ES2470816A1 - Proteína recombinante y usos en el diagnóstico de la esclerosis múltiple - Google Patents

Abstract

Proteína recombinante y usos en el diagnóstico de la esclerosis múltiple. Proteína recombinante IFNAR2.3, anticuerpos, composiciones que los comprenden, y usos. Entre sus usos, especialmente, se refiere a un método para el diagnóstico de la esclerosis múltiple, así como al kit de diagnóstico.

Description

Prote�na recombinante y usos en el diagnóstico de la esclerosis múltiple.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la biotecnolog�a, y se refiere al receptor soluble IFNAR2.3 aislado, producido de manera recombinante, a un método de diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple, a un kit y a sus usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), presumiblemente autoinmune. Se caracteriza por la presencia de lesiones inflamatorias en la sustancia blanca y gris del SNC, denominadas placas, en las que se produce pérdida de mielina y cierto grado de degeneración axonal.

Aunque en los últimos años se han desarrollado numerosos fármacos para paliar los efectos de esta enfermedad, el interferon beta (IFN�) sigue siendo el tratamiento más ampliamente utilizado. Numerosos ensayos cl�nicos han demostrado que disminuye la frecuencia y gravedad de los brotes, el número y volumen de las lesiones cerebrales observadas por resonancia y la progresión en la escala de discapacidad física. Sin embargo, un porcentaje importante de pacientes (30-50%) no responden adecuadamente al tratamiento, ya que continúan con la presencia de brotes y progresan en la escala de discapacidad física.

El IFN� ejerce su actividad biológica a través de la interacción con el receptor de superficie IFNAR formado por dos subunidades, IFNAR1 e IFNAR2. Tras la unión del IFN� a IFNAR2, se produce la dimerizaci�n de las dos subunidades y la activación de la cascada de se�alizaci�n intracelular cuya señal es transducida al núcleo a través de la vía Jak-Stat. De esta forma se ejercen las actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras del IFN�.

La subunidad IFNAR2 del receptor sufre un procesamiento alternativo del ARNm que da lugar a tres formas distintas: una forma corta (IFNAR2b), una forma larga funcionalmente activa (IFNAR2c) y la forma soluble (sIFNAR2, IFNAR2.3 o IFNAR2a). Solamente IFNAR2c actúa como receptor funcional junto con IFNAR1 y es capaz de mediar los efectos biológicos del IFN�. IFNAR2.3 que carece de dominios citoplasmáticos y transmembrana, ha sido identificada en fluidos biológicos humanos y aunque su papel no est� definido, se ha sugerido que pueda tener capacidad neutralizante de la unión del IFN� con el receptor IFNAR2. De esta forma podría ejercer funciones moduladoras según la concentración a la que se encuentre; por un lado podría neutralizar la unión del IFN� al receptor IFNAR o por el contrario, prolongar la vida media del IFN� circulante, impidiendo su degradación o la formación de olig�meros. A día de hoy sigue siendo desconocida la función de la variante soluble de IFNAR2.

El diagnóstico cl�nico de la EM es complejo. éste se realiza teniendo en consideración la existencia de criterios cl�nicos de diseminaci�n espacial (presenta de síntomas y signos que indiquen existencia de dos lesiones independientes en el SNC) y de diseminaci�n temporal (dos o más episodios de disfunción neurol�gica).

Los estudios de conductividad nerviosa de los nervios ópticos, sensitivos y motores también proporcionan pruebas de la existencia de la enfermedad, ya que el proceso de desmielinizaci�n implica una reducción de la velocidad de conducción de las señales nerviosas. El estudio se realiza comparando los tiempos de reacción con mediciones preestablecidas.

El proceso de diagnóstico se completa con la realización de pruebas para excluir otras enfermedades que pueden imitar a la esclerosis como la Enfermedad de Devic, la sarcoidosis, la vasculitis y la enfermedad de Lyme.

Hasta el momento, la prueba paracl�nica por excelencia para confirmar el diagnóstico de EM es la presencia de bandas oligoclonales (BOC) en líquido cefalorraqu�deo, producidas por células situadas en el espacio subaracnoideo, que dan lugar a síntesis intratecal de IgG. El método más sensible para su detección es el isoelectroenfoque en gel de poliacrilamida, que permite detectar BOC hasta en el 95% de los casos de EM. El principal inconveniente de esta técnica es la necesidad de realizar una punci�n lumbar al paciente, siendo un método invasivo para el paciente y costoso.

Ser�a útil, por tanto, encontrar una prueba paracl�nica que consiga diagnosticar individuos con EM de una manera mucho menos invasiva, incruenta y por ello, más inocua para el paciente.

DESCRIPCI�N DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado un método para diagnosticar la esclerosis múltiple, y han diseñado un ELISA cualitativo, tipo s�ndwich, para la determinación de IFNAR2.3 en suero. Para dar validez a este ensayo, han clonado y purificado la proteína IFNAR2.3, de forma que pueda servir como control positivo para incluir en el ensayo. Se ha realizado la optimización de cada uno de los pasos de la técnica y se ha calculado la variación intraensayo e interensayo de la misma. Una vez desarrollada y optimizada la metodología, se han determinado los valores de IFNAR2 soluble en suero de pacientes con EM y controles sanos.

PROTE�NA RECOMBINANTE DE LA INVENCIÓN.

Los autores de la invención han clonado y purificado la proteína IFNAR2.3. Además, mediante el método de clonaci�n empleado han añadido una cola de histidina-asparagina en el extremo carboxi terminal, quedando fusionado a la proteína recombinante como una etiqueta. Tras la producción de la proteína recombinante en la célula hospedadora, se hace pasar el lisado celular por una columna de afinidad para su purificación. La proteína de fusión con la etiqueta queda retenida en la columna mientras que las otras proteínas y otros contaminantes son afluidos a través de ésta.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína recombinante obtenible por un procedimiento que comprende:

a) integrar un inserto con la secuencia nucleot�dica SEQ ID NO. 1 en una construcción genética o un vector de expresión,

b) transformar un hospedador con el vector de expresión del paso (a),

c) inducir la expresión de la proteína recombinante,

d) extraer la proteína recombinante, y

e) purificar la proteína recombinante

El diseño del vector basado en técnicas de ingeniería genética y la elección de la célula hospedadora determinan, en gran parte, las características de la proteína recombinante.

La construcción g�nica de la invención puede comprender, además de la secuencia nucleot�dica SEQ ID NO. 1, elementos que regulan la expresión de dicha secuencia. Dichos elementos reguladores incluyen promotores y potenciadores. Los promotores se encuentran típicamente posicionados en posición 5’ con respecto al sitio de iniciación de la transcripción o traducción. Los potenciadores son capaces de influenciar la expresión de genes cuando se encuentran en posición 5’o 3 ’con respecto al ADNc o cuando se encuentran formando parte de un intr�n. Secuencias reguladoras incluyen, además de promotores, secuencias que facilitan la traducción, señales de procesamiento para los intrones, codones de terminación, secuencias señales, sitios internos de unión al ribosoma (IRES) y señales de poliadenilaci�n.

El vector de expresión que comprende la secuencia nucleot�dica SEQ ID NO. 1 o una construcción g�nica de la invención, est� operativamente acoplado con una secuencia que regula la expresión de dicha secuencia nucleot�dica SEQ ID NO. 1 o de dicha construcción g�nica. El experto en la materia advertir� que el tipo de vector adecuado para la expresión de los ácidos nucleicos y construcciones g�nicas de la invención, depender� del organismo en el que se desee expresar el polinucle�tido de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el vector de expresión es el vector prelinearizado pEcoli-Cterm 6xHN Linear.

