JP5823296B2 - Piv−5及びpiv−2のfタンパク質の突然変異タンパク質 - Google Patents
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Description
・核酸、ベクター、細胞;
・抗体、アプタマー、干渉RNAタイプの融合阻害剤;
・骨髄腫、ハイブリドーマ;
・幹細胞及び前駆細胞
に関する。
PIV-5のFタンパク質の配列を図1Aに示す(配列番号31のタンパク質配列;配列番号30のコーディング核酸配列)。これは、サル単離体(isolate)であるWR単離体の配列である。それらの配列は、ジーンバンクデータベースから受入れ番号AB021962により入手可能である。
・例えばW3A単離体などの他のサル単離体;
・他の非ヒト動物からの単離体、例えば、
○イヌ単離体、例えば、イヌ単離体CPI+、CPI−、H221、78524、Tl;
○ブタ単離体、例えば、ブタ単離体SER;
・ヒトから採取されたサンプルに由来するが、動物細胞で培養された(上記導入部分を参照)「ヒト」単離体と名付けられた単離体、例えば、MIL単離体、DEN単離体、LN単離体、MEL単離体、及びWO 02 077211において「クリプトウイルス」であると記載されている単離体;
が明らかに存在する。
・147位における、アミノ酸T;
・158位における、アミノ酸T;
・447位における、アミノ酸L;及び
・449位における、アミノ酸I
を有する。
・配列番号31の配列、又は前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」;又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じサイズであるか、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ大きいサイズであり[前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」は、配列番号31の配列と同じサイズである]、好ましくは配列番号31のものと同じサイズを有し、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ大きい;及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有する(この同一性は、配列番号31の配列又は適切であれば前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の配列の長さを用いて算出される)、
として定義され得る変異配列;
から成る。
・配列番号33の配列;又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか、又は、配列番号33の配列より最大で2アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は、配列番号33の配列より最大で2アミノ酸だけ大きいサイズであり、好ましくは配列番号33のものと同じサイズを有し、好ましくは配列番号33のものとサイズが同じである;及び
○配列番号33の配列に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有する(この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される)
で定義される変異配列;
から成りうる。
a)配列番号34の配列:
・N−末端において3〜7のアミノ酸によって先行され、特にはN−末端において3アミノ酸(例えばMGT)に先行され又は7アミノ酸(例えばMHHLHPM)に先行され;及び
・任意に、C−末端において18アミノ酸が続き、特にはC−末端においてアミノ酸ENPAFFSKNNHGNIYGISが続き;又は
b) 上記a)で記載された配列の変異配列であって、
・下記の何れか:
i. 配列番号31のものと同じサイズを有するか、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ大きいサイズであり;及び好ましくは配列番号31のものと同じサイズを有し、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ大きいサイズである;及び
ii. 配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有する(この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、適切であれば前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の長さを用いて算出される);
・又は:
i. 配列番号33のものと同じサイズを有するか、又は、配列番号33のものより最大で2アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は、配列番号33のものより最大で2アミノ酸だけ大きいサイズであるか、好ましくは配列番号33のものと同じサイズを有する;及び
ii. 配列番号33の配列に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有する(この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される);
である変異配列。
本願は、突然変異タンパク質であって、該アミノ酸配列が、
・置換:
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の22位のアミノ酸、又は、PIV-2 Fタンパク質の配列中の24位のアミノ酸の、アミノ酸Pによる置換(PIV-5のFにおける突然変異22P;PIV-2のFにおける突然変異24P);及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の132位のアミノ酸、又は、PIV-2 Fタンパク質の配列中の133位のアミノ酸の、アミノ酸Eによる置換(PIV-5のFにおける突然変異132E;PIV-2のFにおける突然変異133E);及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の290位のアミノ酸、又は、PIV-2 Fタンパク質の配列中の294位のアミノ酸の、アミノ酸Aによる置換(PIV-5のFにおける突然変異290A;PIV-2のFにおける突然変異294A);及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の449位のアミノ酸、又は、PIV-2 Fタンパク質の配列中の439位のアミノ酸の、アミノ酸Pによる置換(PIV-5のFにおける突然変異449P;PIV-2のFにおける突然変異439P);
・並びに、任意に:
○前記Fタンパク質の天然の(又は自然な)切断サイトの、他の酵素的切断サイトによる置換、及び/又は、前記Fタンパク質の天然の(又は自然な)切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Fタンパク質への挿入;及び/又は
○前記Fタンパク質のC−末端部分であって、該タンパク質のC−末端にある最後のアミノ酸からN−末端方向に伸張するが、前記Fタンパク質のHR2ドメインを超えては伸張しないC−末端部分の欠失;
によって、PIV-5又はPIV-2ウイルスのFタンパク質の配列から導き出される(derivable)配列を含む突然変異タンパク質に関する。
本発明の一つの側面に従って、本発明の突然変異タンパク質はPIV-5ウイルスのFタンパク質の配列から導き出される配列を含む。
・配列番号31の配列(図1Aに示されたPIV-5のWR単離体のFタンパク質の配列)、又は、前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の配列;又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じサイズであるか(即ち、529アミノ酸から成る)、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ大きいサイズであるか(即ち、530, 531, 532, 533, 534, 535又は536 アミノ酸から成る)、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ小さいサイズであり(即ち、522, 523, 524, 525, 526, 527又は528 アミノ酸から成る);及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、(適切であれば)前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の長さを用いて算出される、変異配列;
から成り得る。
・配列番号31の配列(図1Aに示されたPIV-5のWR単離体のFタンパク質の配列)、又は、前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の配列;又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じサイズであるか(即ち、529アミノ酸から成る)、又は、配列番号31のものより最大で7アミノ酸だけ大きいサイズである(即ち、530, 531, 532, 533, 534, 535又は536 アミノ酸から成る);及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、適切であれば、前記代替配列「443位にSを有する配列番号31」の長さを用いて算出される、変異配列。
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○49位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○402位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○443位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;
○447位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;
及び/又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換。
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○49位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○402位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
及び/又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換。
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
及び、
・少なくとも一つの他の融合後突然変異、即ち、463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、好ましくはV、I又はL、より好ましくはVによる置換;
によって、このFタンパク質の配列から導き出される。
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、このFタンパク質の配列から導き出される。
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○49位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○402位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
及び
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、このFタンパク質の配列から導き出される。
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、このFタンパク質の配列から導き出される。
本発明の他の側面に従って、本発明の突然変異タンパク質は、PIV-2ウイルスのFタンパク質の配列から導き出される配列を含む。
・配列番号33の配列(図1Bに示したPIV-2のGreer 単離体のFタンパク質の配列);又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか(即ち、551アミノ酸から成る)、又は、配列番号33の配列より最大で2アミノ酸だけ大きいサイズであるか(即ち、552又は553アミノ酸から成る)、又は、配列番号33の配列より最大で2アミノ酸だけ小さいサイズであり(即ち、549又は550アミノ酸から成る);及び
○配列番号33の配列に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列;
から成り得る。
・配列番号33の配列(図1Bに示したPIV-2のGreer 単離体のFタンパク質の配列);又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか(即ち、551アミノ酸から成る)、又は、配列番号33の配列より最大で2アミノ酸だけ大きいサイズであり(即ち、552又は553アミノ酸から成る);及び
○配列番号33の配列に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列;
からなる。
・配列番号33の配列(図1Bに示したPIV-2のGreer 単離体のFタンパク質の配列);又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであり(即ち、551アミノ酸から成る);及び
