ES2459590B1 - Composiciones para reducir el peso y la grasa corporal. - Google Patents

Abstract

Composiciones para reducir el peso y la grasa corporal.#La presente invención se refiere a una composición que comprende ácido hialurónico y sulfato de dermatano para su uso en reducir la ingesta de alimento, inducir la sensación de saciedad, reducir el apetito, reducir el peso corporal, prevenir el aumento de peso, reducir la grasa corporal o reducir la formación de grasa, todo ello asociado al sobrepeso u obesidad en un mamífero. La composición está en forma de alimento, alimento funcional o complemento alimenticio. Además la composición puede contener hidrolizado de colágeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para reducir el peso y la grasa corporal.

Sector técnico de la invención 5

La presente invención se refiere a composiciones para su uso en la reducción del sobrepeso o de la obesidad en un mamífero. Las composiciones pueden estar en forma de alimentos, alimentos funcionales o complementos alimenticios.

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Estado de la técnica anterior

La obesidad, definida como un exceso de peso corporal en forma de grasa, es un importante factor de riesgo de desórdenes clínicos graves, entre ellos la diabetes tipo 2 y la enfermedad cardiovascular, y es un problema de incidencia creciente y difícil tratamiento que acarrea un importante gasto socio-sanitario (véase 15 http://www.iaso.org/iotf/obesity/). Es conocido que muchas personas con sobrepeso u obesidad desarrollan resistencia a la insulina e hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, dislipidemia, e hipertensión, características que, en conjunto, conforman el llamado síndrome metabólico.

Una de las complicaciones metabólicas más frecuentes en la obesidad es la resistencia a la insulina (A. Astrup & N. 20 Finer, Obes. Rev. 1, 57-59 (2000)). La conexión entre ambas condiciones ha sido ampliamente estudiada y parece deberse a que, en los individuos obesos, el tejido adiposo libera cantidades incrementadas o anormales de ácidos grasos no esterificados, hormonas (adipoquinas) y citoquinas pro-inflamatorias, entre otros factores, que favorecen la pérdida de sensibilidad a la insulina en diferentes tejidos (S.E.
Kahn et al., Nature 444, 840-846 (2006)). La resistina, en particular, es una proteína secretada por adipocitos y/o macrófagos infiltrados en el tejido adiposo 25 obeso que actúa como un factor pro-inflamatorio y de resistencia a la insulina, y cuyos niveles circulantes están elevados en individuos obesos (D.R.
Schwartz & M.A.
Lazar,
Trends Endocrinol. Metab. 22, 259-265 (2011)). La reducción de la resistina se correlaciona con incrementos de la sensibilidad a la insulina (C.M. Steppan et al., Nature 409, 307-312 (2001); F. Felipe et al., Diabetes 53, 882-889 (2004)).

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La resistencia a la insulina es clínicamente relevante porque está estrechamente asociada a la diabetes de tipo 2 y otros problemas como hipertensión, dislipidemia, y defectos en la coagulación sanguínea y la fibrinolisis, todos los cuales se relacionan a su vez con la enfermedad cardiovascular (G. Boden, Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 18, 139-143 (2011)). En general, se acepta que el defecto primario en el desarrollo de diabetes de tipo 2 es el deterioro de la sensibilidad a la insulina, al que sigue una hiperinsulinemia compensatoria, e hiperglucemia cuando 35 los mecanismos de compensación fallan. Por tanto, la mejora de la homeostasis de la glucosa-insulina es un objetivo de salud de interés específico en sí mismo.

Las estrategias para la reducción de peso basadas únicamente en la restricción calórica y el aumento de la actividad física son difíciles de seguir, y se han mostrado ineficaces frente a la actual pandemia de obesidad. Paralelamente, 40 hay evidencia de que nutrientes específicos y otros ingredientes alimentarios influencian procesos bioquímicos que impactan sobre el balance energético y la acumulación de grasa de manera tal que pueden favorecer un fenotipo más magro (K. H. Kim & Y. Park, Annu. Rev. Food Sci. Technol. 2, 237-257 (2011); C. Pico et al., Rev. Esp. Obes. 4, 156-174 (2006); E. M. Kovacs & D. J. Mela, Obes. Rev. 7, 59-78 (2006)). Esta evidencia es la base para el desarrollo de complementos alimenticios o alimentos funcionales para el control de la obesidad. 45

Se han definido las siguientes estrategias principales en alimentación funcional para el control de la obesidad: (i) reducción de la ingesta, vía modulación de las sensaciones de hambre y/o saciedad, o limitando la biodisponibilidad de nutrientes; (ii) reducción de la densidad calórica en alimentos light; (iii) estimulación del gasto energético mediante activación de la termogénesis adaptativa; y (iv) redireccionamiento de nutrientes hacia tejidos y vías 50 metabólicas que los consumen, desfavoreciendo así la deposición de grasa (C. Pico et al., Rev. Esp. Obes. 4, 156-174 (2006)). Se considera de especial interés el uso de nutrientes o combinaciones de nutrientes capaces de afectar simultáneamente a varios de estos procesos (C Pico et al., Rev. Esp. Obes. 4, 156-174 (2006)).

La inhibición de la adipogénesis es otra posible estrategia anti-obesidad (K. H. Kim & Y. Park, Annu. Rev. Food Sci. 55 Technol. 2, 237-257 (2011)). La adipogénesis es el proceso de diferenciación de los adipocitos a partir de células precursoras, y ha sido muy estudiada principalmente en modelos celulares (B. Feve, Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 19, 483-499B (2005)). En humanos, un porcentaje considerable de los adipocitos, en torno al 10%, es renovado anualmente durante toda la vida adulta mediante la coordinación de adipogénesis de novo y muerte de adipocitos preexistentes (K. L. Spalding et al., Nature 453, 783-787 (2008)). Muchos individuos obesos 60 presentan un número excesivo de adipocitos (hiperplasia) en sus depósitos adiposos, y estos individuos son especialmente refractarios a la pérdida de peso a largo plazo y propensos al conocido efecto yo-yo. El control farmacológico o nutricional de la adipogénesis emerge en este contexto como una nueva diana terapéutica en el control de la obesidad, como coadyuvante en estrategias convencionales de control del balance energético: la

inhibición de la adipogénesis puede ayudar a normalizar (reducir) el número de adipocitos, y con ello al mantenimiento del peso tras la pérdida de peso (P. Arner & K. L. Spalding, Biochem. Biophys. Res. Commun. 396, 101-104 (2010)).

