ES2476966T3

ES2476966T3 - Composición farmacéutica con glicosaminoglicanos y su uso en tratamiento de úlceras crónicas

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Publication number: ES2476966T3
Application number: ES09772593.1T
Authority: ES
Inventors: Iv�N L�Pez-Belmonte Encina; Mar�A De Los �Ngeles Canales Mayordomo; Elena Cebadera Miranda
Original assignee: Laboratorios Farmaceuticos Rovi SA
Current assignee: Laboratorios Farmaceuticos Rovi SA
Priority date: 2008-07-01
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2014-07-15
Anticipated expiration: 2029-06-30
Also published as: CA2766483A1; JP2011526608A; US9211305B2; ES2340902B1; PT2308497E; US20110201572A1; ES2340902A1; MX2010014552A; CA2766483C; US20140066402A1; AU2009265623B2; EP2308497B1; AU2009265623A1; WO2010000905A1; DK2308497T3; BRPI0913839A2; WO2010000906A1; PL2308497T3; RU2011103459A; WO2010000904A1

Abstract

La invención se refiere a una composición de glicosaminoglicanospara el tratamiento de ulcera de pie diabético, en concreto se refiere a heparínas de bajo peso molecular (HBPM) y heparínas de muy bajo peso molecular (HMBPM) en el tratamiento de ulceras crónicas, en particular de úlceras de pie diabético, y más en concretoen la fabricación de un medicamento para el tratamiento de úlceras crónicas, y en particular úlceras de pie diabético y úlceras depresión.

Description

Composicion farmaceutica con glicosaminoglicanos y su uso en tratamiento de ulceras cronicasA

Campo de la invención:

La invencion se refiere a una composicion de glicosaminoglicanos para el tratamiento de ulceras cronicas, en concreto ulceras de pie diabetico, y ulceras de presionA Mas en particular, se refiere a composiciones de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) y heparinas de muy bajo peso molecular (HMBPM) en el tratamiento de ulceras cronicas, y mas en concreto en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de ulceras cronicasA

Estado de la técnica:

La Diabetes Mellitus (DM) es una enfermedad metabolica que se caracteriza por un aumento sostenido de los niveles de glucosa plasmaticos, lo que contribuye a la aparicion de neuropatia periferica y de complicaciones macro y microvascularesA Segun los datos publicados por la Organizacion Mundial de la Salud (OMS), la incidencia de la DM esta aumentada de forma alarmante, estimandose en 2000 una prevalencia en la poblacion mundial del 2,8% y que esta cifra aumentara hasta el 4,4% en 2030A Asi, en 2000 el numero de pacientes con DM rondaba los 171 millones y se estima que este numero se incremente hasta los 366 millones en el 2030A Este aumento en la incidencia de la DM se ha asociado entre otros factores al envejecimiento general de la poblacion, ya que existe una relacion directa entre la edad y la prevalencia de la enfermedadA En este sentido, se ha estimado que la prevalencia de la DM en Espana podria estar entre el 2% y el 6%; el 10% corresponderia a DM tipo 1, estando el 50% de los pacientes con DM tipo 2 sin diagnosticarA Teniendo en cuenta que los estudios publicados de prevalencia de DM en diferentes regiones de Espana son anteriores a 2002 y la tendencia al aumento de la incidencia, actualmente en Espana se estima que existirian mas de 2,5 millones de personas diabeticasA

La afectacion neurologica, tanto del sistema periferico como del autonomo representa probablemente la complicacion mas frecuente de la DMA Puede ocurrir en ambos tipos de DM, y su prevalencia y severidad esta en relacion con los anos de evolucion de la diabetes y con el grado de control glucemicoA Se estima que esta complicacion afecta al 60% de los sujetos DM, siendo la principal causa de la aparicion de ulceras en los pies de los sujetos diabeticosA En esta linea, la American Diabetes Association en su sexagesima sesion cientifica establecio que el 15% de los pacientes con DM desarrollaban a lo largo de su vida una ulcera en el pie y que el 6% de las hospitalizaciones que se producen en sujetos diabeticos tienen como causa las ulceras del piesA De todas las ulceras que se producen en pacientes con diabetes, el 15% termina en amputacion, siendo las complicaciones asociadas a la DM la causa principal de las amputaciones no traumaticas (40-70%), estando a su vez el 85% de las amputaciones que se producen en los pacientes diabeticos relacionadas con ulceras en el pieA En Estados Unidos se efectuan de forma anual 100A000 amputaciones, lo que repercute de forma considerable en el gasto sanitario, calculandose que en 2001 las ulceras y las amputaciones tuvieron en US un coste aproximado de 1000 millones de dolares y siendo este gasto en UK de 456 millones de dolaresA Estos costes derivados de la ulcera del pie diabetico varian en gran medida dependiendo de si se ha producido amputacion o no y asi, en un estudio realizado en Suiza en 1990, se observo que en el caso de aquellas ulceras que curaron y que no presentaban componente isquemico, los costes asociados fueron de 16A500 dolaresA Por el contrario, en los casos en los que fue necesaria una amputacion menor, los costes se elevaron a 27A000 dolares, ascendiendo a 63A000 dolares en el caso de que se produjera una amputacion mayorA

La definicion de pie diabetico propuesta por el Grupo de Consenso sobre Pie Diabetico de la Sociedad Espanola de Angiologia y Cirugia Vascular es: "Alteracion clinica de base etiopatogenica neuropatica inducida por la hiperglicemia mantenida, en la que con o sin coexistencia de isquemia, y previo desencadenante traumatico, se produce la lesion y/o ulceracion del pie"A

La ulceracion del pie es una complicacion significativa de enfermedades como la diabetes con una incidencia anual ligeramente superior al 2% (Abbott CAAA, et al (2002) The North-West Diabetes Foot Care Study: incidence of, and risk factors for, new diabetic foot ulceration in a community-based patient cohortA DiabetA MedA 19(5):377-84)A Se estima que un 15% de los pacientes con diabetes desarrollaran ulceras en algun momento de su vida (Reiber GA EA (1996) The epidemiology of diabetic foot problemsA DiabetA MedA 13 Suppl 1 :S6-11) y que alrededor de un 10%- 30% de los que presenten ulceras progresaran con la amputacion del miembro (Lipsky BAAA (2004) Medical treatment of diabetic foot infectionsA ClinA lnfeci DisA 39 Suppl 2:S104-14)A Ademas, esto se complica en el caso en el que se produce una isquemia en la extremidad inferior en la que aparece la ulcera, siendo producida en la mayor parte de los casos por insuficiencia de riego sanguineo por alta incidencia de trombosisA

En relacion con la mortalidad a los 5 anos de los pacientes a los que se les practica una amputacion de miembros inferiores, es de 50-60% (Reiber GA EA (1996) The epidemiology of diabetic foot problemsA DiabetA MedA 13 Suppl 1 :S6-11)A Se han utilizado diversos metodos para el tratamiento del paciente con pie diabetico que incluyen el control metabolico estricto, profilaxis de los factores de riesgo modificables, desbridamiento, empleo de apositos, tratamiento antimicrobiano de las infecciones, eliminacion de la presion del area lesionada, uso de injertos de piel, administracion de factores de crecimiento y el empleo de metodos de revascularizacion en caso de existir indicacionA

En la mayoria de los casos el tratamiento de este tipo de ulceras cronicas se realiza por via topica, por ejemplo, el empleo de apositos en las ulceras como las del pie diabetico es comunmente utilizadoA Entre los nuevos tipos de apositos estudiados en ensayos clinicos controlados se encuentran los apositos que se basan en membrana polimerica semipermeable, Promogran (matriz de colageno), alginato, carboximetilcelulosa, hialuronan y presion subatmosferica (Eldor RA Y colA (2004) New and experimental approaches to treatment of diabetic foot ulcers: a comprehensive review of emerging treatment strategiesA DiahetA MedA 21(11):1161-73)A Tambien se han desarrollado metodos para crear sustitutos de piel que son colocados sobre la lesion ulcerosaA El Dermagraft� se produce sembrando fibroblastos de dermis humana sobre un andamio sintetico de material bioabsorbible que ha demostrado ser eficaz en las ulceras de bajo grado con una mayor proporcion de curacion en un menor tiempo (Marston WAAA, et alA (2003) Dermagraft Diabetic Foot Ulcer Study GroupA The efficacy and safety of Dermagraft� in improving the healing of chronic diabetic foot ulcers: results of a prospective randomized trialA Diabetes Care 26:1701-5)A El Apligraf� consta de una capa de dermis compuesta de fibroblastos humanos en una matriz de colageno tipo l bovino y una capa de epidermis formada de queratinocitos humanosA De manera similar, este sustituto de piel ha mostrado asociarse significativamente a una mayor y mas rapida curacion de lesiones cuando se aplica en ulceras neuropaticas de bajo grado y no infectadas (Veves AA, et al (2001) Graftskin, a human skin equivalent, is effective in the management of noninfected neuropathic diabetic foot ulcers: a prospective randomized multicenter clinical trialA Diabetes Care 24:290-5)A En un ensayo clinico fase lll, aleatorizado, de doble ciego y controlado con placebo, el Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (Platelet Derived Growth Factor, abreviado PDGF) en forma de gel mostro ser eficaz y seguro para el tratamiento de pacientes diabeticos que presentaban ulceras neuropaticas con buena perfusion sanguinea (Wieman TJA , et al (1998) Clinical efficacy of beclapermin (rh PDGF-BB) gelA Diabetes Care 21 (5):822-7)A La mayoria de los pacientes (95%) incluidos en este estudio tenian ulceras con un area < 10 cm2 segun la evaluacion por planimetriaA El gel de becaplermina 100 Ig/g, en comparacion con placebo, aumento significativamente la proporcion de cierre completo de la lesion en un 43% (50 vsA 35%, p = 0A007) y redujo el tiempo para lograr dicho efecto en un 32% (86 vsA 127 dias, p = 0A013)A Los resultados satisfactorios con el PDGF o becaplermina (Regranex�) llevaron a su aprobacion para el tratamiento de las ulceras neuropaticas en las extremidades inferiores del diabetico que se extienden hasta el tejido subcutaneo o mas profundamente y tienen un adecuado flujo sanguineo (Brem HA, Sheehan PA, Boulton AJA (2004) Protocol for treatment of diabetic foot ulcersA AmA JA SurgA 187(5A): 1 S-1 OS)A Sin embargo, unos meses mas tarde la FDA inicio una revision de seguridad tras recibir los datos de un estudio que mostro un mayor riesgo de cancer en pacientes con diabetes que se aplicaron el factor de crecimiento topico Regranex� de Johnson & Johnson directamente en sus ulceras de pierna y pie diabetico, por lo que esta alternativa terapeutica actualmente esta en revision y se ha limitado para pacientes que no tengan predisposicion a padecer algun tipo de tumorA

En cuanto a tratamientos por via parenteral local, hace unos anos se ha publicado un metodo de administracion de un agente cicatrizante como el Factor de Crecimiento Epidermico (EGF), que consiste en la infiltracion de una solucion de la biomolecula en la lesion mediante varias inyecciones (WO 03053458)A Este tratamiento ha mostrado tener efectividad en la prevencion de la amputacion del pie diabetico pero tiene el inconveniente de que resulta traumatico para el paciente ya que la aplicacion de inyecciones en la lesion es muy dolorosa y en cada tratamiento deben aplicarse varias inyecciones durante varias semanasA Tambien, en el documento EP 1499317 se divulga un metodo de tratamiento de complicaciones diabeticas tales como el pie diabetico con inhibidores del intercambiador sodio-hidrogeno de tipo 1 (NHE-1), y en la publicacion internacional WO 02077155 se describe que el factor de crecimiento de queratinocitos (KFG-2) promueve o acelera la curacion de heridasA

Finalmente, la publicacion internacional WO2007087759 se refiere a una composicion farmaceutica que contiene microesferas con factores de crecimiento de epidermis para administracion parenteral para pacientes que poseen afecciones cronicas en la piel, como son las ulceras de pie diabeticoA Muchas otras patentes se han enfocado sobre otros metodos de acelerar el rango de cicatrizacionA Sin embargo, ninguno de estos metodos ha probado ser ampliamente eficazA

En la literatura no patente, por otro lado, se han publicado algunos estudios que divulgan ciertos resultados alentadores para enfermos de pie diabetico tratados con heparinas de bajo peso molecular (HBPM), sobre la base de que las heparinas son conocidos antitromboticos y antiinflamatorios que pueden mejorar la microcirculacion vascularA En "Effect of Dalteparin of healing of chronic foot ulcers in diabetic patients with peripheral arterial occlusive disease", Diabetes Care, volA 26(9), Septiembre 2003, asi como en la publicacion del mismo grupo de MA Kalani, AA et alA titulado "Beneficial effects of dalteparin on haemostatic function and local tissue oxygenation in patients with diabetes, severe vascular disease and foot ulcers", Thrombosis ResearchA 120, 653-661, 2007 en los se describen ensayos clinicos que demuestran que una heparina de bajo peso molecular (HBPM) tal como la dalteparina mejora la evolucion de las ulceras de pie diabetico en pacientes con enfermedad arterial oclusiva perifericaA Sin embargo, llama la atencion que en estos articulos los pacientes son tratados de forma conjunta con acido acetilsalicilico, es decir, se deja entrever como la asociacion de dos principios activos con efecto anticoagulante favorecen de forma sinergica la evolucion de las ulceras de pie diabetico en pacientes con enfermedad arterial oclusiva perifericaA Tambien, en "Low molecular weight heparin seem to improve local capillary circulation and healing of chronic foot ulcers in diabetic patients", VASA, Brand 22, 1993, FET 2, se divulga la realizacion de ensayos clinicos, controlados con placebo, doble ciego, para evaluar la eficacia de dalteparina en enfermos con ulceras de pie diabeticoA Los resultados preliminares de este estudio parecen indicar que la dalteparina podria tener un efecto beneficioso sobre la prevencion de este tipo de heridas, aunque siempre en dosis de profilaxis, es decir en ningun momento se emplean

dosis de dalteparina superiores a 2500 Ul/dia, ya que se preven hemorragias durante el tratamiento a dosis superiores, sin que este aumento suponga una eficacia mayor en el caso de pacientes con ulcera de pie diabeticoA Esto se debe a la creencia general en el estado de la tecnica de que los pacientes diabeticos tienen mayor riesgo de sangrado que pacientes que no tienen la enfermedad (Adverse impact of bleeding on prognosis in patients with acute coronary sindromes, Eikelboom JW et alA CirculationA 2006 Aug 22;114(8):774-82)A

