ES2492015A1 - Hidrogeles de poloxamina y su uso para la regeneración o reparación ósea - Google Patents

Abstract

Hidrogeles de poloxamina y su uso para la regeneración o reparación ósea. La presente invención se relaciona con hidrogeles de poloxamina y ciclodextrina que pueden incorporar una estatina. La incorporación de ciclodextrinas permite disminuir la concentración de poloxamina necesaria para dar lugar a la formación de geles y aumenta además la actividad osteogénica/osteoinductiva de la poloxamina. Dichos hidrogeles promueven la diferenciación de células madre mesenquimales a osteoblastos y pueden utilizarse para la reparación, regeneración o aumento de la formación de hueso.

Description

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3

2,5 0,047 Sola Sol Sol

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5 0,094 Gel Gelb 2P

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7 0,132 Gel Gel Gel

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9,7 0,183 Gel Gel Gel

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0 0 Sol Sol Sol

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2,5 0,035 Sola Sol Sol

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5 0,071 Gel Gelb 2P

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7 0,099 Gel Gel Gel

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9,7 0,137 Gel Gel Gel

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0 0 Sol Sol Sol

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2,5 0,028 Sola Sol Sol

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0,057 Gel Gel 2 2P

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7 0,079 Gel Gel Gel

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9,7 0,110 Gel Gel Gel

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2,5 0,018 Sola Sol Sol

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5 0,035 Gel Gelb 2P

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7 0,049 Gel Gel Gel

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9,7 0,069 Gel Gel Gel

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0 0 Sol Sol Sol

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2,5 0,007 Sola Sol Sol

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5 0,014 Gel Gelb 2P

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7 0,020 Gel Gel Gel

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9,7 0,027 Gel Gel Gel

2P: separación en dos fases a Dispersión turbia blanquecinab Gelificado después de 3 días.

Pocos minutos (<5) después de que las disoluciones de T908 y CD fuesen mezcladas, los sistemas se convirtieron en dispersiones turbias y a continuación en geles blanquecinos (Tabla 1), lo que está de acuerdo con el tiempo requerido para que se formen polipseudorotaxanos con bloques PEO tan largos como los de T908.

5 La formación del gel resultó más favorable a 4 ºC ó 20 ºC que a 37 ºC. Sin embargo, una vez que los geles se formaron a 4 ºC ó 20 ºC, permanecieron estables durante al menos un mes. Importantemente, la temperatura puede entonces ser incrementada hasta 37 ºC sin provocar la separación de fases.

Propiedades reológicas

10 Los módulos elástico o de almacenamiento (G’) y viscoso o de pérdida (G’’) de las dispersiones preparadas con T908 (1, 5, 8, 13, y 20%) sin y con αCD (5 ó 9,7%) fueron registrados a 0,5 Pa en el intervalo de frecuencias angulares de 0,5 a 50 rad/s usando una geometría cono-plato (diámetro 6 cm, ángulo 2º) a 10, 25 y 37 ºC en un reómetro Rheolyst AR-1000N (TA Instruments, New Castle, UK) equipado con un analizador de

15 datos AR2500 y un plato Peltier.

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A temperatura inferior a la de gelificación, las disoluciones acuosas de poloxamina presentan un comportamiento reológico newtoniano. Por encima de la temperatura de gelificación, se transforman en sistemas viscoelásticos, y si se enfrían de nuevo, el gel vuelve a presentar la baja viscosidad inicial. En el intervalo de concentración del 1 a 13 5 %, las dispersiones de T908 solo en PBS pH 7,4 mostraron valores bajos de G" y por debajo del umbral de detección en el caso de G' incluso a 37 ºC (Figura 1). La adición de CD al 5 % provocó un aumento en G" de casi 5 órdenes de magnitud, excepto en el caso de T908 al 1% que no se vio afectado. Además, los valores de G' superaron a los de G" y resultaron ser independientes de la frecuencia angular, lo que es típico de una 10 red tridimensional bien estructurada. Entre 10 ºC y 37 ºC, el aumento de temperatura no causó efectos relevantes sobre G' y G". La incorporación de más CD hasta 9.7% condujo a entramados más viscoelásticos, incluso en el caso de T908 al 1%. Cabe destacar que los geles se pueden calentar en autoclave a 120ºC durante 20 min sin provocar cambios en su comportamiento reológico. La incorporación de simvastatina a

15 nivel de concentración M tampoco modificó las propiedades reológicas de los geles.

