ES2822923T3 - Péptidos auto-ensamblables que comprenden aminoácidos polares no iónicos - Google Patents

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Toshiro Kiyofuji
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Abstract

Una composición que comprende un péptido de auto-ensamblaje que consiste en una estructura química (ST14) de: **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos auto-ensamblables que comprenden aminoácidos polares no iónicos
CAMPO DE LA TECNOLOGÍA
Uno o más aspectos se refieren, en general, a materiales y métodos que pueden utilizarse en aplicaciones médicas y de investigación. Más particularmente, uno o más aspectos se refieren a materiales y métodos que pueden utilizarse para proporcionar materiales de hidrogel de péptidos.
El documento WO2010037395 describe complejos de MHC (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) que comprenden péptidos antigénicos del cáncer y usos de los mismos. El documento WO2012016357 describe una composición que comprende una molécula diana acoplada a una partícula y una molécula sonda inmovilizada en una micromatriz que se une a la molécula diana, en donde la molécula diana se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido, un anticuerpo, un compuesto de molécula pequeña, un péptido y un hidrato de carbono. El documento US2009130455 describe reactivos útiles para unir biomoléculas a una superficie. El documento WO2014167350 describe jaulas de péptidos auto-ensamblables de moléculas de péptidos en espiral. E Protopapa et al (Electrochimica Acta 55, 2010, páginas 3368-3375) describe la interacción de péptidos de lámina p auto-ensamblables con monocapas de fosfolípidos.
SUMARIO
La presente invención se refiere a una composición y a una solución peptídica que comprende un péptido autoensamblable que consiste en una estructura química de (ST14) tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención se refiere, además, a un método para la esterilización de péptidos que comprenden un péptido auto-ensamblable que consiste en una estructura química de (ST14) tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con uno o más aspectos, se proporciona una composición que comprende un péptido auto-ensamblable que comprende esencialmente aminoácidos polares no iónicos.
De acuerdo con uno o más aspectos, se proporciona una solución peptídica que comprende un péptido autoensamblable, que consiste esencialmente en aminoácidos polares no iónicos.
De acuerdo con uno o más aspectos, se proporciona un método de esterilizar péptidos. El método comprende proporcionar una solución peptídica que comprende un péptido auto-ensamblable que consiste esencialmente en aminoácidos polares no iónicos. El método también comprende tratar la solución peptídica a una temperatura predeterminada y una presión predeterminada durante un período de tiempo predeterminado para esterilizar la solución peptídica, la temperatura predeterminada y la presión predeterminada seleccionadas para proporcionar condiciones de vapor saturado.
La composición puede ser un armazón macroscópico que comprende péptidos auto-ensamblables que consisten esencialmente en aminoácidos polares no iónicos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los dibujos adjuntos no pretenden estar dibujadas a escala. Con el propósito de una mayor claridad, no todos los componentes pueden estar marcados. En los dibujos:
La FIG. 1 es una estructura química de ST14, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 2 es una estructura química de T14,
la FIG. 3 es una imagen del péptido ST14, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 4 es una imagen del péptido ST14, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 5 es una imagen del péptido T14,
la FIG. 6 es una imagen del péptido T14,
la FIG. 7 es un gráfico de espectrometría de masas del péptido ST14, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 8 es un gráfico de espectrometría de masas del péptido ST14, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 9 es un gráfico de espectrometría de masas del péptido T14,
la FIG. 10 es un gráfico de espectrometría de masas del péptido T14,
la FIG. 11 son imágenes relacionadas con la formación de gel con solución tampón de rojo Congo, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 12 es un gráfico que representa el módulo de almacenamiento frente a la tensión de oscilación de ST14, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 13 es un gráfico que representa el módulo de almacenamiento frente a la concentración de ST14, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 14 es un gráfico que representa el módulo de almacenamiento de ST14 antes y después del tratamiento con DMEM, de acuerdo con algunas realizaciones;
la FIG. 15 es un gráfico que representa el aumento de veces del módulo de almacenamiento de ST14 después del tratamiento con DMEM, de acuerdo con algunas realizaciones; y
la FIG. 16 es un gráfico que representa el porcentaje de viabilidad celular frente a la concentración de péptido, de acuerdo con algunas realizaciones.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
De acuerdo con una o más realizaciones, se proporcionan péptidos de auto-ensamblaje que consiste esencialmente en aminoácidos polares no iónicos. La expresión "péptido de auto-ensamblaje" puede referirse a un péptido que puede exhibir una estructura de lámina beta en solución acuosa en presencia de condiciones específicas para inducir la estructura de lámina beta. Las condiciones específicas pueden incluir ajustar el pH de una solución peptídica de autoensamblaje. El ajuste puede ser un aumento o una disminución del pH de la solución de péptido de auto-ensamblaje. El ajuste del pH puede ser un ajuste, por ejemplo, un aumento o una disminución del pH a un pH fisiológico o un pH neutro. Las condiciones específicas también pueden incluir la adición de un catión, tal como un catión monovalente, a una solución peptídica de auto-ensamblaje.
"Condiciones fisiológicas", tales como un pH fisiológico o una temperatura fisiológica, pueden ocurrir en la naturaleza para un organismo, sistema celular o sujeto particular que pueden contrastar con las condiciones artificiales de laboratorio. Las condiciones pueden comprender una o más propiedades, tales como una o más propiedades particulares o uno o más intervalos de propiedades. Por ejemplo, las condiciones fisiológicas pueden incluir una temperatura o un intervalo de temperaturas, un pH o un intervalo de pH, una presión o un intervalo de presiones y una o más concentraciones de compuestos, sales y otros componentes particulares. Por ejemplo, en algunos ejemplos, las condiciones fisiológicas pueden incluir una temperatura en un intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 grados Celsius. En algunos ejemplos, la presión atmosférica puede ser de aproximadamente 1 atm. El pH puede estar en el intervalo de pH neutro. Por ejemplo, el pH puede estar en un intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. En algunos casos, el pH fisiológico puede ser menor que 6, por ejemplo, aproximadamente 1-4, en el caso de al menos una porción del tracto gástrico. Las condiciones fisiológicas pueden incluir cationes tales como cationes metálicos monovalentes que pueden inducir la formación de membranas o hidrogel. Estos pueden incluir cloruro de sodio (NaCl). Las condiciones fisiológicas también pueden incluir una concentración de glucosa, concentración de sacarosa u otra concentración de azúcar, de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 20 mM. Las condiciones fisiológicas pueden incluir las condiciones locales del sitio diana en algunas realizaciones específicas.