Breve descripción de la invención

Hasta la fecha, la utilizacion de glicosaminoglicanos en el tratamiento de ulceras cronicas, en concreto las ulceras de pie diabetico, y de forma particular la utilizacion de algunas heparinas de bajo peso molecular para este fin, se ha descrito a grosso modo para pacientes que tienen afecciones circulatorias severas ya que estas heparinas de bajo peso molecular poseen actividad antitrombotica y anticoagulante, expresada como efecto anti-factor X activado (Xa) y efecto anti-factor llaA Sin embargo, no se utilizan de forma general para pacientes diabeticos que padecen ulcera de pie diabetico sin enfermedad oclusiva arterial periferica, por el riesgo de sangrado que supone el tratamiento a dosis superioresA Esto es debido al efecto anti factor Xa que tienen este tipo de compuestos que se traduce en efecto antitrombotico y que guarda una relacion directa con el contenido dentro de la estructura heparinoide de un pentasacarido concreto presente en las estructuras sacaridicas que conforman las heparinas de bajo peso molecular y muy bajo peso molecular y a la relacion efecto anti-factor Xa / anti-factor llaA Esta relacion viene determinada porque a mayor cantidad de pentasacarido en la estructura total, mayor actividad anti-factor Xa, siendo el pentasacarido sintetico (fondaparinux) el inhibidor mas selectivo del factor Xa y por tanto la molecula con mayor capacidad antitrombotica de forma selectivaA

Por lo tanto, la actividad antitrombotica del fondaparinux es consecuencia de la inhibicion selectiva del factor Xa, mediada por la antitrombina lll (ATlll)A Por su union selectiva a la ATlll, el fondaparinux potencia aproximadamente 300 veces la neutralizacion innata del factor Xa por la ATlllA La neutralizacion del factor Xa interrumpe la cascada de coagulacion sanguinea e inhibe la formacion de trombina y el desarrollo de trombos (ver Figura l)A

Teniendo en cuenta el estado de la tecnica, en principio cabe pensar que para obtener un efecto curativo (no paliativo) sera necesaria mayor cantidad de pentasacarido en la estructuraA Sin embargo, como se ha indicado mas arriba, esta aproximacion no se lleva a cabo por el riesgo de sangrado que supone el tratamiento a dosis superioresA Los inventores de la presente invencion han conseguido vencer este prejuicio de estado de la tecnica ya que han conseguido demostrar que, aunque el pentasacarido este en menor proporcion o alterado quimicamente o enzimaticamente de forma selectiva, el efecto cicatrizante y regenerativo no se ve afectado, ya que lo realmente importante en la estructura del glicosaminoglicano es la proporcion de cadenas polisacaridicas que no contienen el pentasacaridoA Ademas, los investigadores de la presente invencion han podido determinar experimentalmente que el efecto beneficioso cicatrizante de la administracion de los glicosaminoglicanos con menos cantidad de pentasacarido en cualquier tipo de ulcera que se considere cronica -no solo en las ulceras de pie diabetico- y que dicha administracion es efectiva mediante tres vias principales de administracion: parenteral, oral y topicaA

Fue gracias a los trabajos realizados a principio de los anos 80 por los grupos de Lindahl y Choay (Choay J, Lormeau JC, Petitou M, Sinay P and Fareed JA Ann NY Acad Sci 1981;370:644-649; Thunberg L, Backstrom G and Lindahl UA Carbohydr Res 1982;100:393-410), cuando se llego a la hipotesis de que dentro de las cadenas de heparina existe una secuencia especifica correspondiente a un pentasacarido que es la que interacciona selectivamente con la antitrombina lllA La estructura de este pentasacarido es la siguiente (formula 1):

-

R: COCH3 o SO3

Formula 1

En la Heparina no fraccionada asi como en las diversas HBPM o HMBPM obtenidas por los metodos conocidos de despolimerizacion (enzimatica, acido nitroso, �-eliminacion, etc), existe una medida que nos permite la determinacion de la cantidad de pentasacarido dentro de la estructura general a traves de la cuantificacion del contenido de unaunidad disacaridica especifica y exclusiva del pentasacarido llamada Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3sulfo-D-Glucosamina (ANS,3S)A Esta medida nos permite obtener una buena correlacion entre el porcentaje presente

de este disacarido y el contenido de pentasacarido en la estructura heparinica y por tanto de actividad anti-FXa de la heparina en cuestion (Guerrini M et alA Seminars in Thrombosis and Hemostasis 2007 ; 33: 478-787)A

Las distintas modificaciones quimicas y/o enzimaticas que pueden afectar a la integridad del pentasacarido tambien llevarian correlacionadas una disminucion de la actividad anti-FXa del compuestoA Estas reacciones pueden ser Ndeacetilaciones, N y O-sulfataciones, O-acilaciones, reacciones de apertura del anillo, etcA

Por ejemplo, si el pentasacarido se encuentra alterado quimica o enzimaticamente en cuanto al grado de sulfatacion tambien se encontrara alterado el efecto anti-Factor XaA Sin embargo en diversos estudios (Lindahl U, Backstrom G and Thunberg LA JA BiolA ChemA 1983;258:9826-9830; Riesenfeld J, Thunberg L, Hook M and Lindahl UA JA BiolA ChemA 1981;256:2389-2393) se ha demostrado que cuando se altera el grado de sulfatacion no todos los grupos sulfato presentes en el pentasacarido con afinidad por la antitrombina lll son igualmente importantes, asi es posible establecer como afecta a la actividad anti-Factor Xa de este, la eliminacion de alguno de estos grupos:

-

CH2OSO3

O

OH

O

-

R: COCH3 o SO3

!!: Pérdida de actividad anti-Xa > 95%

!: Pérdida de actividad anti-Xa aprox. 75%

+: Pérdida de actividad anti-Xa aprox. 50 %

Por esta razon en la presente invencion, hemos modificado fisica y quimicamente distintas HBPM o HMBPM (ver ejemplos) para alterar el pentasacarido responsable de la actividad anti FXa de forma cualitativa y cuantitativa, para demostrar que en el caso de ulceras, en concreto aquellas de pie diabetico, lo que interesa es que en este tipo de glicosaminoglicanos exista mayor proporcion de secuencias oligosacaridicas ricas en los monosacaridos seleccionados del grupo formado por: N-sulfo-D-Glucosamina y Acido D-Glucuronico, y en realizaciones preferidas de la invencion, tambien, N-acetil-D-Glucosamina, Acido L-lduronico y Acido L-lduronico 2-sulfatado y no tanto del pentasacarido responsable de la la actividad anti FXa (no siendo necesaria la presencia de altas concentraciones de la unidad de N-sulfo-3O-sulfo-D-glucosamina esencial para la actividad antitrombotica del pentasacarido)A Por esta razon para los propositos de la presente invencion la proporcion de pentasacarido esta limitada a un maximo de un 20% del disacarido caracteristico del pentasacarido (acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-Glucosamina) en la estructura del glicosaminoglicano que, de acuerdo con el estado de la tecnica, es el responsable de la actividad anti FXa y que por tanto, segun esta, convendria tener en mayor proporcionA

En el estado de la tecnica se aprecia claramente que los pacientes diabeticos tienen alterado el proceso de cicatrizacion de las ulceras provocadas por la propia enfermedad, pero los inventores de la presente invencion tambien han demostrado que el efecto de la composicion farmaceutica objeto de la presente invencion, funciona de forma sorprendente para todo tipo de ulceras de cronicas como las de presionA

Para el objeto de la presente invencion se entiende por ulceras cronicas a las soluciones de continuidad con perdida de sustancia en la piel, dependiendo del origen de la ulcera se pueden clasificar como: ulceras por presion, ulcera diabetica, ulcera isquemica (arterial o venosa), ulcera postquemadura, ulceras postradioterapia, etcA

Esta clasificacion se ha realizado segun la causa que origina ulcera, sin embargo el mecanismo fisiopatologico que convierte una herida/ulcera en cronica, es una alteracion en el proceso isquemico que lleva a la necrosis cutanea y a una dificultad regenerativa de la misma por medios naturales (Kirman CNA Pressure ulcers, non surgical treatment and principles, Emedicine Jul 2008 (wwwAemedicineAcom/plastic) An G, Faeder J, Vodovotz YA Transactional systems biology: introduction of an engineering approach to the pathophysiology of the burn patientA J Burn Care ResA 2008;29(2):277-85A Nikolovska S, et alA The role of nitric oxide in the pathogenesis of venous ulcersA Acta Dermatovenerol Croat 2005;13(4):242-6)A

En este sentido, por ejemplo la isquemia se puede producir por presion externa sobre los capilares (ulceras por decubito o por presion), por lesion calorica (quemadura), o por obstruccion vascular (diabetes, arteriosclerosis, etcA)A Tras el proceso isquemico de la piel y organos circundantes, se produce una reperfusion de los tejidos danados, que aumenta la lesion inicial llevando a un empeoramiento y agravamiento de las lesionesA El mecanismo exacto del proceso de isquemia-reperfusion que agrava la lesion inicial y que lleva a la cronicidad de la lesion, que se produce tras la necrosis inicial no se conoce, pero se sospecha que la continua produccion de mediadores inflamatorios (citoquinas, interleukina, etcA) agravan el proceso isquemico inicial empeorando las lesiones, y llevando a la cronicidad de la ulceraA

Por ello se han investigado diferentes armas terapeuticas para modelar la produccion de mediadores inflamatorios que facilitan la regeneracion tisular, pero que no empeoren el dano celularA Un hecho a resaltar es que el proceso de cicatrizacion de una herida es el mismo en casi todos los tejidos, despues de la exposicion a cualquier proceso destructivo (Gurtner GC et alA Wound repair and regenerationA Nature 2008;453:314-21); de esta manera recientemente se ha investigado con heparinas de bajo peso molecular en la prevencion de las heridas por quemaduras (Ravikumar T et alA Low molecular weight heparin-induced pharmacological modulation of burn wound healingA Ann Burn fire Disast 2006;19(3):1-10 Oremus M, et alA The uses of heparin to treat burn injuryA Evid Rep Technol Assess (Full Rep)A 2006;(148):1-58) pero hasta la fecha no existe ningun tratamiento sistemico que facilite la regeneracion de una ulcera cronica (Fonder MA et alA Treating the chronic wound: A practical approach to the care of nonhealing wounds and wound care dressingsA J Am Acad dermatol 2008;58:185-206) y aun menos se conoce en el caso de los glicosaminoglicanos cual es la composicion y/o porcentaje de monosacaridos responsables de esta actividad curativa y regeneradora que favorece la aparicion de sistemas fisiologicos como el bloqueo de la produccion de mediadores inflamatorios, la regeneracion capilar, o los mecanismos de reperfusion y cicatrizacion de las ulcerasA

Es decir, la composicion objeto de la presente invencion funciona para ulceras cronicas incluso para pacientes que no tengan diabetes y a los que les aparecen determinado tipo de ulceras cronicas que no cicatrizan facilmente como pueden ser las ulceras de presion, entendiendo ulceras de presion como aquellas que presentan areas de dano en la piel y tejido subyacente causado por la presion prolongada sobre un plano duro, no necesariamente intensa, e independiente de la posicionA Se desecha en la actualidad el termino ulcera por decubito por no hacer referencia a la presion, factor determinante en su aparicion, y por excluir a la que no han aparecido en decubitoA

Es un problema comun en el cuidado de los pacientes con enfermedades cronicas, sobre todo en ancianos con movilidad limitada, con importante morbi-mortalidad y elevada repercusion economica y social, por eso para el objeto de la presente invencion es importante determinar que aunque la mayoria de los ejemplos se han realizado provocando diabetes en los animales, en el ejemplo 5, se ve claramente como aunque el animal no sea diabetico la administracion de la composicion farmaceutica objeto de la presente invencion funciona sorprendentemente bienA

Ademas, sin pretender quedar vinculados por la teoria, sin embargo creemos que esta hipotesis se encuentra refrendada por los resultados de nuestros ejemplos, ya que si empleamos para el tratamiento de ulceras, y en concreto las de pie diabetico, el pentasacarido sintetico (fondaparinux), la actividad cicatrizante y/o regenerativa se encuentra muy disminuida (cuando deberia ser al reves) del mismo modo que si modificamos quimica y/o enzimaticamente los monosacaridos seleccionados del grupo formado por N-sulfo-D-Glucosamina y Acido D-Glucuronico, asi como, en realizaciones preferidas de la invencion, tambien N-acetil-D-Glucosamina, Acido Llduronico y Acido L-lduronico 2-sulfatado, la actividad de nuestro glicosaminoglicano disminuye drasticamenteA Por ello se concluye que, aunque exista una porcion de pentasacarido en la estructura, este no es el responsable de la actividad cicatrizante y/o regenerativa tisular, asi como si alteramos cualitativa o cuantitativamente los monosacaridos anteriormente mencionados no obtenemos una buena actividad cicatrizante y/o regenerativa tisularA

Por esta razon, un aspecto principal de la presente invencion se dirige a una composicion de glicosaminoglicanos que contiene una proporcion de determinados monosacaridos y contiene una proporcion que no supere un 20%, del disacarido caracteristico del pentasacarido, para tratamiento de ulceras cronicas y en particular la ulcera de pie diabeticoA

Los inventores de la presente invencion tambien han llegado a elaborar una relacion entre la cantidad necesaria de los monosacaridos citados anteriormente y la dosis de un medicamento que contiene una cantidad farmaceuticamente eficaz de glicosaminoglicano, relacionando la proporcion de monosacaridos (Ul) con la vida media plasmatica del producto, para conseguir una dosis de "tratamiento" de la enfermedad y no de profilaxisA

En los estudios publicados hasta la fecha, las escasas heparinas utilizadas para ulceras cronicas, y en concreto ulceras de pie diabetico, han tenido como objetivo siempre la profilaxis, es decir que se pensaba que aumentando la dosis se produciria una hemorragia en el paciente, o bien una terapia coadyuvante de la enfermedad con otro tipo de compuestos que actuan a distintos niveles en la cascada de coagulacion, como es el AASA Por ello, las condiciones utilizadas en estos casos han sido las habituales para profilaxis, lo que implica utilizar concentraciones de heparina muy bajas, siendo la relacion entre el tiempo de vida media plasmatica (en horas) y la dosis en Ul de1:472 para el caso de la bemiparina, por ejemploA

Esto es asi porque el efecto que se busca con la heparina es actuar en profilaxis, ya que teniendo en cuenta el estado de la tecnica, la cantidad de pentasacarido responsable de la actividad antitrombotica es mas que suficiente para favorecer la vascularizacion de extremidades inferiores en pacientes con ulcera de pie diabetico, y a dosis superiores a la indicada la creencia general es que el riesgo de sangrado aumenta por exceso de dicho efecto antitrombotico, teniendo en cuenta que los pacientes diabeticos tienen mayor predisposicion al sangrado, sin darse cuenta que lo realmente importante es administrar mayor cantidad de otros monosacaridos que no forman parte del pentasacarido en la formulacionA Por ello, tradicionalmente se han utilizado para este fin siempre dosis muy bajas, en las que la relacion entre el tiempo de vida media plasmatica y la dosis en Ul de la HBPM inferior a 1:500, ya que se considera que asi se consigue el mismo efecto anticoagulante y antitrombotico pero con un menor riesgo de sangrado para pacientes que ya poseen una enfermedad compleja como es la diabetesA