Los glicosaminoglicanos (GAGs) son biomoléculas poliméricas de elevado peso molecular formados por repeticiones 5 de una unidad disacarídica. Se encuentran fundamentalmente en los organismos vivos, donde desarrollan diferentes funciones fisiológicas.

El ácido hialurónico es un glicosaminoglicano no sulfatado, con una estructura polimérica caracterizada por un disacárido que se repite, constituido por los monosacáridos N-acetil-D-glucosamina y ácido D-glucurónico. Es uno de 10 los principales componentes del cartílago, de la membrana sinovial y del líquido sinovial. En particular, es importante su uso en el tratamiento de disfunciones articulares como la artrosis, generalmente por vía intraarticular. También se ha descrito su uso en oftalmología, en la cicatrización de heridas, así como en cosmética.

El sulfato de dermatano es un glicosaminoglicano sulfatado con una estructura polimérica constituida 15 mayoritariamente por disacáridos de N-acetil-D-galactosamina sulfatada en posición 4 y ácido L-idurónico, a menudo sulfatado en posición 2. Se ha descrito que participa en la reparación de heridas y en la regulación de la coagulación de la sangre. Esta sustancia se usa en gran medida en cosmética.

El hidrolizado de colágeno está constituido por una mezcla de aminoácidos y péptidos de peso molecular bajo. Se 20 obtiene por hidrólisis enzimática controlada de la proteína colagenosa contenida en la piel y en otros tejidos conjuntivos. Se utiliza mayoritariamente en cosmética.

La solicitud de patente US 2005084518 describe un alimento para la salud (health food) que contiene ácido hialurónico y sulfato de dermatano. Dicho alimento es útil para el embellecimiento de la piel. 25

En la patente US 7,763,594 se describe el uso de una composición de ácido hialurónico y sulfato de dermatano para tratar la artrosis.

A la vista de lo anterior, el proporcionar composiciones para el control del sobrepeso y/o de la obesidad, así como de 30 algunas de sus complicaciones metabólicas, es un tema de enorme interés en el campo nutricional.

Explicación de la invención

Los presentes inventores han encontrado que las composiciones definidas más abajo, ejercen un efecto sinérgico 35 anti-adipogénico, incluso en presencia de un cóctel hormonal pro-adipogénico; inhiben la expresión de resistina (adipoquina relacionada con la resistencia a la insulina); reducen la ganancia de peso y la ingesta energética acumulada en ratones alimentados ad libitum; reducen la insulinemia y la trigliceridemia en ratones; y provocan la pérdida de peso y de grasa, así como ganancia de masa grasa, en ratones obesos. Por ello, las referidas composiciones pueden ser utilizadas en forma de alimento, alimento funcional o complemento alimenticio en reducir 40 la ingesta de alimento, inducir la sensación de saciedad, reducir el apetito, reducir el peso corporal, prevenir el aumento de peso, reducir la grasa corporal, reducir la formación de grasa, reducir el colesterol en sangre, mantener los niveles normales de colesterol en sangre, reducir los triglicéridos en sangre, mantener los niveles normales de triglicéridos en sangre o aumentar la sensibilidad a la insulina.

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La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende ácido hialurónico y sulfato de dermatano para la preparación de un alimento, un alimento funcional o de un complemento alimenticio para reducir la ingesta de alimento, inducir la sensación de saciedad, reducir el apetito, reducir el peso corporal, prevenir el aumento de peso, reducir la grasa corporal o reducir la formación de grasa, todo ello asociado al sobrepeso u obesidad en un mamífero. Aunque la composición que comprende ácido hialurónico y sulfato de dermatano también puede usarse 50 para la preparación de un alimento, un alimento funcional o de un complemento alimenticio para reducir el colesterol en sangre, mantener los niveles normales de colesterol en sangre, reducir los triglicéridos en sangre, mantener los niveles normales de triglicéridos en sangre o aumentar la sensibilidad a la insulina en un mamífero con al menos una de las enfermedades que conforman el síndrome metabólico, estos uso no constituyen el objeto de la invención, aunque posteriormente se pueda hacer mención a ellos en la descripción que sigue. 55

Preferentemente, el uso es para reducir la ingesta de alimento, inducir la sensación de saciedad o reducir el apetito. Igual de preferente es el uso para reducir la grasa corporal o reducir la formación de grasa. Igual de preferente es el uso para reducir los niveles de triglicéridos en sangre. Igualmente, se prefiere el uso para aumentar la sensibilidad a la insulina el peso corporal o prevenir el aumento de peso. 60

Otro aspecto de la invención es el uso de una composición, definida anteriormente, para la preparación de un alimento, alimento funcional o un complemento alimenticio para reducir la acumulación de grasa visceral y/o subcutánea.

En una realización preferida, el ácido hialurónico y el sulfato de dermatano están presentes en una relación en peso ácido hialurónico a sulfato de dermatano comprendida entre 1:0,05 y 1:0,75, preferentemente entre 1:0,10 y 1:0,50. La relación en peso ácido hialurónico a sulfato de dermatano especialmente preferida es 1:0,25.

En otra realización igualmente preferida la composición además comprende hidrolizado de colágeno. 5 Preferentemente, el ácido hialurónico, el sulfato de dermatano y el hidrolizado de colágeno están presentes en una relación en peso ácido hialurónico a sulfato de dermatano a hidrolizado de colágeno comprendida entre 1:0,06:0,03 y 1:0,80:0,40, preferentemente entre 1:0,10:0,05 y 1:0,40:0,20. La relación en peso ácido hialurónico a sulfato de dermatano a hidrolizado de colágeno especialmente preferida es 1:0,20:0,10.

10

En otra realización preferida, el mamífero es obeso o tiene sobrepeso asociado al síndrome metabólico.

En otra realización igualmente preferida el mamífero es un humano.

Preferentemente, la composición se adapta para la administración oral o parenteral. La más preferida es la 15 administración oral.

Otro aspecto de la invención es una composición definida anteriormente para su uso en la preparación de un alimento funcional o un complemento alimenticio para reducir la adipogénesis.