A los péptidos de auto-ensamblaje se les puede aludir como o son una parte de una composición, que puede ser un hidrogel, por ejemplo, un armazón de hidrogel. De acuerdo con una o más realizaciones, se proporcionan péptidos de auto-ensamblaje que consisten esencialmente en aminoácidos polares no iónicos. En aún otras realizaciones, se proporcionan péptidos de auto-ensamblaje que consisten en aminoácidos polares no iónicos. Pueden proporcionarse composiciones o soluciones peptídicas que comprendan, consistan esencialmente en o consistan en un péptido de auto-ensamblaje.
El número o porcentaje de aminoácidos polares no iónicos específicos puede basarse en la capacidad de los péptidos de auto-ensamblarse. Las composiciones y soluciones peptídicas pueden comprender o consistir esencialmente en o consistir en péptidos de auto-ensamblaje que consisten esencialmente en aminoácidos polares no iónicos.
Los aminoácidos polares no iónicos del péptido de auto-ensamblaje se pueden seleccionar del grupo que consiste en serina, treonina, tirosina, cisteína, glutamina, asparagina, metionina, triptófano, hidroxilo-prolina, y combinaciones de los mismos. Los aminoácidos polares no iónicos del péptido de auto-ensamblaje pueden seleccionarse del grupo que consiste en serina y treonina.
El péptido de auto-ensamblaje consiste esencialmente en o consiste en una serie de aminoácidos o tiene una longitud del péptido, que proporciona el auto-ensamblaje del péptido. El péptido de auto-ensamblaje puede ser más largo que la longitud que puede proporcionar un auto-ensamblaje del péptido, aunque en determinados casos puede no ser deseable debido al costo o la agregación de los péptidos durante o después del auto-ensamblaje.
El péptido de auto-ensamblaje consiste esencialmente en entre aproximadamente 7 aminoácidos y aproximadamente 200 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en entre aproximadamente 7 aminoácidos y aproximadamente 200 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en aproximadamente 7 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en aproximadamente 8 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en aproximadamente 10 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en aproximadamente 12 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en aproximadamente 14 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en aproximadamente 16 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en aproximadamente 18 aminoácidos. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en aproximadamente 20 aminoácidos.
El péptido de auto-ensamblaje puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en aminoácidos polares no iónicos alternantes. El péptido de auto-ensamblaje, o la porción de aminoácidos polares no iónicos alternantes del péptido, puede ser de una longitud apropiada o predeterminada, tal como se describió arriba.
Por alternante, se quiere dar a entender que incluye una serie de tres o más aminoácidos que se alternan entre un primer aminoácido polar no iónico y un segundo aminoácido polar no iónico no iónico. En algunas realizaciones, alternante quiere dar a entender que incluye una serie de tres o más aminoácidos que alternan entre un primer aminoácido polar no iónico, un segundo aminoácido polar no iónico y un tercer aminoácido polar no iónico. En algunas divulgaciones, alternante quiere dar a entender que incluye una serie de cuatro o más aminoácidos que alternan entre un primer aminoácido polar no iónico, un segundo aminoácido polar no iónico, un tercer aminoácido polar no iónico y un cuarto aminoácido polar no iónico. No necesita incluir todos y cada uno de los aminoácidos en la secuencia de péptidos alternantes entre un primer aminoácido polar no iónico y un segundo aminoácido polar no iónico o alternantes entre un primer aminoácido polar no iónico, un segundo aminoácido polar no iónico y un tercer aminoácido polar no iónico, o alternantes entre un primer aminoácido polar no iónico, un segundo aminoácido polar no iónico, un tercer aminoácido polar no iónico ácido y un cuarto aminoácido polar no iónico.
Se puede proporcionar un péptido de auto-ensamblaje que comprende, consiste esencialmente en o consiste en aminoácidos polares no iónicos consecutivos. El péptido de auto-ensamblaje, o la porción consecutiva del aminoácido polar no iónico del péptido, puede tener una longitud apropiada o predeterminada tal como se describe arriba.
Por consecutivo, se quiere dar a entender que incluye una serie de tres o más aminoácidos que siguen de forma continua, en sucesión ininterrumpida. Pueden proporcionarse los péptidos de auto-ensamblaje que comprendan aminoácidos polares no iónicos en una disposición consecutiva. Por ejemplo, un péptido de auto-ensamblaje puede comprender aminoácidos polares no iónicos consecutivos. Los aminoácidos polares no iónicos que son consecutivos pueden ser el mismo aminoácido polar no iónico. En algunos casos, los aminoácidos polares no iónicos que son consecutivos pueden ser diferentes entre sí, pero pueden mantener un patrón repetitivo.
En algunas realizaciones, el péptido de auto-ensamblaje puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en aminoácidos polares no iónicos alternantes. Los aminoácidos polares no iónicos alternantes pueden ser aminoácidos alternos de serina y treonina. En algunas realizaciones, el péptido de auto-ensamblaje puede comprender aminoácidos alternantes de serina y treonina. En otras realizaciones, los péptidos de auto-ensamblaje pueden consistir esencialmente en residuos de aminoácidos alternantes de serina y treonina. En determinadas realizaciones, se proporciona un péptido de auto-ensamblaje que consiste esencialmente en 14 aminoácidos polares no iónicos, que alternan entre serina y treonina, en determinados casos, a los que se alude como ST14.
Se proporciona un péptido de auto-ensamblaje que consiste esencialmente en aminoácidos polares no iónicos consecutivos. Se proporciona un péptido de auto-ensamblaje que consiste esencialmente en aminoácidos treonina. La composición puede consistir esencialmente en al menos 7 aminoácidos treonina. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en 14 aminoácidos treonina. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en al menos 14 aminoácidos treonina. El péptido de auto-ensamblaje puede consistir esencialmente en 14 aminoácidos treonina polares no iónicos, a los que se alude como T14.
ST14 y T14 están compuestos de aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas, específicamente serina (Ser o S) y treonina (Thr o T). La cadena lateral de serina es un alcohol primario, químicamente equivalente a un metanol sustituido. También, la cadena lateral de treonina contiene un alcohol secundario y un grupo metilo. Considerando los grupos laterales, ST14 y T14 son similares al poli(alcohol vinílico) (PVC), en que el grupo lateral es un alcohol primario tal como serina. El PVC se ha utilizado en aplicaciones biomédicas por su biocompatibilidad.
ST14 se compone de serina y treonina, que son alternativamente secuenciadas para tener catorce aminoácidos en la estructura, tal como se muestra a continuación y en la FIG. 1.
Figure imgf000005_0001
Figura 1. Estructura química de ST14. ST14 tiene catorce serinas y treoninas alternantes en su estructura.