Hasta el conocimiento de los inventores no existe sustancialmente bibliografia de patentes sobre el tratamiento de ulceras de pie diabetico con composiciones de glicosaminoglicanos como las heparinas de bajo peso molecular sin que sean dosis de profilaxis, ya que estas no son curativas sino preventivas y realmente no curan las ulceras mediante cicatrizacion con regeneracion del tejido de granulacion, sino que se utilizan porque se cree que previenen la formacion de las mismas y en la mayoria de los casos utilizadas en tratamiento sinergico con otros farmacos como el Acido acetilsalicilico (Effect of Dalteparin of healing of chronic foot ulcers in diabetic patients with peripheral arterial occlusive disease", Diabetes Care, volA 26(9), Septiembre 2003; MA Kalani, AA et alA Titulado Beneficial effects of dalteparin on haemostatic function and local tissue oxygenation in patients with diabetes, severe vascular disease and foot ulcersA Thrombosis ResearchA 120, 653-661, 2007) A

Ademas, los inventores de la presente invencion, han conseguido eliminar prejuicios del estado de la tecnica, ya que han determinado que en el caso de ciertos glicosaminoglicanos, como son las HBPM y las HMBPM, la cantidad de pentasacarido para el tratamiento de ulceras de pie diabetico (en pacientes diabeticos) no es significativo, sino que lo realmente importante es la presencia de una proporcion de secuencias oligosacaridicas ricas en ciertos monosacaridos especificosA Esta proporcion de ciertos monosacaridos especificos, citados en la descripcion detallada de la presente invencion, es la responsable de la cicatrizacion de este tipo de ulceras en pacientes diabeticos ya que cuando este tipo de glicosaminoglicanos es administrado por via subcutanea o via parenteral, el efecto cicatrizante se debe a la presencia de ciertas fracciones oligosacaridicas que no contienen el pentasacarido comunmente vinculado en el estado de la tecnica con el efecto anti-factor Xa en las heparinas de bajo peso molecular y muy bajo peso molecularA Ademas, los inventores de la presente invencion han determinado que siempre que el pentasacarido se encuentre ligeramente alterado (cuantitativa y cualitativamente) en la estructura heparinoide, la actividad anti FXa disminuye considerablementeA Sin embargo, no se observa una disminucion analoga en el poder cicatrizanteA

Por lo tanto, un importante problema en el tratamiento de ulceras del pie diabetico es conseguir la dosis efectiva y eficaz de un medicamento, que logre la regeneracion del tejido isquemico y prevenga la amputacion del pie diabetico y que ademas sea efectivo no solo en profilaxis sino como tratamiento terapeuticoA Otra ventaja adicional que debe tener el tratamiento de eleccion es que sea poco traumatico para el paciente ya que las ulceras de pie diabetico se caracterizan por ser extremadamente dolorosas, por lo que la via de administracion debe ser poco traumatica en la proximidad de la heridaA Por ello, para los fines de la presente invencion las vias preferidas de administracion son la via parenteral, la via oral y la via topica no invasiva o de aplicacion directa sobre la mucosa a tratarA

Descripci�n de las figuras

Figura 1: Representa el mecanismo de accion del pentasacarido sintetico (fondaparinux)A

Figura 2A: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de fondaparinux (pentasacarido responsable de la interaccion con antirombina lll) registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A En el espectro podemos observar cinco picos de correlacion que corresponden a los cinco monosacaridos que componen el pentasacaridoA ANSred, N-sulfo-D-glucosamina del extremo reductor; l2S, acido Liduronico 2-sulfato; ANS,3S, N-sulfo-3O-sulfo-D-glucosamina; G-(ANS,3S), acido D-glucuronico que precede a la unidad ANS,3S y ANS-(G), N-sulfo-D-glucosamina que precede al anillo de acido D-glucuronicoA El pico de correlacion H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) se ha resaltado con un circulo porque es la senal mas caracteristica del pentasacarido y se va a tomar como referencia para cuantificar la presencia del mismo en diversas muestrasA La proporcion de este monosacarido en el fondaparinux es del 20%A

Figura 2B: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de bajo peso molecular bemiparina, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es mucho mas complejo que el obtenido para fondaparinux (ver figura 2A), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, Nacetil-D-glucosamina) y a la alteracion de la proporcion de las unidades existentes, como es el caso del anillo de acido L-iduronico sulfatado en 2, l2S, que esta presente en mayor proporcionA El pico de correlacion H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) caracteristica del pentasacarido se ha resaltado con un circuloA Como se puede observar en la figura, la intensidad de esta senal ha disminuido en comparacion con la muestra de fondaparinux debido al incremento de la proporcion de acido D-glucuronico enlazado a N-sulfo-D-glucosamina G-(ANS), siendo este el anillo de glucuronico mayoritarioA La disminucion de la proporcion de la unidad G-(ANS,3S) en las muestras de bemiparina, 1A5% del contenido de monosacaridos total, evidencia que la mayor parte de las cadenas oligosacaridicas no presentan el motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Tambien se han etiquetado las senales: ANSred, N-sulfo-D-glucosamina del extremo reductor; ANS,3S, N-sulfo-3O-sulfo-D-glucosaminaA

Figura 2C: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de muy bajo peso molecular RO14 ckw2 13 11L, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es mucho mas complejo que el obtenido para fondaparinux (ver figura 2A), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, N-acetil-D-glucosamina) y a la alteracion de la proporcion de las unidades existentes, como es el caso del anillo de acido L-iduronico sulfatado en 2, l2S, que esta presente en mayor proporcionA El pico de correlacion H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) caracteristica del pentasacarido se ha resaltado con un circuloA Como se puede observar en la figura, la intensidad de esta senal ha disminuido en comparacion con la muestra de fondaparinux debido al incremento de la proporcion de acido D-glucuronico enlazado a N-sulfo-D-glucosamina G-(ANS), siendo este el anillo de glucuronico mayoritarioA La disminucion de la proporcion de la unidad G-(ANS,3S) en las muestras de RO14 ckw2 13 11L, 2A6 % del contenido de monosacaridos total, evidencia que la mayor parte de las cadenas oligosacaridicas no presentan el motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Tambien se han etiquetado las senales:

ANSred, N-sulfo-D-glucosamina del extremo reductor; ANS,3S, N-sulfo-3O-sulfo-D-glucosaminaA

Figura 2D: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de bajo peso molecular enoxaparina, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es mucho mas complejo que el obtenido para fondaparinux (ver figura 2A), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, Nacetil-D-glucosamina) y a la alteracion de la proporcion de las unidades existentes, como es el caso del anillo de acido L-iduronico sulfatado en 2, l2S, que esta presente en mayor proporcionA El pico de correlacion H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) caracteristica del pentasacarido se ha resaltado con un circuloA Como se puede observar en la figura, la intensidad de esta senal ha disminuido en comparacion con la muestra de fondaparinux debido al incremento de la proporcion de acido D-glucuronico enlazado a N-sulfo-D-glucosamina G-(ANS), siendo este el anillo de glucuronico mayoritarioA La disminucion de la proporcion de la unidad G-(ANS,3S) en las muestras de enoxaparina, 1A7 % del contenido de monosacaridos total, evidencia que la mayor parte de las cadenas oligosacaridicas no presentan el motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Tambien se han etiquetado las senales:

Figura 2E: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de bajo peso molecular tinzaparina, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es mucho mas complejo que el obtenido para fondaparinux (ver figura 2A), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, Nacetil-D-glucosamina) y a la alteracion de la proporcion de las unidades existentes, como es el caso del anillo de acido L-iduronico sulfatado en 2, l2S, que esta presente en mayor proporcionA El pico de correlacion H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) caracteristica del pentasacarido se ha resaltado con un circuloA Como se puede observar en la figura, la intensidad de esta senal ha disminuido en comparacion con la muestra de fondaparinux debido al incremento de la proporcion de acido D-glucuronico enlazado a N-sulfo-D-glucosamina G-(ANS), siendo este el anillo de glucuronico mayoritarioA La disminucion de la proporcion de la unidad G-(ANS,3S) en las muestras de tinzaparina, 1A05 % del contenido de monosacaridos total, evidencia que la mayor parte de las cadenas oligosacaridicas no presentan el motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Tambien se han etiquetado las senales:

Figura 2F: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de muy bajo peso molecular RO14 H13 96 5, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es mucho mas complejo que el obtenido para fondaparinux (ver figura 2A), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, N-acetil-D-glucosamina) y a la alteracion de la proporcion de las unidades existentes, como es el caso del anillo de acido L-iduronico sulfatado en 2, l2S, que esta presente en mayor proporcionA El pico de correlacion H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) caracteristica del pentasacarido se ha resaltado con un circuloA Como se puede observar en la figura, la intensidad de esta senal ha disminuido en comparacion con la muestra de fondaparinux debido al incremento de la proporcion de acido D-glucuronico enlazado a N-sulfo-D-glucosamina G-(ANS), siendo este el anillo de glucuronico mayoritarioA La disminucion de la proporcion de la unidad G-(ANS,3S) en las muestras de RO14 H13 96 5, 1A9 % del contenido de monosacaridos total, evidencia que la mayor parte de las cadenas oligosacaridicas no presentan el motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Figura 2G: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de bajo peso molecular BEMl 99 4, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es muy diferente al obtenido para fondaparinux (ver figura 2A), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, N-acetil-Dglucosamina) y a la desaparicion de algunas de las senales caracteristicas como ANS,3S y G-(ANS,3S)A La desaparicion de la senal del pentasacarido, G-(ANS,3S), evidencia que este tipo de heparina de bajo peso molecular no presenta cantidades detectables del motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA Asimismo, la desaparicion de la senal de l2S muestra que esta HBPM tambien presenta cambios significativos en las unidades caracteristicas de la region regular de la heparinaA

Figura 2H: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de heparina sodica, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es mucho mas complejo que el obtenido para fondaparinux (ver figura 1), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, N-acetil-D-glucosamina) y a la alteracion de la proporcion de las unidades existentes, como es el caso del anillo de acido L-iduronico sulfatado en 2, l2S, que esta presente en mayor proporcionA El pico de correlacion H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) caracteristica del pentasacarido se ha resaltado con un circuloA Como se puede observar en la figura, la intensidad de esta senal ha disminuido en comparacion con la muestra de fondaparinux debido al incremento de la proporcion de acido Dglucuronico enlazado a N-sulfo-D-glucosamina G-(ANS), siendo este el anillo de glucuronico mayoritarioA La disminucion de la proporcion de la unidad G-(ANS,3S) en las muestras de heparina sodica, 1A0 % del contenido de monosacaridos total, evidencia que la mayor parte de las cadenas oligosacaridicas no presentan el motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Tambien se han etiquetado las senales:

Figura 2l: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de bajo peso molecular BEMl 99 2, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es muy diferente al obtenido para fondaparinux (ver figura 1), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, N-acetil-Dglucosamina; ANH2, D-glucosamina; ANH2,3S, D-3-O-sulfo-glucosamina) y a la desaparicion de algunas de las senales caracteristicas como ANS,3S y G-(ANS,3S)A

Figura 2J: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de heparina calcica, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es mucho mas complejo que el obtenido para fondaparinux (ver figura 1), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, N-acetil-D-glucosamina) y a la alteracion de la proporcion de las unidades existentes, como es el caso del anillo de acido L-iduronico sulfatado en 2, l2S, que esta presente en mayor proporcionA El pico de correlacion H1-C1 de la unidad G-(ANS,3S) caracteristica del pentasacarido se ha resaltado con un circuloA Como se puede observar en la figura, la intensidad de esta senal ha disminuido en comparacion con la muestra de fondaparinux debido al incremento de la proporcion de acido Dglucuronico enlazado a N-sulfo-D-glucosamina G-(ANS), siendo este el anillo de glucuronico mayoritarioA La disminucion de la proporcion de la unidad G-(ANS,3S) en las muestras de heparina sodica, 1A0 % del contenido de monosacaridos total, evidencia que la mayor parte de las cadenas oligosacaridicas no presentan el motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Tambien se han etiquetado las senales:

Figura 2K: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de bajo peso molecular BP06408-66/27-A, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es muy diferente al obtenido para fondaparinux (ver figura 2A), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, N-acetil-Dglucosamina) y a la disminucion de las senales correspondientes a ANS,3S y G-(ANS,3S)A La disminucion de las senal del pentasacarido, G-(ANS,3S), evidencia que este tipo de heparina de bajo peso molecular presenta una baja concentracion del motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Figura 2L: Representacion de la region de las senales anomericas (correlaciones H1-C1) del espectro 13C-1H HSQC de la heparina de bajo peso molecular BP06408-66/28-A, registrado a 298 K en agua deuterada (D2O)A El espectro es muy diferente al obtenido para fondaparinux (ver figura 2A), debido a la presencia de nuevas unidades monosacaridicas que no estaban presentes en fondaparinux (l, acido L-iduronico sin sulfatar; ANAc, N-acetil-Dglucosamina) y la desaparicion de las senales correspondientes a ANS,3S y G-(ANS,3S)A La desaparicion de la senal del pentasacarido, G-(ANS,3S), evidencia que este tipo de heparina de bajo peso molecular no presenta cantidades detectables del motivo estructural responsable de la interaccion con la antitrombina lllA

Figura 3: Muestra el porcentaje de reduccion de area ulcerada enlos ratones del Ejemplo 2 cuando se administra bemiparina con una relacion entre la vida media y la dosis de 1:950, bemiparina con una relacion entre la vida media y la dosis de 1:472 y fondaparinux a dosis equivalentes de tratamiento, es decir 5mg/ml, ya que tiene una vida media plasmatica de 17 horas en individuos sanos, por lo que en rata wistar es de 0,22 mg por rataA

Figura 4: Muestra la evolucion de los ratones control diabeticos del Ejemplo 4 con respecto a los ratones tratados con bemiparina sodicaA El area de la herida se ha representado a la derecha de cada animalA

Figura 5: Muestra la evolucion del tanto por ciento de cicatrizacion de la herida con el tiempo en los ratones del Ejemplo 4A

Figura 6A Microfotografias de las secciones de las heridas de los ratones del Ejemplo 4 tras la tincion con hematoxilina-eosinaA A control diabeticoA B animal diabetico tratado con fondaparinux sodico, C animal diabetico tratado con bemiparina sodicaA

Figura 7: Se representa el porcentaje de reduccion de area ulcerada de los ratones del Ejemplo 5 cuando se les administra una composicion control por via topica, una composicion topica de bemiparina sodica y una composicion topica de fondaparinux sodico , una composicion topica de heparina no fraccionadaA

Figura 8: Muestra la evolucion de los ratones control no diabeticos del Ejemplo 5 con respecto a los ratones tratados con heparina calcicaA El area de la herida se ha representado a la derecha de cada animalA