○配列番号33の配列に対して、95%を超える配列同一性、好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列;
からなる。
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○53位アミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○406位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○428位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;
○445位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;
及び/又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、このFタンパク質配列から導き出され得る。
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○53位アミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○406位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
及び/又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、このFタンパク質配列と相違する。
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
及び、
・少なくとも一つの他の融合後突然変異、即ち、474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、好ましくは、V、I又はL、より好ましくはVによる置換;
によって、このFタンパク質の配列と相違する。
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、このFタンパク質の配列と相違する。
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○53位アミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○406位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、このFタンパク質の配列と相違する。
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、このFタンパク質の配列と相違する。
・F PIV-5の突然変異49Aは、F PIV-2の突然変異53Aに対応する;
・F PIV-5の突然変異402Aは、F PIV-2の406Aに対応する;
・F PIV-5の突然変異147Vは、F PIV-2の151Vに対応する;
・F PIV-5の突然変異158Vは、F PIV-2の162Vに対応する;
・F PIV-5の突然変異463Vは、F PIV-2の474Vに対応する。
本発明に従って、本発明の突然変異タンパク質は、
・上述の突然変異;及び更に
・前記Fタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換、及び/または前記Fタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの前記Fタンパク質への挿入、好ましくは、前記Fタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換
によって、PIV-5またはPIV-2ウイルスのFタンパク質の配列から導き出される配列を含み得る。
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (配列番号24)。
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (配列番号29)
を含んでいてもよいし、この配列からなっていてもよい。
また本出願は、本発明による突然変異タンパク質をコードする核酸、DNAまたはRNA (普遍的な遺伝暗号に従って、この遺伝暗号の縮重を許容する)、並びにかかる核酸の相補的核酸(同じ長さの完全に相補的な核酸)に関する。
また本出願は、本発明による少なくとも一つの核酸を含む核酸ベクター、より具体的には、トランスフェクション、形質導入または形質転換ベクターに関する。
・ヒト細胞、有利には病的なヒト細胞、より具体的にはヒト腫瘍細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において;または
・胎盤細胞において、
前記少なくとも一つの核酸の発現を許容するベクターである。
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び/または本発明による少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、及び/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む細胞に関する。
本発明の突然変異タンパク質、及び/または本発明の核酸、DNAまたはRNA、及び/または本発明のベクター、及び/または本発明の細胞は、病的な細胞及び/または生物の健康に好ましくない細胞の存在及び/または増殖を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和において、より具体的には、不十分な細胞の膜融合性 (cellular fusogenicity) を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和において、好ましくは疾病または腫瘍形成状態、たとえば腫瘍、転移性腫瘍、有利には転移性黒色腫の治療及び/または予防及び/または緩和において使用され得る。
また本出願は、細胞融合を減少させるかまたは遮断する能力を有する生成物に関する。これら生成物は、本発明の一または複数の突然変異タンパク質の阻害剤である。
・本発明による突然変異タンパク質に対する抗体、またはかかる抗体のFabもしくはF(ab’)2断片;または
・本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または本発明による核酸、DNA、RNAに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー;または
・本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞;または
・本発明による核酸のアンチセンス核酸;または