T14 se compone de solamente treonina, en que catorce treoninas se secuencian consecutivamente en la estructura, tal como se muestra a continuación y en la Fig. 2.
Figure imgf000005_0002
Figura 2. Estructura química de T14. T14 tiene catorce treoninas consecutivas en su estructura.
Las composiciones, soluciones peptídicas y péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación pueden ser capaces de formar nanofibras auto-ensambladas.
Se pueden proporcionar soluciones peptídicas que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en las composiciones o péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación. Por ejemplo, se pueden proporcionar soluciones peptídicas que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en péptidos de auto-ensamblaje que consisten esencialmente en, o consisten en aminoácidos polares no iónicos. Pueden proporcionarse soluciones peptídicas que pueden comprender un cierto número de aminoácidos polares no iónicos para proporcionar el autoensamblaje de los péptidos. El número de aminoácidos polares no iónicos puede basarse en su capacidad de autoensamblarse. Las soluciones peptídicas pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en cualquiera de los péptidos de auto-ensamblaje descritos en esta memoria.
En algunas realizaciones, se puede proporcionar una solución peptídica que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una composición o un péptido de auto-ensamblaje que comprende, consiste esencialmente en o consiste en residuos de aminoácidos alternantes de serina (S) y treonina (T). Se puede proporcionar una solución peptídica que comprenda, consista esencialmente en o consista en una composición o péptido de auto-ensamblaje que consista esencialmente en residuos de aminoácidos alternantes de serina (S) y treonina (T) o una composición que consista esencialmente en 14 o más aminoácidos treonina.
La concentración del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica puede estar entre aproximadamente 0,1 por ciento en peso por volumen (p/v) a aproximadamente 10 por ciento en peso por volumen (p/v). En determinadas realizaciones, la concentración de péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica está entre aproximadamente 0,5 por ciento en peso por volumen (p/v) y aproximadamente 5 por ciento en peso por volumen (p/v).
El pH de la solución peptídica (de péptido en agua desionizada) puede estar entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 3. En determinadas realizaciones, el pH de la solución peptídica puede estar entre aproximadamente 1,8 y aproximadamente 2,7. En determinadas realizaciones, el pH de la solución peptídica puede estar entre aproximadamente 1,9 y 2,5. El pH de la solución peptídica puede variar dependiendo de diversas propiedades del péptido, incluyendo el tipo de aminoácidos, la longitud del péptido y la concentración de péptido en la solución.
En determinadas realizaciones, la solución peptídica puede tener un pH de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 8. El pH de la solución peptídica se puede ajustar para proporcionar una solución peptídica que tiene un pH de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 8. En determinadas realizaciones, el pH de la solución peptídica puede ajustarse para que esté entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8. La solución peptídica puede cambiarse o ajustarse basándose en su uso deseado. Por ejemplo, puede ser deseable un pH más neutro (un pH de entre aproximadamente 5 y 8) para aplicaciones particulares, por ejemplo, experimentos de laboratorio. El mismo o diferente intervalo de valores de pH puede ser deseable para otras aplicaciones. La solución peptídica puede ser sustancialmente no biológicamente activa.
La solución peptídica puede tener un módulo de almacenamiento que se incrementa en la exposición de la solución a condiciones de mayor pH. Por ejemplo, al exponer la solución peptídica a un pH de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8, o a un pH neutro, el módulo de almacenamiento puede aumentar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 veces. La exposición puede ocurrir durante un tiempo predeterminado. Por ejemplo, la exposición puede ocurrir durante un tiempo de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 60 minutos, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos, o de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 15 minutos. En algunas realizaciones, la exposición puede ser durante un período de tiempo indefinido. En algunas realizaciones, el módulo de almacenamiento de la solución peptídica puede aumentar aproximadamente 7 veces después de la exposición a un pH de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8, o a un pH neutro. En determinadas realizaciones, la concentración de péptido en la solución peptídica está entre aproximadamente 0,1 por ciento en peso por volumen (p/v) y aproximadamente 10 por ciento en peso por volumen (p/v). En determinadas realizaciones, la concentración de péptido en la solución peptídica está entre aproximadamente 0,5 por ciento en peso por volumen (p/v) y aproximadamente 5 por ciento en peso por volumen (p/v). La concentración de la solución de péptido puede ser de aproximadamente 1 por ciento (p/v) de péptido.
En determinadas realizaciones, las soluciones peptídicas de la presente divulgación pueden comprender células. Las células pueden ser o se pueden derivar de seres humanos u otros mamíferos. En determinadas realizaciones, las células pueden ser células madre mesenquimales. En algunas realizaciones, las células pueden ser células madre mesenquimales de ratón. En algunas realizaciones, las células pueden ser células madre mesenquimales humanas. La concentración de células en la solución puede ser de aproximadamente 5 millones de células por mililitro. En algunas realizaciones, la concentración de células puede ser inferior a 5 millones de células por mililitro.
En determinadas otras realizaciones, el péptido puede consistir esencialmente en, o consistir en al menos aproximadamente 14 amino ácidos. El péptido puede ser
STSTSTSTSTSTST (ST14).
El armazón de hidrogel puede estar caracterizado por un módulo de almacenamiento de más de aproximadamente 10 Pa. En determinadas realizaciones, el armazón de hidrogel puede estar caracterizado por un módulo de almacenamiento de más de aproximadamente 100 Pa. Esto puede determinarse, al menos en parte, por la concentración de la solución de péptido inicial. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, sin desear estar ligado por la teoría, cuanto mayor sea la concentración de la solución peptídica inicial, mayor será el módulo de almacenamiento del armazón de hidrogel.
La concentración eficaz para formar un armazón de hidrogel puede comprender una concentración en un intervalo de entre aproximadamente 0,5 por ciento en peso por volumen (p/v) y aproximadamente 5 por ciento en peso por volumen (p/v).
El armazón de hidrogel puede tener nanofibras con un diámetro de entre aproximadamente 1 nanómetro y aproximadamente 20 nanómetros. En determinadas realizaciones, el armazón de hidrogel puede comprender nanofibras que tienen un diámetro de menos de aproximadamente 5 nanómetros.