Figura 9: Muestra la evolucion del tanto por ciento de cicatrizacion de la herida con el tiempo en los ratones del Ejemplo 5A

Figura 10: Microfotografias de las secciones de las heridas de los ratones del Ejemplo 5 tras la tincion con hematoxilina-eosinaA A control no diabeticoA B animal no diabetico tratado con bemiparina sodica, C animal no diabetico tratado con heparina calcicaA

Figura 11: Se representa el porcentaje de reduccion de area ulcerada en rata wistar diabetica cuando se le administra una solucion control por via oral, una suspension oral de bemiparina sodica de 100 mg/kg y una suspension de fondaparinux sodico de 10 mg/kg

Descripcion detallada de la invencion

El problema a ser resuelto por la presente invencion es, por tanto, proporcionar una composicion farmaceutica que solvente los problemas de la tecnica anteriorA

La solucion se basa en que los inventores han identificado que una composicion farmaceutica de glicosaminoglicanos por via subcutanea o parenteral, via oral y/o via topica, en particular HBPM y HMBPM, para tratamiento de ulceras cronicas como las de pie diabetico, que contiene la siguiente proporcion de los siguientes monosacaridos (en los que todos los porcentajes son sobre el porcentaje total de monosacaridos de la composicion):

a) N-sulfo-D-Glucosamina: 25-50%

b) Acido D-Glucuronico: 3-25%

y que esta caracterizada porque la proporcion de la unidad disacaridica Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3sulfo-D-Glucosamina no es superior al 25%, y preferiblemente al 20%, consigue resolver el problema indicado, puesto que logra la regeneracion del tejido, previniendo la amputacion del miembro, y es efectiva como tratamiento terapeutico y no solo en profilaxisA

Otro aspecto de la invencion se refiere tambien al uso de una composicion de glicosaminoglicanos por via subcutanea o parenteral, via oral y/o via topica, en particular HBPM y HMBPM, que contienen una proporcion caracteristica de al menos los monosararidos seleccionados del grupo N-sulfo-D-Glucosamina, N-acetil-D-Glucosamina, Acido L-lduronico, Acido L-lduronico 2-sulfatado y Acido D-Glucuronico en la fabricacion de un medicamento alternativo para el tratamiento de las ulceras cronicas como las ulceras de presion y las de pie diabeticoA

La solucion se basa en que los inventores han identificado que, contrariamente a la creencia generalizada, es posible administrar a un paciente que padezca de ulcera de pie diabetico un tratamiento que consiste en una dosis de heparina de bajo peso molecular (HBPM) clasificada como dosis de tratamiento de enfermedad tromboembolica venosa sin que se produzca un mayor riesgo de sangrado, y obteniendose sorprendentemente mejores resultados que si se administra a concentraciones inferiores tales como las concentraciones habituales para profilaxis, debido a la presencia de una proporcion determinada de ciertos monosacaridos en los glicosaminoglicanosA Por lo tanto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para el tratamiento de ulcera de pie diabetico que emplea las dosis habituales de tratamiento para enfermedad tromboembolica venosa, entendiendo como dosis de tratamiento, aquellas en las que en las que la relacion entre el tiempo de vida media plasmatica y la dosis en Ul de la HBPM es entre 1:800 y 1:5A000, es decir, aquellas que contienen mayor cantidad de monosacaridos especificos

En una realizacion particular de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica de glicosaminoglicanos por via subcutanea o parenteral, via oral y/o via topica, en particular HBPM y HMBPM, para tratamiento de ulcera de pie diabetico que contienen la siguiente proporcion de los siguientes monosacaridos:

-: N-sulfo-D-Glucosamina: 25-50%

-: N-acetil-D-Glucosamina: 0-10%

-: Acido L-lduronico: 0-35%

-: Acido L-lduronico 2-sulfatado: 0-50%

-: Acido D-Glucuronico: 3-25%

En otra realizacion particular de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica de glicosaminoglicanos por via subcutanea o parenteral, via oral y/o via topica, en particular HBPM y HMBPM, para tratamiento de ulcera de pie diabetico que contienen la siguiente proporcion de los siguientes monosacaridos:

-N-sulfo-D-Glucosamina: 25-50%

-N-acetil-D-Glucosamina: 0-10%

-: Acido L-lduronico: 0-10%

-: Acido L-lduronico 2-sulfatado: 15-50%

-: Acido D-Glucuronico: 3-25%

-N-sulfo-D-Glucosamina: 25-50%

-N-acetil-D-Glucosamina: 0,1-8%

-: Acido L-lduronico: 1-10%

-: Acido L-lduronico 2-sulfatado: 15-40%

-: Acido D-Glucuronico: 3-15%

De forma mas particular, la presente invencion se dirige a una composicion farmaceutica de glicosaminoglicanos por via subcutanea o parenteral, via oral y/o via topica, en particular HBPM y HMBPM, para tratamiento de ulceras cronicas como las de pie diabetico, que contiene una proporcion de la unidad disacaridica Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-Glucosamina (ANS,3S) inferior al 20%, aun mas preferiblemente inferior al 10% y lo mas preferiblemente inferior al 5% de la totalidad de la composicion sacaridicaA

Uno de los meritos de esta invencion no es solo el haber eliminado un prejuicio del estado de la tecnica, sino el conseguir una correlacion efectiva entre la proporcion de los monosacaridos citados anteriormente con la dosis de medicamento que contiene la composicion farmaceutica citada anteriormente necesaria para tratatar la ulcera de pie diabetico asi como para favorecer la cicatrizacion y regeneracion del tejido en los pacientes en funcion de la vida media plasmatica de estos glicosaminoglicanosA

La vida media plasmatica para diversas HBPM conocidas se recoge en la tabla 1, cuyos datos han sido extraidos de la publicacion Planes, AA Review on bemiparin sodium - a second generation low molecular weigth heparin-and its applications in venous thromboembolismA Expert opinion PharmacotherA 2003; 4:1551-61A

Tabla 1

HBPM: lntervalo de Vida Media Plasmatica (horas) Vida Media Plasmatica (horas)

RO-14: 6A5 - 6A9 6A7

Bemiparina: 5A2 - 5A4 5A3

Tabla 1

Enoxaparina: 4A0 - 4A4 4A2

Nadroparina: 3A7 3A7

Dalteparina: 2A3 - 2A8 2A5

Tinzaparina: 3A0 3A0

En cuanto a los distintos tipos de HBPM, se observa que las dosis empleadas dependen de forma inversamente proporcional al tiempo de vida media plasmatica, tal y como se muestra en la tabla 2 (fuente: vease el articulo arriba citado de "Expert opinion Pharmacother", excepto para el caso de la RO-14, cuyos datos provienen de experimentos del solicitante):

Tabla 2

HBPM: Dosis media (Ul/dia) Relacion aproximada Vida media / Dosis

RO-14: 5A400 1:800

Bemiparina: 5A000 1: 950

Enoxaparina: 8A000 1: 1A900

Nadroparina: 7A600 1: 2A000

Dalteparina: 10A000 1: 4A000

Tinzaparina: 10A000 1: 3A300

En consecuencia, un aspecto adicional de la invencion esta dirigido al uso de glicosaminoglicanos, en particular heparinas de bajo peso molecular, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de ulcera de pie diabetico que se caracteriza porque la relacion entre el tiempo de vida media plasmatica y la dosis en Ul de la HBPM 10 es entre 1:800 y 1:5A000, es decir, se caracteriza porque se administra una composicion que contiene mayor cantidad de los monosacaridos seleccionados del grupo formado por N-sulfo-D-Glucosamina N-acetil-D-Glucosamina y Acido D-Glucuronico, y en realizaciones preferidas de la invencion tambien Acido L-lduronico y Acido L-lduronico 2-sulfatado, y una proporcion de la unidad disacaridica Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfoD-Glucosamina inferior al 20% de la totalidad de la composicion sacaridica, para tratamiento de ulcera de pie

15 diabetico, mas preferiblemente inferior al 10% y lo mas preferiblemente inferior al 5%

En otro aspecto, la invencion se dirige al uso de una heparina de bajo peso molecular en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de ulcera de pie diabetico en el que la HBPM es una heparina de peso molecular medio inferior a 6A000 daltonsA

En otro aspecto la invencion se dirige al uso de una heparina de bajo peso molecular en la fabricacion de un

20 medicamento para el tratamiento de ulcera de pie diabetico caracterizado porque el tiempo de vida media plasmatica es entre 5,2 y 5,4 y la dosis media diaria es de 5A000 Ul, lo que asegura tener una proporcion especifica de los monosacaridos seleccionados del grupo formado por N-sulfo-D-Glucosamina y Acido D-Glucuronico, y en realizaciones preferidas de la invencion tambien N-acetil-D-Glucosamina, Acido L-lduronico y Acido L-lduronico 2sulfatado, y la unidad disacaridica Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-Glucosamina inferior al 20% de

25 la totalidad de la composicion sacaridica, mas preferiblemente inferior al 10% y lo mas preferiblemente inferior al 5%

En otro aspecto, la invencion se dirige al uso de una heparina de bajo peso molecular en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de ulcera de pie diabetico caracterizado porque el tiempo de vida media plasmatica es entre 4,0 y 4,4 y la dosis media diaria es de 7A600 Ul, lo que asegura tener una proporcion especifica de los monosacaridos seleccionados del grupo formado por N-sulfo-D-Glucosamina, N-acetil-D-Glucosamina, Acido L

30 lduronico, Acido L-lduronico 2-sulfatado y Acido D-GlucuronicoA En otro aspecto, la invencion se dirige al uso de una heparina de bajo peso molecular en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de ulcera de pie diabetico caracterizado porque el tiempo de vida media plasmatica es entre 2A3 y 2A8 y la dosis media diaria es de 10A000 Ul, lo que asegura tener una proporcion especifica de los monosacaridos seleccionados del grupo formado por N-sulfo-D-Glucosamina y Acido D-Glucuronico, y en realizaciones preferidas de la invencion tambien N-acetil-D-Glucosamina, Acido L-lduronicoy Acido L-lduronico 2sulfatadoA

Como se ha indicado, gracias a la provision de una HBPM a una dosis de tratamiento en la que la relacion entre el tiempo de vida media plasmatica de cada HBPM y la dosis en Ul de cada HBPM es entre 1:800 y 1:5A000 se consigue la ventaja de proporcionar un medicamento alternativo para el tratamiento de ulceras cronicas como son las del pie diabetico que aporta una mayor efectividad que los tratamientos tradicionales sin un incremento significativo de las desventajas tipicamente asociadas a este tratamiento, tal como un mayor riesgo de sangrado, debido a que contiene mayor cantidad de ciertas unidades monosacaridicas y una cantidad limitada de la unidad disacaridica Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-Glucosamina inferior al 20% de la totalidad de la composicion sacaridicaA

Esta invencion ha sido posible gracias a que los inventores han superado el prejuicio existente en el campo tecnico de las heparinas en contra de elevar la concentracion de HPBM hasta niveles del orden de las dosis de tratamiento de la enfermedad tromboembolica venosa, en lugar de quedarse en la habitual dosis de profilaxis (mas bajas), en la creencia de que tal elevacion aumentaria significativamente el riesgo de sangrado sin producir efectos beneficiosos en cuanto a la mejora de la cicatrizacion y la regeneracion de tejido epitelial, tal y como se observa en la presente invencionA

Ademas, sin pretender quedar vinculados por la teoria, sin embargo los inventores de la presente invencion consideran los resultados de los ejemplos refrendan su hipotesis, ya que si emplean para el tratamiento de ulcera de pie diabetico el pentasacarido sintetico (fondaparinux) la actividad cicatrizante y/o regenerativa se encuentra muy disminuida (cuando deberia ser al reves) del mismo modo que si modifican quimica y/o enzimaticamente los monosacaridos seleccionados del grupo formado por N-sulfo-D-Glucosamina, N-acetil-D-Glucosamina, Acido Llduronico, Acido L-lduronico 2-sulfatado y Acido D-Glucuronico, la actividad de la composicion de glicosaminoglicano disminuye drasticamente, por ello se concluye que aunque exista una porcion de pentasacarido en la estructura este no es el responsable de la actividad cicatrizante y/o regenerativa tisular asi como si alteramos cualitativa o cuantitativamente los monosacaridos anteriormente mencionados no obtenemos una buena actividad cicatrizante y/o regenerativa tisularA

Ejemplos

Los siguientes ejemplos especificos que se proporcionan a continuacion sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invencionA Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invencion que aqui se reivindicaA

Se han realizado una serie de experimentos para demostrar que el uso de glicosaminoglicanos tales como heparinas de bajo peso molecular en la fabricacion de medicamentos para el tratamiento de ulcera de pie diabetico a dosis de tratamiento para HBPM en las que la relacion entre el tiempo de vida media plasmatica de cada HBPM y la dosis en Ul de la HBPM es entre 1:800 y 1:5A000 proporcionan las ventajas indicadas de la invencionA

En estos experimentos se han utilizado varios compuestos, en particular los siguientes:

Productos comerciales:

-: Fondaparinux: Analogo del pentasacarido con alta afinidad por la antitrombina lll obtenido por sintesis quimicaA Entre otras presenta las siguientes caracteristicas: Peso Molecular de 1728 Daltons y una actividad anti-factor Xa: 700 Ul/mgA

-: Bemiparina: es una heparina de segunda generacion, de bajo peso molecular (peso molecular medio de 3A600 daltons) y una relacion anti-Xa/anti-lla superior a 8A La Bemiparina se obtiene mediante un nuevo metodo de despolimerizacion y fraccionamiento -beta-eliminacion en medio no acuoso-con el fin de conseguir un peso molecular aun mas bajo que las heparinas anteriores, asi como una optima distribucion de sus fragmentos, de tal modo que el porcentaje de fragmentos de mas de 6A000 Daltons resultante es muy inferior al resto de las HPBM, con una proporcion elevada de cadenas por debajo de la longitud critica (PM < 5A400 D)A Sin pretender quedar vinculados por la teoria, los inventores creen que son precisamente los monosacaridos presentes que no forman parte de la porcion caracteristica del pentasacarido responsable de la actividad antitrombotica, que se consideran secundarios y a los que no se habia dado importancia hasta la fecha, las que aportan a las HPBM de la invencion las ventajas indicadas, por esta razon, a mayor dosis de estos monosacaridos se produce mejor cicatrizacion y curacion de las ulceras de pie diabeticoA

-: Enoxaparina: Heparina de bajo peso molecular obtenida por despolimerizacion por un metodo de -eliminacion en medio acuoso de los esteres bencilicos de heparina previamente formadosA Entre otras presenta las siguientes caracteristicas (PhA EurA 6th Edition): Peso Molecular medio de 3500 -5500 Daltons y una actividad

anti-factor Xa: 90 - 125 Ul/mg

-: Dalteparina: Heparina de bajo peso molecular obtenida por despolimerizacion con acido nitrosoA Entre otras presenta las siguientes caracteristicas (PhA EurA 6th Edition): Peso Molecular medio de 5600 -6400 Daltons y una actividad anti-factor Xa: 110 - 210 Ul/mg