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖RNAを含み、かつ本発明による核酸に結合する(ハイブリダイズする)ことができる、低分子干渉(small interfering)RNA、siRNA。
・本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または本発明の核酸、DNA、RNAに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー;
・本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞;
・本発明の核酸のアンチセンス核酸;
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖RNAを含み、かつ本発明の核酸に結合する(ハイブリダイズする)ことができ、有利には前記核酸の転写を遮断または阻害することができる、低分子干渉(small interfering)RNA、siRNA。
また本出願は、
・不十分なシンシチウムの形成、たとえば、腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫または胎盤の発達不全;あるいは対照的に
・過剰なシンシチウムの形成、たとえば、エンベロープに包まれたウイルスの感染(好ましくは、HIV及び/またはインフルエンザ及び/またはパラインフルエンザ及び/またはラブドウイルスの感染)、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶
を伴う疾病または状態の診断または予後のための方法、より具体的にはインビトロでの方法に関する。
また本出願は、シンシチウムの形成を減少させるかまたは遮断することができる化合物をスクリーニングするための方法、より具体的にはインビトロでの方法に関する。本発明の方法は、(たとえば、候補化合物の存在下で達成される融合度を、その非存在下で達成される融合度と比較することにより) 候補化合物が前記細胞の融合を減少させるかまたは遮断するかどうかを決定するために、候補化合物を、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質を発現する細胞と接触させることを含む。
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、及び/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、及び/または本発明による少なくとも一つのベクター、より具体的には本発明による発現ベクターを含む、腫瘍細胞、より具体的には骨髄腫に関する。
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、及び/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、及び/または本発明による少なくとも一つのベクター、より具体的には本発明による発現ベクターを含む、幹細胞または前駆細胞に関する。
材料及び方法及び:
細胞及びウイルス
細胞株LLC-MK2 (Macaca mulatta腎臓細胞株) は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection (ATCC)) から受入れ番号CCL-7で入手可能である。
ウイルスRNAは、PIV-5によるLLC-MK2細胞の感染から得られた上清から、Absolutely RNA(登録商標) Microprep Kit (Stratagene, USA) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って抽出した。逆転写は、pd(N)6ランダムヘキサマー (Amersham Biosciences, GB) 及び鳥類骨髄芽球症ウイルスAMVの逆転写酵素 (Reverse Transcriptase; RT) (Promega から入手可能なAMV-RT逆転写酵素) を用いて行った。
センスプライマー (配列番号 1):
5' TTGCGGCCGCATGGGTACTATAA 3'
アンチセンスプライマー (配列番号 2):
5' CCGCTCGAGTTATGATAAACAAAATTCTCC 3'。
PIV-5のFタンパク質の突然変異タンパク質は、PIV-5 F融合タンパク質をコードするプラスミドpcDNA3.1において、指定突然変異により産生した。突然変異は、供給業者により提供されるプロトコール (Stratageneから入手可能なQuickChange(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System) に従って、相補的プライマーを用いたPCRにより作成した。使用されたプライマーのリストは、下記表2に示す。プラスミドのアセンブリは、配列決定により確認した。
試薬ExGen500 (Fermentas) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って、細胞をプラスミドによりトランスフェクトした。1〜3マイクログラムのプラスミドDNAを、48hの間、細胞 (70〜80% コンフルエンス) に添加した。トランスフェクションの効率は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするプラスミドを用いて評価した。
トランスフェクトされた細胞は、リン酸緩衝生理食塩水PBS中のパラホルムアルデヒド (1% v/v) を用いて固定し、その後、2回洗浄した。PBSで1/10に希釈された、PIV-5 Fタンパク質に対するモノクローナル抗体の存在下で、この場合、Randall et al, 1987に記載されるモノクローナル抗体F1aの存在下で、細胞マットを3hの間インキュベートした。モノクローナル抗体F1aは、PIV-5の単離体 (この場合、LN単離体) に対するマウスの免疫処置、ハイブリドーマの調製、及び特異的な抗F抗体の選択により得た。
フローサイトメトリーは、文献 (Horvat and Lamb 1992) に記載されるとおり行った。A549細胞を、種々のFusをコードするプラスミドによりトランスフェクトし、氷上に置いた。細胞マットを、1 %のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水PBSですすいだ。その後、そのマットに、抗PIV-5 Fタンパク質モノクローナル抗体 (この場合、モノクローナル抗体F1a) を添加し (1% ウシ胎仔血清を含む1/500 PBSリン酸緩衝液)、4℃で30分間インキュベートした。その後、そのマットをすすぎ、1/1000のAlexa Fluor(登録商標) 488 に結合した抗マウス二次抗体 (Invitrogen) の存在下でインキュベートした。細胞を、すすいだ後、500μLのPBSリン酸緩衝液、EDTA (エチレンジアミンジアミン四酢酸) 中0.5mMを用いて穏やかに引き離した。細胞を、500μLの1 %パラホルムアルデヒド溶液を含有する専用のフローサイトメトリー管に移した。5000細胞の蛍光強度を、蛍光活性化細胞ソーティングFACSを用いて、この場合、Becton DickinsonからのFACSVantageTM SEフローを用いて測定した。