En determinadas realizaciones, los péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación, que consiste esencialmente en, o consiste en no iónico, aminoácidos polares se caracterizan por tener estabilidad (poca o ninguna degradación), o poco o ningún cambio en el peso molecular después de ser sometido al autoclave. El proceso en autoclave se puede realizar en el péptido de auto-ensamblaje o en la solución peptídica de auto-ensamblaje y puede proporcionar una esterilización exitosa del péptido de auto-ensamblaje o la solución peptídica de auto-ensamblaje con una degradación mínima o nula del péptido de auto-ensamblaje. La esterilización se refiere a un proceso que elimina o mata al menos una parte de los microorganismos presentes y puede incluir la eliminación o reducción de al menos una parte de todas las formas de vida, incluyendo los agentes transmisibles, tales como microorganismos, hongos, bacterias, virus y esporas, presentes en un fluido, compuesto o material. La esterilización puede incluir una eliminación o reducción de microorganismos que serían adecuados para su uso previsto. La esterilización puede incluir al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% de eliminación o reducción de todas las formas de vida, incluyendo agentes transmisibles, tales como microorganismos, hongos, bacterias, virus y esporas, presentes en un fluido, compuesto o material. La esterilización puede incluir una eliminación o reducción del 100% de todas las formas de vida, incluyendo los agentes transmisibles, tales como los microorganismos, hongos, bacterias, virus y esporas presentes. El proceso en autoclave se puede realizar utilizando cualquier procedimiento en autoclave convencional, por ejemplo a 121°C en vapor saturado durante un período de tiempo predeterminado. El tiempo en autoclave puede oscilar entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 30 minutos. En determinadas realizaciones, el tiempo predeterminado puede ser de al menos aproximadamente 3 minutos. En determinadas realizaciones, el tiempo predeterminado puede ser de al menos aproximadamente 15 minutos. En determinadas otras realizaciones, el tiempo predeterminado puede ser de al menos aproximadamente 25 minutos. El proceso en autoclave satisfactorio de estos péptidos proporciona un procedimiento coherente para esterilizar los péptidos de autoensamblaje y las soluciones de péptidos de cualquier concentración, y evita los problemas potenciales que pueden ocurrir con la filtración de soluciones de péptidos de concentraciones más altas. Péptidos de auto-ensamblaje particulares que tienen estabilidad durante el proceso de esterilización en autoclave incluyen los de la presente divulgación, incluyendo ST14 y T14.
Se proporcionan métodos para la esterilización de péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación. El método puede comprender proporcionar un péptido de auto-ensamblaje, o una solución de péptido de auto-ensamblaje, que comprende un péptido de auto-ensamblaje de la presente divulgación. La solución peptídica puede comprender o consistir esencialmente en un péptido de auto-ensamblaje que consiste esencialmente en, o consiste en aminoácidos polares no iónicos. La solución peptídica puede comprender o consistir esencialmente en péptidos de auto-ensamblaje que comprenden al menos uno de un péptido de auto-ensamblaje que consiste esencialmente en treonina, y un péptido que consiste esencialmente en serina y treonina alternantes. El método comprende tratar la solución peptídica a una temperatura predeterminada y una presión predeterminada durante un período de tiempo predeterminado para esterilizar la solución peptídica, la temperatura predeterminada y la presión predeterminada seleccionadas para proporcionar condiciones de vapor saturado.
El método puede comprender, además, medir la masa molar del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica antes de tratar la solución peptídica. El método puede comprender, además, medir la masa molar del péptido de autoensamblaje en la solución peptídica después de tratar la solución peptídica. El método puede comprender, además, comparar la masa molar del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica antes de tratar la solución peptídica con la masa molar del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica después de tratar la solución peptídica. El tratamiento de la solución peptídica puede comprender tratar la solución peptídica en un autoclave.
Tal como se comentó, la temperatura y la presión se pueden seleccionar para proporcionar condiciones de vapor saturado. Por ejemplo, la temperatura puede ser de aproximadamente 121°C y la presión puede ser de aproximadamente 103 kPa (aproximadamente 15 psi). La temperatura puede ser de aproximadamente 132°C y la presión puede ser de aproximadamente 207 kPa (aproximadamente 30 psi).
El período de tiempo predeterminado puede ser de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 30 minutos. En determinadas realizaciones, el tiempo predeterminado puede ser de al menos aproximadamente 3 minutos. En determinadas realizaciones, el tiempo predeterminado puede ser de al menos aproximadamente 15 minutos. En determinadas otras realizaciones, el tiempo predeterminado puede ser de al menos aproximadamente 25 minutos.
Condiciones ilustrativas pueden incluir las de la Tabla 1.
Tabla 1.
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En este sentido, se pueden proporcionar soluciones peptídicas o péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación que han sido esterilizados por tratamiento en autoclave.
La esterilización por irradiación gamma también se puede realizar sobre el péptido o la solución peptídica. Pueden proporcionarse péptidos o soluciones peptídicas de esta divulgación que hayan sido esterilizados por irradiación gamma.
La composición puede ser un armazón macroscópico que comprende péptidos de auto-ensamblaje que consisten esencialmente en aminoácidos polares no iónicos. El armazón macroscópico puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una pluralidad de péptidos de auto-ensamblaje, cada uno de los cuales comprende, consiste esencialmente en o consiste en entre aproximadamente 7 y aproximadamente 200 aminoácidos polares no iónicos. Los péptidos pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en entre aproximadamente 8 y aproximadamente 20 aminoácidos. Los péptidos pueden consistir esencialmente en residuos de aminoácidos polares no iónicos. Los aminoácidos polares no iónicos del péptido de auto-ensamblaje pueden seleccionarse del grupo que consiste en serina, treonina, tirosina, cisteína, glutamina, asparagina, metionina, triptófano e hidroxil-prolina y combinaciones de los mismos. El armazón macroscópico puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en cualquiera de los péptidos de auto-ensamblaje comentados en esta divulgación.
En algunas realizaciones, puede utilizarse un agente biológicamente activo con los materiales y métodos de la presente divulgación, y puede ser parte de las composiciones y soluciones peptídicas descritas en esta memoria. Un agente biológicamente activo puede comprender un compuesto, incluyendo un péptido, secuencia de ADN, compuesto químico o compuesto inorgánico u orgánico que puede impartir alguna actividad, regulación, modulación o ajuste de una condición u otra actividad en un sujeto o en un entorno de laboratorio. El agente biológicamente activo puede interactuar con otro componente para proporcionar dicha actividad. Al agente biológicamente activo se le puede aludir como un fármaco de acuerdo con algunas realizaciones en esta memoria. En determinadas realizaciones, uno o más agentes biológicamente activos pueden liberarse gradualmente al exterior del sistema peptídico. Por ejemplo, el uno o más agentes biológicamente activos pueden liberarse gradualmente del hidrogel. Tanto las pruebas in vitro como in vivo han demostrado esta liberación gradual de un agente biológicamente activo. El agente biológicamente activo puede añadirse a la solución peptídica antes de administrarlo a un sujeto, o puede administrarse al sujeto por separado de la solución.