-: Tinzaparina: Heparina de bajo peso molecular obtenida por despolimerizacion enzimatica con heparinasa lA Entre otras presenta las siguientes caracteristicas (PhA EurA 6th Edition): Peso Molecular medio de 5500 -7500 Daltons y una actividad anti-factor Xa: 70 -120 Ul/mgA

-: Heparina Sodica: Heparina no FraccionadaA Entre otras presenta las siguientes caracteristicas (PhA EurA 6th Edition): Actividad anticoagulante: � 150 Ul/mg

-: Heparina Calcica: Heparina no FraccionadaA Entre otras presenta las siguientes caracteristicas (PhA EurA 6th Edition): Actividad anticoagulante: � 150 Ul/mg

Productos en fase de investigacion:

-RO-14: Heparina de muy bajo peso molecular obtenida por despolimerizacion por un metodo de -eliminacion en medio no acuosoA Entre otras presenta las siguientes caracteristicas: Peso molecular medio de 1800 - 3000 Daltons y presenta una actividad anti-factor Xa: 80 - 140 Ul/mgA

-BEMl-99/4: Es una heparina de bajo peso molecular que tiene alterado el grado de sulfatacion, de tal modo que unicamente presenta grupos sulfato en la posicion N de las glucosaminasA Por esta razon, su actividad anti factor Xa disminuye considerablemente ya que la porcion del pentasacarido se ve afectado cualitativa y cuantitativamenteA

Las modificaciones para obtener esta heparina se fundamentan en una reaccion de N,O-desulfatacion que se realiza de acuerdo a las condiciones descritas por Nagasawa e lnoue (Nagasawa K, lnoue YA De-N-sulfationA Methods CarbohydrA ChemA 1980;8:287-289) y de N-sulfatacion, segun las condiciones de Lloyd et alALloyd AG, Embrey G, Fowler LJA Studies on heparin degradation-l: Preparation of [35S] sulphamate derivatives for studies on heparin degrading enzymes of mammalian originA BiochemA PharmacolA 1971;20:637-648), asi 10 g de bemiparina se disuelven en 150 ml de agua y la solucion se pasa a traves de una columna de Dowex 50WX8, H+A El eluido se neutraliza con piridina y se liofiliza, obteniendose 11,2 g de sal de piridinio de BemiparinaA

La sal de piridinio de bemiparina (3 g) se disuelve en 75 ml de dimetilsulfoxido conteniendo un 10% de metanol, y la solucion se mantiene durante 24 h a 105 DCA Transcurrido este tiempo, se anaden 75 ml de agua, se ajusta el pH a 9,0-9,5 con hidroxido sodico y se agita durante 15 minutosA La solucion se neutraliza con acido clorhidrico, se disuelven 0,5 g de cloruro sodico y se precipita con adicion de 3 volumenes de metanol, obteniendose el derivado N,O-desulfatadoA

El derivado N,O-desulfatado (1 g) se N-sulfata, de acuerdo a las condiciones de Lloyd et colA El producto se disuelve en 75 ml de una solucion saturada de bicarbonato sodico y se ajusta el pH a 9A La disolucion se calienta a 55 DC y se anaden 3 g de complejo de trioxido de azufre -trimetilaminaA La reaccion se mantiene 3 h a 55 DCA Trascurrido este tiempo se vuelve a anadir 3 g de complejo de trioxido de azufre -trimetilamina, dejando 3 h mas la reaccion a 55 DCA La solucion se enfria y se ajusta el pH a 7 con acido clorhidrico, se anade 1 g de cloruro sodico y se precipita con tres volumenes de metanolA Se obtienen 0,88 g de BEMl-99/4A El producto obtenido presenta las siguientes caracteristicas: Peso molecular medio de 3468 Daltons y una actividad anti-factor Xa: 4 Ul/mgA

-BEMl-99/2: Es una heparina de bajo peso molecular que tiene alterado el grado de sulfatacion, por una reaccion de N-desulfatacionA Esto conlleva una disminucion en su actividad anti factor Xa ya que el pentasacarido se ve afectadoA

Las modificaciones para obtener esta heparina se fundamentan en las condiciones descritas por Nagasawa e lnoue (Nagasawa K, lnoue YA De-N-sulfationA Methods CarbohydrA ChemA 1980;8:287-289)A

3 g de sal de piridinio de bemiparina (preparada segun se indica en el ejemplo anterior), se disuelven en 450 ml de dimetilsulfoxido conteniendo un 10% de metanol, y la solucion se mantiene durante 2 h a 55 DCA Transcurrido este tiempo, se ajusta el pH a 9,0-9,5 con hidroxido sodico y se agita durante 15 minutosA La solucion se neutraliza con acido clorhidrico, se disuelven 0,5 g de cloruro sodico y se precipita con adicion de 3 volumenes de metanol, obteniendose el derivado N-desulfatadoA Se obtienen 0,91 g de BEMl-99/2A El producto obtenido presenta las siguientes caracteristicas: Peso molecular medio de 3619 Daltons y una actividad anti-factor Xa: 19 Ul/mgA

-: H13-96/5: Es una heparina de bajo peso molecular que presenta un menor grado de acetilacionA Por esta razon, su actividad anti factor Xa disminuye considerablemente ya que la porcion del pentasacarido se ve afectado cualitativa y cuantitativamenteA

En este caso, para poder obtener este glicosaminoglicano se realiza una reaccion de N-deacetilacion segun las condiciones descritas por Shaklee y Conrad (Shaklee PN, Conrad HEA Hydrazinolysis of heparin and other glycosaminoglycansA Biochem J 1984;217:187-197)A Asi, 5 g de RO-14 se disuelven en 125 ml de hidrazina anhidra que contiene un 1% de hidrazina sulfato y se mantiene durante 6 h a 95 DCA La solucion se concentra a sequedad, se redisuelve en la minima cantidad de agua y se neutraliza con acido clorhidricoA Se anaden 2,5 g de cloruro sodico y se precipita con 3 volumenes de metanol, obteniendose el producto H13-96/5 (3,4 g)A El producto obtenido presenta las siguientes caracteristicas: Peso molecular medio de 2008 Daltons y una actividad anti-factor Xa: 46 Ul/mgA

-: BP06408-66/27-A: Es una heparina de bajo peso molecular de actividad anti factor Xa reducida, obtenida por fraccionamiento de Bemiparina por cromatografia de afinidad sobre ATlllA

Para obtener este derivado, se pasan 10 mg de Bemiparina, por una columna de CNBr-activated Sepharose 4B activada previamente con ATlll (Humana), preparada segun las condiciones descritas por HooK et alA (Hook M, Bjork l, Hopwood J, Lindahl UA FEBS LettA 1976 ;66,:90-93)A La columna se eluye a 4DC con una disolucion tampon pH 7A40 de 1mM Tris-HCl+ 0A4M NaCl, eluyendo asi la fraccion de baja afinidadA

Esta fraccion se purifica por una columna de Biogel P2, eluyendo con aguaA La disolucion que contiene el producto se liofiliza, obteniendose finalmente 7,6 mg de productoA

El producto obtenido presenta las siguientes caracteristicas: Peso molecular medio de 3567 Daltons y una actividad anti-factor Xa: 32 Ul/mgA

-: BP06408-66/28-A: Es una heparina de bajo peso molecular con actividad anti factor Xa minimizada, obtenida por fraccionamiento de Bemiparina por cromatografia de afinidad sobre ATlllA

Para obtener este derivado, se pasan 10 mg de Bemiparina, por la columna de afinidad descrita en la preparacion del producto anteriorA La columna se eluye a 4DC con una disolucion tampon pH 7A40 de 1mM Tris-HCl+ 0A25M NaCl, eluyendo la fraccion de baja afinidadA

Esta fraccion se purifica por una columna de Biogel P2, eluyendo con aguaA La disolucion que contiene el producto se liofiliza, obteniendose finalmente 3,6 mg de productoA

El producto obtenido presenta las siguientes caracteristicas: Peso molecular medio de 3611 Daltons y una actividad anti-factor Xa: 5,4 Ul/mgA

Los experimentos realizados han sido de forma general los siguientes: preparacion y cuantificacion e identificacion de fracciones de las muestras de glicosaminoglicanos mediante RMN y administracion en ratas wistar previamente diabetizadas y en ratones modificados geneticamente para valorar la cicatrizacion de dichas ulcerasA

Estudio de cuantificacion e identificacion de fracciones por rmn

Determinacion de las proporciones monosacariadicas de los productos

Los inventores de la presente invencion han analizado muestras comerciales y muestras de investigacion propia, para determinar las proporciones monosacaridicas de aquellos monosacaridos responsables de la cicatrizacion de la ulcera de pie diabetico asi como de las distintas fracciones sacaridicas presentes en el pentasacaridoA

El contenido promedio de monosacaridos en las muestras de glicosaminoglicanos (GAGs) se ha determinado mediante la tecnica de Resonancia Magnetica Nuclear (RMN), empleando experimentos bidimensionales 13C-1H HSQC (heteronuclear single quantum coherence) cuantitativos, segun el metodo descrito por Marco Guerrini et alA El incremento de resolucion que se consigue con la segunda dimension permite cuantificar senales que solapan en el espectro monodimensional, siendo esta tecnica de especial interes para estudiar carbohidratos complejos como los GAGsA Estas moleculas presentan graves problemas de solapamiento en los espectros monodimensionales de 1H que dificultan la determinacion de las areas de picos aislados en el 1D para su cuantificacionA

La cantidad de la unidad de acido-D-glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-glucosamina G-(ANS,3S) presente en GAGs obtenidos a partir de heparina natural, puede relacionarse directamente con la actividad anti-Xa de los mismos, tal y como describen MA Guerrini et alA Este disacarido pertenece al pentasacarido responsable de la interaccion con la antitrombina lll y solo se detecta en las secuencias activasA La senal de correlacion del carbono anomerico de este tipo de acido glucuronico con el hidrogeno directamente unido aparece en una region caracteristica y libre de solapamiento en el espectro HSQC y por ello puede emplearse para cuantificar la proporcion del pentasacarido en el GAGA

Los espectros 13C-1H HSQC de fondaparinux y de distintos GAGs se muestran en las Figuras 2A a 2L adjuntas, en las que la senal de correlacion 1H-13C del proton anomerico correspondiente a la unidad de acido glucuronico del pentasacarido se ha resaltado con un circuloA

La medida de la intensidad de esta senal en los espectros nos permite determinar la proporcion de pentasacaridoA Los resultados indican que el porcentaje del monosacarido G-(ANS,3S) en ningun caso supera el 3 % en los GAGs analizados, a diferencia del fondaparinux donde la proporcion es del 20 %A

Sin embargo, los GAGs estudiados presentan nuevas unidades monosacaridicas , como son los anillos de acido iduronico sin sulfatar (l) o glusaminas N-acetiladas (ANAc)A Asimismo, la proporcion de la unidad de acido iduronico sulfatado en 2 es mucho mayor que en el pentasacaridoA Por tanto, las muestras analizadas contienen mayoritariamente cadenas oligosacaridas distintas al fondaparinuxA

Fracciones: Fondaparinux Bemiparina RO14 H13 965 BEMl 99 2 BEMl99 4 BP06408 66/27A BP0640866/28A Enoxaparina Dalteparina Tinzaparina Heparina nofraccionada %

ANS: 40 44,4 35,3 39,6 -- 44,4 43,4 49,3 40,65 37,3 42,45 42,6 25-50

ANAc: 0 2,9 2,2 0,1 2,5 6,03 1,8 4,1 5,6 5,15 7,5 5,1 0-10

l2S: 20 30,7 28,3 23,1 26,9 0 34,6 22,6 26 37,7 30,2 38,4 0-50

l: 0 2,8 3,3 1,4 1,8 34,2 1,8 1,3 3,35 5,0 4,30 5,7 0-35

G: 205 ,7 5,7 6,8 5,7 9,26 6,2 8,6 8,4 7,25 7,9 7,0 3-25

ANS,3S: 20 2,4 3,1 3,0 0 0 < 0,1 0 2,2 2,3 1,0 2,2 <20

G-ANS,3S: 20 1,5 2,6 1,9 0 0 < 0,1 0 1,7 2,05 1,05 1,0 <20

Todos los datos de esta tabla estan expresados en %ANS : N-sulfo-D-Glucosamina ANAc: N-acetil-D-Glucosaminal2S: Acido L-lduronico 2-sulfatadol: Acido L-lduronico G:Acido D-Glucuronico ANS,3S: N-sulfo-3-sulfo-D-Glucosamina G-ANS,3S: Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-GlucosaminaA

Estudio en rata wistar por via parenteral

Ejemplo 1:

Diabetizacion de ratas wistar A

Para realizar el presente ejemplo se administraron dosis de estreptozocina (STZ) por via intramuscular de 45 mg/kg de estreptozocina para hacer diabeticas a un lote de 8 ratas (Andrades Ja et alA Engineering, expression, and renaturation of a collagen-targeted human bFGF fusion proteinA Growth FactorsA 2001;18(4):261-75)

Se emplearon ratas wistar macho con un peso medio de 250 g por rata a las que se les administro una dosis 11A25 mg STZ por rata mediante la administracion intramuscular de 100 IL en pata izquierda de cada rataA

A todas las ratas se les administro agua azucarada (350 mg/dL) durante tres dias y se realizaron mediciones de glucosa con un glucometro todos los dias para comprobar que las ratas efectivamente estaban diabetizadasA Por eso, antes de la administracion y a tiempo 4 dias tras la administracion de estreptozocina, se extrajo una gota sangre de la vena de la cola de la rata para la posterior cuantificacion de la glucemia y ver si eran diabeticas antes de comenzar el ensayo de ulceracionA

Tabla 1: Medida peso-glucemia ratas wistar

RATA: PESO (g) Glucemia Dia 0 (mg/dL) Glucemia dia 4 (mg/dL) Glucemia dia 9 (mg/dL)

1: 250 120 >350 >350

2: 245 129 >350 ----

3: 255 119 >350 ----

4: 250 135 >350 ----

5: 240 136 >350 ----

6: 260 171 >350 >350

7: 270 124 >350 ----

8: 245 133 >350 ----

Ulceracion de ratas wistar y medida del grado de cicatrizacion Para este ejemplo se escogieron 3 grupos con 8 ratas Wistar macho en total:

Grupo control:: 2 ratas

Grupo 1: Dosis alta de heparina (217 Ul): 3 ratas

Grupo 2: Dosis baja de heparina (108 Ul): 3 ratas

La seleccion de las ratas incluidas en cada grupo se realizo al azarA

Una vez diabetizadas las ratas, se les realizaron 4 ulceras de 1 cm de diametro cada una gracias a un bisturiA Se siguio un protocolo de anestesia/analgesia con Ketamina/xilacina siguiendo las recomendaciones del libro: "Handbook of laboratory animal management and welfare":

