:- por sustitución: 5- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 22, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 24, por el aminoácido P, y- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 132, o que, en la 10 secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 133, por el aminoácido E, y- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 290, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 294, por el aminoácido A, y15- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 447, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en la posición 445, por el aminoácido P,- y por sustitución:20- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 147, o que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en posición 151, por un aminoácido hidrófobo seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V, y/o- del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 158, o que, en la 25 secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en posición 162, por un aminoácido hidrófobo seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V,- y, opcionalmente:30- por sustitución del sitio de escisión nativo de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimático, y/o por inserción en dicha proteína F de un sitio de escisión enzimático diferente del sitio de escisión nativo de esta proteína F, y/o- por supresión de una parte C-terminal de dicha proteína F, extendiéndose dicha parte C-terminal en dirección N-terminal a partir del último aminoácido en el extremo C-terminal de la proteína, pero sin extenderse más allá del 35 dominio HR2 de dicha proteína F,la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5 o PIV-2 que comprende la secuencia de la SEC ID NO: 34.
- 2. Proteína mutante según la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de dicha proteína F es una 40 proteína F de PIV-5.
- 3. Proteína mutante según la reivindicación 2, caracterizada por que la secuencia de dicha proteína F consiste en:- la secuencia de la SEC ID NO: 31, o la secuencia alternativa que es idéntica a la secuencia de SEC ID NO: 31 con 45 la excepción del aminoácido en la posición 443, que es S en esta secuencia alternativa (en lugar de P en la SEC ID NO: 31), o en- una secuencia variante de esta secuencia de la SEC ID NO: 31 o de dicha secuencia alternativa, esta secuencia variante: 50 es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 31, o es de un tamaño superior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31, o es de un tamaño inferior en un máximo de 7 aminoácidos al de la SEC ID NO: 31, y presenta una identidad de secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente 55 de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 31 o a dicha secuencia alternativa, siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de la SEC ID NO: 31 o, llegado el caso, de dicha secuencia alternativa.
- 4. Proteína mutante según la reivindicación 3, caracterizada por que la secuencia de dicha proteína F consiste en la 60 secuencia de la SEC ID NO: 31 modificada por las sustituciones de aminoácidos indicados en la tabla 1 en la columna "W3A" o "MIL" o "DEN" o "LN" o "MEL" o "Criptovirus" o "CPI+" o "CPI-" o "H221" o "78524" o "T1" o "SER".
- 5. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada por que su secuencia en aminoácidos no comprende otra mutación con respecto a dicha secuencia de la proteína F de PIV-5. 65
- 6. Proteína mutante según la reivindicación 5, caracterizada por que dicha secuencia que difiere de la de dicha proteína F difiere además por:- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 147, por el aminoácido V, 5 o por- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 158, por el aminoácido V, o por10- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 147, por el aminoácido V, y por sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 158, por el aminoácido V.
- 7. Proteína mutante según la reivindicación 5 o 6, caracterizada por que la secuencia de dicha proteína F es la 15 secuencia SEC ID NO: 31 con el aminoácido S en posición 443, y por que dicha secuencia que difiere de la de dicha proteína F difiere además por:- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 147, por el aminoácido V, o por 20- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 158, por el aminoácido V, o por- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 147, por el aminoácido V, y 25 por sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 158, por el aminoácido V.
- 8. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada por que dicha secuencia que difere de la de dicha proteína F difiere además por: 30- al menos una mutación de prefusión seleccionada de entre:- la sustitución del aminoácido en la posición 49 por el aminoácido A,- la sustitución del aminoácido en la posición 402 por el aminoácido A, 35- la sustitución del aminoácido en la posición 443 por el aminoácido P,- la sustitución del aminoácido en la posición 449 por el aminoácido P,y/o por40- al menos una mutación de post-fusión seleccionada de entre:- la sustitución del aminoácido en la posición 463 por un aminoácido hidrófobo.
- 9. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizada por que dicha secuencia que 45 difiere de la de la proteína F de un virus PIV-5 comprende la sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 158, por un aminoácido hidrófobo, seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V.