Esta divulgación se refiere a soluciones acuosas, composiciones, hidrogeles, armazones y membranas que comprenden péptidos de auto-ensamblaje, a los que veces se alude como oligopéptidos de auto-ensamblaje. Los péptidos de auto-ensamblaje pueden exhibir una estructura de lámina beta en solución acuosa en presencia de pH neutro, pH fisiológico y/o un catión, tal como un catión monovalente.
Los péptidos pueden ser generalmente estables en soluciones acuosas y auto-ensamblarse en grandes estructuras macroscópicas, armazones, o matrices cuando se expone a pH neutro o fisiológico. Una vez que se forma el hidrogel, es posible que no se descomponga, o se puede descomponer o biodegradar después de un período de tiempo. La velocidad de descomposición puede basarse, al menos en parte, en al menos una de las secuencias de aminoácidos y las condiciones de su entorno.
Por "macroscópico" se quiere dar a entender que tienen dimensiones lo suficientemente grandes como para ser visible bajo un aumento de 10 veces o menos. En realizaciones preferidas, una estructura macroscópica es visible a simple vista. Una estructura macroscópica puede ser transparente y puede ser bidimensional o tridimensional. Típicamente, cada una de las dimensiones tiene un tamaño de al menos 10 pm. En determinadas realizaciones, al menos dos dimensiones tienen un tamaño de al menos 100 pm, o al menos 1000 pm. Con frecuencia, al menos dos dimensiones tienen un tamaño de al menos 1-10 mm, un tamaño de 10-100 mm o más.
En determinadas realizaciones, el tamaño de los filamentos puede ser de aproximadamente 10 nanómetros (nm) a aproximadamente 20 nm. La distancia entre filamentos puede ser de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 80 nm. En algunas realizaciones, el tamaño de los filamentos, por ejemplo, el diámetro de los filamentos, puede ser de aproximadamente 5 nm. En determinadas realizaciones, el tamaño de los filamentos, por ejemplo, el diámetro de los filamentos, puede ser inferior a aproximadamente 5 nm.
Los péptidos también pueden ser complementarios y estructuralmente compatibles. Complementario se refiere a la capacidad de los péptidos para interactuar a través de pares ionizados y/o enlaces hidrógeno que se forman entre sus cadenas laterales hidrófilas, y estructuralmente compatible se refiere a la capacidad de los péptidos complementarios para mantener una distancia constante entre sus cadenas principales peptídicas. Péptidos que tienen estas propiedades participan en interacciones intermoleculares que dan como resultado la formación y estabilización de láminas beta a nivel de estructura secundaria y filamentos entretejidos a nivel de estructura terciaria.
Ambas mezclas homogéneas y heterogéneas de péptidos caracterizados por las propiedades antes mencionadas pueden formar membranas estables macroscópicas, filamentos e hidrogeles. Los péptidos que son autocomplementarios y auto-compatibles pueden formar membranas, filamentos e hidrogeles en una mezcla homogénea. Los péptidos heterogéneos, incluidos los que no pueden formar membranas, filamentos e hidrogeles en soluciones homogéneas, que son complementarios y/o estructuralmente compatibles entre sí, también pueden auto-ensamblarse en membranas macroscópicas, filamentos e hidrogeles.
Las membranas, los filamentos, e hidrogeles pueden ser no citotóxicos. Los hidrogeles de la presente divulgación se pueden digerir y metabolizar en un sujeto. Los hidrogeles pueden biodegradarse en 30 días o menos. Los hidrogeles tienen una composición simple, son permeables y su producción en grandes cantidades es relativamente económica. Las membranas y los filamentos, hidrogeles o armazones también se pueden producir y almacenar en condiciones estériles. Las longitudes óptimas para la formación de membranas pueden variar con al menos una de la composición de aminoácidos, las condiciones de la solución y las condiciones en el sitio de formación.
El auto-ensamblaje de los péptidos puede ser atribuible a enlaces hidrógeno y unión hidrofóbica entre las moléculas de péptidos por parte de los aminoácidos que componen los péptidos.
Los péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación pueden tener un diámetro de nanofibras en un intervalo de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 20 nm y el tamaño medio de poros está en un intervalo de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 200 nm. En algunas realizaciones, los péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación pueden tener un diámetro de nanofibras de aproximadamente 5 nm o menos de aproximadamente 5 nm. En determinadas realizaciones, el diámetro de la nanofibra, el tamaño de los poros y la densidad de la nanofibra pueden controlarse por al menos una de la concentración de la solución peptídica utilizada y la cantidad de solución peptídica utilizada, tal como el volumen de la solución peptídica.
Los péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación, tales como ST14 y T14, pueden ser secuencias peptídicas que carecen de un motivo o una secuencia fisiológicamente distinto o biológicamente activo y, por lo tanto, puede no afectar a la función celular intrínseca. Motivos fisiológicamente activos pueden controlar numerosos fenómenos intracelulares, tales como la transcripción, y la presencia de motivos fisiológicamente activos puede conducir a la fosforilación de proteínas intracitoplasmáticas o de la superficie celular por enzimas que reconocen los motivos. Cuando está presente un motivo fisiológicamente activo, se puede activar o suprimir la transcripción de proteínas con diversas funciones. Los péptidos de auto-ensamblaje de la presente divulgación pueden carecer de motivos fisiológicamente activos de este tipo y, por lo tanto, no conllevan este riesgo. Puede añadirse un azúcar a la solución peptídica de auto-ensamblaje para mejorar la presión osmótica de la solución de hipotonicidad a isotonicidad, permitiendo de ese modo aumentar la seguridad biológica. En determinados ejemplos, el azúcar puede ser sacarosa o glucosa.
De acuerdo con una o más realizaciones, una tonicidad de la solución peptídica puede ser hipotónica, isotónica o hipertónica. En algunas realizaciones específicas no limitantes, la tonicidad de la solución peptídica puede ser isotónica. La tonicidad de la solución peptídica se puede ajustar en diversos enfoques. En algunas realizaciones, la tonicidad de la solución peptídica puede impactar o ajustar la tonicidad asociada con un sitio de administración de la solución peptídica, tal como, pero no limitada a un sitio de administración asociado con un sujeto tal como un cuerpo humano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la tonicidad se puede ajustar con un agente de tonicidad. El agente de tonicidad puede seleccionarse del grupo que consiste en, pero no se limita a: dextrosa, glicerol, manitol, cloruro de potasio y cloruro de sodio. En otras realizaciones, la tonicidad de la solución peptídica se puede ajustar con al menos una sal. La al menos una sal se puede seleccionar del grupo que consiste en, pero no se limita a: cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio y sulfato de calcio. La al menos una sal puede incluir uno o más cationes formadores de sal y uno o más aniones formadores de sal. El uno o más cationes formadores de sal se pueden seleccionar del grupo que consiste en, pero no se limita a: amonio, calcio, hierro, magnesio, potasio, piridinio, amonio cuaternario y sodio. El uno o más aniones formadores de sal se pueden seleccionar del grupo que consiste en, pero no se limita a: acetato, carbonato, cloruro, citrato, cianuro, fluoruro, nitrato, nitrito y fosfato.