Una célula o un organismo hospedador puede comprender la construcción g�nica de la invención o un vector, tal como se ha definido en la invención. En principio, cualquier tipo de organismo hospedador conocido para el experto en la materia puede ser usado en la presente invención, tales como una cepa bacteriana (Escherichia coli, Bacillus subtilis y similares), una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha y similares), una planta transg�nica (dicotiledoneas o monocotildoneas), una célula de insecto, por ejemplo, baculovirus, una célula de mamífero (células COS, CHO, C127, HeLa y similares) y un transg�nico no humano (por ejemplo, un ratón, una vaca, una cabra, un conejo, un cerdo, etc.).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el hospedador del paso (b) son bacterias de expresión. Más preferiblemente las bacterias de expresión son BL21(DE3). Las bacterias de expresión BL21(DE2) son células de Escherichia coli químicamente competentes, que posee un genotipo adecuado para la transformación y la expresión de proteínas, y cuyo genoma se conoce (Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Jeong H, et al. J Mol Biol 2009 Dec 11).

Una bacteria competente, se caracteriza por tener una pared bacteriana debilitada y por tanto tiene más facilidad para captar un ADN foráneo mediante un proceso de choque térmico o eléctrico (transformación). Para la producción de la proteína se utilizan bacterias de expresión. En esta memoria, las bacterias de expresión son aquellas que poseen la maquinaria necesaria para sobrexpresar el cDNA insertado y producir la proteína recombinante.

En otra realización preferida, la integración de la secuencia nucleot�dica SEQ ID NO: 1 del paso (a) se realiza mediante un proceso de ligación.

Para la realización del proceso de ligación, la mezcla de inserto: pl�smido fue resuspendida en el producto In-Fusion Dry-Down pellet (Clontech). In-Fusion Dry-Down pellet es un liofilizado que contiene la enzima In-Fusion, la cual favorece la unión del inserto al pl�smido gracias a la homología en la secuencia nucleot�dica presente en ambos.

Por tanto, en otra realización preferida de la invención, en la ligación se emplea un liofilizado que comprende la enzima In-Fusion. ésta es una ADN polimerasa de Poxvirus con actividad exonucleasa 3´-5´, que es capaz de unir moléculas de ADN de cadena simple que presentan secuencias cortas y homólogas en sus extremos, tales como un producto de PCR amplificado y un vector.

En otra realización preferida, el inserto se sintetizó empleando los cebadores de secuencia nucleot�dica SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

Otro aspecto se refiere a una proteína que comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 2, o a la proteína recombinante de la invención, para su uso como medicamento; o, alternativamente, a una proteína que comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 2 o a la proteína recombinante de la invención para su uso en la elaboración de un medicamento.

Otro aspecto se refiere a una proteína que comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 2, o a la proteína recombinante de la invención, para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple, o alternativamente, al uso de una proteína que comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 2, o a la proteína recombinante de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

ANTICUERPOS Y COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN, Y USOS

Adem�s, los anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de unirse a la proteína recombinante de la invención son también un objeto de la presente invención. Estos anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden obtener fácilmente a partir de antisueros.

Los antisueros para la proteína recombinante descrita en la presente invención pueden ser generados por técnicas estándar, por ejemplo, por inyección de la proteína recombinante de la invención en un animal apropiado y recogida y purificación de los antisueros de los animales. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a la SEQ ID NO: 2, o una secuencia variante de la misma de acuerdo con la invención pueden ser identificados por inmunoensayos estándar. Los anticuerpos as� obtenidos (en lo sucesivo, anticuerpos de la invención) se pueden usar para el método de diagnóstico de la invención. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos son anticuerpos monoclonales.

As� pues, en otro aspecto la invención se relaciona con un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce específicamente la proteína recombinante de la invención, de ahora en adelante anticuerpo de la invención. Anticuerpos contemplados en el contexto de la presente invención incluyen antisueros policlonales, moléculas de IgG purificadas, sobrenadantes o líquido ascético que contiene anticuerpos monoclonales, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, ScFvdiabodies, triabodies, tetrabodies y anticuerpos humanizados.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende:

a) una proteína que comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 2, b) la proteína recombinante de la invención, y/o

c) el anticuerpo, o un fragmento del mismo, de la invención.

Dicha composición puede ser una composición farmacéutica. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas, de ahora en adelante composiciones farmacéuticas de la invención, que comprenden al menos uno de los polinucle�tidos de la invención, polip�ptidos de la invención o su forma madura, y/o un anticuerpo de la invención, acompañado de un excipiente farmac�uticamente aceptable. Para uso en medicina, los compuestos y combinaciones de compuestos de la invención pueden ser formulados conjuntamente con un excipiente que es aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Excipientes preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas, gomas, proteínas y otros. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se formular� en una forma farmacéutica de administración sólida (p.ej., comprimidos, cápsulas, grageas, gránulos, supositorios, etc.) o líquida (p.ej., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.). En otra realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transd�rmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, ent�rica, típica, sublingual o rectal.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento, o alternativamente, al uso de una composición farmacéutica de la invención en la elaboración de un medicamento.

El término “medicamento”, tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades o prevención de estados fisiológicos no deseados en el hombre y los animales.

Otro aspecto se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de la esclerosis múltiple, o alternartivamente, al uso de la composición farmacéutica de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

M�TODO DE DIAGNÓSTICO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la invención han visto que la capacidad discriminante de la detección en suero de IFNAR2.3 por s� sola, entre pacientes con EM y controles es elevada teniendo en cuenta que estamos ante un indicador univariante, y han desarrollado una técnica de ELISA para la detección de IFNAR2 soluble en suero, que sirve como prueba paracl�nica para diagnóstico de la EM. Es una técnica mucho menos invasiva para el paciente y menos costosa que las bandas oligoclonales, y podría utilizarse como un método de screening previo, de forma que solo en el caso de pacientes que obtengan valores de ELISA que puedan dar lugar a duda, sería necesario realizar las bandas oligoclonales. Para ello, tras la normalización de los datos de absorbancias y el establecimiento de un punto de corte para distinguir entre positivo y negativo, se ha obtenido una curva COR con un área bajo la curva de 0.820, y se han establecido diferentes puntos de corte que darán diferente sensibilidad y especificidad según los requerimientos que se le exija al test.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de IFNAR2.3 para el diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante primer método de la invención, para el diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple, que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) detectar el producto de expresión de IFNAR2.3

En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende:

c) comparar el producto de expresión de IFNAR2.3 obtenido en el paso (b) con una cantidad de referencia

La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresión constitutiva de IFNAR2.3, en un grupo de individuos sanos o, alternativamente, que no presentan esclerosis múltiple. Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. As�, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras de individuos que no padecen la enfermedad que se pretende diagnosticar. Preferiblemente, el producto de expresión de IFNAR2.3 del paso (b) del primer método de la invención es la proteína IFNAR2.3. En otra realización más preferida, el paso (c) de la invención comprende comparar la detección de la proteína IFNAR2.3 en la muestra biológica de (a) con la detección de la proteína IFNAR2.3 en una población de referencia.

Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo rob�tico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).

Una “muestra biológica aislada” incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es suero. En otra realización preferida, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es líquido cefalorraqu�deo.

El término “individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término “individuo” no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

La detección del producto de expresión de IFNAR2.3 puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica.

La medida del producto de expresión de IFNAR2.3, aunque puede ser cualitativa, también puede determinarse la cantidad o la concentración de dicho producto de expresión, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, y puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de la detección de la proteína. Dicha señal – a la que también podemos referirnos como señal de intensidad – puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reacción enzim�tica).

