CN110656166B - 以ankrd22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用，以ANKRD22为靶标是指包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低ANKRD22基因的表达。本发明为修复胃肠粘膜轻中度损伤提供了一种新的靶标，即通过抑制ANKRD22基因表达，不仅能够使胃组织LGR5+干细胞扩增，而且能够减轻胃组织炎症反应，增加胃粘液分泌。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。
背景技术
胃肠道是人体重要的消化和吸收器官，食物需要胃的充分研磨与胃酸混匀后才能形成可供小肠吸收的糊状食糜。胃肠粘膜虽可保护胃免受损伤，但极易受到饮食、药物和不良情绪等的损伤。胃肠粘膜损伤是世界范围内的常见病和多发病，几乎所有人在一生中都罹患此疾病。随着现在人们社交活动的增加，酒精、刺激性食物等外源性损伤因素引起的胃肠粘膜损伤相关疾病发病率也在逐年增加，尤其是酒精引起的轻中度胃肠粘膜损伤正日益增加。乙醇通过直接或者间接作用损伤胃肠粘膜屏障导致粘膜通透性增加、中性粒细胞浸润、自由基增加，从而出现炎症、疼痛等症状。目前，国内外学者对胃肠粘膜损伤修复进行了大量研究，探讨乙醇致胃肠粘膜损伤机制，研究防治乙醇性胃肠粘膜损伤的药物，但至今尚无国际公认的有效药物问世。
临床上保护胃肠粘膜的关键手段为抑制胃酸和抗幽门螺旋杆菌，主要药物为碱性抗酸类、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂和胃肠粘膜保护剂等。近年来，人们已经认识到加强胃肠粘膜防御功能的重要性，认为加强调胃肠粘膜保护，能对胃肠粘膜损伤修复起到积极的作用。目前胃肠粘膜保护剂的主要代表有：前列腺素类药、替普瑞酮、硫糖铝、枸橼酸铋钾等，其作用机理都不尽相同。这些药物虽然有较好的治疗效果，但有关其不良反应的报道也日益增多。因此，寻找更加安全有效的胃肠粘膜保护剂药物对于攻克这一全球性疾病具有重要意义。
胃肠道组织中存在干细胞，而干细胞具有损伤修复功能。随着“提高胃肠粘膜修复质量是粘膜损伤治疗的关键”这一观念的提出，发明者希望通过不断探索，找到一种靶向性分子，可以特异性靶向胃组织干细胞，增强干细胞扩增能力从而修复胃肠粘膜损伤，而对正常的组织细胞不具有破坏作用。因此提供一种新型的有效提高胃肠粘膜损伤修复质量的靶标是目前亟需解决的问题。
发明内容
ANKRD22是一个具有4个锚蛋白重复基序(ANK)的小分子蛋白。每个ANK包含2个反向á螺旋和1个
发卡样的L形结构，大小约30-34个氨基酸残基，形成高亲和的分子连接绞手架结构。体内包含ANK基序的蛋白众多，功能非常广，而ANKRD22在人体胃组织及巨噬细胞中有高表达水平，是一个联系了细胞代谢重编程和核重编程的分子，提示ANKRD22这一靶点与胃组织干细胞修复功能密切相关。通过试验发现ANKRD22与轻中度胃肠粘膜损伤修复存在关联，有可能作为胃肠粘膜损伤治疗的靶标。因此，以ANKRD22为靶标，筛选出一种新型的靶向胃组织干细胞的胃肠粘膜修复保护剂具有重要的社会意义和广阔的经济市场。
有鉴于此，本发明的主要目的在于寻找用于修复胃肠粘膜轻中度损伤，尤其是靶向胃组织干细胞的新靶标，以更好地预防和/或治疗轻中度胃肠粘膜损伤相关疾病。
本发明提供了一种新型的靶向干细胞的胃肠粘膜修复保护剂潜在靶标，即以ANKRD22基因为靶点在制备胃肠粘膜保护剂中的应用。
ANKRD22(Ankyrin repeat domain-containing protein 22)，是一个具有4个锚蛋白重复基序(ANK)的小分子蛋白，在人体胃组织和巨噬细胞中有高表达水平。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
第一方面，本发明提供以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。
进一步地，所述胃肠粘膜修复保护剂为靶向胃组织干细胞的药物。
进一步地，所述胃肠粘膜修复保护剂以ANKRD22为靶标，胃肠粘膜损伤修复时扩增胃组织LGR5+干细胞。
进一步地，所述胃肠粘膜修复保护剂以ANKRD22为靶标，减轻胃组织炎症反应和增加胃组织黏液分泌。