Las longitudes óptimas para la formación de la membrana pueden variar con la composición de aminoácidos. Un factor de estabilización contemplado por los péptidos de la presente divulgación es que los péptidos complementarios mantienen una distancia constante entre las cadenas principales del péptido.
Los péptidos se pueden sintetizar químicamente o se pueden purificar a partir de fuentes naturales y recombinantes. El uso de péptidos sintetizados químicamente puede permitir que las soluciones peptídicas sean deficientes en componentes no identificados, tales como componentes no identificados derivados de la matriz extracelular de otro animal. Por lo tanto, esta propiedad puede eliminar las preocupaciones de infección, incluido el riesgo de infección viral en comparación con los biomateriales convencionales derivados de tejidos. Esto puede eliminar las preocupaciones de infección, incluidas infecciones tales como la encefalopatía espongiforme bovina (BSE), lo que hace que el péptido sea altamente seguro para uso médico.
La concentración inicial del péptido puede ser un factor en el tamaño y espesor de la membrana, hidrogel o armazón formado. En general, cuanto mayor sea la concentración de péptido, mayor será el grado de formación de la membrana o del hidrogel. Los hidrogeles, o armazones, formados a concentraciones de péptido iniciales más altas (aproximadamente 10 mg/ml) (aproximadamente 1,0 por ciento p/v) pueden ser más gruesos y, por lo tanto, probablemente más fuertes.
La formación de membranas, hidrogeles o armazones puede producirse en base a la exposición de la solución peptídica a condiciones seleccionadas. La formación de membranas, hidrogeles o armazones puede ocurrir en un intervalo del orden de segundos a del orden de minutos. Por ejemplo, la formación puede ser instantánea. En algunas realizaciones, la formación puede ocurrir en menos de 1 segundo. La formación puede ocurrir en menos de 5 segundos, menos de 30 segundos, menos de 1 minuto, menos de 5 minutos, menos de 15 minutos o menos de 30 minutos. La formación del hidrogel puede ocurrir en aproximadamente uno a dos minutos. En otros ejemplos, la formación del hidrogel puede ocurrir en aproximadamente tres a cuatro minutos. En determinadas realizaciones, la formación de las membranas o los hidrogeles puede ser reversible y, en otras realizaciones, la formación puede ser irreversible. En determinadas realizaciones, el tiempo que lleva formar el hidrogel puede basarse, al menos en parte, en una o más de la concentración de la solución peptídica, el volumen de la solución peptídica aplicada y las condiciones en el área de aplicación (por ejemplo, la concentración de cationes metálicos monovalentes en la zona de aplicación, el pH de la zona y la presencia de uno o más fluidos en o cerca de la zona). El proceso puede no verse afectado por un pH menor o igual a 12 y por la temperatura. Las membranas o los hidrogeles pueden formarse a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 1 a 99 grados Celsius.
En determinadas realizaciones, el péptido de auto-ensamblaje se puede preparar con uno o más componentes que pueden proporcionar para mejorar la eficacia del péptido de auto-ensamblaje o pueden proporcionar otra acción, tratamiento, terapia o interactúan de otra manera con uno o más componentes del sujeto. Por ejemplo, pueden incluirse péptidos adicionales que comprenden una o más secuencias o motivos de aminoácidos biológica o fisiológicamente activos como uno de los componentes junto con el péptido de auto-ensamblaje. Otros componentes pueden incluir compuestos biológicamente activos tales como un fármaco u otro tratamiento que puede proporcionar algún beneficio a un sujeto. Por ejemplo, se puede administrar un antibiótico o un fármaco de pequeño peso molecular para tratar o prevenir la hemólisis, la inflamación o la infección con el péptido de autoensamblaje, o se puede administrar por separado.
Los fármacos de pequeño peso molecular pueden seleccionarse del grupo que consiste en glucosa, sacarosa, sacarosa purificada, lactosa, maltosa, trehalosa, destrano, yodo, cloruro de lisozima, dimetilisopropilazuleno, tretinoína tocoferil, yodo povidona, alprostadil alfadex, alcohol de anís, salicilato de isoamilo, alcohol a,a-dimetilfeniletílico, bacdanol, helional, sulfazina de plata, bucladesina sódica, alprostadil alfadex, sulfato de gentamicina, hisdrocloruro de tetraciclina, fusidato de sodio, hidrato de calcio de mupirocina y benzoato de isoamilo. Pueden contemplarse otros fármacos de pequeño peso molecular. Pueden incluirse fármacos basados en proteínas como un componente a administrar, y pueden incluir eritropoyetina, activador de plasminógeno de tipo tisular, hemoglobina sintética e insulina.
Puede incluirse un componente A para proteger la solución peptídica frente a la formación rápida o inmediata en un hidrogel. Esto puede incluir un sistema de suministro encapsulado que puede degradarse con el tiempo para permitir una liberación controlada en el tiempo de la solución peptídica en el área diana para formar el hidrogel durante un período de tiempo predeterminado deseado. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico.
Cualquiera de los componentes descritos en esta memoria se pueden incluir en la solución peptídica o se pueden administrar por separado a partir de la solución peptídica. Además, cualquiera de los métodos y métodos de facilitación proporcionados en esta memoria pueden ser realizados por una o más partes.
En algunas realizaciones de la divulgación, los péptidos de auto-ensamblaje se pueden utilizar como un recubrimiento sobre un dispositivo o un instrumento. Los péptidos de auto-ensamblaje también pueden incorporarse o fijarse a un soporte, tal como una gasa o un vendaje, o un revestimiento, que puede proporcionar un efecto terapéutico a un sujeto, o que puede aplicarse dentro de un área diana. Los péptidos de auto-ensamblaje también pueden empaparse en una esponja para su uso.