種々のFus発現プラスミドによりトランスフェクトし、免疫蛍光法で観察したマットに、半定量的分析を行った。この分析は、以下の基準を用いて突然変異体の各々について融合スコアを決定することから構成される:
・融合または融合なし (単純な集合)、-/+で表示;
・シンシチウムのサイズ、1〜5のスケールで表示;
・核の数、1〜5のスケールで表示。
細胞−細胞融合を定量するために、“ドナー”A549細胞 (6ウェルプレートのウェルあたり2.5百万の細胞) を、種々のFus突然変異タンパク質をコードする2μgのプラスミドpcDNA3.1、並びに長い末端反復配列LTRに依存してルシフェラーゼを発現する50 ngのプラスミドで、同時トランスフェクトした (Lavillette et al, 2007)。
本発明者らにより構築され産生された突然変異タンパク質は、上記表3に示される。
・HNに対する自律性の機能への関与: PIV-5のFタンパク質の22、132及び290位;
・融合前の機能への関与:PIV-5のFタンパク質の49、402、443、447及び449位;
・融合後の機能への関与:PIV-5のFタンパク質の147、158及び463位。
・自律性の3つの突然変異及び融合前の突然変異449Pを共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば、突然変異タンパク質Fus8、Fus10、Fus10.4、Fus10.5、Fus11、Fus8.l、Fus8.2、Fus8.4、Fus8.5、Fus8.6、Fus8.7、Fus10.l、Fus10.2、Fus10.3;及び
・自律性の3つの突然変異、融合前の突然変異447P、及び少なくとも一つの融合後の突然変異 (147Vまたは158V) を共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば、Fus7.1、Fus7.2またはFus7.3。
本発明の突然変異タンパク質、及びとりわけ上記表1に記載されるものは、天然のFタンパク質の天然の切断サイトの置換により、たとえば、それを組織特異的な切断サイトで置換することにより、予め改変された。
RRRRR (配列番号 23)。
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (配列番号 24)。
PXXHyS/T (配列番号 27)
ここでX = 任意のアミノ酸、及び
ここでHy = 任意の疎水性アミノ酸 (すなわち、F、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸)。
PRRIT (配列番号 28)。
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (配列番号 29)。
PIV-5のFタンパク質の突然変異タンパク質は、上記例1に記載されるとおり産生した。
切断サイトの置換は、融合タンパク質F PIV-5をコードするプラスミドpcDNA3.1において、3つの連続的な指定突然変異誘発により行った。突然変異は、供給業者により提供されるプロトコール (Stratageneから入手可能なQuickChange(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System) に従って、相補的プライマーを用いたPCRにより作成した。プラスミドのアセンブリは、配列決定により確認した。
センス 5' CCAGTTGATTCCAACTCCGAGGAGACGCCGGTTTGC 3' (配列番号80)
アンチセンス 5' GCAAACCGGCGTCTCCTCGGAGTTGGAATCAACTGG 3' (配列番号81)
2nd 突然変異 R101I
センス 5 ' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCCGGTTTGCAGGAGTGGTG 3 ' (配列番号82)
アンチセンス 5 ' CACCACTCCTGCAAACCGGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (配列番号83)
3rd 突然変異 R102T
センス 5' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCACGTTTGCAGGAGTGGTGATTGG 3' (配列番号84)
アンチセンス 5' CCAATCACCACTCCTGCAAACGTGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (配列番号85)。
試薬ExGen500 (Fermentas) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って、細胞をプラスミドによりトランスフェクトした。1〜3マイクログラムのプラスミドDNAを、48hの間、細胞 (70〜80% コンフルエンス) に添加した。トランスフェクションの効率は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするプラスミドを用いて評価した。
トランスフェクトされた細胞は、リン酸緩衝生理食塩水PBS中のパラホルムアルデヒド (1% v/v) を用いて固定し、その後、2回洗浄した。PBSで1/10に希釈された、融合タンパク質PIV-5 Fに対するモノクローナル抗体の存在下で、この場合、Randall et al, 1987に記載されるモノクローナル抗体F1aの存在下で、細胞マットを3hの間インキュベートした。モノクローナル抗体F1aは、PIV-5の単離体 (この場合、LN単離体) に対するマウスの免疫処置、ハイブリドーマの調製、及び特異的な抗F抗体の選択により得た。
本発明者らはこのように、突然変異タンパク質、例えば、その天然の切断サイトが配列番号28のMMP-9サイトにより置換されることにより、突然変異タンパク質Fus8及びFus8.7と相違する、タンパク質Fus8M及びFus8.7M(それぞれ、配列番号88及び89)を得た。
Baker et al, 1999, Mol Cell. 3(3):309-19.
Chatziandreou et al, 2004, Journal of General Virology 85: 3007-3016.
Horvat and Lamb 1992, J. Virol. 66(4): 2443-2455.
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West et al, 2005, J Virol. 79(3):1543-1551.