进一步地，以ANKRD22为靶标是指包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低ANKRD22基因的表达。
第二方面，本发明提供以ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用。
进一步地，以ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.采用灌胃方式给ANKRD22基因缺失的小鼠进行胃肠粘膜轻中度损伤刺激；
S2.在胃肠粘膜修复24-48h期间，从小鼠身上取下胃组织块，采用酶混合液对胃组织块进行消化，酶混合液包括胶原酶IV、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶；
S3.消化完成后采用胎牛血清终止消化，产物加入50ml离心管，以800rmp/min、4℃离心，将细胞沉淀用RPMI 1640完全培养基重悬；
S4.用Percoll等密度梯度沉淀法分离纯化胃组织巨噬细胞；
S5.2500 rmp/min、4℃离心后，用吸管吸出云雾状中间层细胞带；
S6.加入3倍体积Percoll液的RPMI 1640完全培养基稀释，800rmp/min、4℃离心后，用RPMI 1640完全培养基重悬细胞沉淀，该细胞悬液即ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞。
进一步地，S1中，胃肠粘膜轻中度损伤刺激中，HCl/EtOH灌胃的量为5mL/kg体重。
进一步地，S2中，在胃肠粘膜修复24-48h期间，从小鼠身上取下胃组织块，采用预热至37℃的酶混合液对剪碎的胃组织块进行消化。
进一步地，S2中，从小鼠身上取下胃组织块，具体包括，将脱颈处死的小鼠浸泡于75％酒精中，随后将小鼠放置于无菌超净台上，用手术剪刀和镊子取下胃组织块。
进一步地，S2中，在采用酶混合液对胃组织块进行消化之前，还包括用4℃生理盐水彻底冲洗组织块的血液，用无菌剪刀剔除可见的脂肪、结缔组织，将组织块剪成1～3㎜3大小的小块，然后再进行消化。可以理解，将胃组织块剪成小块可以更好的的进行消化，提高消化的质量和效率。
进一步地，S2中，酶混合液中含有50mg/mL的胶原酶I、50mg/mL的胶原酶IV、5mg/mL的透明质酸酶和1U/mL的脱氧核糖核酸酶。
进一步地，S3中，消化完成后采用胎牛血清终止消化，产物加入50ml离心管，以800rmp/min、4℃离心，将细胞沉淀用RPMI 1640完全培养基重悬；如果消化后上清液粘稠，可再加入脱氧核糖核酸酶消化，用胎牛血清终止反应，再次800rmp/min、4℃离心，用RPMI1640完全培养基重悬细胞沉淀，暂放入37℃孵箱中；将所有重悬的细胞悬液混合，800rmp/min、4℃离心后，用RPMI1640完全培养基重悬；
进一步地，S4中，用Percoll等密度梯度沉淀法分离纯化胃组织巨噬细胞，可以具体的，用带14号长针头的玻璃注射器，按密度从大到小依次将45％和35％的Percoll溶液沿15ml离心管侧壁缓慢加入，每个梯度加3ml，操作过程中注意不要有气泡产生；将3ml的细胞悬液用吸管缓慢沿管壁加入离心管，使其铺于Percoll密度梯度的液体表面；本发明的一种实现方式中，用9份Percoll液与1份10*D-Hanks’液配制90％的Percoll母液，再用Percoll母液与DHanks′液配制35％和45％的Percoll溶液；
进一步地，S6中，加入3倍体积Percoll液的RPMI 1640完全培养基稀释，800rmp/min、4℃离心后，用少量RPMI 1640完全培养基重悬细胞沉淀，该细胞悬液即本发明的ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞。
本发明中，800rmp/min、4℃离心，其中800rmp/min的离心速度是为了使细胞沉淀，而又不至于破裂；4℃的离心温度主要是使细胞处在一个较低温度下，减缓其生长代谢，使其能够更稳定的存在。
第三方面，本发明提供一种胃肠粘膜修复保护剂，其是用ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞来制备的。