20

En la presente invención, el término “comprende” debe interpretarse de forma que también incluye el caso de “consiste únicamente en” y el de “consiste esencialmente en”.

En la presente invención, cuando se habla de ácido hialurónico y de sulfato de dermatano se incluye cualquier sal de los mismos, por ejemplo la sal de sodio, de potasio o de calcio. 25

Preferentemente, el ácido hialurónico y el sulfato de dermatano de las composiciones de la presente invención están en forma de sal de sodio.

En la presente invención, los pesos moleculares medios de ácido hialurónico, sulfato de dermatano y sulfato de 30 condroitina se han determinado por cromatografía de permeación de gel (GPC).

En la presente invención, la abreviatura HA significa ácido hialurónico (Hyaluronic Acid), la abreviatura DS significa sulfato de dermatano (Dermatan Sulphate), la abreviatura CH significa hidrolizado de colágeno (Collagen Hydrolysate) y la abreviatura CS significa sulfato de condroitina (Chondroitin Sulphate). 35

En la presente invención los siguientes términos tienen el significado indicado:

“Alimento funcional” se refiere a un alimento que, aparte de su papel nutritivo básico desde el punto de vista material y energético, es capaz de proporcionar un beneficio para la salud por contener uno o más componentes 40 biológicamente activos o una combinación de componentes biológicamente activa (una composición de la invención). El alimento funcional forma parte de la dieta de un individuo.

“Complemento alimenticio” se refiere a un suplemento de la dieta que contiene en forma concentrada uno o más nutrientes u otros componentes biológicamente activos (una composición de la invención) con efecto nutritivo o 45 fisiológico beneficioso para la salud. Se administra en forma de comprimidos, cápsulas o en cualquier otra forma dosificada.

“Alimento dietético” se refiere a un alimento que por su composición está indicado para un objetivo nutricional específico. 50

“Síndrome metabólico” se refiere a cuando se asocian en una misma persona con sobrepeso u obesidad varios de entre un conjunto de diversos factores de riesgo, tales como la resistencia a la insulina e hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, dislipidemia, e hipertensión.

55

“Inducir la sensación de saciedad” se refiere a inducir a que el cuerpo (el individuo) se sienta satisfecho y no tenga hambre, entendida como necesidad de ingesta inmediata de alimentos.

“Mantener los niveles normales de colesterol en sangre” se refiere a mantener los niveles de colesterol total por debajo de 200 mg/dL, mantener los niveles de colesterol LDL por debajo de 100 mg/dL y mantener los niveles de 60 colesterol HDL por encima de 40 mg/dL.

“Colesterol LDL” se refiere al colesterol ligado a las lipoproteínas de baja densidad (Low Density Lipoproteins), conocido también como “colesterol malo”.

“Colesterol HDL” se refiere al colesterol ligado a las lipoproteínas de alta densidad (High Density Lipoproteins), conocido también como “colesterol bueno”.

“Hipercolesterolemia” se refiere a cuando los niveles de colesterol total y/o colesterol LDL en sangre son elevados.

5

“Mantener los niveles normales de triglicéridos en sangre” se refiere a mantener los niveles de triglicéridos por debajo de 150 mg/dL.

“Vía parenteral” se refiere a cuando los medicamentos o los nutrientes son introducidos en el cuerpo sin ser absorbidos por el tracto gastro-intestinal. Las vías parentelares de uso más frecuente son la intravenosa, subcutánea 10 e intramuscular.

El ácido hialurónico y el sulfato de dermatano de las composiciones de la presente invención se pueden obtener por procedimientos extractivos a partir de tejidos de aves o de mamíferos o bien por biotecnología.

15

Los pesos moleculares medios del ácido hialurónico y del sulfato de dermatano de las composiciones de la presente invención pueden variar dependiendo del procedimiento de obtención. Preferentemente, el peso molecular medio del ácido hialurónico está comprendido entre 300.000 y 2.000.000 daltons, más preferentemente entre 800.000 y 1.000.000 daltons y el del sulfato de dermatano está comprendido entre 10.000 y 50.000 daltons.

20

El ácido hialurónico de las composiciones de la presente invención se puede obtener, mediante extracción, a partir de tejidos de aves o de mamíferos, por ejemplo a partir de humor vítreo, piel de mamífero, cordón umbilical o crestas de aves o bien por fermentación de microorganismos (por ejemplo Streptococcus), siguiendo procedimientos descritos en la literatura (D.A. Swann, Biochim. Biophys. Acta 156, 17-30 (1968); patente US 4,780,414).

25

Preferentemente, el ácido hialurónico de las composiciones de la presente invención es un producto comercial disponible en www.bioiberica.com. Se obtiene a partir de crestas de gallo, las cuales una vez picadas se digieren con un enzima proteolítico. Posteriormente se desactiva el enzima mediante calentamiento, se filtra, se elimina el sulfato de dermatano y se precipita el ácido hialurónico, el cual se anhidrifica, se seca y se moltura. Dicho ácido hialurónico en forma de sal de sodio presenta una riqueza mínima del 90%, determinada por contenido en ácido 30 glucurónico, y un peso molecular medio comprendido entre 800.000 y 1.000.000 daltons.

El sulfato de dermatano de las composiciones de la presente invención se puede obtener a partir de tejidos de aves o de mamíferos, por ejemplo a partir de mucosa porcina o bovina, crestas de aves o piel de mamífero, siguiendo procedimientos descritos en la literatura (N. Volpi, Anal. Biochem. 218, 382-391 (1994); patente EP 238994). 35

Preferentemente, el sulfato de dermatano de las composiciones de la presente invención se obtiene a partir de crestas de gallo, en el procedimiento de obtención del ácido hialurónico. Una vez separado el sulfato de dermatano en forma de complejo, se rompe el complejo mediante fuerza iónica, se precipita, se anhidrifica, se seca y se moltura. También se puede emplear el sulfato de dermatano de mucosa porcina comercializado por la empresa 40 Sigma-Aldrich Química (Referencia: C3788). El sulfato de dermatano en forma de sal de sodio que proviene de crestas de gallo presenta una riqueza mínima del 90%, determinada por valoración fotométrica, y un peso molecular medio comprendido entre 10.000 y 50.000 daltons.

