ES2471403T3 - Utilización de precursores de taquicininas y/o de sus fragmentos en diagnóstico m�dico - Google Patents

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Abstract

Utilización de protaquicinina según la SEC. ID. nº 10 para diagnósticos médicos, en la que se determina la presencia o concentración de la protaquicinina según la SEC. ID. nº 10 en una muestra de líquido corporal ex vivo y en la que la correlación de la protaquicinina según la SEC. ID. nº 10 con la sustancia P se utiliza para determinar el estado de la enfermedad/trastorno en los líquidos corporales.

Description

Utilizaci�n de precursores de taquicininas y/o de sus fragmentos en diagnóstico m�dico.
La presente invención se refiere a la utilización de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10.
Se puede utilizar la protaquicinina para diagnosticar una variedad de enfermedades que comprenden enfermedades/trastornos del sistema nervioso central, que comprenden la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, depresión y/o afecciones de dolor, enfermedades neurol�gicas, endocrinol�gicas, cerebrales, musculares, locales, generales, crónicas, inflamatorias, enfermedades infecciosas que comprenden las infecciones bacterianas y v�ricas, meningitis, septicemia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, anemia depranoc�tica, isquemia, esclerosis lateral amiotr�fica, artritis que comprende la artritis reumatoide, bronquitis, hiperalgesia, asma, la intoxicación que comprende la intoxicación bacteriana, trastornos inmunol�gicos, poli/traumatismo que comprende el traumatismo craneoencef�lico, tumores/cáncer, accidente cerebrovascular, estr�s, dermatitis at�pica, VIH, enfermedad de Huntington, quemaduras, fibromialgia, esquizofrenia, la enfermedad de Hirschsprung, alergias, disautonom�a familiar (síndrome de Riley Day), trastornos hematopoy�ticos, gliomas que comprenden los glioblastomas y los astrocitomas, los trastornos de la barrera hematoencef�lica.
La invención se refiere además a utilizaciones de anticuerpos producidos contra protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 y a utilizaciones de kits que implican a protaquicinina según la SEC. ID. n� 10.
Antecedentes de la invención
En 1931, Von Euler y Gaddum (Von Euler y Gaddum, 1931) aislaron el undecap�ptido sustancia P. Se denomin� sustancia P debido a su consistencia pulverulenta (Gaddum y Schild, 1934). La sustancia P (SP) est� codificada por el gen preprotaquicinina A (PPT-A), que también comprende las secuencias g�nicas de otras taquicininas como neurocinina A (NKA), neurop�ptido K (NPK) y neurop�ptido y (NPy) (Carter y Krause, 1990). La neurocinina B est� codificada por el gen TPP II o PPT-B. La sustancia P se expresa en el sistema nervioso central (SNC), as� como en el sistema nervioso periférico (SNP) (Otsuka y Yoshioka, 1993).
Las taquicininas presentan diversas funciones. Tienen propiedades vasodilatadoras, son responsables de la contracción y relajación de los músculos lisos en el aparato digestivo y genitourinario, as� como en los bronquios. Además, las taquicininas desempeñan una función importante en los reflejos de defensa provocados por lesiones o enfermedades dolorosas. Estos son, por ejemplo, el aumento de la tonicidad cardiovascular, la vasodilataci�n y activación de la biosíntesis de NO. La sustancia P tiene una influencia sobre diferentes células inflamatorias, sirve como neurotransmisor para transmitir el dolor y tiene función reguladora en la formación de sangre. Las taquicininas sin sustancia P Neurocinina A, Neurop�ptido y, as� como el Neurop�ptido K son propensas a desempeñar una función como reguladores de funciones endocrinas.
La concentración de sustancia P en los líquidos corporales se altera en varias enfermedades. En el plasma de pacientes de septicemia un aumento significativo de la concentración de sustancia P se muestra también en el plasma y el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Joyce, Yood y Carraway, 1993).
La sustancia P también parece desempeñar una función en las enfermedades inflamatorias intestinales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa.
La expresión de ARNm en la sustancia P aumenta significativamente en los macr�fagos infectados por el VIH, lo que indica un efecto de esta taquicinina en infecciones por el VIH.
En el líquido de los pacientes de Alzheimer (de aparición tardía) y los pacientes que padecen esclerosis lateral amiotr�fica se observa un aumento significativo de sustancia P.
En la enfermedad de Parkinson se observ� una reducción o un aumento de sustancia P en el globo pálido medio en función del grado de reducción de dopamina en el putamen.
Los pacientes que padecen corea de Huntington, una enfermedad neurodegenerativa genéticamente dependiente, presentaban una pérdida selectiva de neuronas que contienen preprotaquicinina en el cerebro.
En el suero de los pacientes con isquemia cerebral (inhibición temporal de la circulación sanguínea, as� como accidente cerebrovascular), se pudo determinar un aumento significativo en las concentraciones de la sustancia P.
Los pacientes con tumores carcinoides presentaban un aumento de la concentración de sustancia P y neuroquinina A en la circulación sanguínea, as� como un aumento significativo en la inmunorreactividad de los metabolitos similares a la taquicinina en la orina. La sustancia P y la neuroquinina A posiblemente desempeñan también una función en la jaqueca, otros trastornos por sustancias farmacéuticas, en el desarrollo de glioma y tienen una fuerte influencia en la secreción en los bronquios y en la circulación bronquial, lo que sugiere que podrían desempeñar una
posible función como mediadores en el asma.
En los fumadores que padecen bronquitis crónica podría presentarse un aumento de diez veces en la concentración de PPT-A-ARNm en las células epiteliales de los pulmones.
En la fibromialgia y la depresión aumenta la concentración de la sustancia P en el suero y el líquido, as� como aumenta en el suero de pacientes que padecen anemia depranoc�tica, especialmente en las fases dolorosas.
El aumento de las concentraciones de la sustancia P se mide en pacientes que padecen dermatitis at�pica lo que se correlaciona con la gravedad de la enfermedad.