-: Anestesia: 10mg/kg xilacina + 90 mg/kg ketamina lP

-: Analgesia: 300 mg/kg paracetamol via oral (disuelto en el agua)

En el presente ejemplo, al dia siguiente de la ulceracion todas las ratas incluidas en el estudio excepto una del Grupo 1 y otra del Grupo 2 aparecieron muertasA La causa de la muerte no se debio a fenomenos de infeccion, sino que posiblemente fue debido al efecto de la anestesiaA Por tanto se continuo el experimento con dos ratas con cuatro ulceras cada rata una de dosis alta de Bemiparina y otra de dosis baja de Bemiparina, por lo que se continuo con el experimento para observar diferencias en la cicatrizacion y superficie ulcerada entre las distintas dosisA

Durante 9 dias tras la ulceracion se realizaron curas con agua y limpieza en las ulcerasA

Las administraciones de bemiparina se realizaron mediante una solucion de bemiparina por via subcutanea (100 IL) para el tratamiento de las ulcerasA

Se cuantifico el diametro de la ulcera mediante el calcado de la ulcera en transparencia para ver el progreso de la cicatrizacionA En la Tabla 2 se muestra el calculo de porcentaje de disminucion de area del dia 9 respecto al dia 1: Tabla 2

Rata 108 UI: Rata 217 UI

E 43A23% �: A 26A2 %

F 17A36 %: B 20A14 %

G 32A24 %: C 25A64 %

H 23A59 %: D 37A43 %

Media: 24A39�7A47: Media: 27A35�7A25

5 (ÉSe excluye de la media por cuantificacion erronea)

Progreso de la cicatrizacion

Cuantitativamente no se aprecia mucha diferencia en cuanto al area de las ulceras entre las dos ratasA Sin embargo, el proceso de cicatrizacion de la rata D=217 Ul es mucho mejor macroscopicamente ya que el cierre de la ulcera presentaba mayor calidad en la regeneracion del tejido dermico o de granulacion con menor contenido fibroso que la

10 rata D=108 Ul, por lo que se aprecia una mejora cualitativa en cuanto a la cicatrizacion y regeneracion del tejido ulcerado con la administracion D=217A

Ejemplo 2:

Diabetizacion de ratas wistar

Para realizar el presente ejemplo de realizacion se administraron dosis de estreptozocina (STZ) por via intramuscular

15 de 45 mg/kg de estreptozocina para hacer diabeticas a un lote de 8 ratas (Andrades Ja et alA Engineering, expression, and renaturation of a collagen-targeted human bFGF fusion proteinA Growth FactorsA 2001;18(4):261-75)A

Se emplearon ratas wistar macho con un peso medio de 250 mg por rata a las que se les administro una dosis 11A25 mg STZ por rata mediante la administracion intramuscular de 100 IL en pata izquierda de cada rataA

A todas las ratas se les administro agua azucarada (350 mg/dL) durante tres dias y se realizaron mediciones de

20 glucosa con un glucometro todos dias para comprobar que las ratas efectivamente estaban diabetizadasA Por eso, antes de la administracion y a tiempo 4 dias tras la administracion de estreptozocina, se extrajo una gota sangre de la vena de la cola de la rata para la posterior cuantificacion de la glucemia y ver si eran diabeticas para comenzar con el ensayo de ulceracionA

Tabla 3: Medida peso-glucemia ratas wistar

1: 240 128 >350
1

2: 240 132 >350
2

3: 250 121 >350
3

4: 260 138 >350
4

5: 250 142 >350
5

6: 245 136 >350
6

7: 265 129 >350
7

8: 245 141 >350
8

Grupo control Fondaparinux: 2 ratas

Grupo 1: Dosis alta de heparina (217 Ul): 2 ratas

Grupo 2: Dosis baja de heparina (108 Ul): 2 ratas

La seleccion de las ratas incluidas en cada grupo se realizo al azarA 5 Una vez diabetizadas las ratas, se les realizaron 2 ulceras de 1 cm de diametro cada una gracias a un bisturiA Se

siguio un protocolo de anestesia/analgesia con Ketamina/xilacina siguiendo las recomendaciones del libro: "Handbook of laboratory animal management and welfare": -Anestesia: 10mg/kg xilacina + 90 mg/kg ketamina lP -Analgesia: 300 mg/kg paracetamol via oral (disuelto en el agua)

10 Durante 9 dias tras la ulceracion se realizaron curas con agua y limpieza en las ulcerasA

Las administraciones de bemiparina y de fondaparinux se realizaron mediante una solucion de bemiparina por via subcutanea (100 IL) para el tratamiento de las ulcerasA Se cuantifico el diametro de la ulcera mediante el calcado de la ulcera en transparencia para ver el progreso de la

cicatrizacionA 15 En la Tabla 4 se muestra el calculo de porcentaje de disminucion de area del dia 9 respecto al dia 1: Tabla 4

Ratas 217 UI Lote 1: Ratas 108 UI Lote 2 Ratas Fondaparinux Lote 3

A 29,31 %: E 16,96 % H 17,00 %

B 31,85 %: F 13,26 % l 20,69 %

C 28,40 %: G 19,14 % J 21,32 %

D 24,89 %: H 19,71 % K 23,81 %

Media: 27A35�7A25: Media: 24A39�7A47 Media: 20,70�7A20

Las medias de los tres lotes de este ensayo se muestran en la Figura 3A

Progreso de la cicatrizacion

20 En este ensayo, ya se parecia una reduccion del area ulcerado entre el dia 0 al dia 9 (ver figura 3); ademas, igual que en el ejemplo 1, si se aprecia una diferencia cuantitativa de forma macroscopica respecto al tipo de cicatrizacion del tejido ulcerado: el proceso de cicatrizacion de la rata D=217 Ul es mucho mejor macroscopicamente que en el caso de fondaparinux, en el que la herida no presentaba apenas variacion el dia 9 respecto al dia 0A En el caso de la rata con D=217 el cierre de la ulcera presentaba mayor calidad en la regeneracion del tejido dermico o de

25 granulacion con menor contenido fibroso que la rata D=108 Ul, por lo que se aprecia una mejora cualitativa en cuanto a la cicatrizacion y regeneracion del tejido ulcerado con la administracion D=217 y la rata con fondaparinuxA

Ejemplo 3:

Diabetizacion de ratas wistar

Para realizar el presente ejemplo de realizacion se administraron dosis de estreptozocina (STZ) por via intramuscular 30 de 45 mg/kg de estreptozocina para hacer diabeticas a un lote de 10 ratas (Andrades Ja et alA Engineering, expression, and renaturation of a collagen-targeted human bFGF fusion proteinA Growth FactorsA 2001;18(4):261-75)

De todas las ratas a 6 se les indujo diabetes y 4 de ellas se dejaron como control no diabetico, para probar el resultado de la cicatrizacion de ulceras cronicas no originadas por diabetesA

A las ratas diabeticas se les administro agua azucarada (350 mg/dL) durante tres dias y se realizaron mediciones de glucosa con un glucometro todos dias para comprobar que las ratas efectivamente estaban diabetizadasA Por eso, antes de la administracion y a tiempo 4 dias tras la administracion de estreptozocina, se extrajo una gota sangre de la vena de la cola de la rata para la posterior cuantificacion de la glucemia y ver si eran diabeticas para comenzar con el ensayo de ulceracionA

Tabla 5: Medida peso-glucemia ratas wistar

RATA: PESO (g) Glucemia Dia 0 (mg/dL) Glucemia dia 4 (mg/dL)

1: 250 138 >350

2: 255 145 >350

3: 250 129 >350

4: 260 122 >350

5: 255 146 >350

6: 260 140 >350

RATAS NO DlABETlCAS

RATA: PESO (g) Glucemia Dia 0 (mg/dL) Glucemia dia 4 (mg/dL)

7: 245 135 141

8: 260 149 137

9: 245 152 129

10: 250 148 138

Ulceracion de ratas wistar y medida del grado de cicatrizacion Para este ejemplo se escogieron 5 grupos con 10 ratas Wistar macho en total:

Grupo control no diabetico: 2 ratas

Grupo control diabetico: 2 ratas

Grupo 1: Bemiparina no diabetico (217 Ul/rata): 2 ratas

Grupo 2: Bemi 99 2 diabetico (2A2 mg/rata): 2 ratas

Grupo 3: Fondaparinux diabetico (0A22 mg/rata): 2 ratas

La seleccion de las ratas incluidas en cada grupo se realizo al azarA 15 Una vez listas las ratas, se les realizaron 2 ulceras de 1 cm de diametro cada una gracias a un bisturiA Se siguio un

protocolo de anestesia/analgesia con Ketamina/xilacina siguiendo las recomendaciones del libro: "Handbook of laboratory animal management and welfare": -Anestesia: 10mg/kg xilacina + 90 mg/kg ketamina lP -Analgesia: 200 mg de ibuprofeno via oral (disuelto en 1L de agua)

20 En el presente ejemplo al dia siguiente de la ulceracion, una de las ratas diabeticas del grupo 3 aparecio muertaA La causa de la muerte no se debio a fenomenos de infeccion, sino que posiblemente fue debido al efecto de la

anestesiaA Por tanto se continuo el experimento con 8 ratas con dos ulceras cada rata de los grupos control diabetico, control no diabetico, grupo 1 y grupo 2 y con 1 rata con dos ulceras del grupo 3, por lo que se continuo con el experimento para observar diferencias en la cicatrizacion y superficie ulcerada entre las distintas dosisA

Durante 9 dias tras la ulceracion se realizaron curas y limpieza en las ulcerasA Se administro una solucion correspondiente a cada grupo por via SC (100 IL) para el tratamiento de las ulcerasA Se cuantifico el diametro de la ulcera mediante el calcado de la ulcera en transparencia para ver el progreso de la cicatrizacionA

En la Tabla 6 se muestra el calculo de porcentaje de cicatrizacion del dia 9 respecto al dia 1:

Tabla 6

Control no diabético: Grupo 1 Control Diabético Bemi 99_2 Fondaparinux

A 39,85%: A 75,05% A 56,70% A 51,98% A 50,99%

B 46,12%: B 69,83% B 57,24% B 37,08% B 49,55%

C 51,02%: C 72,56% C 47,41% C 68,21% --

D 43,74%: D 69,83% D 51,82% D 62,12% --

Media : 45,18%: Media : 71,82% Media : 53,29% Media : 54,85% Media : 50,22%

En este ensayo se ha realizado un estudio del porcentaje de cicatrizacion: como se puede observar, las ratas, en un proceso de estudio de 9 dias, tienen un porcentaje de cicatrizacion de un 50% aproximadamente, es decir que en 9 dias la herida se reduce a la mitadA Sin embargo, como se aprecia en los ejemplos anteriores, cuando se les administra una composicion de oligosacaridos con mayor procentaje de los monosacaridos:

a) N-sulfo-D-Glucosamina: 25-50%

b) Acido D-Glucuronico: 3-25%

en la que la proporcion de la unidad disacaridica Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-Glucosamina no es superior al 20%, se observa que la cicatrizacion aumenta a un 70 % aproximadamente, y aun mas si la dosis es superior (mayor cantidad en relacion con la totalidad de monosacaridos)A

En aquellas ratas no diabeticas, la cicatrizacion es similar a las ratas diabetizadasA Es decir, no se observa diferencia entre la cicatrizacion de los controles diabeticos y los no diabeticosA

Cuando se les administra fondaparinux, el porcentaje de cicatrizacion se mantiene igual, es decir no presenta mejoras frente a su control diabetico, por lo que se concluye que realmente este producto no favorece la cicatrizacion de las ulcerasA

Cuando se administra la heparina de bajo peso molecular alterada Bemi 99 2, la respuesta es practicamente igual que su control diabetico, por lo que se concluye que realmente este producto no favorece la cicatrizacion de las ulceras debido a que tiene alterados aquellos monosacaridos responsables de la cicatrizacion de las ulcerasA

En el caso de la administracion de Bemiparina no diabetico (217 Ul/rata), es decir, las ratas del Grupo 1, se observa que la cicatrizacion se reduce sustancialmente en un 71,82% frente a su control no diabetico, por lo que se concluye que en el caso de ulceras cronicas de pacientes no diabeticos (como las ulceras por presion) la administracion de una composicion de oligosacaridos con mayor procentaje de los monosacaridos:

a) N-sulfo-D-Glucosamina: 25-50%

b) Acido D-Glucuronico: 3-25%

en la que la proporcion de la unidad disacaridica Acido D-Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-Glucosamina no es superior al 20%, se observa que la cicatrizacion de un 70 % aproximadamenteA

Como conclusiones generales cualitativas de los estudios se resalta que el proceso de cicatrizacion de la s ratas del Grupo 1 es mucho mejor macroscopicamente ya que el cierre de la ulcera presentaba mayor calidad en la regeneracion del tejido dermico o de granulacion con menor contenido fibroso que en el resto de gruposA

Estudio en rata wistar por via oral

El objetivo de este estudio es evaluar la actividad cicatrizante de los productos de ensayo: fondaparinux sodico y

bemiparina tras su administracion por via oral en el modelo de heridas en rata diabeticaA

Ambos tratamientos se administraron por via oral a un volumen de administracion de 10 mL/kgA En el caso del fondaparinux se administro una dosis de 10 mg/kg y en el caso de bemiparina 100 mg/kgA

El grupo control recibio unicamente el vehiculo utilizado para preparar el producto de ensayoA El vehiculo para la preparacion del producto de ensayo es una solucion de bicarbonato al 1,5 % (p/v) en agua para inyeccionesA Se comprobo que el pH de las formulaciones preparadas estuviera por encima de 8,00A

Diabetizacion de ratas wistar

Al inicio del ensayo, se indujo una diabetes mellitus a todos los animalesA Para ello, recibieron una unica inyeccion intraperitoneal de estreptozotocina (60 mg/kg, 10 mL/kg)A 72 horas despues, se comprobo el establecimiento de la diabetes analizando los niveles de glucosa en sangreA Para ello, se anestesiaron los animales con isoflurano y se extrajeron 0A8 mL de sangre del seno retrorbicularA Los animales debian tener valores de glucosa superiores a los 15 mmol/LA Una semana despues de la induccion de la diabetes se procedio a la realizacion de la heridaA

Se anestesiaron los animales (Ketamina + Xilacina, 90 + 10 mg/kg, iAmA)A Se les rasuro y limpio el lomo con desinfectante (povidona yodada) y se marco la zona donde se realizaria la herida, mediante plantilla para homogeneizar su posicion en todos los animalesA

La herida se realizo mediante una incision circular de aproximadamente 1,5 cm de diametro, extirpandose la piel de la zona media dorsalA Se administro, por via iApA, 1 mL/animal de suero fisiologico despues de la intervencionA Durante los 7 dias posteriores a la intervencion se suministro analgesia (paracetamol, 1 mg/mL) en el agua de bebidaA