El hidrolizado de colágeno de las composiciones de la presente invención se puede obtener de piel de mamífero o 45 de crestas de gallo, siguiendo procedimientos descritos en la literatura (“Final Report on the Safety Assessment of Hydrolyzed Collagen”, Journal of the American College of Toxicology 4, nº5, 199-221, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, (1985)).

Las composiciones de la presente invención se pueden preparar mezclando sus componentes en las proporciones 50 deseadas. Así, se pueden preparar composiciones que contengan ácido hialurónico y sulfato de dermatano, o bien ácido hialurónico, sulfato de dermatano e hidrolizado de colágeno (aminoácidos y péptidos de bajo peso molecular).

Las composiciones de la presente invención también se pueden obtener directamente a partir de tejidos de aves o de mamíferos mediante un procedimiento extractivo. Así, por ejemplo, se puede partir de crestas de gallo 55 congeladas, las cuales una vez picadas se digieren con un enzima proteolítico. Posteriormente se desactiva el enzima mediante calentamiento, se filtra y se precipita con solventes. A continuación se filtra, se lava y se seca. Finalmente se puede proceder al molturado. El producto obtenido comprende ácido hialurónico, sulfato de dermatano e hidrolizado de colágeno (en forma de aminoácidos y péptidos de bajo peso molecular). Modificando ligeramente éste procedimiento se pueden obtener composiciones que comprendan ácido hialurónico y sulfato de 60 dermatano, pero no hidrolizado de colágeno. La presencia de los tres componentes (HA, DS y CH) o de sólo dos (HA y DS) y la proporción entre ellos dependerá del procedimiento de obtención (tipo de enzima, temperatura, tiempo de reacción y proceso de purificación).

La composición de la invención que comprende ácido hialurónico, sulfato de dermatano e hidrolizado de colágeno más preferida es la que comprende 65% de ácido hialurónico (HA), 13,40% de sulfato de dermatano (DS) y 6,56% de hidrolizado de colágeno (CH) (relación en peso HA:DS:CH 1:0,20:0,10).

En la presente invención, el glicosaminoglicano sulfato de condroitina se ha empleado únicamente con fines 5 comparativos. El sulfato de condroitina presenta una estructura polimérica caracterizada por un disacárido que se repite, constituido por N-acetil-D-galactosamina y ácido D-glucurónico. La mayoría de los residuos de N-acetil-D-galactosamina están sulfatados. Se puede obtener mediante digestión enzimática proteolítica de tejidos cartilaginosos de animales, por ejemplo tráqueas de ganado bovino o porcino o esqueletos cartilaginosos de peces. El sulfato de condroitina que procede del tejido cartilaginoso se encuentra principalmente en dos formas isoméricas, 10 el 4-sulfato de condroitina y el 6-sulfato de condroitina. El peso molecular medio del sulfato de condroitina puede variar dependiendo de su origen y/o del procedimiento de obtención empleado. Generalmente, tiene un peso molecular medio comprendido entre 10.000 y 70.000 daltons.

El sulfato de condroitina en forma de sal de sodio utilizado con fines comparativos en el Ejemplo 1 de la presente 15 invención es un producto comercial disponible en www.bioiberica.com con una riqueza mínima del 98%, determinada por valoración fotométrica, y un peso molecular medio comprendido entre 14.000 y 18.000 daltons. Se obtiene a partir de cartílago de origen bovino.

Para utilizar las composiciones de la presente invención en reducir la ingesta de alimento, inducir la sensación de 20 saciedad, reducir el apetito, reducir el peso corporal, prevenir el aumento de peso, reducir la grasa corporal, reducir la formación de grasa, reducir el colesterol en sangre, mantener los niveles normales de colesterol en sangre, reducir los triglicéridos en sangre, mantener los niveles normales de triglicéridos en sangre, aumentar la sensibilidad a la insulina en un mamífero o como producto adelgazante, se preparan complementos alimenticios que contienen una composición de la invención y componentes y/o aditivos/excipientes adecuados empleados en nutrición o en 25 farmacia, o bien se preparan alimentos o alimentos funcionales, adicionando las composiciones de la invención a los alimentos que forman parte de la dieta. El complemento alimenticio puede estar en forma de comprimidos, cápsulas, soluciones, suspensiones o sobres. El alimento funcional puede estar en forma de yogures, leche, leche fermentada, jugos de frutas, jugos de vegetales, sopas, alimentos deshidratados, galletas o alimentos infantiles.

Breve descripción de las Figuras 30

La Figura 1 muestra las imágenes, al microscopio de contraste de fase, de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) cultivados durante 8 días en medio de crecimiento conteniendo: vehículo (agua, Control); ácido hialurónico (HA) a concentración final (c.f.) 80 g/mL; sulfato de dermatano (DS) a c.f. 20 g/mL; o composición de la invención HA80+DS20 a c.f. 100 g/mL. Se aprecian gotas de grasa intracelulares refringentes al microscopio de contraste de 35 fase en todos los cultivos, excepto el tratado con HA80+DS20. (Magnificación x200).

La Figura 2 muestra los niveles de expresión de los ARN mensajeros (mRNA) para los factores de transcripción adipogénicos PPARgamma (A) y C/EBPalfa (B) y para la proteína lipogénica ácido graso sintasa (FAS) (C) en MEFs cultivados durante 8 días en medio de crecimiento suplementado con: vehículo (agua); HA a c.f. 80 g/mL; DS a c.f. 40 20 g/mL; CS a c.f. 20 g/mL o composición de la invención HA80+DS20 a c.f. 100 g/mL. Los niveles de mRNA para beta-actina se emplearon como control interno. Los resultados se expresan en tanto por uno del nivel de expresión en las células control tratadas con vehículo, y son la media  SEM de al menos seis muestras para cada condición ensayada, distribuidas en dos experimentos independientes. ***; P= 0,001 vs vehículo, t-test.

45

La Figura 3 muestra los niveles de expresión de los ARN mensajeros (mRNA) para los factores de transcripción adipogénicos PPARgamma (A) y C/EBPalfa (B) y para la proteína lipogénica FAS (C) en MEFs tras 8 días de diferenciación en medio conteniendo un cóctel hormonal adipogénico suplementado con: vehículo (agua); HA a c.f. 80 g/mL; DS a c.f. 20 g/mL; o composición de la invención HA80+DS20 a c.f. 100 g/mL. Los niveles de mRNA para beta-actina se emplearon como control interno. Los resultados se expresan en tanto por uno del nivel de 50 expresión en las células control tratadas con vehículo, y son la media  SEM de triplicados para cada tratamiento. *; P<0,05 vs vehículo, t-test.