Las taquicininas tales como la sustancia P y neuroquinina A, desempeñan además una función en la regulaci�n de las respuestas de citocinas proinflamatorias.
La biosíntesis de las taquicininas comienza como preprohormona. Durante la biosíntesis después de la separación de la secuencia N-terminal hidrófoba por la llamada peptidasa señal y el plegamiento de las proteínas en el lumen del retículo endopl�smico, los prop�ptidos migran en las vesículas del aparato de Golgi y son transportados a la membrana celular. Durante el transporte, los prop�ptidos se procesan a hormonas maduras por prohormonaconvertasas en secuencias de amino�cidos generalmente dib�sicos. Mediante diferentes estímulos los p�ptidos se segregan en el espacio extracelular o en el plasma. Los p�ptidos maduros se inactivan rápidamente después de la secreción por prote�lisis. La sustancia P y la neuroquinina A in vivo tienen una vida media sumamente baja inferior a 2 minutos en la sangre. El neurop�ptido K presenta una degradación bifásica con una vida media de 0,9 minutos (degradación a neurop�ptido y) y 6 minutos en el plasma (degradación adicional).
La taquicinina sustancia P, neuroquinina A, neurop�ptido K y neurop�ptido y est�n codificadas por el gen preprotaquicinina A (PPT-A). El corte y empalme alternativo del transcrito del gen PPT-A produce 4 moléculas diferentes de ARNm: aPPT-A, �PPT-A, yPPT-A y oPPT-A. Las cuatro moléculas de ARNm contienen la secuencia de la sustancia P. Sólo el ARNm �PPT-A contiene todos los 7 exones del gen PPTA y por lo tanto codifica las 4 taquicininas. El ex�n 6 no se encuentra en el mRNA aPPT-A y los exones 4 y 6 est�n desapareciendo en el mRNA oPPT-A. Por lo tanto, sólo estos dos tipos de ARNm codifican la secuencia completa de la sustancia P. El ex�n 4 ha desapareciendo en el ARNm yPPT-A, por lo tanto el neurop�ptido K puede no puede transcribirse a partir de este ARNm. La producción de la sustancia P por las 4 variantes de corte y empalme sugiere que cuando se expresa el gen PPT-A, también se produce la sustancia P. La expresión del ARNm aPPT-A se produce predominantemente en el cerebro, mientras que T moléculas de ARNm �PPT-A y yPPT-A se expresan predominantemente en el tejido periférico.
El fragmento 1-37 de PTK-A desempeña una función fundamental en esta invención y se denomina p�ptido-A en la presente memoria.
Descripci�n detallada de la invención
La sustancia P y otras taquicininas pueden detectarse en diferentes líquidos corporales, tejidos y otros biomateriales.
La corta vida media de taquicininas en la sangre, sin embargo, ha impedido hasta el momento la utilización de taquicininas, especialmente de la sustancia P, en el diagnóstico de rutina. Debido a la corta vida media de taquicininas, no es posible en la rutina clónica tomar muestras, obtener el plasma, transportar la muestra al laboratorio y hacer el diagnóstico en el laboratorio, incluyendo las pruebas necesarias antes que la degradación de taquicinina alcance un nivel crítico.
Por lo tanto debido a la baja estabilidad in vivo de las taquicininas como la sustancia P, la utilización como biomarcador est� sumamente limitada incluso bajo la logística de muestras optimizadas, ya que la influencia de la degradación de los p�ptidos diluye extraordinariamente la influencia de la biosíntesis y la liberación de taquicinina.
El objetivo de la invención consiste en superar la vida media desventajosa de las taquicininas y desarrollar un procedimiento, la utilización y un kit para la detección y determinación de taquicininas en los líquidos corporales.
Este objetivo se consigue por el sorprendente descubrimiento de que protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 se puede utilizar como una herramienta para la determinación de las taquicininas en los líquidos corporales, tejidos y otros biomateriales, en particular la sustancia P. Esta presencia de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 se correlaciona con la presencia de las taquicininas maduras como la sustancia P en los diferentes líquidos corporales.
Adem�s, la estabilidad de protaquicinina ex vivo es sorprendentemente alta y hace a las protaquicininas según la SEC. ID. n� 10 totalmente adecuadas para fines rutinarios.
Lo mismo se aplica para la vida media in vivo de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 que es significativamente
m�s alta que las de la sustancia P, neuroquinina A y neurop�ptido K, que las hace adecuadas para ser utilizadas en la detección de la concentración de sustancia P/protaquicinina de y de la velocidad de liberación.
Este enlace entre la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 de la presente invención y los p�ptidos maduros los hace adecuados como herramientas de diagnóstico para todas las enfermedades y/o trastornos, donde las proteínas maduras como sustancia P, neuroquinina A, neurop�ptido K y neurop�ptido y desempeñan una función.
La protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 por lo tanto se puede utilizar para el diagnóstico de una variedad de enfermedades que comprenden las enfermedades del sistema nervioso central, que comprenden la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la depresión y/o afecciones de dolor, locales, generales, crónicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades infecciosas que comprenden infecciones bacterianas y v�ricas, septicemia, la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, meningitis, la anemia depranoc�tica, la isquemia, esclerosis lateral amiotr�fica, la artritis, la artritis reumatoide, la bronquitis, la hiperalgesia, el asma, la intoxicación que comprende la intoxicación bacteriana, trastornos inmunol�gicos, traumatismo craneoencef�lico, tumores, accidente cerebrovascular, estr�s, dermatitis at�pica, VIH, la enfermedad de Huntington, quemaduras, fibromialgia, esquizofrenia, la enfermedad de Hirschsprung, alergias, disautonom�a familiar (síndrome de Riley Day), trastornos hematopoy�ticos, los gliomas que comprenden los glioblastomas y los astrocitomas.