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○49位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○402位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
及び/又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする突然変異タンパク質。
[2] 前記疎水性アミノ酸が、V、I、Lから選択され、好ましくはVであることを特徴とする、[1]に記載の突然変異タンパク質。
[3] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
から選択される少なくとも一つの融合後突然変異によって前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、[1]又は[2]に記載の突然変異タンパク質。
[4] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号68〜79の配列から選択される配列であることを特徴とする、[3]に記載の突然変異タンパク質。
[5] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○49位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○402位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、[1]、又は[2]に記載の突然変異タンパク質。
[6] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号68、69、70の配列から選択される配列である、[5]に記載の突然変異タンパク質。
[7] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○53位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○406位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
及び/又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、上記に記載の突然変異タンパク質。
[8] 前記疎水性アミノ酸が、V、I、Lから選択され、好ましくはVである、[7]に記載の突然変異タンパク質。
[9] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
から選択される少なくとも一つの融合後突然変異によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、[7]又は[8]に記載の突然変異タンパク質。
[10] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異:
○53位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○406位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異:
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、[7]〜[9]の何れかに記載の突然変異タンパク質。
[11] 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、[7]〜[10]の何れかに記載の突然変異タンパク質。
[12] 天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、一または複数の腫瘍組織によって酵素特異的に発現される切断サイトであることを特徴とする、上記の突然変異タンパク質。
[13] 天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、一または複数の転移性組織によって特異的に発現される酵素の切断サイトであることを特徴とする、[12]に記載の突然変異タンパク質。
[14] 天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、金属プロテアーゼの切断サイトであることを特徴とする、[12]又は[13]のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
[15] 天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、マトリクス金属プロテアーゼ9(MMP−9)の切断サイトであることを特徴とする、[12]〜[14]のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
[16] 天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、配列PXXHyS/T(配列番号27)を含み、ここで、X = 任意のアミノ酸であり、Hy=F、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸であることを特徴とする、[12]〜[15]のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
[17] 天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、配列PRRIT(配列番号28)及び/又は配列IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL(配列番号29)を含むことを特徴とする、[12]30〜36のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
[18] 配列番号88又は89の配列を含むことを特徴とする、[12]〜[17]の何れかに記載の突然変異タンパク質。
[19] 発現ベクターであることを特徴とする、[18]に記載のベクター。
[20] アデノウイルスベクターであることを特徴とする、[19]に記載の発現ベクター。
[21] 前記核酸の発現を制御するためのエレメントを含み、且つ、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞中の前記核酸の発現を可能にする、アデノウイルスベクターであることを特徴とする、[19]又は[20]に記載の発現ベクター。
[22] 動物細胞、好ましくはヒト細胞、特にヒト腫瘍細胞、好ましくは転移性ヒト細胞のゲノムへの、より好ましくは転移性黒色腫細胞への、前記少なくとも一つの核酸の挿入を可能にするベクターであることを特徴とする、上記に記載のベクター。
[23] ヒト細胞又は非ヒト動物細胞であることを特徴とする、上記に記載の細胞。
[24] 腫瘍細胞であり、好ましくは転移性細胞であり、より好ましくは転移性黒色腫細胞である、[23]に記載の細胞。
Claims (32)
- 突然変異タンパク質であって、該アミノ酸配列が、
・置換:
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の22位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の132位のアミノ酸のアミノ酸Eによる置換;及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の290位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の449位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;
又は、
置換:
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の22位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の132位のアミノ酸のアミノ酸Eによる置換;及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の290位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;及び
○PIV-5 Fタンパク質の配列中の449位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;及び
○前記Fタンパク質の天然の切断サイトの、他の酵素的切断サイトによる置換、及び/又は、前記Fタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Fタンパク質への挿入;
によって、PIV-5ウイルスのFタンパク質の配列から導き出される(derivable)配列を含む突然変異タンパク質であって、
前記Fタンパク質の配列が、