La Figura 4 muestra los niveles de expresión de resistina en MEFs tras 8 días de diferenciación en medio adipogénico en presencia de diferentes concentraciones finales de HA+DS en una relación en peso HA a DS de 55 1:0,25. Los niveles de mRNA para la beta-actina se emplearon como control interno. Los resultados se expresan en tanto por uno del nivel de expresión en las células control tratadas con vehículo, y son la media  SEM de cuatro experimentos realizados en triplicados. Las letras diferentes (a, b) implican cambios significativos según ANOVA de un factor (P<0,05).

60

La Figura 5 muestra la ingesta acumulada tras 143 días de suplementación por vía oral con vehículo (agua, grupo Control), o con una composición de la invención, a dosis 0,45 mg/ratón/día (grupo HA+DS+CH). Los datos

representados corresponden a la media  SEM de 8 animales por grupo, distribuidos en 2 jaulas de 4 animales cada una. **; P<0,01 HA+DS+CH vs Control, t-test.

La Figura 6 muestra los niveles circulantes de glucosa (A), niveles circulantes de insulina (B) e índice HOMA-IR (C) en ratones tratados por vía oral con vehículo (agua, grupo Control) o con una composición de la invención, a dosis 5 0,45 mg/ratón/día (grupo HA+DS+CH). Los análisis se efectuaron tras 88 días de tratamiento, después de sometidos los animales a un ayuno de 6 h. Los datos corresponden a la media  SEM de 7-8 animales por grupo. *; P<0,05 HA+DS+CH vs Control, t-test.

La Figura 7 muestra los niveles circulantes de triacilgliceroles en el estado alimentado en ratones tras 143 días de 10 tratamiento con vehículo (grupo Control) o con una composición de la invención, a dosis 0,45 mg/ratón/día (grupo HA+DS+CH). Los datos corresponden a la media  SEM de 7-8 animales por grupo. *; P<0,05 HA+DS+CH vs Control, t-test.

La Figura 8 muestra la evolución de la pérdida de masa grasa (A) y la ganancia relativa de masa magra (B) en 15 ratones con obesidad dietética en fase de adelgazamiento, tratados diariamente por vía oral con vehículo (grupo Control) o con una composición de la invención, a dosis 3 mg/ratón/día (grupo HA+DS+CH). Los resultados son la media  SEM de 7-8 animales por grupo. *; P<0,05 HA+DS+CH vs Control a tiempo respectivo, t-test.

La Figura 9 muestra el peso de los depósitos de tejido adiposo blanco inguinal (TABi), retroperitoneal (TABr) y 20 epididimal (TABe), e índice de adiposidad corporal en ratones expuestos durante 32 días a condiciones de adelgazamiento y tratados con vehículo (grupo Control) o con una composición de la invención, a dosis 3 mg/ratón/día (grupo HA+DS+CH). El índice de adiposidad se definió, para cada animal, como la suma del peso de sus depósitos de TAB expresada como porcentaje del peso corporal. Los resultados son la media  SEM de 7 animales por grupo. *; P<0,05 HA+DS+CH vs Control, t-test. 25

La Figura 10 muestra los niveles circulantes en el estado alimentado de glucosa (A) e insulina (B) en ratones expuestos durante 32 días a condiciones de adelgazamiento y tratados con vehículo (grupo Control) o con una composición de la invención, a dosis 3 mg/ratón/día (grupo HA+DS+CH). Los resultados son la media  SEM de 6-7 animales por grupo. *; P<0,05 HA+DS+CH vs Control, t-test. 30

Descripción detallada de las realizaciones preferidas:

Los siguientes ejemplos son a título ilustrativo, y no representan una limitación del alcance de la presente invención.

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Ejemplo 1: Estudio de eficacia de una composición de la presente invención en la inhibición de la adipogénesis espontánea de fibroblastos embrionarios de ratón, en comparación con ácido hialurónico, sulfato de dermatano y sulfato de condroitina

La adipogénesis es el proceso de formación de células almacenadoras de grasa (adipocitos) a partir de células 40 precursoras. La obesidad se correlaciona a menudo con la presencia de un exceso de adipocitos en los depósitos grasos. El objetivo del estudio fue comparar el potencial de una combinación de ácido hialurónico y sulfato de dermatano, en una relación en peso HA a DS de 1:0,25 (HA80+DS20), y de sus componentes individuales de inhibir la acumulación intracelular de lípidos y la expresión de genes marcadores de adipocitos en cultivos de fibroblastos primarios embrionarios de ratón (MEFs) mantenidos en medio de crecimiento. También se llevó a cabo una 45 comparación con el glicosaminoglicano sulfato de condroitina. Los MEFs son células multipotentes, cultivables, capaces de diferenciarse en diferentes tipos celulares mesenquimales (adipocitos, condrocitos, osteoblastos) dependiendo de la estimulación hormonal que reciban. Algunos estudios han reportado que el suero del medio de cultivo puede inducir la adipogénesis espontánea en células mesenquimales multipotentes como los MEFs (L. Wu et al., J. Cell Mol. Med. 14, 922-932 (2010)). 50