Adem�s, la presente invención en una forma de realización se refiere a la utilización de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 para diagnóstico precoz, diagnóstico del grado de gravedad de la enfermedad, la lucha y pronóstico de la evolución de las enfermedades/trastornos anteriormente mencionados y/o que comprende estas enfermedades/trastornos en los que la proteína madura desempeña una función.
Los datos cl�nicos además pueden tenerse en cuenta para apoyar la determinación de la enfermedad/trastorno.
Tambi�n se da a conocer la producción de protaquicinina y sus fragmentos.
Los p�ptidos sintéticos según la presente invención se utilizaron para producir ant�genos y se inyectaron en animales para producir anticuerpos contra la protaquicinina. Pueden utilizarse diferentes procedimientos para conseguir este objetivo conocido por los expertos en la materia. En una forma de realización preferida se utilizó hemocianina de Limulus polyphemus para la inmunizaci�n de conejos.
En una forma de realización preferida de la invención 10 secuencias de amino�cidos (secuencias ID. 1-10) de protaquicininas se sintetizaron, cuatro secuencias de p�ptidos diferentes más preferidas (PSP1 a PSP4, véase la figura 4a) de protaquicinina se sintetizaron: Los p�ptidos PSP1 y PSP2 comprenden la secuencia para el p�ptido A. PSP3 contiene la primera parte de la secuencia de neurop�ptido K (NPK) activo y PSP4 comprende también partes de la secuencia de NPK as� como Neurop�ptido y (NPy) y la secuencia completa de neuroquinina A (NKA). Se a�adi� a cada p�ptido un resto de ciste�na aminoterminal. Los p�ptidos se conjugaron con una hemocianina de Limulus polyphemus y se produjeron anticuerpos contra PSP1 - PSP4 en conejos según procedimientos conocidos.
Se purificaron anticuerpos según procedimientos conocidos, en una forma de realización preferida de la invención, esto se consiguió preferentemente por cromatograf�a de afinidad específica del ligando acoplando los p�ptidos con el resto de ciste�na amino terminal a SulfoLink-Gel de Pierce (Boston, US) según los procedimientos de Pierce.
En una forma de realización preferida, se marcaron los anticuerpos con un marcador para permitir la detección. El marcador utilizado es preferentemente un marcador luminiscente y en una forma de realización aún más preferida, los anticuerpos contra PSP1 se marcaron con un marcador luminiscente.
La invención todavía en una forma de realización adicional conlleva la utilización de los anticuerpos generados para la detección de protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 en líquidos corporales, tejidos u otros biomateriales, as� como de un kit que contiene una determinada cantidad de dicho anticuerpo específico para detectar protaquicinina según la SEC. ID. n� 10.
Los procedimientos para la detección de la fijación del anticuerpo a la respectiva molécula son también conocidos por los expertos en la materia. En una forma de realización de la invención, la fijación del anticuerpo a la diana (que contiene protaquicinina según la SEC. ID. n� 10) se detecta por luminiscencia.
Una forma de realización preferida de la invención da a conocer la utilización de anticuerpos generados contra PSP1 a PSP4: Se utilizaron diferentes combinaciones de anticuerpos (Tabla 1) para la detección de protaquicinina en individuos de referencia, en pacientes con enfermedad de Alzheimer y en pacientes con septicemia en plasma y líquido. Los fragmentos de protaquicinina detectados por los anticuerpos se muestran en la Tabla 1.
La invención permite además la determinación de la presencia y la estabilidad de protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 en los líquidos corporales, tejidos y otros biomateriales y la diferencia en la concentración de protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 en referencias sanas y pacientes de varias enfermedades.
En una forma de realización, la invención se basa en la estabilidad a largo plazo descubierta de protaquicinina ex vivo en el plasma y la utiliza (figura 2). En el plasma la protaquicinina tiene sorprendentemente una vida media de más de 24 h. Cuantas menos peptidasas est�n presentes en el LCR, es de esperar que la protaquicinina sea incluso más estable en el LCR (líquido cefalorraqu�deo) que en el plasma.
Una forma de realización adicional de la invención da a conocer la vida media in vivo de PTK/p�ptido A que es sorprendentemente más de 60 minutos. (figura 3), en comparación con las vidas medias de la sustancia P (1-2 minutos), neuroquinina A (< 2 min.) y neurop�ptido K (6 min.).
Por lo tanto la protaquicinina es, con mucho, más adecuada para diagnóstico que las proteínas maduras como la sustancia P.
La invención utiliza además la correlación de protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 y taquicininas maduras, como la sustancia P para determinar el estado de la enfermedad/trastorno en los líquidos corporales, tejidos u otros biomateriales, sangre y líquidos corporales en particular.
En una forma de realización de la invención, se muestra el nivel de inmunorreactividad de protaquicinina con las tres combinaciones de anticuerpos de la tabla 1 de plasma de referencia, septicemia/plasma, la enfermedad de Alzheimer/plasma y líquido de individuos sanos de referencia (véase también el ejemplo 4). Un aumento en la concentración de protaquicinina en el plasma se observa en pacientes enfermos (combinación I de anticuerpos, columna negra) en comparación con el plasma de individuos sanos de referencia (figura 5). La combinación I de anticuerpos detecta el p�ptido A (fragmento 1-37) y p�ptidos que contienen p�ptido A, que est� presente en las cuatro variantes de corte y empalme (aPPT-A, PPT-A, yPPT-A y oPPT-A). La combinación II de anticuerpos detecta sólo variantes de corte y empalme aPPT-A y PPT-A y la combinación III solamente PPT-A y yPPT-A. Utilizando la combinación I de anticuerpos, la concentración de p�ptido A en el plasma de pacientes de septicemia y Alzheimer aumenta significativamente, 2 veces y 12 veces, respectivamente (véase la figura 5). Las combinaciones de anticuerpos II y III también presentan un aumento de 2,5 veces de la concentración de protaquicinina en el plasma de los pacientes de Alzheimer y aproximadamente un aumento de 2,8 veces en el plasma de pacientes de septicemia. En líquidos corporales de individuos sanos de referencia (columnas de la extrema derecha de la figura 5), la combinación I de anticuerpos presenta una señal, lasa combinaciones de anticuerpos II y III no presentan una señal significativa.