La función y las ventajas de estas y otras realizaciones de las composiciones, péptidos, soluciones peptídicas y métodos descritos en esta memoria se entenderán más completamente a partir de los ejemplos siguientes. El siguiente ejemplo pretende ilustrar los beneficios de las composiciones descritas, pero no ejemplifica el alcance completo de las mismas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Estudios Morfológicos
Se investigaron imágenes de péptidos ST14 y T14 por Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) para visualizar sus nanoestructuras. Las muestras se prepararon colocando una parte alícuota de aproximadamente 50 microlitros (pl) de la solución peptídica (100 micromolar (pM)) sobre la superficie (9 milímetros (mm) de diámetro) de una superficie de mica. Cada una de las muestras se dejó sobre la mica durante aproximadamente 30 segundos (s) y luego se enjuagó con partes alícuotas de 100 pl de agua Milli-Q (ultrapura) para separar los péptidos no fijados. La muestra sobre la superficie de mica se secó luego al aire para la observación por AFM. La AFM se realizó con el sistema de AFM Asylum-1 MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) utilizando un modo de pulsación. Las imágenes utilizaron una punta de Si Olympus (AC240FS). La frecuencia de resonancia libre de soporte fue de 70 kHz. Las imágenes en altura se registraron con una resolución de 256 x 256 píxeles.
Tal como se muestra en las FIGS. 3 y 4, los estudios morfológicos de AFM demostraron que ST14 forma nanofibras auto-ensambladas. Se han detectado agregados en T14, tal como se muestra en las FIGS. 5 y 6.
Ejemplo 2: Estudios de Estabilidad y Esterilización
La esterilización es una etapa muy importante en el procedimiento de fabricación de todos los biomateriales, incluyendo las soluciones peptídicas de auto-ensamblaje. El tratamiento en autoclave de los péptidos parece ser el mejor método de esterilización para soluciones peptídicas muy viscosas para las que la esterilización por filtración pudiera no ser posible. Para determinar si el tratamiento en autoclave degrada las moléculas de péptidos, se realizó un análisis de espectrometría de masas (espec. de masas) de los péptidos antes y después del tratamiento en autoclave a 121°C durante 25 min a vapor saturado de alta presión. Los resultados se muestran en las FIGS. 7-8 y las FIGS. 9-10 para ST14 y T14, respectivamente, en los que el extremo N y el extremo C no están protegidos.
La masa molar medida de ST14, antes del tratamiento en autoclave, fue de 1335, que coincide con la masa molar calculada (FIGS. 7-8). ST14 no se degradó durante el tratamiento en autoclave; por lo tanto, el autoclave es un método apropiado para la esterilización de ST14.
La masa molar medida de T14 es 1433, que coincide con la masa molar calculada. T14 no se degradó durante el tratamiento en autoclave, por lo tanto, el tratamiento en autoclave es un método apropiado para la esterilización de T14, tal como se muestra en las FIGS. 9-10.
Ejemplo 3: Aspecto visual de la solución peptídica
ST14 y T14 se sometieron a ensayo para la disolución en agua desionizada y la apariencia en solución a diferentes concentraciones. Las soluciones de ST14 y T14 eran translúcidas al 1 por ciento, en peso por volumen (p/v) al 5 por ciento p/v. ST14 formó soluciones espesas al 1 por ciento en peso por volumen (p/v) a 5 por ciento p/v, mientras que T14 formó una solución espesa al 5 por ciento p/v. Esto muestra una diferencia entre los dos péptidos que puede indicar cómo pueden comportarse en determinadas condiciones.
Ejemplo 4: pH de Soluciones Peptídicas
El pH de los péptidos en agua desionizada para proporcionar una solución peptídica se midieron a diversas concentraciones. El pH de las soluciones peptídicas se midió a diversas concentraciones. Se testaron ST14 y T14. Los valores de pH registrados oscilaron entre aproximadamente 1,9 y aproximadamente 2,5. Los resultados se enumeran en la Tabla 2. Estos resultados demuestran que el pH varía dependiendo de la concentración de péptido y del tipo de péptido.
Tabla 2. Valores de pH de ST14 y T14 a diversas concentraciones.
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Ejemplo 5: Formación de Gel Peptídico
Se realizó ensayo con rojo Congo para determinar la formación del gel de soluciones peptídicas en una solución tampón PBS (pH 7,4). Se sembraron 100 gl de cada uno de los geles a concentraciones variables en un portaobjetos de vidrio. Después de 30 segundos, se añadieron 500 gl de una solución de rojo Congo al 1% en tampón PBS (pH 7,4) alrededor y por encima de cada una de las partes alícuotas de gel y luego se limpió el exceso de solución de rojo Congo antes del examen.
ST14 y T14 se sembraron a concentraciones variables de 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% y 5,0%. La visualización de la formación de gel determinó el éxito o el fracaso de la gelificación en cada una de las concentraciones. ST14 no formó un gel al 0,5%. T14 no formó un gel por debajo del 1 %. Los datos se muestran en la Figura 11.
Ejemplo 6: Efecto de la Concentración sobre las Propiedades Reológicas
Las propiedades reológicas de ST14 se evaluaron a diversas concentraciones utilizando un reómetro (AR500, TA Instruments) con placas de 40 mm. Se colocó una solución peptídica (700 pl) en la placa del reómetro y Kimwipes eliminó suavemente el exceso de solución; las mediciones se realizaron después de 2 minutos de tiempo de relajación a 37°C. El módulo de almacenamiento, el módulo de pérdida y la viscosidad (r|') se midieron a 37°C con las placas colocadas en un espacio de geometría de medición de 300 pm, y las pruebas de barrido de tensión se realizaron a 0,1 Pa ~ 1000 Pa de tensión de oscilación con frecuencia angular a 10 rad/s.
Los resultados de la reología se muestran en las FIGS. 12 y 13 para ST14. No se midieron las propiedades reológicas de T14. Las propiedades reológicas de ST14 a diversas concentraciones también se muestran en la Tabla 3.
El módulo de almacenamiento, la tensión de fluencia y la viscosidad máx. de ST14 aumentaron al aumentar la concentración.
Tabla 3. Propiedades reológicas de ST14
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* A 1 Pa de tensión de oscilación
Ejemplo 7: Efecto del Contacto del Medio de Cultivo Celular sobre las Propiedades de1Hidrogel Peptídico
Los efectos de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (pH 7,4) se evaluaron sobre las propiedades reológicas de ST14 en un reómetro (AR500, TA Instruments) con placas de 40 mm. DMEM es un medio de cultivo celular que contiene 6,4 g/L de NaCl, 3,4 g/L de NaHCÜ3 (bicarbonato de sodio), cantidades menores de otras sales, diversos aminoácidos y 4,5 g/L de glucosa. El pH de DMEM es 7,2 ± 0,2 y la osmolalidad es de 335 ± 30 mOsm/Kg de H2O; ambas medidas están cerca de los fluidos fisiológicos humanos tales como la sangre. Las soluciones peptídicas (1%) se mantuvieron a 4 °C durante al menos 48 horas antes del ensayo. Para realizar el experimento, se pipeteó suavemente 1 mL de solución peptídica y se colocó en la placa del reómetro. Se añadieron suavemente 2 mL de solución de DMEM alrededor de la solución peptídica. La solución peptídica se trató con DMEM durante dos minutos, luego se retiró el medio y las placas se colocaron en un espacio de geometría de medición de aproximadamente 450 pm. Las mediciones se realizaron a 37°C después de 2 min de tiempo de relajación. Los ensayos de frecuencia se realizaron desde 1 rad/s a 100 rad/s a 1 Pa de tensión de oscilación.