Materiales y métodos

MEFs obtenidos a partir de embriones de 13 días de edad gestacional fueron cultivados en monocapa hasta llegar a la confluencia, en medio de crecimiento consistente en medio basal AmnioMAXTM-C100 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 55 USA) suplementado con suplemento AmnioMAXTM-C100 (7,5%), suero bovino fetal (7,5%) y antibióticos, en placas de cultivo de 12 pocillos de 1 mL de capacidad/pocillo, siguiendo un protocolo previamente descrito (J.B. Hansen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 4112-4117 (2004)). Dos días después de alcanzada la confluencia, que se considera el día 0 de cultivo, las células fueron expuestas a: vehículo (agua); ácido hialurónico (HA) a concentración final (c.f.) 80 g/mL; sulfato de dermatano (DS) a c.f. 20 g/mL; sulfato de condroitina (CS) a c.f. 20 g/mL; o 60 composición de la presente invención HA80+DS20 a c.f. 100 g/mL, que contenía por mL 80 g de HA y 20 g de DS. El medio de cultivo en contacto con las células se cambió cada dos días (días 2, 4 y 6 de cultivo) por medio fresco, siempre con los suplementos arriba indicados. Las células fueron recogidas a día 8 de cultivo, tras ser examinadas y fotografiadas al microscopio de contraste de fase para visualizar su forma y la eventual acumulación

de lípidos. Los niveles de mRNAs de los genes relacionados con la diferenciación adipocitaria PPARgamma, C/EBPalfa y ácido graso sintasa (FAS) se determinaron por PCR a tiempo real, a partir de RNA total extraído de las células con reactivo Trizol y retrotranscrito con transcriptasa inversa, y utilizando el mRNA de beta-actina como control interno. Las parejas de primers específicas de cada gen se determinaron usando el software Primer 3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, USA), y su especificidad se contrastó mediante las 5 bases de datos ENTREZ y BLAST (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA). Los primers fueron producidos por Sigma (Madrid, Spain). La significancia estadística de diferencias respecto del tratamiento con vehiculo fue analizada mediante t de Student. El umbral de significancia se estableció en P<0,05.

Resultados 10

La observación de las células a día 8 de cultivo reveló la presencia de numerosas islas de células diferenciadas espontáneamente en adipocitos llenos de gotas de grasa, refringentes al microscopio de contraste de fase, en los cultivos tratados con vehículo, HA80 y DS20, pero no en los tratados con la composición de la invención HA80+DS20 (Figura 1). 15

De acuerdo con lo anterior, al nivel molecular, la expresión de los genes marcadores adipocitarios PPAR, C/EBP y FAS resultó drástica y significativamente reducida en las células tratadas con la composición de la invención HA80+DS20, pero no en las tratadas con los componentes de la composición por separado o con CS (Figura 2).

20

Estos resultados indican que la combinación de ácido hialurónico y sulfato de dermatano inhibe la adipogénesis espontánea en MEFs en cultivo en un efecto sinérgico, que excede a la suma de los efectos de los componentes individuales de la combinación por separado. Por lo tanto, la composición de la invención puede ser de gran utilidad en reducir la formación de grasa.

25

Ejemplo 2: Estudio de eficacia de una composición de la presente invención en la inhibición de la expresión de marcadores adipocitarios durante la adipogénesis de fibroblastos embrionarios de ratón inducida hormonalmente, en comparación con ácido hialurónico y sulfato de dermatano

El objetivo del estudio era comparar el potencial de una combinación de ácido hialurónico y sulfato de dermatano, en 30 una relación en peso HA a DS de 1:0,25 (HA80+DS20), y de sus componentes individuales de afectar la adipogénesis en cultivos de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) estimulados hormonalmente a diferenciarse en adipocitos.

Materiales y métodos 35

MEFs obtenidos a partir de embriones de 13 días de edad gestacional fueron cultivados en monocapa hasta llegar a la confluencia en placas de cultivo de 12 pocillos de 1 mL de capacidad/pocillo, tal y como se ha descrito para el Ejemplo 1. Dos días después de alcanzada la confluencia (día 0), las células fueron estimuladas exponiéndolas durante 48 horas a un cóctel hormonal adipogénico estándar conteniendo dexametasona, metilisobutilxantina, 40 insulina y rosiglitazona. Subsecuentemente, las células recibieron cada dos días (días 2, 4 y 6) medio de crecimiento fresco suplementado con insulina y rosiglitazona. El proceso de diferenciación se llevó a cabo en células expuestas desde día 0 a: vehículo (agua); HA a concentración final (c.f.) 80 g/mL; DS a c.f. 20 g/mL; o composición de la presente invención HA80+DS20 a c.f. 100 g/mL, que contenía por mL 80 g de HA y 20 g de DS. Las células fueron recogidas a día 8 de cultivo. Los niveles de mRNAs de genes seleccionados se determinaron por PCR a 45 tiempo real, como se ha descrito para el Ejemplo 1.

Resultados

La expresión de los genes marcadores adipocitarios PPARgamma, C/EBPalfa y FAS se vio reducida en las células 50 expuestas a la composición de la invención HA80+DS20 durante el proceso adipogénico, pero no en las expuestas a los componentes individuales de la composición, HA o DS, por separado (Figura 3).

Estos resultados indican que la combinación de HA y DS ejerce un efecto sinérgico anti-adipogénico incluso bajo condiciones ambientales (presencia de un cóctel hormonal pro-adipogénico) que promueven este proceso. En 55 consecuencia, la composición de la invención puede ser útil en reducir la formación de grasa.

Ejemplo 3: Estudio de eficacia de una composición de la presente invención en la inhibición de la expresión de resistina, una adipoquina relacionada con la resistencia a la insulina, en adipocitos derivados de MEFs

60

El objetivo era estudiar el efecto de una combinación de ácido hialurónico y sulfato de dermatano, a diferentes concentraciones, en una relación en peso HA a DS de 1:0,25 (HA+DS), sobre la expresión de proteínas de secreción de los adipocitos que han sido previamente implicadas como factores que potencian la resistencia a la insulina, en

particular la resistina, en células adiposas en cultivo. En el mismo estudio también se determinó el efecto del ácido hialurónico y del sulfato de dermatano por separado.

Materiales y métodos

5

MEFs obtenidos a partir de embriones de 13 días de edad gestacional fueron cultivados en monocapa hasta llegar a la confluencia y expuestos a un cóctel hormonal adipogénico estándar tal y como se ha descrito para el Ejemplo 2, en presencia de: vehículo (agua); HA a c.f. 80 g/mL; DS a c.f. 20 g/mL; composición de la invención HA16+DS4 a c.f. 20 g/mL, que contenía por mL 16 g de HA y 4 g de DS; composición de la invención HA80+DS20 a c.f. 100 g/mL, que contenía por mL 80 g de HA y 20 g de DS; o composición de la invención HA160+DS40 a c.f. 200 10 g/mL, que contenía por mL 160 g de HA y 40 g de DS. Las células fueron recogidas a día 8 de cultivo. Los niveles de expresión del gen de la resistina se determinaron por PCR a tiempo real, como se ha descrito para el Ejemplo 1.