Estos resultados son coherentes con los de la sustancia P en pacientes con Alzheimer, septicemia, embolia cerebral, isquemia cerebral, infección, síntomas dolorosos, trastornos pulmonares y tumores.
La invención da a conocer la concentración de protaquicinina en líquidos corporales, tejidos y otros biomateriales de individuos sanos de referencia y personas enfermas.
En una forma de realización preferida, la invención da a conocer la distribución de las concentraciones de p�ptidos A en el plasma de individuos sanos (figura 7). El 90% presentan una inmunorreactividad inferior a 35 pg/ml, la mediana fue de 13,3 pg/ml.
La invención da a conocer además un cambio significativo de la concentración de protaquicinina en los líquidos corporales, tejidos y otros biomateriales en la enfermedad o trastorno, que comprende preferentemente las enfermedades del sistema nervioso central, que comprende la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la depresión y/o afecciones dolorosas, locales, generales, crónicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades infecciosas que comprenden infecciones bacterianas y v�ricas, meningitis, septicemia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, anemia depranoc�tica, isquemia, esclerosis lateral amiotr�fica, la artritis que comprende la artritis reumatoide, la bronquitis, la hiperalgesia, el asma, la intoxicación que comprende la intoxicación bacteriana, trastornos inmunol�gicos, poli/traumatismo que comprende el traumatismo craneoencef�lico, tumores, accidente cerebrovascular, estr�s, dermatitis at�pica, el VIH, la enfermedad de Huntington, quemaduras, fibromialgia, esquizofrenia, la enfermedad de Hirschsprung, alergias, disautonom�a familiar (síndrome de Riley Day), trastornos hematopoy�ticos, los gliomas que comprende los glioblastomas y los astrocitomas, los trastornos de la barrera hematoencef�lica.
Una forma de realización preferida de la invención se basa en el sorprendente descubrimiento de un aumento significativo del doble en la concentración de p�ptido A en pacientes de Alzheimer en comparación con los individuos sanos de referencia de la misma edad, como es consistente con los resultados de la sustancia P. La forma de realización correspondiente de la invención se encuentra en un procedimiento de diagnóstico y kit para analizar muestras corporales, en particular sangre, plasma o líquido corporal con un anticuerpo específico para protaquicinina, según la SEC. ID. n� 10 (p�ptido A).
Una forma de realización preferida adicional de la invención da a conocer un aumento significativo de p�ptido A que contiene inmunorreactividad en pacientes de neumonía, infección local (abscesos), septicemia, traumatismo y politraumatismos y diversos tumores (figura 10), intoxicación, la inflamación generalizada (figura 11) y el funcionamiento de la barrera hematoencef�lica (figura 9). El líquido corporal de individuos sanos contiene 150 a 450 ig de proteína por ml, 83% de las proteínas se sintetizan en el suero, y sólo 17% en el cerebro. La prostaglandinaD-sintetasa muestra el cociente más alto líquido corporal a suero de 33 determinado hasta ahora. Una forma de realización preferida sorprendentemente demuestra que la inmunorreactividad del p�ptido A tiene un cociente de suero a líquido corporal de más de 80 y por lo tanto sorprendentemente es significativamente más alto que de otras
5 proteínas. A medida que la concentración de p�ptido A es mayor en el líquido corporal que en el plasma, un aumento de p�ptido A en el plasma indica el daño o la pérdida de la función de la barrera hematoencef�lica: el líquido corporal se difunde en plasma lo que conduce a un aumento en la concentración de protaquicinina en el plasma. La determinación de p�ptido A o de inmunorreactividad de p�ptido A es por lo tanto un marcador de plasma potente para el funcionamiento de la barrera hematoencef�lica.
10 Por lo tanto la invención también proporciona un procedimiento de diagnóstico y un kit para las enfermedades/trastornos mencionados anteriormente, ambos teniendo o utilizando un anticuerpo para protaquicinina según la SEC. ID. n� 10.
15 La invención da a conocer la utilización de protaquicinina según la SEC ID n� 10 y/o de sus anticuerpos para la detección, la lucha y el pronóstico de la evolución de la enfermedad.
Una forma de realización preferida de la invención determina la concentración de p�ptido A en la sangre durante la evolución de enfermedades como la meningitis, traumatismo craneoencef�lico y apoplejía (hasta convalecencia o
20 fallecimiento) en la figura 9. En un estado enfermado los pacientes presentan un aumento significativo de concentración de p�ptido A (superior a 35 pg/ml), que disminuye durante la convalecencia, pero se mantiene en constante aumento significativo hasta el fallecimiento del paciente que padece una embolia cerebral.
Descripci�n de las figuras
25 Figura 1 presenta la biosíntesis de neurop�ptidos in vivo.
Figura 2 presenta la estabilidad de fragmentos de protaquicinina ex vivo (EDTA-plasma). La vida media de protaquicinina a temperatura ambiente es superior a 24 h. 30 Figura 3 presenta la determinación de fragmentos de protaquicinina in vivo después de la aplicación de endotoxina. La vida media de PTK/p�ptido A es superior a 60 minutos in vivo.
Figura 4 presenta las variantes de corte y empalme de a-PPT-A (AS 1-92, Secuencia ID 1).
35 Figura 4b presenta las variantes de corte y empalme de -PPT-A (AS 1-110, Secuencia ID 2).
Figura 4c presenta las variantes de corte y empalme de y-PPT-A (AS 1-95, Secuencia ID 5).
40 Figura 4d presenta las variantes de corte y empalme de o-PPT-A (AS 1-77, Secuencia ID 8).
Figura 5 presenta reactividad inmunol�gica de combinaciones de anticuerpos I-III en el plasma de individuos sanos de referencia, pacientes de septicemia, Alzheimer y el líquido corporal de las referencias sanas.