Las propiedades reológicas de ST14 (1%) se compararon antes y después del tratamiento con DMEM durante 2 minutos en la FIG. 14. Los datos del módulo de almacenamiento para las soluciones peptídicas no tratados se tomaron de los datos a 1 Pa y 10 rad/s en sus ensayos de barrido de tensión, y los de los hidrogeles peptídicos tratados con DMEM se adaptaron de los datos a 1 Pa y 10 rad/s en su ensayo de barrido de frecuencia. El aumento de veces de los módulos de almacenamiento después del tratamiento con DMEM durante 2 minutos se muestra en la FIG. 15. ST14 mostró un aumento de 6,9 veces en los módulos de almacenamiento después del tratamiento con DMEM.
Esta observación sugiere que una interacción intermolecular crítica surge después del tratamiento con DMEM, que determina la rigidez final después de tratamiento con DMEM. El cambio de pH y la concentración de sal pueden afectar sus propiedades reológicas.
Ejemplo 8: Test de Viabilidad Celular
Se realizó un ensayo de viabilidad celular (citotoxicidad) para medir la capacidad de ST14 para soportar la viabilidad de una línea celular C57 BL/6 de células madre mesenquimales de ratón (mMSC)-a frecuentemente utilizada en los sistemas de cultivo de tejidos de hidrogel. Cada uno de los hidrogeles se preparó a una concentración de 2,5% y luego se diluyó a concentraciones de 1,5%, 1,25%, 1,0%, 0,75% y 0,50% con sacarosa, de modo que la concentración final de sacarosa fue del 10%. Las células se lavaron y se resuspendieron en sacarosa al 10% hasta una concentración final de 5 millones de células/ml. Las células se centrifugaron y se separó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en cada una de las concentraciones de hidrogeles en sacarosa al 10%. A continuación, se siguió el protocolo para el cultivo en placa y el posterior aislamiento, tal como se describe en las Directrices de Uso de PuraMatrix® (sitio web de BD/Coming).
Los resultados se muestran en la FIG. 16 para ST14. La viabilidad celular disminuyó significativamente cuando la concentración de péptidos fue superior al 0,75%.
En la Fig. 16, "*" se observa cuando la viabilidad celular es significativamente menor que la viabilidad celular en la siguiente concentración más baja (p < 0,05), y "#" se observa cuando la viabilidad celular es significativamente mayor que la viabilidad celular en la siguiente concentración más baja (p < 0,05).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un péptido de auto-ensamblaje que consiste en una estructura química (ST14) de:
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2. Una solución peptídica que comprende un péptido de auto-ensamblaje que consiste en una estructura química (ST14) de:
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3. La solución peptídica de la reivindicación 2, en donde se aplica uno o más de los siguientes:
a) el péptido de auto-ensamblaje es capaz de formar nanofibras auto-ensambladas; y
b) una concentración del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica está entre 0,1 por ciento en peso por volumen (p/v) y 10 por ciento en peso por volumen (p/v).
4. La solución peptídica de la reivindicación 2, en donde un pH de la solución peptídica está entre 0,5 y 8.
5. La solución peptídica de la reivindicación 2, en donde la solución peptídica comprende un agente de tonicidad y en donde la tonicidad de la solución peptídica es hipotónica, isotónica o hipertónica.
6. La solución peptídica de la reivindicación 2, que comprende, además, células humanas, en donde opcionalmente la solución peptídica tiene una concentración celular de 5 millones de células por mililitro.
7. Un método para esterilizar péptidos, que comprende:
proporcionar una solución peptídica que comprende un péptido de autoensamblaje que consiste en una estructura
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tratar la solución peptídica a una temperatura predeterminada y una presión predeterminada durante un período de tiempo predeterminado para esterilizar la solución peptídica, la temperatura predeterminada y la presión predeterminada seleccionadas para proporcionar condiciones de vapor saturado.
8. El método de la reivindicación 7, en el que se aplica uno o más de los siguientes:
a) el método comprende, además, medir la masa molar del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica antes de tratar la solución peptídica;
b) el método comprende, además, medir la masa molar del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica después de tratar la solución peptídica;
c) el método comprende, además, comparar la masa molar del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica antes de tratar la solución peptídica, con la masa molar del péptido de auto-ensamblaje en la solución peptídica después de tratar la solución de péptido; y
d) tratar la solución peptídica comprende tratar la solución peptídica en un autoclave.
9. La solución peptídica de la reivindicación 2, en donde el módulo de almacenamiento de la solución peptídica aumenta entre 5 y 10 veces después de la exposición a un pH neutro.
10. La solución peptídica de la reivindicación 9, en donde un módulo de almacenamiento de la solución peptídica aumenta 7 veces después de la exposición a un pH neutro.
11. La solución peptídica de la reivindicación 2, en donde la concentración del péptido de auto-ensamblaje en la solución de péptido está entre 0,5 por ciento en peso por volumen (p/v) y 5 por ciento en peso por volumen (p/v).
12. La solución peptídica de la reivindicación 2, en donde el pH de la solución peptídica está entre 3 y 7.
13. La solución peptídica de la reivindicación 5, en donde el agente de tonicidad se selecciona del grupo que consiste en dextrosa, glicerol, manitol, cloruro de potasio y cloruro sódico.
14. La solución peptídica de la reivindicación 5, en donde el agente de tonicidad comprende al menos una sal seleccionada del grupo que consiste en cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio y sulfato de calcio.
15. La solución peptídica de la reivindicación 5, en donde el agente de tonicidad comprende al menos una sal, y en donde la sal incluye uno o más cationes formadores de sal y uno o más aniones formadores de sales, en donde el uno o más cationes formadores de sal se selecciona del grupo que consiste en: amonio, calcio, hierro, magnesio, potasio, piridinio, amonio cuaternario y sodio, y en donde uno o más aniones formadores de sales se seleccionan del grupo que consiste en: acetato, carbonato, cloruro, citrato, cianuro, fluoruro, nitrato, nitrito y fosfato.
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