Resultados 15

La exposición a las composiciones de la invención HA16+DS4 a concentración final 20 g/mL, HA80+DS20 a concentración final 100 g/mL ó HA160+DS40 a concentración final 200 g/mL, redujo la expresión de resistina tras 8 días de diferenciación adipocitaria de MEFs, de manera dosis-dependiente (Figura 4). El efecto de las composiciones de la invención sobre la expresión génica de resistina no fue reproducido por los componentes 20 individuales HA80 y DS20 cuando fueron ensayados por separado. En consecuencia, las composiciones de la invención pueden ser útiles en aumentar la sensibilidad a la insulina.

Ejemplo 4: Efecto de la suplementación con una composición de la presente invención sobre la reducción de la ganancia de peso y de la ingesta energética en ratones 25

El objetivo era estudiar el efecto de la suplementación por vía oral con una composición de la presente invención (HA+DS+CH) sobre la evolución de parámetros biométricos in vivo, en ratones.

Se empleó una composición que contenía 65% de ácido hialurónico (HA), 13,40% de sulfato de dermatano (DS) y 30 6,56% de hidrolizado de colágeno (CH) (relación en peso HA:DS:CH 1:0,20:0,10).

Materiales y métodos

Ratones C57BL6/J machos (Charles River Laboratories, Barcelona, Spain) de 6 semanas de edad al inicio del 35 experimento fueron estabulados a 22ºC con un periodo de luz/oscuridad de 12 horas, bajo condiciones de alimentación ad libitum con una dieta estándar definida (fabricada por Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ, USA) que contenía 3,85 Kcal/g de dieta. Al inicio del experimento se establecieron dos grupos experimentales (n=8 animales por grupo), que recibieron diariamente por vía oral, durante 143 días, vehículo (agua, grupo Control), o una composición de la presente invención (HA+DS+CH), a dosis 0,45 mg/ratón/día (grupo HA+DS+CH; relación en peso 40 HA:DS:CH 1:0,20:0,10). Se hizo un seguimiento del peso corporal y la ingesta de los animales durante los 143 días de tratamiento. La significancia estadística de los efectos observados fue analizada mediante test de la t de Student. El umbral de significancia se estableció a P<0,05.

Resultados 45

Los animales tratados con la composición de la invención HA+DS+CH tendieron a ganar menos peso y, al final del experimento, su peso corporal fue un 5% menor que el de los controles (mediaSEM: pesos iniciales: grupo Control, 22,50,8 g; grupo HA+DS+CH, 22,50,7 g; pesos finales: grupo Control, 29,01.0 g; grupo HA+DS+CH, 27,51.0 g).

50

La ingesta acumulada durante los 143 días del experimento fue un 11% menor en los animales tratados con HA+DS+CH que en los animales del grupo Control a los que se administró el vehículo (P<0,05) (Figura 5).

Los resultados in vivo obtenidos permiten afirmar que las composiciones de la presente invención pueden ser útiles en reducir el peso corporal, la ganancia de peso, la ingesta de alimento y el apetito, en prevenir el aumento de peso y en inducir la sensación de saciedad. 55

Ejemplo 5: Efecto de la suplementación por vía oral con una composición de la presente invención sobre parámetros relacionados con la sensibilidad a la insulina en ratones

El objetivo era estudiar el efecto de la suplementación por vía oral con una composición de la presente invención 60 (HA+DS+CH) sobre la sensibilidad a la insulina in vivo, en ratones.

Se empleó una composición que contenía 65% de ácido hialurónico (HA), 13,40% de sulfato de dermatano (DS) y 6,56% de hidrolizado de colágeno (CH) (relación en peso HA:DS:CH 1:0,20:0,10).

Materiales y métodos

Se utilizaron los mismos grupos experimentales del Ejemplo 4. Tras 88 días de tratamiento, los animales de ambos grupos, Control y HA+DS+CH, fueron sometidos a un ayuno de 6 h tras el cual se les extrajo sangre, para la determinación de los niveles circulantes de glucosa (por sistema Accu-Check, de Roche) e insulina (mediante un kit 5 de ELISA, distribuido por DGR Instruments GnbH). Para cada animal se calculó el índice HOMA-IR (homeostatic model assessment for insulin resistance), que es un índice bien aceptado indicativo de la sensibilidad relativa a la insulina, utilizando la fórmula de Matthews et al. (D.R. Matthews et al., Diabetologia 28, 412-419 (1985)): HOMA-IR= glucosa en ayunas (mM) x insulina en ayunas (mU/L)/22,5. Cuanto menor el índice HOMA-IR, menor es la resistencia a la insulina y por tanto mayor la sensibilidad a esta hormona. Este índice se ha validado en humanos y 10 ratones (S. Lee et al.
Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 294, E261-70 (2008)).

Resultados

Los animales suplementados con HA+DS+CH a igual glucemia presentaron una menor insulinemia que los animales 15 controles, y por tanto un índice HOMA-IR también menor (Figura 6). Estos resultados indican que la sensibilidad a la insulina es mayor en el grupo suplementado con la composición de la invención que comprende ácido hialurónico, sulfato de dermatano e hidrolizado de colágeno (HA+DS+CH) que en el grupo control. El deterioro de la sensibilidad a la insulina es considerado uno de los principales detonantes del desarrollo de diabetes de tipo 2, junto con la disfunción de las células beta pancreáticas (D. LeRoith, Am. J. Med. 113 (Suppl 6A), 3S-11S (2002)). 20

Los resultados in vivo obtenidos en el presente estudio permiten afirmar que las composiciones de la presente invención pueden ser útiles en aumentar la sensibilidad a la insulina.

Ejemplo 6: Efecto de la suplementación por vía oral con una composición de la presente invención sobre los 25 niveles de triacilgliceroles en ratones

El objetivo era estudiar el efecto de la suplementación por vía oral con una composición de la presente invención (HA+DS+CH) sobre los niveles circulantes de triacilgliceroles in vivo, en ratones.

30

Se empleó una composición que contenía 65% de ácido hialurónico (HA), 13,40% de sulfato de dermatano (DS) y 6,56% de hidrolizado de colágeno (CH) (relación en peso HA:DS:CH 1:0,20:0,10).