45 Figura 6 presenta la curva patrón de luminiscencia (unidades relativas de luminiscencia) en función de las concentraciones de p�ptido A (pg/ml).
Figura 7 presenta la curva de distribución de las concentraciones de p�ptido A en el plasma de individuos 50 sanos de referencia (pg/ml).
Figura 8 presenta la concentración de p�ptido A en el plasma de pacientes con la enfermedad de Alzheimer y las referencias de la misma edad sin demencia.
55 Figura 9 presenta la evolución de los pacientes con trastornos cerebrales, que presentan la concentración de p�ptido A en la embolia cerebral (convalecencia y fallecimiento), la meningitis y el traumatismo craneoencef�lico durante la evolución de la enfermedad desde la admisión al hospital hasta 14 días o fallecimiento.
60 Figura 10 presenta las concentraciones de p�ptido A en diferentes enfermedades: neumonía, infección local (absceso), septicemia, cardiopat�a coronaria, traumatismo y politraumatismo o diversos tumores.
Figura 11 presenta la simulación de la inflamación generalizada. Las concentraciones de p�ptido A, FNT-alfa, IL-6 y PCT después de la aplicación de endotoxina. 65
Ejemplo 1
Producci�n de Anticuerpos
(a)
Inmun�geno
Jerini (Berlín, Alemania) seleccion� y sintetizó cuatro secuencias de p�ptidos diferentes (PSP1 a PSP4), véase la figura 1) de protaquicinina A. Los p�ptidos PSP 1 y 2 comprenden la secuencia del p�ptido A. PSP3 comprende la primera parte de la primera secuencia de los neurop�ptidos K (NPK) activos y PSP4 también presenta partes de la secuencia de NPK, as� como de neurop�ptido y (NPy) y la secuencia completa de la neuroquinina A (NKA). Cada p�ptido se proporcion� con un resto de ciste�na aminoterminal (Cys0).
(b)
Anticuerpos
Para la inmunizaci�n el p�ptido respectivo se conjugó con la hemocianina de Limulus polyphemus por BioGenes (Berlín, Alemania). Se produjeron anticuerpos contra el p�ptido PTK-conjugado-PSP1 a PSP4 en conejos.
Ejemplo 2
Purificaci�n de los anticuerpos
Los anticuerpos se purificaron mediante una purificación por afinidad específica de ligandos. Para esta etapa se enlazaron los Cys (0)-p�ptidos PSP1 a PSP4 a Gel SulfoLink suministrado por Pierce (Boston, EE.UU.). El enlace se efectu� según el protocolo del proveedor.
En resumen, las columnas de policarbonato (15 mm x 80 mm) se rellenaron con 5 ml de matriz de afinidad. Después del equilibrado de las columnas con PBS (solución salina tamponada con fosfato) (NaCl 136 mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO4�2H2O 20,4 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,2) se disolvieron 5 mg del p�ptido respectivo en PBS aplicado a las columnas cerradas y el material de gel se homogeneiz� mediante rotación suave. Después de 15 min de incubaci�n a temperatura ambiente y la sedimentación del material de gel, las columnas se lavaron 5 veces con 3 ml de PBS. Para saturar posiciones de enlace libres se añadieron 5 ml de una solución de L-ciste�na 50 mM al material de la columna y el material de gel después de la homogeneización se incub� de nuevo durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la sedimentación del material de gel se lav� cada columna 6 veces con 5 ml de una solución de NaCl 1 M seguido de un lavado con PBS.
El material de gel se mezcl� con 25 ml de los respectivos grupos de antisuero y se incub� durante la noche a temperatura ambiente por rotación suave. La mezcla suero-gel se añade a las columnas de policarbonato y se separ� el suero sobrante. Las columnas se lavaron entonces con 250 ml de PBS para eliminar las proteínas de suero no unidas. La desorci�n de los anticuerpos no unidos se llev� a cabo por eluci�n de la columna con ácido cítrico 50 mM (pH 2,2). El eluido se recogió en fracciones de 1 ml. La concentración de proteína de cada fracción se determin� utilizando el kit de análisis de proteínas BCA de Perbio (Bonn, Alemania) y se combinaron las fracciones con un contenido de proteína > 1 mg/ml. Los anticuerpos purificados por afinidad se volvieron a tamponar en PBS por di�lisis. El contenido de proteína se determin� de nuevo y los anticuerpos se almacenaron a 4�C.
Ejemplo 3
Inmovilizaci�n / marcado de los anticuerpos
Los anticuerpos purificados contra los p�ptidos PSP2, 3 y 4 se inmovilizaron en tubos de poliestireno (startubes, 12 mm x 75 mm, Greiner, Alemania). Para este procedimiento las soluciones de anticuerpos se diluyeron a una concentración en proteínas de 6,7 ig/ml con PBS y se pipetearon 300 il por tubo (corresponde a 2 mig de anticuerpo por tubo). Estos se incubaron durante 20 horas a temperatura ambiente y después se lavaron 3 veces con 4 ml de PBS, respectivamente. Los tubos se almacenaron a 4�C hasta nuevo uso. El anticuerpo contra PSP1 (1mg/ml en PBS) se marcó con el marcador luminiscente Acridiniumester-N-hidroxi-succinimida (1 mg/ml en acetonitrilo, In Vent, Hennigsdorf, Alemania). Para el procedimiento de marcado se mezclaron 200 il de anticuerpo con 4 il de éster de acridinio, se incub� durante 20 minutos y los enlaces de éster de acridinio libre se saturaron mediante la adición de 40 il de una solución de glicina 50 mM. El preparado del marcado se separ� de éster de acridinio libre por HPLC en una columna de filtración en gel BioSil 400 (BioRad, Munich, Alemania). Se utilizó PBS como disolvente.