Ensayos de citocompatibilidad

Ensayo HET-CAM

Huevos de gallina fertilizados de menos de 3 días (Avirojo, Pontevedra, Spain) se incubaron durante 8 días a 37±0,3 ºC y 60±2,6% humedad relativa (Ineltec CCSP0150 20 Tona, Barcelona, España). A continuación, se aplicó el protocolo de la ICCVAM para el test de la membrana corioalantoidea (HET-CAM). Se retiró la parte superior de la cáscara del huevo (correspondiente a la bolsa de aire) utilizando una cuchilla circular (Dremel 300, Breda, Holanda) y se humectó la membrana interna de los huevos con disolución de 0,9% (p/v) NaCl. Al cabo de 30 min, se retiró esa membrana con unas 25 pinzas. Se depositaron alícuotas de dispersiones de T908-αCD (300 μL a 25 ºC) sobre la membrana corioalantoidea del huevo y se monitorizó su potencial irritante (hemorragia, lisis vascular y coagulación) durante 5 min. Como controles negativo y positivo se utilizaron disoluciones de 0,9% NaCl y 0,1 M NaOH, respectivamente. Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado. El índice de irritación se calculó a partir del tiempo (en

30 segundos) al que se inician los procesos de hemorragia (H), lisis (L) o coagulación (C), como sigue:

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Según los valores de IS, los materiales se clasifican en no irritantes (0–0,9), débilmente irritantes (1–4,9), moderadamente irritantes (5–8,9) y severamente irritantes (9–21).

35 Como las CDs libres pueden provocar hemólisis cuando se encuentran a altas

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4% T908

0,0123 (4,4) 3,84 0,021 5,83 1,534 0:1

5% T908

0,0144 (4,4) 4,50 0,019 7,00 1,441 0:1

8% T908

0,0220 (8,8) 6,88 0,017 11,22 1,373 0:1

10% T908

0,0259 (4.6) 8,09 0,016 13,39 1,296 0,1:1

13% T908

0,0395 (13.6) 12,34 0,019 20,94 1,518 0,1:1

20% T908

0,2468 (18.2) 77,13 0,077 136,11 6,172 0,2:1

a número de moles que se pueden solubilizar por mol de copolímero en estado micelar;b coeficiente de reparto micela/agua, es decir, relación de concentraciones de fármaco en la micela con respecto a la concentración de fármaco en agua.

5 Cesión de simvastatina Se prepararon dispersiones de T908 a las que se incorporó simvastatina a una concentración fija de 50 M (0,0209 mg/ml), y a continuación se incorporó αCD. La cesión de simvastatina se evaluó en células de difusión verticales Franz-Chien. La muestra (2 ml) se dispuso en el compartimento superior, que se separó del receptor (6

10 ml de PBS, 37ºC, agitación magnética) por medio de un filtro de acetato de celulosa (0,45 μm, Albet®, Barcelona, España). La superficie disponible para la difusión fue de 0,785 cm2. A tiempos preestablecidos se retiraron 300 μL del receptor (reemplazados con el mismo volumen de PBS a 37ºC) y se cuantificó la simvastatina cedida (contenido total y formas lactona e hidroxiácida) utilizando el procedimiento de HPLC descrito antes.

15 El proceso de cesión resultó más lento al aumentar la concentración de T908 (Figura 3). La incorporación de simvastatina a las dispersiones de T908 no alteró el proceso de gelificación subsecuente a la adición de CD. La gelificación condujo a perfiles de cesión más sostenidos; los geles de T908-CD controlaron la cesión de simvastatina durante más de una semana. Los coeficientes de difusión se calcularon a partir de la pendiente

20 de la recta obtenida al ajustar los perfiles de cesión a la ecuación de Higuchi:

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en la que Q representa la cantidad de fármaco (mg) cedida a tiempo t (s), A es el área de difusión (cm2), C0 es la concentración inicial de simvastatina en la formulación (mg/ml), y D es el coeficiente de difusión (cm2/s).

25 Se encontró una correlación negativa entre el contenido en CD y los valores de los coeficientes de difusión. En general, la adición de CD al 5 % redujo a la mitad los valores de los coeficientes de difusión, mientras que al 9,7 % los valores fueron entre 3 y 4 veces más pequeños que los registrados para las dispersiones de T908 solo. Estos resultados concuerdan con el aumento de viscosidad al que da lugar la formación de los

30 polipseudorotaxanos.

Ensayo fosfatasa alcalina (ALP)

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Claims (1)

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