Materiales y métodos

35

Se utilizaron los mismos grupos experimentales del Ejemplo 4. Tras 143 días de tratamiento, los animales de ambos grupos, Control y HA+DS+CH, fueron sacrificados por decapitación. Se determinaron los niveles de triglicéridos circulantes en suero preparado a partir de sangre del cuello, mediante un ensayo enzimático colorimétrico comercial (Sigma).

40

Resultados

Tras 143 días de suplementación, los animales suplementados con la composición de la invención que comprende ácido hialurónico, sulfato de dermatano e hidrolizado de colágeno (HA+DS+CH) presentaron menor trigliceridemia que los controles a los que se había administrado el vehículo (Figura 7). En consecuencia, las composiciones de la 45 presente invención pueden ser de gran utilidad en reducir los triglicéridos en sangre.

Ejemplo 7: Efecto de la suplementación por vía oral con una composición de la presente invención sobre la reversión de la obesidad en ratones

50

El objetivo era estudiar la pérdida de peso y de grasa en ratones obesos al ser tratados por vía oral con una composición de la presente invención (HA+DS+CH).

Se empleó una composición que contenía 65% de ácido hialurónico (HA), 13,40% de sulfato de dermatano (DS) y 6,56% de hidrolizado de colágeno (CH) (relación en peso HA:DS:CH 1:0,20:0,10). 55

Materiales y métodos

Se emplearon ratones C57BL6/J machos de 25 semanas de edad a los que previamente se les había inducido obesidad dietética por alimentación con dieta hiperlipídica desde las 6 semanas de vida. Los ratones presentaban, 60 en el momento del inicio del experimento, un 22% de exceso de peso respecto de animales de la misma edad mantenidos bajo dieta estándar. Al inicio del experimento, los ratones obesos pasaron a ser alimentados con una dieta normolipídica, y fueron distribuidos en dos grupos, que recibieron diariamente, por vía oral, vehículo (agua, 60 l, grupo Control) o una composición de la presente invención (HA+DS+CH), a una dosis de 3 mg/ratón/día (n=7-8

animales/grupo) (grupo HA+DS+CH; relación en peso HA:DS:CH 1:0,20:0,10). En ambos grupos, Control y HA+DS+CH, se monitorizó regularmente el peso corporal, así como la composición corporal mediante un sistema no invasivo de resonancia magnética (ECHO-MRI). Los animales fueron sacrificados por decapitación, 32 días después del inicio de la reversión a dieta estándar, procediéndose a la recogida de sangre y tejidos, y al peso de los tejidos adiposos. La significancia estadística de los efectos observados fue analizada mediante el test de la t de Student. El 5 umbral de significancia se estableció a P<0,05.

Resultados

Los animales tratados con HA+DS+CH tendieron a perder más porcentaje de peso y más rápidamente que los del 10 grupo Control; esta tendencia alcanzó significación estadística tras 11 días de reversión a la dieta normolipídica, punto en que los animales del grupo Control habían perdido un 9,5% de su peso corporal inicial, y los animales tratados con HA+DS+CH, un 12,8%. Además, los animales tratados con HA+DS+CH presentaron una mayor y más rápida pérdida porcentual de masa grasa que los animales del grupo Control (Figura 8A), lo que se correlacionó con un mayor incremento relativo de su masa magra (Figura 8B). 15

A punto final del experimento, la adiposidad corporal (suma de los pesos de los depósitos de tejido adiposo como porcentaje del peso corporal) de los animales tratados con HA+DS+CH fue un 30% menor que la de los animales del grupo Control (Figura 9B). Todos los depósitos adiposos diseccionados (inguinal (TABi), retroperitoneal (TABr) y epididimal (TABe)) fueron significativamente más pequeños en los animales tratados con HA+DS+CH (Figura 9A). 20

A punto final del experimento, los animales tratados con HA+DS+CH, pese a no presentar variaciones en la glucemia, presentaron una menor insulinemia que los animales Control, indicativo de una mayor sensibilidad a la insulina (Figura 10).

25

Estos resultados in vivo obtenidos permiten afirmar que las composiciones de la presente invención pueden ser útiles en reducir la grasa corporal, la formación de grasa y el peso corporal.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Uso de una composición que comprende ácido hialurónico y sulfato de dermatano para la preparación de un alimento, un alimento funcional o un complemento alimenticio para reducir la ingesta de alimento, inducir la sensación de saciedad, reducir el apetito, reducir el peso corporal, prevenir el aumento de peso, reducir la grasa 5 corporal o reducir la formación de grasa, todo ello asociado al sobrepeso u obesidad en un mamífero.
2. 2.- Uso según la reivindicación 1 para reducir la ingesta de alimento, inducir la sensación de saciedad o reducir el apetito.

   10
3. 3.- Uso según la reivindicación 1 para reducir el peso corporal o prevenir el aumento de peso.
4. 4.- Uso según la reivindicación 1 para reducir la grasa corporal o reducir la formación de grasa.
5. 5.- Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la composición comprende ácido hialurónico y 15 sulfato de dermatano presentes en una relación en peso ácido hialurónico a sulfato de dermatano comprendida entre 1:0,05 y 1:0,75, preferentemente entre 1:0,10 y 1:0,50.
6. 6.- Uso según la reivindicación 5, en el que la composición comprende ácido hialurónico y sulfato de dermatano presentes en una relación en peso ácido hialurónico a sulfato de dermatano de 1:0,25. 20
7. 7.- Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición además comprende hidrolizado de colágeno.
8. 8.- Uso según la reivindicación 7, en el que la composición comprende ácido hialurónico, sulfato de dermatano e 25 hidrolizado de colágeno presentes en una relación en peso ácido hialurónico a sulfato de dermatano a hidrolizado de colágeno comprendida entre 1:0,06:0,03 y 1:0,80:0,40, preferentemente entre 1:0,10:0,05 y 1:0,40:0,20.
9. 9.- Uso según la reivindicación 8, en el que la composición comprende ácido hialurónico, sulfato de dermatano e hidrolizado de colágeno presentes en una relación en peso ácido hialurónico a sulfato de dermatano a hidrolizado de 30 colágeno de 1:0,20:0,10.
10. 10.- Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el mamífero tiene obesidad o sobrepeso asociado al síndrome metabólico.

    35
11. 11.- Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el mamífero es un humano.
12. 12.- Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la composición se adapta para la administración oral.