Ejemplo 4
Determinaci�n de la inmunorreactividad de protaquicinina
La inmunorreactividad de la protaquicinina se determin� en plasma utilizando tres combinaciones diferentes de
anticuerpos de 5 referencias de cada uno, pacientes de septicemia y Alzheimer, as� como en el líquido corporal de 5 pacientes de referencia sin demencia. Se pipetearon muestras de 100 il por tubo recubierto y se añadieron a cada tubo 12,5 ng de los anticuerpos marcados (en 200 il de tampón de PBS, EDTA 10 mM). Los tubos se incubaron a 4�C durante 20 horas. Posteriormente, anticuerpo tr azador no unido se retir� lavando 5 veces con 1 ml de PBS cada una. El anticuerpo unido al tubo se cuantific� detectando la luminiscencia en un lumin�metro (Berthold LB 952T/16).
Los fragmentos de PTK detectados por las diferentes combinaciones de anticuerpos (figura 4a) se muestran en la tabla a continuación y en la figura 4b. Las inmunorreactividades relativas medidas con 3 combinaciones de anticuerpos se muestran en la figura 5. La combinación I de anticuerpos que detecta el p�ptido A (fragmento 1-37) que est� comprendida en las 4 variantes de corte y empalme (aPPT-A, PPT-A, yPPT-A y oPPT-A). La combinación II de anticuerpos detecta solamente variantes aPPT-A y PPT-A de corte y empalme y la combinación III solamente
PPT-A y yPPT-A.
En el plasma de las referencias, podrían detectarse las secuencias de protaquicinina de pacientes de septicemia y Alzheimer que comprenden las tres combinaciones de anticuerpos. Se calibr� al 100% el valor medio de los datos de referencia para la detección de a//y/o la combinación I de anticuerpos para una mejor comparación entre los resultados y los valores medios de los datos restantes se refirieron a éste (véase la tabla 1). Se demuestra que el p�ptido A y los fragmentos PTK que comprenden todas las secuencias presentan, con mucho, la mayor concentración en el líquido corporal y presentan una señal 30 veces mayor que en el plasma de las referencias sanas. La inmunorreactividad del p�ptido A aument� claramente también en el plasma de pacientes de septicemia. En la presente memoria, la señal es aproximadamente 12 veces mayor que en el plasma de los individuos de referencia. Los pacientes de Alzheimer presentan un aumento de la señal por el factor 2.
Las variantes de corte y empalme a/ y a/y en combinación con las combinaciones II y III de anticuerpos no muestran una señal detectable en líquido corporal. Esto indica que la PTK est� presente como la proteína totalmente procesada. En el plasma, sin embargo, pudieron detectarse variantes de corte y empalme a/ y a/y con las combinaciones II y III, éstas, sin embargo, se ejecutaron a continuación de las señales para a//y/o (combinación I de anticuerpos).
La detección de fragmentos de PTK por la combinación I de anticuerpos que presentan un cociente de 11,6 y 2,0 en las muestras de septicemia y Alzheimer, respectivamente, con relación a las muestras de referencia. El cociente de las muestras de septicemia de las combinaciones de anticuerpos II y III es considerablemente inferior a 11,6 de la combinación I de anticuerpos. Por lo tanto, esta combinación es un método mejor para la diferenciación de las referencias sanas, por lo menos para los pacientes de septicemia. (La elección de combinaciones de anticuerpos no parece ser relevante para la diferenciación de referencias y pacientes de Alzheimer, como el cociente de las muestras de Alzheimer en combinación con todas las tres combinaciones de anticuerpos est� en el intervalo de 2.)
Tabla 1: Medición de la inmunorreactividad relativa de fragmentos de PTK en combinación con diferentes combinaciones de anticuerpos
Combinaci�n de anticuerpos
I (PSP2/PSP1) II (PSP3/PSP1) III (PSP4/PSP1)
Variantes de corte y empalme detectadas
a/ /y/o a/ /y
Fragmentos de PTK detectables
AS 1-37 (a/ /y/o) AS 1-92 (a) AS 1-89 ( )
AS 1-50 (a/ /y/o)
AS 1-76 ( ) AS 1-110 ( )
AS 1-92 (a)
AS 1-89 ( ) AS 1-74 (y)
AS 1-76 ( )
AS 1-110 ( ) AS 1-95 (y)
AS 1-89 ( )
AS 1-110 ( )
AS 1-61 (y)
AS 1-74 (y)
AS 1-95 (y)
AS 1-77 (o)
Muestra
IR rel. cociente IR rel. cociente IR rel. cociente
Muestra de referencia
100 1,0 45,6 1,0 36,4 1,0
Plasma de septicemia
1160 11,6 114 2,5 101 2,8
Plasma de enfermedad de Alzheimer
200 2,0 85,5 1,8 67 1,8
L�quido corporal
3096 30,96 6 0,1 5,5 0,15
IR rel. inmunorreactividad relativa (valores en % en respuesta al valor de plasma de referencia de combinación I de anticuerpos que se calibr� al 100%). Todos los valores son valores medios (n = 5).
Cociente relación entre el valor respectivo del paciente (en %) y el valor de referencia correspondiente (en %) de la combinación de anticuerpo respectivo
Ejemplo 5
Inmunoan�lisis para la determinación cuantitativa de p�ptido A
1.
Componentes
En el inmunoan�lisis se utilizaron tubos recubiertos con anticuerpo PSP2 y anticuerpo PSP1 marcados con un marcador luminiscente. La producción de estos componentes se describe en el ejemplo 3.
2.
Procedimiento
Se pipetearon 100 il de muestra en cada tubo recubierto con anticuerpo y se añadieron 12,5 ng del anticuerpo marcado (en 200 il de tampón PBS, EDTA 10 mM). Los tubos se incubaron durante 20 horas a 4�C y, posteriormente, se retir� el anticuerpo trazador lavando 5 veces con 1 ml de PBS. El anticuerpo marcado unido al tubo se cuantific� midiendo la luminiscencia en un lumin�metro (Berthold LB 952T/16).
3.