El término “cantidad”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los genes o de los anticuerpos, as� como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término “comparación”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de los productos de expresión de IFNAR2.3 en una muestra problema frente a la población de referencia, o alternativamente,

a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de los genes o de la cantidad de anticuerpos frente a IFNAR2.3 de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de los genes o con una cantidad de anticuerpos frente a IFNAR2.3 de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (c) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.

Los interferones tipo I (alpha, beta and omega), ejercen su acción a través de la interacción con el receptor de membrana IFNAR, formado por dos subunidades IFNAR1 e IFNAR2. La subunidad IFNAR2 del receptor sufre un procesamiento alternativo del ARNm que da lugar a tres formas distintas: una forma corta (IFNAR2b), una forma larga funcionalmente activa (IFNAR2c) y la forma soluble (sIFNAR2, IFNAR2.3 o IFNAR2a). Solamente IFNAR2c actúa como receptor funcional junto con IFNAR1 y es capaz de mediar los efectos biológicos del IFN�, a través de la activación de la cascada de se�alizaci�n JAK-STAT.

M�ltiples variantes de la transcripción que codificaban por lo menos dos isoformas diferentes se han encontrado para este gen. La secuencia aminoac�dica de IFNAR2.3 se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) L41943.1 y en la SEQ ID NO: 2. Dicha SEQ ID NO2 est� representada por la siguiente secuencia aminoac�dica:

(MLLSQNAFIFRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELKNHSIVPTHYTLLYTIMSKPEDLKV VKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGFSGNTTLFSCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEE ELQFDLSLVIEEQSEGIVKKHKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTLLPPGQESEFS).

En el contexto de la presente invención, IFNAR2.3 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucle�tido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 2, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polip�ptido que comprende la secuencia aminoac�dica de la SEQ ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleot�dica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polip�ptido que comprende la secuencia aminoac�dica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polip�ptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IFNAR2.3. Entre dichas moléculas de ácido nucl�ico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) L41943.1 y la SEQ ID NO: 1. Dicha SEQ ID NO1 est� representada por la siguiente secuencia nucleot�dica:

(agatgtaaaagtcaagagaagactctaaaaatagcaaagatgcttttgagccagaatgccttcatcttcagatcacttaatttggttctcatggtgtatatcagcctcgtg tttggtatttcatatgattcgcctgattacacagatgaatcttgcactttcaagatatcattgcgaaatttccggtccatcttatcatgggaattaaaaaaccactccattgtac caactcactatacattgctgtatacaatcatgagtaaaccagaagatttgaaggtggttaagaactgtgcaaataccacaagatcattttgtgacctcacagatgagtg gagaagcacacacgaggcctatgtcaccgtcctagaaggattcagcgggaacacaacgttgttcagttgctcacacaatttctggctggccatagacatgtcttttgaa ccaccagagtttgagattgttggttttaccaaccacattaatgtgatggtgaaatttccatctattgttgaggaagaattacagtttgatttatctctcgtcattgaagaacagt cagagggaattgttaagaagcataaacccgaaataaaaggaaacatgagtggaaatttcacctatatcattgacaagttaattccaaacacgaactactgtgtatctg tttatttagagcacagtgatgagcaagcagtaataaagtctcccttaaaatgcaccctccttccacctggccaggaatcagaattttcataactttttagcctggccatttcc taacctgccaccgttggaagccatggatatggtggaggtcatttacatcaacagaaagaagaaagtgtgggattataattatgatgatgaaagtgatagcgatactga ggcagcgcccaggacaagtggcggtggctataccatgcatggactgactgtcaggcctctgggtcaggcctctgccacctctacagaatcccagttgatagacccg gagtccgaggaggagcctgacctgcctgaggttgatgtggagctccccacgatgccaaaggacagccctcagcagttggaactcttgagtgggccctgtgagagg agaaagagtccactccaggacccttttcccgaagaggactacagctccacggaggggtctgggggcagaattaccttcaatgtggacttaaactctgtgtttttgaga gttcttgatgacgaggacagtgacgacttagaagcccctctgatgctatcgtctcatctggaagagatggttgacccagaggatcctgataatgtgcaatcaaaccattt gctggccagcggggaagggacacagccaacctttcccagcccctcttcagagggcctgtggtccgaagatgctccatctgatcaaagtgacacttctgagtcagatg ttgaccttggggatggttatataatgagatgactccaaaactattgaatgaacttggacagacaagcacctacagggttctttgtctctgcatcctaacttgctgccttatcg tctgcaagtgttctccaagggaaggaggaggaaactgtggtgttcctttcttccaggtgacatcacctatgcacattcccagtatggggaccatagtatcattcagtgcat tgtttacatattcaaagtggtgcactttgaaggaagcacatgtgcacctttcctttacactaatgcacttaggatgtttctgcatcatgtctaccagggagcagggttcccca cagtttcagaggtggtccaggaccctatgatatttctcttctttcgttcttttttttttttttttgagacagagtctcgttctgtcgcccaagctggagcgcaatggtgtgatcttggct

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En otra realización preferida, la detección de la cantidad de producto de expresión de IFNAR2.3 se realiza mediante un inmunoensayo. El término “inmunoensayo”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con un ant�geno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.

En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (ant�geno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA s�ndwich. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el ELISA es un ELISA s�ndwich.

El término “compuesto marcador”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromog�nica, fluorog�nica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a IFNAR2.3. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radiois�topos, enzimas, fluor�foros o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 32P o 35S, fluorocromos como fluoresce�na o partículas met�licas, para su detección directa mediante colorimetr�a, auto-radiografía, fluorimetr�a, o metalograf�a respectivamente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico, pronóstico y de clasificación de individuos, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos (a)-(c) según el primer método de la invención, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con o sin esclerosis múltiple, en función del punto de corte establecido para el índice de muestra. Valores con el índice de muestra por encima de 2,14 (en la curva COR) nos permite clasificar a los sujetos como pacientes con EM, mientras que valores inferiores a 1,24 (en la curva COR) son clasificados como individuos sanos.

KIT O DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO Y USOS

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para cuantificar el producto de expresión de IFNAR2.3.

Preferiblemente, el kit o dispositivo de la presente invención comprende al menos un anticuerpo anti-IFNAR2.3. En otra realización preferida, el kit de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. En una realización mucho más preferente el kit comprende el polip�ptido de la invención, producido por tecnología recombinante, como control positivo. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.

En otra realización preferida, el kit de la invención comprende:

a) un soporte sólido que lleva unido un anticuerpo primario b) anticuerpo secundario c) una solución del anticuerpo de detección, marcado con un marcador enzim�tico; d) un reactivo.

En una realización aún más preferida, el anticuerpo de primario es un anticuerpo que comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 3 (MLLSQNAFIVRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELKNHSIVPTHYTLLYTIMSKPEDLKV VKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGFSGNTTLFSCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEE ELQFDLSLVIEEQSEGIVKKHKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTLLPPGQESESAES AKIGGIITVFLIALVLTSTIVTLKWIGYICLRNSLPKVLRQGLTKGWNAVAIHRCSHNALQSETPELKQSSCLSFPSSWDY KRASLCPSD).

En otra realización más preferida, el anticuerpo secundario es un anticuerpo que comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 4 (MLLSQNAFIVRSLNLVLMVYISLVFGISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELKNHSIVPTHYTLLYTIMSKPEDLKV VKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVTVLEGFSGNTTLFSCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEE ELQFDLSLVIEEQSEGIVKKHKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTLLPPGQESESAES AKIGGIITVFLIALVLTSTIVTLKWIGYICLRNSLPKVLRQGLTKGWNAVAIHRCSHNALQSETPELKQSSCLSFPSSWDY KRASLCPSD)

Otro aspecto se refiere al uso del kit de la invención, para el diagnóstico, pronóstico, y clasificación de individuos que tienen esclerosis múltiple.

Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención (del primer o del segundo método de la invención).

Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

El primer y/o el segundo método de la invención pueden incluir etapas adicionales, como por ejemplo, la separación de proteínas mediante electroforesis mono y bidimensional (2D-PAGE), o la digestión previa con tripsina de una mezcla de proteínas (de la muestra) para después purificar y analizar los p�ptidos mediante espectrometr�a de masas (MS), como el MALDI-TOF, o mediante cromatograf�a multidimensional, mediante ICAT (Isotope-coded affinity tags), DIGE (Differential gel electrophoresis) o arrays de proteínas.

Los términos “polinucle�tido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas polim�ricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucle�tidos (ARN � RNA) como desoxiribonucle�tidos (ADN � DNA).

Los términos “secuencia aminoac�dica”, “p�ptido”, “oligop�ptido”, “polip�ptido” y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polim�rica de amino�cidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioqu�micamente modificados.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCI�N DE LAS FIGURAS

Fig. 1: Esquema de trabajo de la clonaci�n, producción y purificación la proteína recombinante.

Fig. 2: Estructura del vector pEcoli-Cterm 6xHN Linear.

Fig. 3: Estructura de las estructuras flanqueantes al inserto.

Fig. 4: Electroforesis en gel de agarosa del amplificado obtenido por PCR.

Fig. 5: Alineamientos de las secuencias nucleot�dicas en sentido 5´-3´. En la primera línea se muestra la secuencia nucleot�dica de IFNAR2.3, en la segunda y tercera línea las secuencias nucleot�dicas con los cebadores flanqueantes del inserto T7UP y T7terminal, obtenida tras el proceso de secuenciaci�n del pl�smido.

Fig. 6: Western blot que muestra la banda correspondiente a IFNAR2.3

Fig. 7: Gráficas de la puesta a punto de las concentraciones de anticuerpos para el ELISA para determinar IFNAR2.3 en suero. (A). Absorbancias obtenidas con 1.21g/ml de anticuerpo primario frente a diferentes concentraciones de anticuerpo secundario (B). Absorbancias obtenidas con 1.1g/ml de anticuerpo primario frente a diferentes concentraciones de anticuerpo secundario. (C). Absorbancias obtenidas con 0,8 1g/ml de anticuerpo primario frente a diferentes concentraciones de anticuerpo secundario (D). Gráfica que muestra la relación lineal entre la absorbancia y la concentración de proteína IFNAR2.3.

Fig. 8. Análisis de los valores de IFNAR2.3 en suero en pacientes tratados con INF�, sin tratamiento y controles.

Fig. 9. Análisis de los valores de IFNAR2.3 en suero en pacientes tratados con INF�, sin tratamiento, controles y pacientes tratados con Copaxone�.

Fig. 10. Curva COR pacientes sin tratamiento y controles.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrar� la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.

Materiales y métodos Producción de la proteína recombinante IFNAR2.3

Elecci�n del vector de clonaci�n

El sistema de expresión procariota escogido, es el vector prelinearizado pEcoli-Cterm 6xHN Linear (Clontech). La proteína resultante tendr� fusionada una cola histidina-asparagina en el extremo carboxi terminal que servir� para su purificación.

En las imágenes que se muestran a continuación se detalla la estructura del vector donde se integr� el inserto con la secuencia nucleot�dica de nuestra proteína de interés.

El sistema de expresión de pEcoli Cterm 6xHN Linear est� basado en el sistema de expresión del promotor fuerte T7, controlado por el oper�n LacZ que a su vez es inducible por IPTG (Isopropil-�-D-tiogalactopiran�sido). Además, el pl�smido posee un gen de resistencia a la ampicilina que permite la selección de los clones que contienen el pl�smido.

Para la producción de la proteína, se utilizó la maquinaría de las bacterias de expresión BL21 (DE3), que utilizan el promotor T7. Las bacterias BL21 (DE3) contienen una copia cromosomal del gen de la T7 ARN polimerasa, que a su vez est� bajo el control del promotor de lacUV5 inducible por IPTG.

S�ntesis del inserto de ADN

El primer punto en el diseño de la estrategia de clonaci�n fue la síntesis del inserto. Para ello se recab� toda la información sobre la secuencia de IFNAR2.3, como la secuencia señal del p�ptido, las modificaciones postraduccionales, las características bioquímicas de la proteína, los dominios de la misma etc. Toda esta información se obtuvo de la base de datos UNIPROT (http://www.uniprot.org/uniprot/P48551), que alberga las secuencias aminoac�dicas de las proteínas y sus características bioquímicas.

La secuencia del ARNm de IFNAR2.3 se obtuvo a partir de la base de datos NUCLEOTIDE del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore.)

Siguiendo las directrices del fabricante, los cebadores debían de cumplir los siguientes requisitos:

El extremo 5´:

• Contener 15 bases homólogas con las 15 bases del final del fragmento de ADN del vector donde va a ser insertado.

El extremo 3´:

•

Poseer 15 bases homólogas con los extremos del gen que va a ser insertado.

•

Una longitud entre 18-25 pb y un contenido de GC del 40-60%.

•

Ausencia del cod�n de inicio (ATG) y de parada en la secuencia a amplificar.

•

Ausencia de la secuencia señal.

Teniendo en cuenta estas premisas, los cebadores daban un producto tras la amplificación de 638 pb. Las secuencias de los cebadores fueron: Sentido (secuencia SEQ ID NO. 3): 5´TAAGGCCTCTGTCGACATTTCATATGATTCGCCTGATTACACGATG 3` Antisentido (secuencia SEQ ID NO. 4): 5´CAGAATTCGCAAGCTTTGAAAATTCTGATTCCTGGCCAGGTGGAA 3´ El inserto se sintetizó mediante PCR convencional a partir de los cebadores diseñados en el punto anterior,

empleando una Taq de alta fidelidad y utilizando como molde un ADNc proveniente de una mezcla de ADNc humano comercial. Las condiciones óptimas de concentraciones, temperatura y tiempos para la síntesis del inserto fueron las siguientes:

Tabla 1: resumen de los reactivos de la PCR convencional para la síntesis del inserto.

Reactivos

Volumen/ muestra Concentración final/ muestra

Agua libre de Rnasas

40 1l

Cebador sentido (20 IM)

1 1l 0,4 1M

Cebador antisentido (20 IM)

1 1l 0,4 1M

Dntp (10 IM)

1 1l 0,2 1M

Tamp�n 5X

5 1l 1X

Pfu High Fidelity

1 1l

cDNA

1 1l

Condiciones de temperatura:

Tabla 2: resumen de las condiciones de temperatura para la síntesis del inserto mediante PCR convencional.

El producto final obtenido de la PCR, fue separado en función de su tamaño mediante la técnica de electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 2% disuelta en tampón TAE, junto con el intercalante Gold View Nucleic Acid Sat�n (Sbs Genetech) a una dilución 1/20. El gel fue sometido a una corriente constante de 80 V y fue visionado en un transiluminador de ultavioleta, que permitió localizar la banda de interés en función del número de pares de bases. La banda localizada a la altura de 638 pb fue recortada del gel de agarosa con la ayuda de un bistur�.

La secuencia del inserto amplificada contenida en la agarosa, fue purificada con el kit comercial QIAquick Gel

Etapa

Temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalizaci�n inicial

95�C 3 min 1

Desnaturalizaci�n

95�C 20 seg

Anillamiento

60,4 �C 20 seg 40 ciclos

Extensi�n

72�C 30 seg

Extensi�n final

72�C 10 min 1

Etapa final

4�C Infinito

Extraction (QIAGEN) siguiendo las indicaciones del fabricante. Al final del proceso se obtuvo un eluido, que fue cuantificado con un espectrofotómetro (Nanodrop, Thermo) antes de ser almacenado a -20�C.