- 10. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizada por que dicha secuencia que 50 difiere de la de la proteína F de un virus PIV-5 comprende la sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-5, está en la posición 147, por un aminoácido hidrófobo, seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V.
- 11. Proteína mutante según la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de dicha proteína F es una 55 proteína F de PIV-2.
- 12. Proteína mutante según la reivindicación 11, caracterizada por que la secuencia de dicha proteína F consiste en:- la secuencia de la SEC ID NO: 33, o en 60- una secuencia variante de esta secuencia de SEC ID NO: 33, esta secuencia variante:* es de un tamaño idéntico al de la SEC ID NO: 33, o es de un tamaño superior en un máximo de 2 aminoácidos al de la SEC ID NO: 33, o es de un tamaño inferior en un máximo de 2 aminoácidos al de la SEC ID NO: 33, y65* presenta una identidad de la secuencia de más del 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, con respecto a la secuencia de la SEC ID NO: 33, siendo esta identidad calculada sobre la longitud de la secuencia de SEC ID NO: 33.
- 13. Proteína mutante según la reivindicación 11 o 12, caracterizada por que dicha secuencia en aminoácidos no 5 comprende otra mutación con respecto a dicha secuencia de proteína F de PIV-2.
- 14. Proteína mutante según la reivindicación 13, caracterizada por que dicha secuencia que difiere de la de dicha proteína F difiere además por:10- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 151, por el aminoácido V, o por- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 162, por el aminoácido V, o por 15- sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 151, por el aminoácido V, y sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F, está en la posición 162, por el aminoácido V.
- 15. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, caracterizada por que dicha secuencia que 20 difiere de la de dicha proteína F difiere además por:- al menos una mutación de pre-fusión seleccionada de entre:- la sustitución del aminoácido en la posición 53 por el aminoácido A, 25- la sustitución del aminoácido en la posición 406 por el aminoácido A,- la sustitución del aminoácido en la posición 428 por el aminoácido P,- la sustitución del aminoácido en la posición 439 por el aminoácido P, y/o por- al menos una mutación de post-fusión seleccionada de entre: 30- la sustitución del aminoácido en la posición 474 por un aminoácido hidrófobo.
- 16. Proteína mutante según la reivindicación 8 o 15, caracterizada por que dicha aminoácido hidrófobo se selecciona de entre V, I, L, preferiblemente V. 35
- 17. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizada por que dicha secuencia que difiere de la de la proteína F de un virus PIV-2 comprende la sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en posición 162, por un aminoácido hidrófobo seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V. 40
- 18. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizada por que dicha secuencia que difiere de la de la proteína F de un virus PIV-2 comprende la sustitución del aminoácido que, en la secuencia de dicha proteína F de virus PIV-2, está en posición 151, por un aminoácido hidrófobo seleccionado de entre V, I, L, preferiblemente V. 45
- 19. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada por que comprende una secuencia que difiere de la de la proteína F de un virus PIV-5 o PIV-2 por sustitución del sitio de escisión nativo de dicha proteína F por otro sitio de escisión enzimático, y/o por inserción en dicha proteína F de un sitio de escisión enzimático diferente del sitio de escisión nativo de esta proteína F. 50
- 20. Proteína mutante según la reivindicación 19, caracterizada por que dicho sitio de escisión diferente del sitio de escisión nativo es un sitio de escisión específico de tejido.
- 21. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada por que es fusogénica. 55
- 22. Ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, o ácido nucleico complementario de tal ácido nucleico.
- 23. Vector de transfección, transducción o transformación, que comprende al menos un ácido nucleico según la 60 reivindicación 22.
- 24. Vector de expresión según la reivindicación 23, caracterizado por que es un vector adenoviral oncolítico.
- 25. Célula, caracterizada por que comprende al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, y/o al menos un ácido nucleico, ADN o ARN según la reivindicación 22, y/o al menos un vector según la reivindicación 23 o 24.
- 26. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, un ácido nucleico, ADN o ARN según la 5 reivindicación 22, un vector según la reivindicación 23 o 24, una célula según la reivindicación 25, para una utilización en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado neoplásico, preferiblemente de un tumor metastásico, preferiblemente de un melanoma metastásico.