Calibraci�n
Para poder determinar las concentraciones y las inmunorreactividades, de p�ptido A, Jerini (Berlín, Alemania) sintetizó el p�ptido. El p�ptido pesado se utilizó como calibrador para el inmunoan�lisis. En la figura 6 se muestra el gráfico patrón del p�ptido A. La sensibilidad analítica de los análisis del p�ptido A es de aproximadamente 4 pg/ml.
Ejemplo 6
Concentraciones de p�ptido A en el plasma de individuos supuestamente sanos (referencias)
En la figura 7 se muestra el gráfico de distribución de la concentración de p�ptido A en el plasma de individuos sanos. El 90% de las 100 muestras de referencia presentan una inmunorreactividad del p�ptido A inferior a 35 pg/ml. La mediana fue de 13,3 pg/ml.
Ejemplo 7
Contenido de p�ptido en la enfermedad de Alzheimer
La inmunorreactividad del p�ptido A en el plasma de los pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer y referencias de la misma edad sin demencia difieren significativamente (figura 8). La mediana de las referencias en este caso es 18,0 pg/ml, la mediana de los pacientes de Alzheimer aumenta el doble, es decir, es 39,0 pg/ml.
Ejemplo 8
Concentraciones de p�ptido A en el líquido cefalorraqu�deo (LCR)
Se determin� la concentración de p�ptido A en el líquido corporal de muestras de referencia (n = 30) y se determin� una mediana de 1085 pg/ml. La mediana de LCR se ha incrementado significativamente por un factor de aproximadamente 80 superior a la mediana del plasma de individuos sanos de referencia.
Ejemplo 9
Concentraci�n de p�ptido A en disfunciones de la barrera hematoencef�lica
Se determin� el contenido p�ptido A en la circulación en la evolución de la enfermedad de pacientes que padecen trastornos cerebrales como la meningitis, traumatismo craneoencef�lico, as� como embolia cerebral (incluyendo la recuperación o el fallecimiento) (figura 9). Se demostr� que la concentración de p�ptido A era muy alta (superior a la concentración normal de aproximadamente 35 pg/ml) en la admisión de los pacientes al hospital. Los pacientes convalecientes que tienen meningitis, apoplejía o traumatismo craneoencef�lico, presentaban una disminución constante de la concentración de p�ptido A por debajo del nivel normal. Una embolia cerebral con la consiguiente muerte presenta aumento significativo de las concentraciones de p�ptido A durante el ciclo completo. La concentración de p�ptido A no disminuye a un nivel normal hasta fallecimiento.
Consecuencia: La determinación de la concentración de p�ptido A puede utilizarse como un marcador de plasma para el funcionamiento de la barrera hematoencef�lica. Ya que la concentración de p�ptido A en líquido corporal es de aproximadamente 80 veces mayor, en comparación con la circulación, la transferencia de proteínas del líquido corporal en la sangre por la medición de p�ptido A en el plasma es una señal para una presente distorsión de la función de la barrera hematoencef�lica. La evolución de la concentración de p�ptido A permite una publicación significativa acerca de la enfermedad del paciente y un pronóstico sobre la evolución de la enfermedad.
Ejemplo 10
Determinaci�n de la concentración de p�ptido A en la circulación de pacientes que padecen neumonía, infecciones locales, septicemia, enfermedades coronarias del corazón, traumatismo o politraumatismo y diferentes tumores
5 Los pacientes que padecen enfermedades inflamatorias, como la neumonía, infecciones locales (abscesos), as� como septicemia, presentaban en partes valores significativamente más altos (> 35 pg/ml) en el 80%, 100% y 72%, respectivamente, de los casos (figura 10). A diferencia de estos resultados sólo 3 de 16 pacientes que padecen cardiopat�as coronarias tenían un valor más alto que en las referencias. Los pacientes que padecen de traumatismo
10 y politraumatismo, as� como los pacientes que padecen diferentes enfermedades tumorales presentaban un aumento de la concentración p�ptido A en 50% de los casos en comparación con los individuos de referencia.
Ejemplo 11
15 P�ptido A y simulación de inflamación generalizada
El patrón de endotoxina 0113:H10:k de E. coli se inyect� por vía intravenosa en personas voluntarias para el ensayo a una concentración de 4 ng/kg de peso corporal. Se tomaron muestras de sangre en diferentes momentos (protocolo según DANDONA et al., 1994). La determinación de diferentes parámetros de inflamaciones (IL-6, FNTa, 20 PCT), as� como el p�ptido A en las personas del ensayo tratadas con endotoxina, presentaba una evolución en función del tiempo de las concentraciones de las sustancias en la sangre (véase la figura 11). En primer lugar, un aumento del FNT después de aproximadamente 1 hora después de la inyección de la endotoxina se produce como se esperaba. Poco después un aumento de citotoxinas IL-6 sigue (alrededor de 1,5 horas después de la inyección de la endotoxina). Después de 3 horas las concentraciones de FNTa e IL-6 est�n disminuyendo, mientras que ahora,
25 sorprendentemente, se produce un aumento de la concentración de p�ptido A, que alcanza el nivel de partida después de sólo alrededor de 7 horas. PCT presenta un aumento de la concentración después de 5 horas y aumenta constantemente durante el ciclo posterior. Por lo tanto la secreción de p�ptido A es inducible por única inyección de endotoxina y es un episodio en la cascada inmunitaria entre FNTa/IL-6 y PCT.
30 Bibliografía
DANDONA P., NIX D., WILSON M. V., ALJADA A., LOVE J., ASSICOT M., BOHUON C., (1994), Procalcitonon increase after endotoxin injection in normal subjects. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 79: 16051608.