Proceso de ligación

Siguiendo el esquema de trabajo, el siguiente punto en el proceso de clonaci�n, fue el proceso de ligación, es decir, “pegar” al pl�smido, la secuencia nucleot�dica de IFNAR2.3, que dar� lugar a la proteína recombinante.

Para determinar las concentraciones y los volúmenes del inserto y del pl�smido, la casa comercial Clontech, en su web ofrece una herramienta informática (http://bioinfo.clontech.com/infusion) para calcular las cantidades óptimas del vector y del inserto, para el proceso de ligación a partir de las variables conocidas longitud del vector y del inserto.

Para la realización del proceso de ligación, la mezcla de inserto: pl�smido fue resuspendida en el producto In-Fusion Dry-Down pellet (Clontech). In-Fusion Dry-Down pellet es un liofilizado que contiene la enzima In-Fusion, la cual favorece la unión del inserto al pl�smido gracias a la homología en la secuencia nucleot�dica presente en ambos. La reacción de ligación fue llevada a cabo en un termociclador, a 37�C durante 15 minutos seguida de 15 minutos a 50�C y posteriormente fue transferido a hielo. Finalmente, el producto de ligación fue resuspendido en 40 μl de tampón TE (Tris-HCl, EDTA) a pH 8.

Transformaci�n en bacterias replicativas

Las bacterias competentes utilizadas fueron MAX Efficiency DH5a™ Competent Cells (Invitrogen) las cuales fueron transformadas con el pl�smido, siguiendo el siguiente protocolo:

Como control positivo de la técnica de transformación, se añadieron 5 μl del pl�smido pUC19 (control positivo) en una alícuota de bacterias competentes y se resuspendi� suavemente esta mezcla. De forma paralela, se transformaron las bacterias con el producto de ligación. Para ello, se añadieron 2,5 μl a una alícuota de bacterias competentes y se mezcl� suavemente. A continuación, ambas alícuotas de bacterias (control y problema) fueron incubadas durante 30 minutos en hielo. Pasado este tiempo, las muestras se sometieron a un choque térmico a 42�C durante 45 segundos. Rápidamente, las muestras fueron transferidas a hielo durante 2 minutos y posteriormente se añadieron 900 μl de medio SOC (el cual favorece el proceso de transformación). Para que el pl�smido expresara la resistencia a ampicilina, las muestras fueron incubadas a 37�C, con agitaci�n de 225 rpm durante 1 hora. Finalmente las bacterias transformadas, fueron sembradas a diferentes volúmenes en placas de LB-Agar suplementadas con ampicilina 100 μg/ml e incubadas toda la noche a 37�C.

Purificaci�n del ADN plasm�dico y verificación del marco de lectura

Trascurrida una noche en el incubador, las bacterias habían formando UFC (unidades formadoras de colonias). Para evaluar las características de cada UFC, éstas fueron aisladas de forma independiente con la ayuda de un hilo de siembra y sembradas en tubos con 4 ml de medio LB Broth suplementados con 100 μg/ml de ampicilina. Estas suspensiones fueron incubadas a 37�C durante toda la noche con una agitaci�n de 220 rpm junto con un control negativo que fue un tubo de LB Broth sin bacterias. Posteriormente, se procedió a la purificación del pl�smido contenido en las bacterias, siguiendo las indicaciones del kit de Promega (PureYield™ Plasmid Miniprep System) como se explican a continuación:

El cultivo de bacterias fue alicuotado en tubos de 1.5 ml y centrifugado a 16000g durante 30 segundos en una microcentrifuga. Del producto obtenido, se descart� el sobrenadante y el precipitado fue resuspendido en 600 1l de agua, al cual se le a�adi� 1001l de tampón de lisis celular y fue mezclado por inversión. A esta mezcla se le añadieron 3501l de solución neutralizante y se mezcl� de nuevo por inversión. A continuación, se centrifug� a 16000g durante 3 minutos. El sobrenadante obtenido fue transferido a una de las minicolumnas que proporciona el kit que retiene el ADN. Se volvió a centrifugar a 16000g durante 15 segundos. A continuación, se le añadieron 2001l de solución de lavado a la minicolumna y se volvió a centrifugar durante 15 segundos. Posteriormente, se añadieron 4001l de solución de lavado a la minicolumna y se centrifug� durante 30 segundos. Finalmente para eluir el ADN que había quedado retenido en la membrana, se transfirió la minicolumna a un tubo de microcentrifuga limpio de 1.5 ml, se le añadieron 301l de agua estéril al centro de la membrana y se incub� durante 1 minuto a temperatura ambiente. Finalmente, para obtener el ADN plasm�dico purificado se centrifug� a 16000g durante 15 segundos. El ADN plasm�dico fue cuantificado mediante absorbancia en el espectrofotómetro (Nanodrop, Thermo) y fue almacenado a -20�C hasta el momento de su uso.

En este punto teníamos diferentes UFC aisladas y congeladas, pero se desconocía si el pl�smido poseía el inserto, su secuencia completa, la orientación en el marco abierto de lectura etc, por tanto se debía comprobar que el pl�smido cumplía con todos los requisitos deseados. Para ello se realizaron dos pruebas:

•

PCR convencional utilizando como ADN molde el ADN plasm�dico.

•

Secuenciaci�n de ADN: Los pl�smidos positivos en la PCR, fueron secuenciados para obtener la secuencia nucleot�dica que nos permitiría evaluar la secuencia del inserto y comprobar la orientación del mismo.

La secuenciaci�n del inserto abarcaba secuencias aguas arriba que coincidían con el promotor del T7 y aguas abajo con la secuencia T7 terminal. Las secuencias obtenidas fueron alineadas en sentido 5´3´ con la secuencia de referencia del NBCI de número de GeneBank: CAA61940.1 mediante el programa bioinform�tico Multalin. A continuación se muestra los resultados obtenidos tras el alineamiento que nos cercioraba la integridad de la secuencia y orientación en el marco de lectura correcto:

Transformaci�n en bacterias de expresión BL21 (DE3)

Una vez verificado el clon que contenía el pl�smido con las condiciones correctas, el pl�smido se transform� en las bacterias de expresión BL21(DE3) para la producción de la proteína recombinante IFNAR2.3, siguiendo el mismo protocolo descrito anteriormente para la transformación en bacterias replicativas y detección del pl�smido .

Inducci�n de la expresión de la proteína recombinante IFNAR2.3

En condiciones normales, en las bacterias BL21 (DE3) transformadas con el pl�smido, la proteína recombinante no se est� expresando porque su expresión est� reprimida por el represor Lac (LacI) que se encuentra unido al operon Lac. Para permitir su expresión, es necesario la adicción de IPTG que actúa como inductor secuestrando al represor y permitiendo que la T7 ARN polimerasa se una al promotor T7 y realice el proceso de transcripción. Para inducir la expresión de la proteína recombinante IFNAR2.3 se siguió el siguiente protocolo:

En el día previo a la inducción de la producción de la proteína, se prepar� un precultivo de la siguiente manera:

• Las bacterias BL21 (DE3) con el pl�smido fueron cultivadas en 4ml de LB-Broth suplementados con ampicilina a una concentración final de 1001g/ml e incubadas toda la noche a 37�C con una agitaci�n de 220 rpm.