需要说明的是，本发明经过研究发现，ANKRD22基因缺失，不仅能够修复胃肠粘膜轻中度损伤，而且能够扩增胃组织中LGR5+干细胞，减轻胃组织炎症，增加胃黏液分泌，能够用于修复轻中度胃肠粘膜损伤。因此，可以ANKRD22基因为靶点制备胃肠粘膜修复保护剂；只要能够降低ANKRD22基因的表达，就可以起到治疗轻中度胃肠粘膜损伤的效果。
还需要说明的是，本发明经过研究发现，ANKRD22基因缺失对生物个体本身生长发育没有明显影响，对于无损伤的胃组织没有明显影响，因此，可以ANKRD22基因为靶点制备胃肠粘膜修复保护剂。
发明人在研究中发现，ANKRD22是胃组织轻中度损伤后与LGR5+干细胞扩增相关的新型靶点，且利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除或shRNA方式干扰ANKRD22的基因表达，可以有效地缓解实验性小鼠轻中度胃肠粘膜损伤的症状。
在本发明的具体实验中，通过基因敲除技术干扰ANKRD22的基因表达，可以有效缓解由盐酸乙醇溶液(150mM HCl/60％absolute ethanol solution,HCl/EtOH)引起的实验性小鼠轻中度胃肠粘膜损伤的症状。进一步的，在体内外检测ANKRD22敲除或过表达细胞的实验中我们发现，ANKRD22靶点与Wnt-Ca2+信号通路密切相关。
还需要说明的是，发明人经过研究发现，ANKRD22基因缺失的胃组织巨噬细胞，能够减轻轻中度损伤后的胃组织炎症反应，增加胃粘液分泌，因此，同样可以ANKRD22基因为靶点的胃组织巨噬细胞制备胃肠粘膜修复保护剂。
可以理解，本发明的ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞具有很好的修复胃肠粘膜损伤效果，能够减轻胃组织炎症反应，因此，完全可以制备成胃肠粘膜修复保护剂，用于修复胃肠粘膜轻中度损伤。其中，药物中还可以包括其它药学上可以接受的辅助成份或活性成份，在此不做具体限定。
综合而言，本发明佐证了ANKRD22是靶向LGR5+干细胞的胃肠粘膜修复保护剂的新靶标，能够减轻胃组织炎症反应，增加胃黏液分泌，与Wnt-Ca2+信号通路密切相关，且利用任何技术干扰ANKRD22基因表达，可以有效修复胃肠粘膜轻中度损伤症状。
综上，由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：
本发明为修复胃肠粘膜轻中度损伤提供了一种新的靶标，即通过抑制ANKRD22基因表达，不仅能够使胃组织LGR5+干细胞扩增，而且能够减轻胃组织炎症反应，增加胃粘液分泌。本发明的ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞，可以用于开发新的靶向干细胞的胃肠粘膜修复保护剂。
附图说明
图1：ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤的影响。其中，WT,wild
type：野生型小鼠。Ankrd22-/-：ANKRD22基因缺失小鼠。Control(Ctrl)：对照组。HCl/EtOH，盐酸乙醇溶液：盐酸乙醇灌胃的实验组。
图2：ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤修复24后小鼠胃组织中LGR5水平的影响。其中，Lgr5：G蛋白偶联受体5。
图3：ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤修复24后小鼠胃组织中Mucin2、Mucin5AC和Mucin6水平的影响。其中，Muc2：粘蛋白2；Muc5ac：粘蛋白5AC；Muc6：粘蛋白6；
图4：ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤修复24后小鼠胃组织细胞中Ca2+水平的影响。
图5：ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤修复24后小鼠胃组织巨噬细胞炎症因子IL-1β和IL-18水平的影响。其中，IL-1β：白细胞介素1β；IL-18：白细胞介素18。
具体实施方式
本发明在对胃肠粘膜损伤进行研究的过程中发现一个新的治疗靶标，即ANKRD22基因，通过研究证实，对ANKRD22基因进行敲除降低ANKRD22基因的表达，可以有效的修复胃肠粘膜轻中度损伤，扩增胃组织LGR5+干细胞，并减轻胃组织炎症反应，增加胃组织黏液分泌，起到保护胃肠粘膜的效果。可以理解，只要能够降低ANKRD22基因的表达，就可以达到修复轻中度胃肠粘膜损伤的效果；因此，除了基因敲除以外，基因敲减或者化学药物降低ANKRD22基因的表达，也可以起到相同的保护胃肠粘膜的效果。