Al dia siguiente de la realizacion de la herida y durante un total de 14 dias, los animales se administraron con los tratamientos asignadosA Se realizo el seguimiento de los animales valorandose macroscopicamente la evolucion de las heridas 2 veces por semana, mediante fotografia digital de la heridaA Se registro tambien el peso corporal de los animales dos veces por semanaA

Al dia siguiente de la ultima administracion, se sacrificaron los animales con sobredosis anestesica (pentobarbital sodico)A Se procedio a extraer el area donde se realizo la heridaA La mitad anterior se congelo en nitrogeno liquido y se conservo en congelador (-80 � 5 DC) y la mitad posterior se conservo en formol para su posterior procesado histologicoA

Medida del grado de cicatrizacion

El area de las heridas se calculo como el porcentaje de reduccion de la misma para evaluar el grado de curacion de las mismas, mediante la formula estandarizada:

(Abasal -Atiempo )

x 100 (Abasal )

% curacion =

Se utilizo como area basal la medida realizada inmediatamente despues de la intervencion o incisionA

Ratas no diabetizadas

Al dia siguiente y durante un total de 14 dias, los animales se administraron con 10 mL/kg por via oralA

Para ello, previamente los animales se distribuyeron homogeneamente, segun el peso corporal, en los siguientes grupos de tratamiento, con al menos 5 animales por grupo:

Tratamiento Dosis

Control no diabetico: -

Rata tratada con fondaparinux sodico: 10 mg/kg

Rata tratada con bemiparina sodica: 100 mg/kg

Al dia siguiente de la realizacion de la herida y durante un total de 14 dias, los animales se administraron con los tratamientos asignadosA

Se realizaro el seguimiento de los animales valorandose macroscopicamente la evolucion de las heridas 2 veces por semana, mediante fotografia digital de la heridaA Se registro tambien el peso corporal de los animales dos veces por semanaA

Medida del area de la heridaA

Los valores correspondientes al area de la herida no fueron significativosA En este caso, las ratas tratadas con Bemiparina sodica redujeron el area de ulceracion mas o menos en igual medida que los animales testigoA

Evaluacion histopatologicaA

El dia 15 del estudio se sacrificaron los animales y la zona de la piel donde se produjo la herida se conservo en formol para realizar una evaluacion histopatologica (tincion hematoxilina-eosina)A

A cada corte se le dio una puntuacion histologica en el rango grado l a grado V, donde l significa herida sin curar y V herida completamente epitelizadaA La puntuacion se basa en el grado de invasion celular, la formacion tejido de granulacion, vascularizacion y epitelizacionA

Las puntuaciones histopatologicas obtenidas para los distintos grupos se muestran en la siguiente tabla:

Tratamiento: Puntuacion Grado

Control no diabetico: 10,0 lll

Animal diabetico tratado con fondaparinux sodico: 9,5 lll

Animal diabetico tratado con bemiparina sodica: 9,0 lll

Todas las muestras pertenecientes a los animales sacrificados a los 15 dias del inicio del tratamiento presentaban actividad cicatrizante evolucionada, con clara presencia de tejido de granulacion, neovascularizacion y reepitelizacion mas o menos completa de la ulceracion cutanea inducidaA

En este caso, todos los animales muestran un grado de cicatrizacion media mas o menos igual; sin embargo, en el grupo control y en el grupo tratado con fondaparinux, se observa que hay mucha variabilidad en los datos con los que se hace la mediaA En todo caso, los 5 animales del grupo tratado con bemiparina sodica obtuvieron un valor histologico de 9,0 con lo que se observa que el grado de cicatrizacion es sorprendentemente homogeneoA

Ademas, en el caso de los grupos tratado con bemiparina, se observa un proceso de costra mucho mas acusado que en los animales tratados con fondaparinuxA En este sentido cabe destacar que la formacion de costra es fundamental en el proceso de cicatrizacion de la herida, ya que cumple con el objetivo de limitar la perdida de agua transdermica y de actuar como barrera frente a bacterias y patogenos externos, impidiendo la infeccion de la heridaA

En este ejemplo, las ratas que han formado costra en dias anteriores muestran en el analisis histopatologico de la cicatriz que el patron de la dermis es mas cercano a la normalidad, comparado con las heridas de los animales en donde no se ha formado o la costra es menorA A pesar de que, tras su caida, el area de cicatrizacion es mayor y por lo tanto la medida no es concluyente frente a los animales que no han formado costraA Por tanto, la formacion de costra es un buen indicador del proceso natural de cicatrizacion, que en este caso particular solo se observa macroscopicamente en el grupo tratado con bemiparinaA

Estudio de la relacion de la actividad inhibitoria del factor Xa del glicosamiglicano y su poder cicatrizante por via oral en rata diabetica

Para ello, previamente los animales se distribuyeron homogeneamente, segun el peso corporal, en los siguientes grupos de tratamiento:

Tratamiento Dosis

Control diabetico -Rata tratada con fondaparinux sodico 10 mg/kg Rata tratada con bemiparina sodica 100 mg/kg

Se realizo el seguimiento de los animales, valorandose macroscopicamente la evolucion de las heridas 2 veces por semana mediante fotografia digital de la heridaA Se registro tambien el peso corporal de los animales dos veces por 5 semanaA

Medida del area de la heridaA

En la Figura 11 se muestra la evolucion de las ratas control diabetizadas respecto a las ratas diabetizadas tratadas con bemiparina sodica y fondaparinuxA En esta grafica se muestra como las ratas tratadas con bemiparina cicatrizan mucho mejor que las tratadas con forndaparinuxA En relacion con las areas de las ulceras, cuando comparamos

10 todos los productos se observa como los glicosaminoglicanos que tienen mayor proporcion de monosacaridos de la region regular tienen un efecto beneficioso en la cicatrizacion de las heridasA

Evaluacion histopatologicaA

15 A cada corte se le dio una puntuacion histologica en el rango grado l a grado V, donde l significa herida sin curar y V herida completamente epitelizadaA La puntuacion se basa en el grado de invasion celular, la formacion tejido de granulacion, vascularizacion y epitelizacionA

Grado Puntuacion Descripcion

Acumulacion celular de ninguna a minima, ausencia de tejido de granulacion

l 1-3

o desarrollo epitelialA

Tejido de granulacion fino e inmaduro dominado por celulas inflamatorias pero ll 4-6 con pocos fibroblastos, capilares o deposicion de colageno; migracion epitelial minimaA

Tejido de granulacion moderadamente gruesoA Puede variar de estar dominado por celulas inflamatorias a mayor presencia de fibroblastos y lll 7-9 deposicion de colagenos, neovascularizacion extensiva, migracion epitelial minima a moderadaA

Tejido de granulacion grueso y vascular dominado por fibroblastos y lV 10-12 deposicion extensiva de colageno, el epitelio cubre la herida parcial o totalmenteA

Area correspondiente a la herida totalmente epitelizado, sin presentar, mas o

V 13-15

menos, rastros de la heridaA

Tratamiento Puntuacion Grado

Control diabetico 10,0 lll Animal diabetico tratado con fondaparinux sodico 9,5 lll Animal diabetico tratado con bemiparina sodica 11,3 lV

Se observa un tejido de granulacion mas evolucionado, intensa neovascularizacion, con un mayor indice de 25 cicatrizacion en el grupo tratado con bemiparina sodica, aparte de una mayor homogeneidad en los resultados

obtenidos en todos los animalesA Los animales hiperglucemicos tratados con bemiparina sodica han mostrado unos indices de cicatrizacion incluso superiores a los del grupo Control normoglucemicoA

Estos resultados quedan apoyados por los hallazgos histologicos al obtenerse un mayor indice de cicatrizacion en los animales diabeticos tratados con bemiparina sodicaA

Estudio de ulcera del pie diabetico en raton diabetico con diabetes inducida geneticamente por via subcutanea

Ejemplo 4:

Ulceracion del raton diabetico C57BL/KS BKSACg-m +Leprdb /+Leprdb/J, medida del grado de cicatrizacion y evaluacion histopatologicaA

El raton diabetico C57BL/KsJ-db/db se ha empleado como modelo de diabetes tipo ll que presenta una cicatrizacion alterada, a diferencia del raton con diabetes inducida por estreptozotocina empleado en los ejemplos anteriores, que es un modelo de diabetes tipo l (Michaels, JA, et alA, db/db mice exhibit severe wound-healing impairments compared with other murine diabetic strains in a silicone-splinted excisional wound modelA Wound Repair Regen, 2007A 15(5): pA 665-70)A El raton geneticamente diabetico desarrolla resistencia a la insulina e hiperglucemia similares a las observadas en la diabetes del adultoA Las heridas de grosor total realizadas en el lomo de estos animales tardan mas tiempo en formar el tejido granulacion y en cerrarse que las mismas heridas producidas en animales no diabeticosA

El primer dia del ensayo se anestesiaron los animales (Ketamina + Xilacina, 100 + 10 mg/kg, iAmA)A Se rasuro el lomo del animal, se limpio la zona con desinfectante y se marco la situacion de la herida, mediante plantilla para igualar su posicion en todos los animalesA

La herida se realizo mediante una incision circular de aproximadamente 1A5 cm de diametro, extirpandose la piel de la zona media dorsalA Posteriormente se coloco un aposito semipermeable sobre la heridaA Se administro por via iApA 1 mL/animal de suero fisiologico despues de la intervencionA

Durante los 7 dias posteriores a la intervencion se administro analgesia (Paracetamol, 1 mg/mL) en el agua de bebidaA

El area de las heridas se calculo como el porcentaje de reduccion de la misma para evaluar el grado de curacion de las mimas, mediante la formula estandarizada:

(Abasal -Atiempo )

x 100 (Abasal )

% curacion =

Se utilizo como area basal la medida realizada inmediatamente despues de la intervencion o incisionA Al dia siguiente y durante un total de 14 dias, los animales se administraron con los tratamientos asignadosA

Estudio de la relacion de la actividad inhibitoria del factor Xa del glicosaminoglicano y su poder cicatrizante por via subcutaneaA

Al dia siguiente y durante un total de 14 dias, los animales se administraron con 10 mL/kg por via subcutanea en el lomo del animal, evitando la zona de la heridaA

Tratamiento: Dosis

Control diabetico: -

Animal diabetico tratado con fondaparinux sodico: 1 mg/kg

Animal diabetico tratado con bemiparina sodica: 1000 Ul Xa/kg

Animal diabetico tratado con heparina calcica: 600 Ul Xa/Kg

Animal diabetico tratado con BP06408-66/28-A: 10 mg/Kg

Animal diabetico tratado con RO-14: 1000 Ul Xa/Kg

Se realizo el seguimiento de los animales hasta un periodo de 21 dias (tiempo promedio necesario para la cicatrizacion de las heridas en este modelo animal)A La valoracion se realizo mediante fotografia digital de la herida y analisis posterior de la imagenA

Medida del area de la heridaA

En la Figura 4 se muestra la evolucion de los ratones control diabeticos respecto a los ratones tratados con bemiparina sodicaA El area de la herida se ha representado a la derecha de cada animalA

En la Figura 5 se muestra la evolucion del tanto por ciento de cicatrizacion de la herida con el tiempoA

Los animales diabeticos no tratados son los que presentan una velocidad de curacion mas lenta, ya que no alcanzan al 90% de cicatrizacion en el dia 21, seguidos por los animales tratados con fondaparinux que tampoco alcanzan la curacion completa, que llegan al 96% en el dia 21A Los animales tratados con bemiparina alcanzan la curacion completa a tiempo 21 dias y presentan valores de cicatrizacion del 98 % desde el dia 18A

Estos resultados indican que no existe una relacion entre la actividad anti-Xa (determinada por el presencia del pentasacarido responsable de la union a la antitrombina lll) de los glicosaminoglicanos empleados y su efecto beneficioso en la cicatrizacion, ya que la bemiparina sodica es el producto con menor contenido de pentasacarido en su estructura (solo un 1A5% del contenido de monosacaridos total corresponde al acido D-Glucuronico enlazado a Nsulfo-3-sulfo-D-Glucosamina caracteristico del pentasacarido) y sin embargo presenta tiempos de cicatrizacion menores que fondaparinux (pentasacarido puro, acido D- Glucuronico enlazado a N-sulfo-3-sulfo-D-Glucosamina representa el 20 % del contenido total de monosacaridos)A

En relacion con las areas de las ulceras, cuando comparamos todos los productos se observa como los glicosaminoglicanos que tienen mayor proporcion de monosacaridos de la region regular tienen un efecto beneficioso en la cicatrizacionn de las heridasA Este hecho se observa en la figura 5, donde se aprecia que la heparina no fraccionada asi como la bemiparina sodica favorecen la cicatrizacion, obteniendo un porcentaje por encima del 80% a partir del dia 11 de administracionA

Evaluacion macroscopicaA

En los datos extraidos se aprecian diferencias macroscopicas importantes entre los grupos Heparina calcica no fraccionada, RO-14 y Bemiparina apreciandose un comportamiento distinto a partir del quinto dia de observacionA De este modo se puede ver como el grupo tratado con Bemiparina muestra una diferencia clara en la calidad de la cicatriz a partir del quinto dia de tratamiento, observandose en la herida un lecho cubierto de tejido de granulacion, hecho que no ocurre en el grupo control, y parcialmente en el grupo tratado con fondaparinuxA

Este hecho diferencial marca la velocidad en el proceso y la calidad de la cicatrizacion (tal y como se observa en la Figura 5), ya que el tejido de granulacion es el responsable de la regeneracion del tejido celular y de la cicatrizacion, ademas de proteger al animal de las posibles infeccionesA

Ademas, en el grupo control se observa que no se produce tejido de granulacion (la base de la herida es clara y brillante), y en el grupo tratado con Fondaparinux solo se aprecia en los bordes de las heridasA Por lo que el cierre de las heridas de los ratones diabeticos control y los tratados con fondaparinux se produce por contraccion de los bordes de las heridas, siendo este proceso mas lento que el que se produce por la formacion de tejido de granulacionA Adicionalmente, la herida del grupo tratado con bemiparina se cierra el dia 18, mientras que en el grupo control la herida permanece abierta con el consiguiente riesgo de infecciones y de complicacionesA

Evaluacion histopatologicaA

El dia 21 del estudio se sacrificaron los animales y la zona de la piel donde se produjo la herida se conservo en formol para realizar una evaluacion histopatologica (tincion hematoxilina-eosina)A

Grado: Puntuacion Descripcion

l: 1-3 Acumulacion celular de ninguna a minima, ausencia de tejido de granulacion o desarrollo epitelialA

ll: 4-6 Tejido de granulacion fino e inmaduro dominado por celulas inflamatorias pero con pocos fibroblastos, capilares o deposicion de colageno; migracion epitelial minimaA