• Al día siguiente, se realizó la inducción de la expresión de la proteína. Para ello, el cultivo del día anterior fue diluido 1/10 en un volumen final de 50 ml de medio LB-Broth suplementado con ampicilina e incubado a 37�C con una agitaci�n de 220 rpm hasta alcanzar una densidad óptica (D.O.) de 0.80-1 nm. Llegado este momento se a�adi� el inductor IPTG a una concentración final de 0.5mM (previamente establecida) y el cultivo fue incubado durante 4 horas a 37�C con una agitaci�n de 220 rpm. A partir de este momento comenzó el proceso de transcripción para la expresión de la proteína. Transcurridas las 4 horas de inducción (optimizada previamente) se recogió el cultivo y se centrifug� a 1600g a 4�C durante 20 minutos. El sobrenadante fue descartado y el pellet guardado a -80�C hasta su posterior uso.

Extracci�n de la proteína recombinante

La proteína recombinante expresada se localizaba en el interior de la bacteria. Para acceder a ella y poder purificarla se debía romper la pared bacteriana mediante procesos físicos y químicos que a continuación se detallan:

El precipitado de bacterias almacenado a -80�C fue descongelado a temperatura ambiente. Seguidamente, se le añadieron 0.5ml de tampón de lisis bacteriana por cada mililitro de cultivo inicial y se resuspendi� on la ayuda de una pipeta. La suspensión resultante fue incubada durante 1 hora a temperatura ambiente en rotación. Transcurrido este tiempo la muestra fue sometida a ultrasonidos en ciclos de 5 pulsos de 30 segundos en hielo, y con una intensidad del 40%. A continuación fue ultracentrifigada a 15000 g durante 20 minutos a 4�C y con ello se separaron las membranas de las proteínas liberadas de la bacteria. Tras la ultracentrifugaci�n se recogió el sobrenadante y se pas� a través de un filtro de 0.45 1m.

Purificaci�n de la proteína recombinante IFNAR2.3

El producto obtenido tras la extracción contenía la proteína recombinante junto con otras proteínas bacterianas. Para purificar y aislar la proteína recombinante IFNAR2.3, se utilizó la técnica de cromatograf�a de afinidad, de forma que la proteína recombinante IFNAR2.3 queda retenida por la cola de histidina-asparagina que contiene. Las columnas elegidas se presentan en un volumen de 1 ml y est�n llenas de resina de sefarosa que llevan unidas iones de níquel. Los iones de níquel le confieren la capacidad de retener proteínas ricas en histidina y por tanto la proteína recombinante IFNAR2.3 va a quedar retenida, entre otras. La liberación de la proteína de la resina se produce por la adicción de un tampón rico en imidazol que compite con el sitio de unión al níquel. A continuación se detalla el protocolo seguido:

Antes de iniciar el proceso de purificación con la cromatograf�a de afinidad, la resina fue lavada y equilibrada con 10 ml de tampón de equilibrado. Seguidamente, el extracto proteico que contiene nuestra proteína de interés, fue puesto en contacto con la resina en rotación a 4�C durante 1 hora y posteriormente, la resina fue empaquetada en la columna. Para eliminar las proteínas no unidas a la resina, ésta se lav� con 10ml de tampón de equilibrado. Finalmente, las proteínas retenidas por el níquel fueron eluidas con 5 ml de tampón de eluci�n rico en imidazol y recogidas en alícuotas de 1 ml.

Detecci�n de la proteína recombinante: Electroforesis y Western blot

El primer paso para la detección de la proteína fue la realización de la electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente la transferencia de las proteínas a una membrana. El protocolo seguido fue:

Las muestras fueron resuspendidas en tampón de carga 5x y hervidas a 100�C durante 3 minutos en un termobloque. A continuación, éstas fueron cargadas en un gel de poliacrilamida al 12%, sumergidas en tampón de electroforesis y sometidas a una corriente constante de 130 V. Una vez finalizada la electroforesis, el gel obtenido fue sumergido en tampón de transferencia durante unos minutos.

La transferencia se realizó en un sistema semi-seco en planchas de grafito que previamente habían sido humedecidas con agua. A continuación la membrana de nitrocelulosa con tamaño de poro de 0.45 μm fue activada sumergiéndola en agua y posteriormente equilibrada en tampón de transferencia. Posteriormente, se procedió a montar el s�ndwich; sobre la plancha de grafito; se dispusieron 9 papeles de transferencia previamente humedecidos en tampón de transferencia, a continuación la membrana encima y sobre ésta el gel que iba a ser transferido. Para terminar con el s�ndwich, se volvieron a poner 9 papeles de transferencia humedecidos en tampón de transferencia. La transferencia se realizó durante 45 minutos con una intensidad de 0.8 mA/cm2.

Una vez terminada la transferencia, la membrana fue separada y bloqueada con tampón de bloqueo durante 2h a temperatura ambiente y con agitaci�n. El bloqueo es una etapa que evita la unión no específica de los anticuerpos a los sitios libres de la membrana, quedando éstos bloqueados con la caseína de la leche. Tras el bloqueo, la membrana fue puesta en contacto con el anticuerpo primario anti-IFNAR2 Human producido en conejo (Abnova)

1/5000, previamente establecida la dilución, en solución de bloqueo durante toda la noche a 4�C en rotación. Al día siguiente, la membrana fue retirada de la solución con anticuerpo y lavada con tampón de lavado. La membrana fue incubada durante una hora y media con el anticuerpo anti-IgG de conejo (Sigma-Aldrich) marcado con fosfatasa alcalina, a una dilución 1/10000 en solución de bloqueo. Se procedió a lavar como en el punto anterior. Para ver el resultado del western blot, se revel� la membrana poniéndola en contacto con una mezcla formada por 200 μl de NBT/BCIP + 10ml de solución de revelado a temperatura ambiente hasta la aparición un producto coloreado. Para finalizar, la reacción fue parada desechando la solución de revelado y sumergiéndola en solución de parada, rica en iones magnesio que bloquean el desarrollo de la reacción colorim�trica retirando el NBT/BCIP.

Tras la purificación de la proteína, se hicieron los ensayos de puesta a punto de la técnica de ELISA tal y como se detalla a continuación.

T�cnica de ELISA para cuantificación del fragmento soluble IFNAR2.3

Podemos considerar la técnica de ELISA (enzyme linked immunosorben assay) como una de las herramientas más poderosas para la detección y cuantificación de proteínas específicas en una mezcla compleja de ellas. Originalmente descrito por Engvall y Perlmann en 1971 (Engvall & Perlmann Immunochemistry. 1971 Sep;8(9):8714) como una alternativa más sencilla e igualmente sensible a la metodología de detección de sustancias por RIA (Radioimmuno assay).

Se ha puesto a punto un ELISA tipo s�ndwich que requiere dos anticuerpos diferentes que se unen al mismo ant�geno. El primer anticuerpo (unido a la placa) es el llamado anticuerpo primario, mientras que el segundo anticuerpo detecta el ant�geno inmovilizado por el primero y se denomina anticuerpo de secundario) Dado que este último no est� marcado, hemos recurrido a un tercer anticuerpo (especie-específico) conjugado a una enzima a la que posteriormente enfrentaremos con su sustrato que dar� lugar a una reacción colorim�trica.

Se sensibiliza la placa con un anticuerpo específico que reconocer� e inmovilizar� nuestro ant�geno objeto de estudio (IFNAR2.3). En este estudio hemos optimizado la concentración de anticuerpo primario en combinación con la concentración de anticuerpo secundario para incrementar la relación entre señal/ruido de fondo. Para esto, hemos realizado la sensibilizaci�n de las placas con tres diferentes concentraciones de anticuerpo de primario (0.8, 1 y 1.2 μg/ml) en tampón carbonato/bicarbonato a pH 9.6 e incubado 16 horas a 4�C. Posteriormente se procede a la retirada del anticuerpo de primario y el lavado de la placa tres veces con tampón de lavado TBS/Tween (TBS, 1.5mM MgCl2, 0.05% Tween 20)

En todos los experimentos se bloque� la unión no específica por medio de la adición de una solución de bloqueo (TBS/Tween/1% BSA), incubando durante 1 hora a 37 �C, tras lo cual procedemos a realizar de nuevo tres lavados con TBS-Tween.