・配列番号31の配列、又は、443位のアミノ酸が(配列番号31のPの代わりに)Sであることを除いて配列番号31の配列と同じである代替配列;又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じアミノ酸長であるか、又は、配列番号31のものより最大でC−末端の7アミノ酸だけ大きいアミノ酸長であり;及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列に対して、95%を超える配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、前記代替配列の長さを用いてそれぞれ算出される、変異配列;
からなるPIV-5ウィルスのFタンパク質の配列であり、PIV-5 Fタンパク質の膜融合能力を有する、突然変異タンパク質。 - PIV-5ウイルスの前記Fタンパク質の配列が、配列番号34の配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の突然変異タンパク質。
- 前記Fタンパク質の配列が、
・配列番号31の配列、又は、443位のアミノ酸が(配列番号31のPの代わりに)Sであることを除いて配列番号31の配列と同じである代替配列;又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じアミノ酸長であるか、又は、配列番号31のものより最大でCー末端の7アミノ酸だけ大きいアミノ酸長であり;及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列に対して、少なくとも96%の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、前記代替配列の長さを用いてそれぞれ算出される、変異配列;
から成るPIV-5ウィルスのFタンパク質の配列であり、PIV-5 Fタンパク質の膜融合能力を有することを特徴とする、請求項1又は2に記載の突然変異タンパク質。 - 前記配列同一性のパーセンテージが少なくとも97%である請求項3の突然変異タンパク質。
- 前記Fタンパク質は、配列番号35および39の配列の一つから成ることを特徴とする、請求項1〜4の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
- そのアミノ酸配列が前記PIV-5 Fタンパク質配列に対して他の突然変異を含まないことを特徴とする、請求項1〜5の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
- 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号65の配列であることを特徴とする、請求項6に記載の突然変異タンパク質。
- 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの突然変異:
○49位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○402位のアミノ酸のアミノ酸Aによる置換;
○443位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;
○447位のアミノ酸のアミノ酸Pによる置換;
及び/又は
・以下から選択される少なくとも一つの突然変異:
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、請求項1〜5の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。 - 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号67〜79の配列から選択される配列であることを特徴とする、請求項1〜5および8の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
- 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;及び
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、請求項1〜5及び8〜9の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。 - 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号78の配列である、請求項10に記載の突然変異タンパク質。
- 前記Fタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの突然変異:
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換;
及び
・463位のアミノ酸のV、I又はLによる置換;
によって、前記Fタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、請求項1〜5及び8〜10の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。 - 前記の463位のアミノ酸が、Vにより置換される請求項12の突然変異タンパク質。
- 前記疎水性アミノ酸が、V、I、又はLである請求項8,10,12の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
- 前記疎水性アミノ酸が、Vである請求項8,10,12の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
- 前記Fタンパク質の天然の切断サイトの、他の酵素的切断サイトによる置換によって、及び/又は、前記Fタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Fタンパク質への挿入によって、PIV-5ウイルスのFタンパク質の配列から導き出される配列を含むことを特徴とする、請求項1〜13の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
- 天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、組織特異的切断サイトであることを特徴とする、請求項16に記載の突然変異タンパク質。
- 請求項1〜17の何れか一項に記載の突然変異タンパク質をコードする、核酸、DNA若しくはRNA、又はそのような核酸の相補的核酸。
- 請求項18に記載の少なくとも一つの核酸を含む、トランスフェクション、形質導入又は形質転換ベクター。
- 発現ベクターである請求項19のベクター。
- 腫瘍崩壊性のアデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項20に記載のベクター。
- 請求項1〜17の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び/又は、請求項18に記載の核酸、DNA又はRNAの少なくとも一つ、及び/又は、請求項19〜21の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とする細胞。
- 請求項22の細胞であって、ヒト又は非−ヒト動物の免疫系の細胞であり、請求項1〜17の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する細胞。
- ヒト又は非−ヒト動物の樹状細胞である請求項22又は23の細胞。
- 請求項1〜17の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質を含み、及び/又は、請求項18に記載の少なくとも一つの核酸を含み、及び/又は、請求項19〜21の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含む、腫瘍細胞。
- 骨髄腫細胞である請求項25の腫瘍細胞。
- 前記少なくとも一つの突然変異タンパク質は、前記腫瘍細胞の表面上に含まれる請求項25又は26の腫瘍細胞。
- ハイブリドーマの産生において使用するための、請求項25〜27の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
- 請求項1〜17の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び/又は、請求項18に記載の少なくとも一つの核酸、及び/又は、請求項19〜21の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とするハイブリドーマ。
- 筋細胞への分化能力を有する幹細胞又は前駆細胞であって、請求項1〜17の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質を含み、及び/又は、請求項18に記載の少なくとも一つの核酸を含み、及び/又は、請求項19〜21の何れか1項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とし、前記細胞はヒト胚細胞ではない、幹細胞又は前駆細胞。
- 前記少なくとも一つの突然変異タンパク質が前記幹細胞又は前駆細胞の表面上に含まれる請求項30の幹細胞又は前駆細胞。
- 筋繊維幹細胞又は前駆細胞としての使用のための、請求項30又は31の幹細胞又は前駆細胞。
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