此外，经过本发明研究证实，ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞进行提取后可以修复胃肠粘膜轻中度损伤，并减轻胃组织炎症反应，起到保护胃肠粘膜的效果；因此，ANKRD22基因敲除的胃组织巨噬细胞可以用于开发新的胃肠粘膜修复保护剂靶向药物。
实施例1、干扰ANKRD22的基因表达，可以有效缓解由盐酸乙醇溶液(150mM HCl/60％absolute ethanol solution,HCl/EtOH)引起的实验性小鼠轻中度胃肠粘膜损伤症状。
本实施例中，验证了干扰ANKRD22的基因表达，可以有效修复由HCl/EtOH引起的实验性小鼠轻中度胃肠粘膜损伤症状。其中，建立了HCl/EtOH引起的实验性小鼠轻中度胃肠粘膜损伤模型。但是，与野生型小鼠相比，ANKRD22基因敲除小鼠胃肠粘膜损伤的症状明显得到缓解，包括：胃肠粘膜出血点减少、粘膜不平颗粒状减轻。
具体如下：
HCl/EtOH实验性小鼠轻中度胃肠粘膜损伤模型
C57BL/6J背景的ANKRD22基因敲除小鼠委托赛业(广州)生物科技有限公司构建。C57BL/6J野生型雌性小鼠来自浙江省中医药大学实验动物中心。
将动物养在恒定温度和湿度下，12小时的光-暗循环饲养室内。饲料和水可用自由采食。所有动物的程序，按照动物福利伦理委批准的程序进行。
野生型小鼠：雌鼠在出生后的第42天(D42)，随机分为：对照组，HCl/EtOH组，每组至少6只小鼠。
ANKRD22基因缺失小鼠：雌鼠在出生后的第42天(D42)，随机分为：对照组，HCl/EtOH组，每组至少6只小鼠。
HCl/EtOH组：小鼠禁食不禁水24h后灌胃HCl/EtOH，5mL/kg体重，150mM HCl和100％乙醇以4：6体积比溶于PBS。
对照组：小鼠灌胃等量PBS。
在造模24h后处死小鼠，并收集血样和组织。将小鼠用异氟烷麻醉，眼球取血收集血样。分离胃组织，并在4％多聚甲醛液流体过夜固定。此外，离体组织快速冷冻在液氮中，直至进一步处理。
图1显示了ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤的影响。
如图1所示，野生型小鼠(WT-control)胃肠粘膜大体观呈淡粉色，且光润平滑；ANKRD22基因缺失小鼠(Ankrd22-/-control)胃肠粘膜与WT-control组胃肠粘膜无明显差别；经过HCl/EtOH处理24h后的野生型小鼠(WT-HCl/EtOH)胃肠粘膜存在很多红色条状出血点，粘膜不平呈细颗粒状。HCl/EtOH导致了小鼠轻中度胃肠粘膜损伤；当使用HCl/EtOH处理ANKRD22基因缺失小鼠后(Ankrd22-/-HCl/EtOH)，胃肠粘膜红色条状出血点比Ankrd22-/-control组明显减少、粘膜颗粒状减轻，说明该组小鼠胃肠粘膜损伤修复作用更强。
实施例2、干扰ANKRD22的基因表达，可以明显增加轻中度胃肠粘膜损伤的实验性小鼠胃组织的LGR5+干细胞扩增数量。
图2显示了ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤修复24后小鼠胃组织中LGR5水平的影响。
将小鼠胃组织加入Trizol研磨后，提取RNA，逆转录为cDNA，分别利用real-timePCR检测LGR5相对表达量：HCl/EtOH轻中度胃肠粘膜损伤后24h的Ankrd22-/-小鼠胃组织(Ankrd22-/-HCl/EtOH)LGR5水平与野生型小鼠(Ankrd22-/-control)相比显著升高。P<0.05代表统计学差异上有显著意义。
通过图1和图2的结果可知，ANKRD22基因缺失可以修复轻中度胃肠粘膜损伤，影响胃组织LGR5水平，增加LGR5+细胞扩增，从而表现出靶向LGR5+干细胞的胃肠粘膜保护作用。
实施例3、干扰ANKRD22的基因表达，可以明显增加轻中度胃肠粘膜损伤的实验性小鼠胃组织黏液分泌水平。
图3显示了ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤修复24后小鼠胃组织中Mucin2、Mucin5AC和Mucin6水平的影响。