- 27. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, un ácido nucleico, ADN o ARN según la 10 reivindicación 22, un vector según la reivindicación 23, una célula según la reivindicación 24, para una utilización en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una deficiencia del desarrollo placentario.
- 28. Inhibidor de la fusión celular, caracterizado por que es:15- un anticuerpo dirigido contra una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, o un fragmento Fab o F(ab')2 de tal anticuerpo,- un ácido nucleico aptámero o un péptido aptámero que se une específicamente a al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, o a un ácido nucleico, ADN, ARN según la reivindicación 22, 20- una célula del sistema inmunitario recombinante, preferiblemente una célula dendrítica recombinante, que expresa en su superficie al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21,- un ácido nucleico anti-sentido de un ácido nucleico según la reivindicación 22, 25- un pequeño ARN interferente (small interfering RNA; siRNA) que comprende un ARN bicatenario de 19 a 22 nucleótidos, capaz de unirse a un ácido nucleico según la reivindicación 22.
- 29. Célula según la reivindicación 25, que es una célula del sistema inmunitario humano o animal no humano, 30 preferiblemente una célula dendrítica humana o animal no humana, expresando dicha célula en su superficie al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
- 30. Inhibidor de fusión celular según la reivindicación 28, para una utilización en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un exceso de fusogenicidad celular, siendo dicha 35 enfermedad o estado una infección por virus con envoltura (preferiblemente una infección por VIH y/o Influenza y/o Parainfluenza y/o Rhabdovirus), una alergia, una enfermedad autoinmune o un rechazo de injerto.
- 31. Proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para una utilización a título de agente inmunógeno en el tratamiento y/o la prevención y/o la paliación de una enfermedad o de un estado que implique un 40 exceso de fusogenicidad celular, siendo dicha enfermedad o estado una infección por virus con envoltura (preferiblemente una infección por VIH y/o Influenza y/o Parainfluenza y/o Rhabdovirus), una alergia, una enfermedad autoinmune o un rechazo de injerto.
- 32. Vacuna destinada al tratamiento y/o a la prevención y/o a la paliación de una enfermedad o de un estado que 45 implique un exceso de fusogenicidad celular, siendo dicha enfermedad o estado una infección por virus con envoltura (preferiblemente una infección por VIH y/o Influenza y/o Parainfluenza y/o Rhabdovirus), una alergia, una enfermedad autoinmune o un rechazo de injerto, caracterizada por que comprende al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.50
- 33. Método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de una enfermedad que implique una formación insuficiente, o por el contrario excesiva, de sincitio, caracterizado por que comprende la detección en una muestra biológica de al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o de al menos un ácido nucleico según la reivindicación 22.55
- 34. Método in vitro para el cribado de un compuesto capaz de disminuir o bloquear la formación de sincitio, caracterizado por que comprende la puesta en contacto de un compuesto candidato con unas células que expresan al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, a fin de determinar si este compuesto candidato disminuye o bloquea la fusión de dichas células.60
- 35. Célula tumoral, más particularmente mieloma, que comprende al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, preferiblemente que comprende al menos tal proteína mutante en su superficie, y/o que comprende al menos un ácido nucleico según la reivindicación 22, y/o que comprende al menos un vector según la reivindicación 23.65
- 36. Célula tumoral, más particularmente el mieloma, según la reivindicación 35, para una utilización en la producción de un hibridoma.
- 37. Hibridoma, caracterizado por que comprende al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, y/o al menos un ácido nucleico según la reivindicación 22, y/o al menos un vector según la 5 reivindicación 23.
- 38. Célula madre o progenitora, que presenta una capacidad de diferenciación en célula muscular, caracterizada por que comprende al menos una proteína mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, preferiblemente que comprende al menos tal proteína mutante en su superficie, y/o que comprende al menos un ácido nucleico según la 10 reivindicación 22, y/o que comprende al menos un vector según la reivindicación 23, no siendo dicha célula una célula embrionaria humana.
- 39. Célula madre o progenitora de la reivindicación 38, para una utilización como célula madre o progenitora de fibra muscular. 15
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