Listado de secuencias
<110> SPHINGOTEC GMBH
40 <120> UTILIZACIÓN DE PRECURSORES DE TAQUICININAS Y/O DE SUS FRAGMENTOS EN DIAGNÓSTICO M�DICO
<130> 5012PCT
45 <140> PCT/EP2005/004254
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<150> EP04009284.3
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<160> 14
<170> PatentIn versión 3.2
55 <210> 1
<211> 92
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
60 <220>
<223> VARSPLIC
<400> 1 <210> 2
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VARSPLIC 10
<400> 2
<210> 3
<211> 89
<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> P�PTIDO
25 <400> 3 <210> 4
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> P�PTIDO 10
<400> 4
15 <210> 5
<211> 95
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> VARSPLIC
<400> 5
<210> 6
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> P�PTIDO 10
<400> 6
<210> 7
<211> 61
<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> P�PTIDO
25 <400> 7 <210> 8
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> VARSPLIC 10
<400> 8
<210> 9
<211> 50
<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> P�PTIDO
25 <400> 9
<210> 10 30 <211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> P�PTIDO
<400> 10
<210> 11
<211> 19 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> P�PTIDO 15
<400> 11
20 <210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> P�PTIDO
<400> 12
<210> 13
<211> 14
<212> PRT 35 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> P�PTIDO
40 <400> 13
<210> 14 45 <211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 50 <223> P�PTIDO
<400> 14

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Utilizaci�n de protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 para diagnósticos m�dicos, en la que se determina la presencia o concentración de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 en una muestra de líquido corporal ex vivo y en la que la correlación de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 con la sustancia P se utiliza para determinar el estado de la enfermedad/trastorno en los líquidos corporales.
  2. 2.
    Utilizaci�n según la reivindicación 1 en combinación con un marcador, que es adecuado para detectar la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 mencionada en la reivindicación 1 o un compuesto que se une específicamente a la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10.
  3. 3.
    Utilizaci�n según la reivindicación 1 que comprende determinar la concentración de protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 mencionada en la reivindicación 1 en una muestra de un líquido corporal de un individuo, ser humano o animal.
  4. 4.
    Utilizaci�n según la reivindicación 3 en la que la determinación de la concentración se realiza utilizando por lo menos un anticuerpo que se une específicamente a la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 mencionada en la reivindicación 1.
  5. 5.
    Utilizaci�n según la reivindicación 4 en la que dicho por lo menos un anticuerpo est� marcado con un marcador detectable.
  6. 6.
    Utilizaci�n según la reivindicación 5 en la que el marcador es un marcador luminiscente.
  7. 7.
    Utilizaci�n según una de las reivindicaciones 3 a 6 en la que dicha utilización implica uno o más de los anticuerpos que se unen específicamente a 1-37 de la protaquicinina (p�ptido A).
  8. 8.
    Utilizaci�n según una de las reivindicaciones 1 a 7 en la que las enfermedades que deben detectarse comprenden enfermedades/trastornos del sistema nervioso central, que comprenden la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, depresión y/o afecciones de dolor, enfermedades neurol�gicas, endocrinol�gicas, cerebrales, musculares, locales, sist�micas, crónicas, inflamatorias, enfermedades infecciosas que comprenden las infecciones bacterianas y v�ricas, meningitis, septicemia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, anemia depranoc�tica, isquemia, esclerosis lateral amiotr�fica, artritis que comprende la artritis reumatoide, bronquitis, hiperalgesia, asma, intoxicación que comprende la intoxicación bacteriana, trastornos inmunol�gicos, poli/traumatismo que comprende el traumatismo craneoencef�lico, tumores/cáncer, accidente cerebrovascular, estr�s, dermatitis at�pica, VIH, enfermedad de Huntington, quemaduras, fibromialgia, esquizofrenia, la enfermedad de Hirschsprung, alergias, disautonom�a familiar (síndrome de Riley Day), trastornos hematopoy�ticos, gliomas que comprenden los glioblastomas y los astrocitomas, trastornos de la barrera hematoencef�lica.
  9. 9.
    Utilizaci�n de un anticuerpo que es específico para 1-37 de protaquicinina (p�ptido A) para diagnósticos m�dicos en la que la correlación de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 con la sustancia P se utiliza para determinar el estado de enfermedad/trastorno en los líquidos corporales.
  10. 10.
    Procedimiento in vitro de diagnóstico que comprende la determinación de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 en los líquidos corporales que comprende:
    -
    utilizar un anticuerpo específico o una combinación de anticuerpos específicos para la detección de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10,
    -
    determinar la concentración de protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 en la muestra respectiva,
    -
    deducir a partir de la concentración la presencia y/o evolución y/o gravedad y/o pronóstico de una enfermedad o trastorno,
    -
    incluir datos cl�nicos suplementarios para determinar la presencia y/o evolución y/o gravedad y/o pronóstico de enfermedades o trastornos, y en el que la correlación de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 con la sustancia P se utiliza para determinar el estado de la enfermedad/trastorno en los líquidos corporales.
  11. 11.
    Procedimiento según la reivindicación 10 en el que por lo menos un anticuerpo que se une específicamente al compuesto respectivo est� inmovilizado sobre una superficie y se utiliza un segundo anticuerpo que se une específicamente a otra parte del compuesto para la detección del compuesto.
  12. 12.
    Procedimiento según la reivindicación 11 en el que el anticuerpo est� marcado con un marcador detectable.
  13. 13.
    Procedimiento según la reivindicación 12 en el que el anticuerpo est� marcado con un marcador luminiscente.
  14. 14.
    Procedimiento según las reivindicaciones 10 a 13 siendo el anticuerpo o las combinaciones de anticuerpos anticuerpos que se unen específicamente a 1-37 de protaquicinina (p�ptido A).
  15. 15. Utilización de un kit para un análisis inmunol�gico que comprende: 5
    -
    por lo menos un anticuerpo que se une a la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10, que comprende un marcador detectable, o
    -
    por lo menos un anticuerpo que se une a la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 y un marcador detectable, 10 en la que dicho por lo menos un anticuerpo es específico para la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10,
    y en la que la correlación de la protaquicinina según la SEC. ID. n� 10 con la sustancia P se utiliza para determinar el estado de la enfermedad/trastorno en los líquidos corporales. 15
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