Para optimizar la concentración de anticuerpo de detección, la placa se sensibilizó con el anticuerpo primario como acabamos de describir. Como ant�geno (y control positivo de la técnica) se emple� la proteína recombinante IFNAR2.3 producida en bacterias y purificada por medio de cromatograf�a de afinidad. Se utilizaron distintas diluciones de la proteína recombinante IFNAR2.3 (1/20, 1/50, 1/100 y 1/200); además se incluyó un control negativo en cada placa que consistió en solución de bloqueo (TBS/Tween 20/1% BSA). Las muestras se incubaron a 37�C durante 1 hora, tras lo cual se procedió a lavar la placa tres veces con tampón TBS/Tween. Tras este paso se a�adi� el anticuerpo secundario a distintas concentraciones (400, 600 y 800 ng/ml en solución de bloqueo) y se incub� de nuevo durante 1 hora a 37�C, procediendo de nuevo al lavado de la placa 3 veces con tampón TBS/Tween. Posteriormente, se recurrió a la incubaci�n con un anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina, siguiendo las especificaciones del proveedor, que detecta específicamente la IgG de ratón y se incub� de nuevo durante 1 hora a 37�C, lavando la placa tras la incubaci�n con TBS/Tween. Finalizado este proceso se a�adi� a cada pozo de la placa la solución sustrato de fosfatasa alcalina. Tras incubar la placa durante 30 min a 37�C se detuvo la reacción con 3 M NaOH. Como fruto de la reacción enzima-sustrato, los pozos en los que hay una identificación del ant�geno aparecen amarillo brillante. La intensidad del color se cuantific� por la lectura de la densidad óptica de cada pocillo a 405 nM en un lector de placas.

El resultado obtenido en este tipo de experimentos permitió fijar la concentración óptima de anticuerpo de primario y secundario para mantener la mejor relación entre señal y ruido de fondo (figuras), eligiendo como mejor condición, la sensibilizaci�n de la placa con 0.8 μg/ml de anticuerpo de primario y 400 ng/ml de anticuerpo secundario.

Ensayo en pacientes

Una vez optimizada la técnica se ha determinado la presencia de IFNAR2.3 en suero de pacientes de EM y de controles sanos.

Frecuencia Porcentaje

V�lidos Sin tratar 81 60,4 CONTROLES 53 39,6 Total 134 100,0

A continuación se presenta una tabla (Tabla 3) como ejemplo de las absorbacias obtenidas:

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

0,999 0,876 0,813 0,812 0,709 0,722 0,928 0,939 0,862 0,835 0,743 0,778

B

0,747 0,665 0,672 0,733 0,787 0,768 0,8 0,776 0,686 0,702 0,995 1,056

C

0,882 0,85 0,841 0,829 0,729 0,735 1,032 0,845 0,706 0,759 1,045 1,012

D

0,711 0,721 0,701 0,7 0,915 0,906 0,6 0,618 0,726 0,966 0,96 0,983

E

0,89 0,832 0,925 0,877 0,897 0,866 0,709 0,676 0,843 0,949 0,917 0,892

F

0,872 0,814 0,839 0,825 1,106 1,118 0,639 0,661 0,767 0,776 0,764 0,75

G

0,941 0,954 0,839 0,86 0,933 0,94 0,758 0,743 0,984 1,014 0,842 0,827

H

0,967 0,972 0,874 0,89 0,808 0,817 0,88 0,919 4,000 3,909 0,208 0,205

Se ha calculado la variación intraensayo de la técnica, determinando la DO la misma muestra en el mismo ensayo 12 veces y se ha obtenido un coeficiente de variación de 12,2%. Para el cálculo de la variación interensayo se determin� la DO de la misma muestra en 7 ensayos diferentes realizados en diferentes días, obteniéndose un

10 coeficiente de variación de 17,1%.

Todas las muestras han sido analizadas por duplicado. En el caso que el porcentaje del coeficiente de variación entre las dúplicas exceda el 25%, la determinación para esa muestra es considerada como no válida.

An�lisis estadístico de los datos

15 Los datos obtenidos en los diferentes experimentos se normalizaron para obtener el “índice de muestra” como se describe en el apartado siguiente y sobre ellos se aplicaron test no paramétricos para muestras independientes. La expresión de IFNAR2.3 en suero muestra diferencias significativas en pacientes tratados con IFN, pacientes de EM sin tratamiento y controles sanos, tal y como se observa en la Fig. 8.

20 Según los datos, el tratamiento con IFN� aumenta los niveles s�ricos de IFNAR2.3 respecto a pacientes no tratados y controles sanos. Las diferencias encontradas entre pacientes no tratados y controles sanos, sin intervenir el tratamiento con IFN�, son probablemente debidas a la patogenia de la enfermedad.

Para comprobar que las diferencias encontradas no se deben exclusivamente al tratamiento con IFN�, se han incluido pacientes tratados con Copaxone�. No se han encontrado diferencias significativas entre los pacientes

25 tratados con Copaxone� y los pacientes sin tratamiento (presentan medianas muy similares) y se mantienen las diferencias entre los tratados con Copaxone� y los controles sanos.

An�lisis de la sensibilidad y especificidad del ELISA

Para normalizar y homogeneizar los datos crudos de absorbancias obtenidos en el ELISA para la determinación de IFNAR2.3 en suero, se estableció un punto de corte a partir del control negativo obtenido en cada placa, mediante

30 los siguientes cálculos:

Cut off: 3(DO NEG+Desv. St neg); Cut off: 3(0.089+0.0136) = 0.307

Las absorbancias de los sueros fue divido entre el cut off. A este nuevo valor resultante, se le denomin� “INDICE DE LA MUESTRA” con la cual realizaríamos todos los análisis estadísticos. SENSIBILIDAD: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo que se ha definido como positivo

respecto a la condición que estudia la prueba. Probabilidad de que un sujeto enfermo obtenga en la prueba un resultado positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la enfermedad. En este ensayo se ha definido como positivo ser paciente.

S= VP/(VP+FN) *100 ESPECIFICIDAD: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo que se ha definido como negativo. Probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que un sujeto sano obtenga un resultado negativo. Es igual a restar a 1 la fracción de falsos positivos.

En nuestro caso se ha definido como negativo ser control. E= VN/ (VN+FP)*100 Con el índice de muestra se ha establecido de forma arbitraria diferentes puntos de corte. Se ha creado una variable nueva para cada punto de corte, clasificando las muestras como:

-

verdaderos positivos (pacientes por encima del punto de corte)

-

falsos positivos (control por encima del punto de corte),

-

verdaderos negativos (control por debajo del punto de corte)

-

falsos negativos (pacientes por debajo del punto de corte).

An�lisis de pacientes tratados, no tratados y controles sanos

En este primer análisis se incluyen pacientes de EM (sin tratamiento, tratados con IFN y tratados con Copaxone�) y controles sanos (Fig. IX)

Este análisis no sirve para discriminar entre controles sanos y pacientes, porque dentro del grupo de pacientes de EM se incluyen los pacientes tratados con IFN y previamente se ha visto que el tratamiento con IFN incrementa los niveles de IFNAR2.3, por lo que es necesario excluir a los pacientes tratados con IFN� del análisis.