将小鼠胃组织加入Trizol研磨后，提取RNA，逆转录为cDNA，分别利用real-timePCR检测Mucin2、Mucin5AC和Mucin6相对表达量：HCl/EtOH轻中度胃肠粘膜损伤后24h的Ankrd22-/-小鼠胃组织(Ankrd22-/-HCl/EtOH)Mucin2、Mucin5AC和Mucin6水平与野生型小鼠(Ankrd22-/-control)相比显著升高。P<0.05代表统计学差异上有显著意义。
图3说明ANKRD22基因缺失可以通过抑制Wnt-Ca2+信号通路，降低胃组织细胞Ca2+浓度，间接增加经典Wnt通路激活水平，增加LGR5+干细胞扩增。
实施例4、ANKRD22通过Wnt-Ca2+信号通路，调节胃组织细胞Ca2+浓度和Wnt通路激活水平。
图4显示了ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤修复24后小鼠胃组织细胞中Ca2+水平的影响。
将小鼠胃组织消化成单细胞后，加入10μmol/L fluo-4(Invitrogen，USA)和0.02％
F-127(Sigma)，置于37℃避光孵育1h，FACSCanto II流式细胞仪检测FITC荧光强度。以平均FITC荧光强度代表细胞中Ca2+水平。
如图4所示，ANKRD22基因缺失小鼠(Ankrd22-/-control)胃组织细胞Ca2+浓度与WT-control组无明显差别；而HCl/EtOH轻中度胃肠粘膜损伤后24h的Ankrd22-/-小鼠(Ankrd22-/-HCl/EtOH)胃组织细胞Ca2+浓度与野生型小鼠(WT-HCl/EtOH)相比显著降低。P<0.05代表统计学差异上有显著意义。
图4说明ANKRD22基因缺失可以通过抑制Wnt-Ca2+信号通路，降低胃组织细胞Ca2+浓度，间接增加经典Wnt通路激活水平，增加LGR5+干细胞扩增。
实施例5、ANKRD22基因缺失的胃组织巨噬细胞可以明显减轻轻中度胃肠粘膜损伤的实验性小鼠胃组织炎症反应水平。
图5显示了ANKRD22基因的缺失对HCl/EtOH引起的轻中度胃肠粘膜损伤修复24后小鼠胃组织巨噬细胞炎症因子IL-1β和IL-18水平的影响。
分别提取HCl/EtOH刺激胃肠粘膜24h后的ANKRD22基因敲除小鼠胃组织巨噬细胞及野生型小鼠胃组织巨噬细胞，并提取PBS灌胃24h后的ANKRD22基因敲除小鼠及野生型小鼠胃组织巨噬细胞作为对照。将小鼠胃组织加入RIPA强裂解液研磨后提取蛋白，利用IL-1β和IL-18ELISA试剂盒(Abcam)，通过酶标仪检测吸光度。
如图5所示，经过HCl/EtOH处理24h后的小鼠胃组织巨噬细胞IL-1β和IL-18水平相比PBS对照组都有明显增加，说明轻中度胃肠粘膜损伤后小鼠胃组织炎症增强；而HCl/EtOH处理后的ANKRD22基因缺失小鼠胃组织巨噬细胞IL-1β和IL-18水平与野生型小鼠胃组织巨噬细胞相比显著降低。P<0.05代表统计学差异上有显著意义。
图5说明ANKRD22基因缺失的胃组织巨噬细胞可以明显减轻胃肠粘膜损伤导致的胃组织炎症反应，起到胃肠粘膜保护作用。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。更确切地，本发明涉及本文所公开的抗体、器械和试剂盒等及其用途，以及控制ANKRD22水平，并且按所述细节内容可作出各种修改方案，这些修改方案在权利要求书的范围和等同权利要求范围之内，并不偏离本发明的精神。
Claims (3)
1.以ANKRD22为靶标的物质在制备胃粘膜修复保护剂中的应用，其特征在于，所述以ANKRD22为靶标是指包括采用基因敲除、基因敲减降低ANKRD22基因的表达。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃粘膜修复保护剂以ANKRD22为靶标，胃粘膜损伤修复时扩增胃组织LGR5+干细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃粘膜修复保护剂以ANKRD22为靶标，减轻胃组织炎症反应和增加胃组织黏液分泌。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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