Grado lll lV: Puntuacion 7-9 10-12 Descripcion Tejido de granulacion moderadamente gruesoA Puede variar de estar dominado por celulas inflamatorias a mayor presencia de fibroblastos y deposicion de colagenos, neovascularizacion extensiva, migracion epitelial minima a moderadaA Tejido de granulacion grueso y vascular dominado por fibroblastos y deposicion extensiva de colageno, el epitelio cubre la herida parcial o totalmenteA

V: 13-15 Area correspondiente a la herida totalmente epitelizado, sin presentar, mas o menos, rastros de la heridaA

Las puntuaciones histopatologicas obtenidas para los distintos grupos se muestran en la Tabla 7A Tabla 7

Tratamiento: Puntuacion Grado

Control diabetico: 6A7 lll

Animal diabetico tratado con fondaparinux sodico: 7,2 lll

Animal diabetico tratado con bemiparina sodica: 11A5 lV

Animal diabetico tratado con heparina Ca: 8,0 lll

Animal diabetico tratado con BP06408-66/28-A: 9A0 lll

El estudio morfologico de las secciones correspondientes a las muestras cutaneas puso de manifiesto la evolucion normal de los procesos de reparacion cicatricial en todos los gruposA En los grupos tratados, el tejido de granulacion esta plenamente constituido obteniendo la mejor puntuacion la bemiparina sodica, ya que, en este caso, se llega a observar un estructura celular completamente nueva por restitucion ab integrum (ver Figura 6 panel C) en la que se observan los siguientes resultados:

A Reepitelizacion completaA Escaso infiltrado inflamatorio en dermisA Moderada presencia de fibroblastos en dermisA Neovascularizacion moderada, en dermisA

B Reepitelizacion completaA Moderado infiltrado inflamatorio, polimorfonucleares neutrofilos en dermisA Moderada presencia de fibroblastos en dermisA Neovacularizacion moderada en dermisA

C Estructura celular completamente regeneradaA

De los resultados obtenidos por determinacion del area de la herida y evaluacion histopatologica podemos concluir que el mejor de los productos ensayados es bemiparina porque es el que tiene un tiempo de cicatrizacion menor y una calidad del tejido mayorA Otro producto que parece funcionar bastante bien es el producto experimental BP06408-66/28-AA Por lo tanto, se demuestra nuevamente que una mayor actividad inhibitoria del factor Xa no se correlaciona con un mejor efecto en la cicatrizacionA

Estudio de la relacion de la actividad inhibitoria del factor Xa del glicosaminoglicano y su poder cicatrizante por via topicaA

En este caso se prepararon unas formulaciones topicas para administrar directamente sobre las ulceras cuyos vehiculos estan formados por Carbopol, Phenonip� , Span 80, Glicerol y aguaA

La ulceracion y medicion del area se realizo como se detalla en los ensayos de administracion subcutaneaA Al dia siguiente de la incision y durante un total de 14 dias, los animales se administraron con los tratamientos asignados, 0A15 ml/animal por via topica en el lomo del animal, encima de la heridaA

Tratamiento: Dosis

Control diabetico: -

Animal diabetico tratado con Bemiparina: 10000 Ul/kg

Animal diabetico tratado con Fondaparinux: 10000 Ul/kg

Animal diabetico tratado con Heparina calcica: 10000 Ul/kg

Se realizo el seguimiento de los animales hasta un periodo de 14 dias (tiempo promedio necesario para la cicatrizacion de las heridas en este modelo animal)A La valoracion se realizo mediante fotografia digital de la herida y analisis posterior de la imagenA La Figura 7 muestra los valores globales de la evolucion del porcentaje de reduccion de la herida de los grupos de tratamiento frente al grupo controlA Tal y como se observa en la grafica, la mejor de las heridas se observo con la bemiparina, obteniendose un valor de reduccion del area superior al 60% al finalizar el tratamientoA

Evaluacion macroscopica

Tal y como se observa macroscopicamente se aprecian diferencias importantes en todos los grupos (control, Bemiparina, Fondaparinux y heparina calcica no fraccionada (HNF)) distinguiendose un comportamiento distinto a partir del septimo dia de observacionA

Mientras que en el grupo control al septimo dia se observa que no se produce tejido de granulacion (la base de la herida es clara y brillante), se puede ver en contraposicion como los grupos tratados muestran una diferencia clara en la calidad de la cicatriz al mismo dia de tratamiento, observandose en la herida un lecho cubierto de tejido de granulacionA Este hecho diferencial marca la velocidad en el proceso y la calidad de la cicatrizacion, ya que el tejido de granulacion es el responsable de la regeneracion del tejido celular y de la cicatrizacion, ademas de proteger al animal de las posibles infecciones, al ser muy rico en fibroblastos, vasos capilares y colagenoA

Evaluacion histopatologica

Al dia siguiente de la ultima administracion (dia 15) se sacrificaron los animales y se extrajo el area donde se realizo la heridaA La porcion posterior de la zona que contenia la herida se conservo en formol para su procesado histologico (tincion de hematoxilina-eosina)A

Los resultados se basan en la puntuacion dada por el metodo de Greenhalgh et alA (1990)A A cada bloque se le dio una puntuacion histologica del 1 al 15 donde 1 significa herida sin curar y 15 herida completamente epitelizadaA La puntuacion se basa en el grado de invasion celular, la formacion de tejido de granulacion, vascularizacion y epitelizacion:

Las puntuaciones histopatologicas obtenidas para los distintos grupos se muestran en la tabla a continuacionA

Tratamiento: Puntuacion Grado

Control diabetico: 6A7 lll

Animal diabetico tratado con Bemiparina: 8A7 lll

Animal diabetico tratado con Fondaparinux: 8A6 lll

Animal diabetico tratado con HNF: 9A4 lV

En general los tres grupos tratados obtienen una mejor puntuacion histologica que el grupo control, al menos dos puntos por encima de esteA A pesar de que la cicatrizacion en todos los grupos (control y tratados) se caracteriza por la presencia de tejido de granulacion moderadamente grueso, la diferencia entre ellos esta en la mayor presencia de celulas inflamatorias, como ocurre en el caso del grupo control, frente a la mayor presencia de fibroblastos y deposicion de fibras de colageno, como es el caso de los grupos tratadosA Esto indica que en el caso del grupo control el proceso de cicatrizacion se encuentra en estadios mas tempranos, explicandose asi la velocidad de cicatrizacion mas lenta puesta de manifiesto en los estudios de reduccion del area de la heridaA Dentro de los tratamientos las muestras cutaneas pertenecientes a los grupos tratados con bemiparina y HNF presentan un indice de reparacion cicatricial algo mas evolucionada, con un tejido de granulacion mas evolucionado, mayor presencia de fibroblastos y neovascularizacion dermicaA

El grupo tratado con HNF se diferencia en puntuacion histologica encuadrandose dentro del grado lV, lo que indica una mayor calidad en la cicatrizacion con respecto a los demas gruposA El tejido de granulacion formado es mas grueso y esta dominado por fibroblastos, con deposicion extensiva de fibras de colagenoA El epitelio cubre la herida parcial o totalmenteA

De los resultados obtenidos tanto por determinacion del area de la herida como por evaluacion histopatologica podemos concluir que los mejores productos ensayados son la bemiparina y la HNFA La bemiparina presenta una velocidad de cicatrizacion mayor, mientras que en el caso de la HNF la cicatrizacion es mas lenta pero con mayor calidad en el tejido formadoA

Ejemplo 5:

Ulceracion del raton C57BL/KSACg-m Leprdb +/+ m, medida del grado de cicatrizacion y evaluacion histopatologicaA Estudio del efecto cicatrizante de una HNF y una HBPM en animales no diabeticosA Determinacion de la potencial aplicacion de las heparinas en el tratamiento de ulceras cronicas en pacientes no diabeticos, por via oral, subcutanea y topicaA

El raton C57BL/KSACg-m Leprdb +/+ m es el analogo no diabetico del raton empleado en el ejemplo anteriorA

(Abasal -Atiempo )

x 100 (Abasal )

% curacion =

Tratamiento: Dosis

Control no diabetico: -

Animal no diabetico tratado con bemiparina Na: 1000 Ul Xa/kg

Animal no diabetico tratado con heparina Ca: 600 Ul Xa/kg

Animal no diabetico tratado con BP06408-66/28-A: 10 mg/Kg

Se realizo el seguimiento de los animales hasta un periodo de 21 diasA La valoracion se realizo mediante fotografia digital de la herida y analisis posterior de la imagenA

En la Figura 8 se muestra la evolucion de los ratones control no diabeticos respecto a los ratones tratados con heparina calcicaA El area de la herida se ha representado a la derecha de cada animalA

En la Figura 9 se muestra la evolucion del tanto por ciento de cicatrizacion de la herida con el tiempoA

Los animales no diabeticos sin tratar alcanzan valores de reduccion de la herida superiores al 90 % a partir del dia 14A El tratamiento con bemiparina sodica no mejora la velocidad de cicatrizacionA Sin embargo, los animales tratados con heparina calcica si mejoran respecto al control, alcanzando el 90 % de cicatrizacion en el dia 11A

Evaluacion macroscopicaA

Los tres grupos de animales tienen un proceso de cicatrizacion normal, estando las heridas curadas en el dia 21A Sin embargo, parece que el grupo de ratones tratados con heparina calcica el proceso se ha acelerado ya que el dia 11 la herida esta seca y cerrada, y el dia 21 cubierta de peloA

Evaluacion histopatologicaA

Grado: Puntuacion Descripcion

lll: 7-9 Tejido de granulacion moderadamente gruesoA Puede variar de estar dominado por celulas inflamatorias a mayor presencia de fibroblastos y deposicion de colagenos, neovascularizacion extensiva, migracion epitelial minima a moderadaA

lV: 10-12 Tejido de granulacion grueso y vascular dominado por fibroblastos y deposicion extensiva de colageno, el epitelio cubre la herida parcial o totalmenteA

Las puntuaciones histopatologicas obtenidas para los distintos grupos se muestran en la Tabla 8A Tabla 8

Tratamiento: Puntuacion Grado

Control no diabetico: 11A7 lV

Animal no diabetico tratado con bemiparina Na: 8 lll

Animal no diabetico tratado con heparina calcica: 15 V

Animal no diabetico tratado con BP06408-66/28-A: 12A8 V

El estudio morfologico de las secciones correspondientes a las muestras cutaneas puso de manifiesto la evolucion normal de los procesos de reparacion cicatricial en todos los gruposA En todos los grupos tratados el tejido de granulacion esta plenamente constituido, obteniendo la mejor puntuacion en el tratamiento con heparina calcica, ya que, en este caso, se llega a observar una estructura celular completamente nueva por restitucion ab integrumA Por otro lado, para el caso de animales no diabeticos, la puntuacion obtenida con la muestra del producto de investigacion BP06408-66/28A que apenas tiene presencia del pentasacarido en su estructura es especialmente buena con una estructura celular completa y un grado de epitelizacion muy alto, lo que demuestra nuevamente que para el tratamiento de ulceras cronicas no es necesario una mayor actividad inhibitoria del factor Xa puesto que no se correlaciona con un mejor efecto en la cicatrizacionA

En la Figura 10 se muestran microfotografias de las secciones de las heridas tras la tincion con hematoxilina-eosina: A control no diabeticoA B animal no diabetico tratado con bemiparina sodica, C animal no diabetico tratado con 5 heparina calcicaA Los resultados obtenidos han sido los siguientes:

A Reepitelizacion completaA No se observan alteracionesA

B Reepitelizacion completaA Leve infiltrado inflamatorio, polimorfonucleares neutrofilos en dermisA Presencia de celulas gigantes multinucleadas en dermisA Moderada presencia de fibroblastos en dermisA Neovascularizacion moderada, en dermisA

10 C Estructura celular completamente regeneradaA

De los resultados obtenidos por determinacion del area de la herida y evaluacion histopatologica podemos concluir que el tratamiento con heparina calcica tiene un efecto beneficioso en la cicatrizacion de los animales no diabeticos, tiempo de cicatrizacion menor y estructura celular completamente regenerada, seguido de los resultados obtenidos con el producto en fase de investigacion BP06408-66/28-AA Por tanto, los glicosaminoglicanos objeto de la presente

15 invencion pueden utilizarse para tratar otras ulceras cronicas distintas de las del pie diabeticoA

Sin quedar vinculados por los ejemplos anteriormente descritos, gracias a los resultados obtenidos asi como al comportamiento observado en los animales, se cree que la presente invencion es muy probable que funcione para otros polisacaridos, ramificados o no, como podrian ser los pentosanos polisulfatados, betaglucanos, condroitin sulfatos, dermatan sulfatos, carragenanos, alginatos, arabinoxilanos, galactomananos y glucomananos, entre otrosA

Claims

REIVINDICACIONES

1A Composicion farmaceutica que comprende heparinas de bajo o muy bajo peso molecular para uso en el tratamiento de ulceras cronicas, caracterizada porque el tiempo de vida media plasmatica de la heparina esta entre 2,3 y 6,9 horas, y la dosis media diaria de la heparina esta entre 5A400 y 10A000 Ul/diaA

2A Composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 1, en la que la dosis media diaria se selecciona de una manera inversamente proporcional al tiempo de vida media plasmaticaA

3A Composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 2 anterior en la que, cuando el tiempo de vida media plasmatica de la heparina esta entre 6,5 y 6,9, la dosis media diaria es alrededor de 5A400 Ul/diaA

4A Composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 2 anterior en la que, cuando el tiempo de vida media plasmatica de la heparina esta entre 4,0 y 4,4, la dosis media diaria es alrededor de 7A600 Ul/diaA

5A Composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 2 anterior en la que, cuando el tiempo de vida media plasmatica de la heparina es alrededor de 3,0, la dosis media diaria es alrededor de 10A000 Ul/diaA

6A Composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 2 anterior en la que, cuando el tiempo de vida media plasmatica de la heparina esta entre 2,3 y 2,8, la dosis media diaria es alrededor de 10A000 Ul/diaA

7A Composicion farmaceutica para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 anteriores, en la que la ulcera cronica es una ulcera de pie diabeticoA

8A Composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la ulcera cronica es una ulcera de presionA

9A Composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 anteriores, en la que la heparina de bajo peso molecular se administra por via intravenosaA

10A Composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 anteriores, en la que la heparina de bajo peso molecular se administra por via subcutaneaA

11A Composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 anteriores, en la que la heparina de bajo peso molecular se administra por via oralA

12A Composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 anteriores, en la que la heparina de bajo peso molecular se administra por via topicaA

13A Uso de una composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 anteriores en la fabricacion de un producto medicinal para el tratamiento de ulceras cronicasA

14A El uso segun la reivindicacion 13, en el que la ulcera cronica es una ulcera de pie diabeticoA

15A El uso segun la reivindicacion 13, en el que la ulcera cronica es una ulcera de presionA