An�lisis de pacientes sin tratamiento - Controles sanos

Para establecer si el test permite discriminar entre pacientes de EM y controles sanos, se han excluido del análisis

los pacientes con tratamiento.(Fig. 10) A continuación, se muestran las sensibilidades y especificidades para distintos puntos de corte, según las siguientes fórmulas

Sensibilidad= VP/(VP+FN) *100 Especificidad= VN/ (VN+FP)*100 Tabla X. positivo=paciente; negativo= control; punto de corte 1.45

Frecuencia Porcentaje

V�lidos

verdadero negativo 30 22,4

verdadero positivo

74 55,2

falso negativo

8 6,0

falso positivo

22 16,4

Total

134 100,0

Sensibilidad= 90% Especificidad= 57%

Frecuencia Porcentaje

Tabla X. positivo=paciente; negativo= control; punto de corte 1.50

V�lidos

verdadero negativo verdadero positivo falso negativo falso positivo Total 36 67 14 17 134 26,9 50,0 10,4 12,7 100,0

Sensibilidad = 82.7% Especificidad = 67.9%

5

positivo=paciente; negativo= control; punto de corte 1.55

Frecuencia Porcentaje

V�lidos

verdadero negativo 36 26,9

verdadero positivo

65 48,5

falso negativo

17 12,7

falso positivo

16 11,9

Total

134 100,0

Sensibilidad= 79.2%

Especificidad = 69.0%

positivo=paciente; negativo= control; punto de corte 1.70

Frecuencia Porcentaje

V�lidos

verdadero negativo verdadero positivo falso negativo falso positivo Total 39 49 33 13 134 29,1 36,6 24,6 9,7 100,0

10

Sensibilidad= 59.7% Especificidad = 75%

Resumen de los resultados Teniendo en cuenta los grupos de los pacientes sin tratamiento y los controles sanos.

Tabla resumen de frecuencias

Frecuencia

Porcentaje

V�lidos

Sin tratar 81 60,4

CONTROLES

53 39,6

Total

134 100,0

TABLA RESUMEN Sensibilidad y especificidad de la variable índice de la muestra (ELISA) con distintos puntos de corte establecidos (pacientes sin tratamiento y controles sanos)

Punto de corte (Test positivo)

Sensibilidad (tasa de aciertos con los enfermos) Especificidad (tasa de aciertos con los controles)

>1.24

100% 25% Se clasifican bien los pacientes

>1.45

90.0% 57.0%

>1.50

82.7% 68.0%

>1.55

79.2% 69.0%

>1.70

59.7% 75.0%

<2.14

24% 100% Se clasifican bien los controles

TABLA RESUMEN: Valores predictivos positivo y negativo de la variable índice de la muestra (ELISA) con 10 distintos puntos de corte establecidos

Valor predictivo positivo: VP/VP+FP Valor predictivo negativo: VN/FN+VN

Punto de corte (Test positivo)

Valor predictivo positivo* Valor predictivo negativo*

<1.24

100% Detecta a todos los controles

<1.45

77.0% 79.0%

<1.50

79.7% 72.0%

<1.55

80.0% 68.0%

<1.70

79.0% 54.0%

>2.14

100% Detecta a todos los pacientes

* Valores sujetos a la prevalencia obtenida en consulta.

Estar�amos ante un indicador (univariante) que sin otro tipo de información multivariante presenta buena capacidad discriminante entre pacientes de EM y controles sanos.

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Una proteína recombinante obtenible por un procedimiento que comprende: a) integrar un inserto con la secuencia nucleot�dica SEQ ID NO. 1 en un vector de expresión, b) transformar un hospedador con el vector de expresión del paso (a), c) inducir la expresión de la proteína recombinante, d) extraer la proteína recombinante, y e) purificar la proteína recombinante. 2.- La proteína recombinante según la reivindicación anterior, donde el vector de expresión es el vector

   prelinearizado pEcoli-Cterm 6xHN Linear.
2. 3.- La proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el hospedador del paso (b) son bacterias de expresión. 4.- La proteína recombinante según la reivindicación anterior, donde las bacterias de expresión son bacterias E. coli

   BL21(DE3).
3. 5.- La proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la integración del paso (a) se realiza mediante un proceso de ligación. 6.- La proteína recombinante según la reivindicación anterior, donde en la ligación se emplea un liofilizado que

   comprende la enzima In-Fusion.
4. 7.- La proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el inserto se sintetizó empleando los cebadores de secuencia nucleot�dica SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. 8.- Un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente una proteína recombinante según

   cualquiera de las reivindicaciones 1-7. 9.- El anticuerpo o un fragmento del mismo, según la reivindicación anterior, obtenible por inyección de la proteína

   recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un animal apropiado, y recogida y purificación de los antisueros de los animales. 10.- El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, que es un anticuerpo monoclonal. 11.- Una composición que comprende: a) una proteína que comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 2, b) la proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o c) el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8-10. 12.- La composición según la reivindicación anterior, que es una composición farmacéutica. 13.- El uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en la elaboración de un

   medicamento.
5. 14.- El uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple. 15.- Un método de obtención de datos útiles, para el diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple, que

   comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) detectar el producto de expresión de IFNAR2.3
6. 16.- Un método de obtención de datos útiles según la reivindicación anterior, que además comprende: c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia. 17.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, donde los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados.
7. 18.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde la muestra biológica es suero.
8. 19.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, donde la cuantificación se hace mediante un inmunoensayo.
9. 20.- El método según la reivinidcaci�n 19, donde el inmunoensayo es un ELISA.
10. 21.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 19-20, donde el inmunoensayo es un ELISA s�ndwich.
11. 22.- Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (a)-(c) según cualquiera de las reivindicaciones 15-21, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con esclerosis múltiple cuando presentan un valor superior a 2,14 por encima del punto de corte establecido en la curva ROC.
12. 23 . Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (a)-(c) según cualquiera de las reivindicaciones 15-21, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos sin esclerosis múltiple cuando presentan un valor inferior a 1,14 por debajo del punto de corte establecido en la curva ROC.
13. 24.- Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para cuantificar el producto de expresión de

    IFNAR2.3.
14. 25.- El kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende un anticuerpo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 8-10.
15. 26.- Un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 24-25, que comprende una proteína recombinante según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
16. 27.- Un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 24-26, que además comprende:

    a) un soporte sólido que lleva unido un anticuerpo primario b) anticuerpo secundario c) una solución del anticuerpo de detección, marcado con un marcador enzim�tico; y d) un reactivo.
17. 28.- Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, donde el anticuerpo primario comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 3.
18. 29.- Un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 27-28, donde el anticuerpo secundario comprende la secuencia aminoac�dica SEQ ID NO: 4.
19. 30.- El uso de un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, para llevar a cabo un método según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 15 -23.
20. 31.- Un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 15 -23.
21. 32.- Una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 15 -23.

    Fig. 1 Fig. 2

    Fig. 3

    Fig. 4

    Fig. 5

    Fig. 6

    Densidad óptica. Placa activada con 1.2 μg/ml de anticuerpo de sensibilizaci�n (condición V)

    400 (condición c) 600 (condición d) 800 (condición e) Anticuerpo de detección ng/ml

    1/20 1/50 1/200 1/100 Dilución eluido de la columna

    Fig. 7(A)

    Densidad óptica. Placa activada con 1 μg/ml de anticuerpo de sensibilizaci�n(condición IV)

    Anticuerpo detección ng/ml

    1/20 1/50 1/100 1/200 Dilución eluido de la columna

    Fig. 7(B)

    Fig. 7(C)

    OD450 nM

    Densidad óptica. Placa sensiblizada con 0.8

    μg/ml. Anticuerpo de detección 400 ng/ml

22. 0.8

23. 0.6

24. 0.4

25. 0.2

    1/10 1/20 1/40 1/60 1/801/1001/1501/200

    Diluci�n eluido de la columna

    Fig. 7(D)

    Fig. 8 Fig. 9

    Fig. 10