CN116139280A - Ankrd22蛋白及其诱导剂在制备治疗炎症性肠病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ANKRD22蛋白及其诱导剂在制备治疗炎症性肠病药物中的应用，属于生物医药领域。本发明经过研究发现，在DSS诱导的溃疡性结肠炎模型条件下，ANKRD22敲除小鼠溃疡性结肠炎严重程度显著高于对照野生型小鼠，具体表现为体重减轻、结肠萎缩、肠粘膜损伤、结肠组织炎性细胞浸润和细胞因子紊乱等情况显著加剧，表明ANKRD22蛋白可作为防治溃疡性结肠炎新的有效的药物。本发明为防治溃疡性结肠炎提供了一种新方法，且由于ANKRD22蛋白本身是一种人体的内源性蛋白质，其对人体可能的副作用很小，因此作为潜在药物的安全性很高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及ANKRD22蛋白及其诱导剂在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
背景技术
炎症性肠病(InflammatoryBowel Disease,IBD)是一种病因不明的多因素导致的慢性、炎症性肠道疾病，以活动期和缓解期交替为特点，主要包括两种类型，即溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。UC病变主要位于结肠、直肠的粘膜表层和粘膜下层，其特征是炎症呈现连续性弥漫性分布。发病年龄段主要在20～50岁，主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便和里急后重，该病病程长，病情轻重不一，常反复发作，并且与结肠癌的发病有关。CD为一种慢性肉芽肿性炎症，累及从口腔到肛周部位的整个消化道或任意部分消化道，以腹痛、腹泻、瘘管、肛门病变和不同程度的全身症状为主要临床表现。虽在二者在病因及临床表现上有所不同，但两者都是由基因和环境共同作用并由免疫系统介导的疾病，肠道黏膜免疫的调控紊乱是其主要病理诱因。目前，国内外流行病学统计数据显示，IBD的发病率和和患病率均呈现明显的增高趋势，被世界卫生组织列为现代难治病之一，其病因、病机和治疗药物一直是研究热点。
ANKRD22蛋白共由191个氨基酸组成，是一种具有4个锚蛋白重复基序(ANK)的小分子蛋白，每个ANK包含2个反向á螺旋和1个ǎ发卡样的L形结构，大小约30-34个氨基酸残基，形成高亲和的分子连接绞手架结构。有研究报道ANKRD22与脂质转运蛋白E-Syt1合作，将多余的脂质转运到线粒体中促进结直肠癌细胞的代谢重编程。另外，有研究揭示ANKRD22可能负向调节前列腺癌的进展；然而，在乳腺癌中，ANKRD22通过调节NuSAP1表达激活Wnt/β-catenin通路从而增强乳腺癌细胞的恶性程度；类似的，ANKRD22上调E2F1的转录并通过增强细胞增殖促进非小细胞肺癌的进展。除肿瘤学领域的研究，发现ANKRD22与多种生理和病理过程相关，包括慢性活动性Epstein-Barr病毒感染、排卵、角膜上皮分化和潜伏性结核感染等。最新研究表明ANKRD22是一种核编码的线粒体膜蛋白，在正常胃粘膜上皮细胞中高表达，可以通过上调Wnt/β-catenin通路活性来促进LGR5+胃上皮细胞的动员，从而帮助修复受损的胃粘膜。但是，ANKRD22在炎症性肠病中的作用还未有相关报道。
中国专利文献CN201910878139.9，公开了一种以ANKRD22为靶标在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用，并指出通过抑制ANKRD22基因表达，不仅能够使胃组织LGR5+干细胞扩增，而且能够减轻胃组织炎症反应，增加胃粘液分泌。中国专利文献CN202010113832.X，公开了一种作为ANKRD22抑制剂的先导化合物及其应用，先导化合物为与ANKRD22天然底物结合位点具有高亲和力的小分子化合物；亲和力为(1～9)×10-(5-12)M。应用包括以先导化合物为活性成分作为ANKRD22抑制剂在制备胃肠粘膜修复保护剂中的应用，以及在制备研究胃肠粘膜修复功能和作用机制的工具药中的应用。并指出ANKRD22抑制剂具有促进胃肠粘膜上皮干细胞扩增，间接激活Wnt经典通路的作用，有助于机体受损胃肠粘膜组织的康复。
然而，关于ANKRD22蛋白及其诱导剂在防治炎症性肠病中的应用，还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供ANKRD22蛋白及其诱导剂的新用途。本发明的第二个目的是，提供一种筛选防治炎症性肠病的潜在物质的方法。
为实现上述第一个目的，本发明提供如下技术方案：
本发明利用ANKRD22敲除小鼠溃疡性结肠炎模型中发现，ANKRD22敲除鼠可明显促进葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎，加重小鼠体重下降、腹泻、便血和隐血现象，促进结肠长度缩短，加重肠粘膜损伤，加剧结肠组织炎性细胞浸润和细胞因子紊乱，降低结肠炎小鼠生存率。因此ANKRD22蛋白及其诱导剂可以制备治疗炎症性肠病的药物、组合物、保健品、食品或添加剂。
优选的，所述ANKRD22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述ANKRD22蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
所述的诱导剂选自激动剂、上调剂或稳定剂。
所述的激动剂、上调剂或稳定剂是指可上调ANKRD22的表达、提高ANKRD22的稳定性、提高ANKRD22的活性、增加ANKRD22有效作用时间的物质。
所述的物质为化合物、化学小分子、生物分子中的一种。
所述的生物分子为核酸水平(包括DNA、RNA)、蛋白水平或上调ANKRD22表达的病毒产品中的一种。
所述的药物还含有一种或者至少两种药学上可以接受的载体。
所述的药物剂型选自片剂、粉剂、注射液或胶囊剂中的一种或多种。
所述的药物剂型中活性成分含量为0.01％～99.9％。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种筛选防治溃疡性结肠炎的潜在物质的方法，包括以下步骤：
a)将候选物质与含ANKRD22蛋白或基因的体系接触；
b)观察候选物质对于ANKRD22蛋白或基因表达及活性的影响，其中，若所述候选物质能够促进ANKRD22基因表达或提高ANKRD22蛋白活性，则所述候选物质是防治溃疡性结肠炎的潜在物质。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用ANKRD22敲除小鼠及相应的对照野生型小鼠，制备DSS诱导的溃疡性结肠炎模型，结果显示：ANKRD22敲除小鼠溃疡性结肠炎严重程度显著高于对照野生型小鼠，具体表现为，ANKRD22敲除小鼠的体重下降、腹泻、便血、隐血、肠粘膜损伤程度、结肠组织炎性细胞浸润和细胞因子紊乱等主要症状显著高于对照野生型小鼠，并且显著降低结肠炎小鼠生存率，总之ANKRD22敲除小鼠显著加重溃疡性结肠炎。本领域技术人员据此可以确定ANKRD22蛋白可作为防治溃疡性结肠炎新的更有效的药物，可以作为筛选发现防治溃疡性结肠炎药物的方法。本发明为防治溃疡性结肠炎提供了一种新方法，且由于ANKRD22蛋白本身是一种人体的内源性蛋白质，其对人体可能的副作用很小，因此作为潜在药物的安全性很高。
附图说明
图1为实施例1中溃疡性结肠炎模型中WT和ANKRD22敲除小鼠的体重随时间的变化趋势；
图2为实施例1中溃疡性结肠炎模型中WT和ANKRD22敲除小鼠的疾病活动指数随时间的变化趋势；
图3为实施例1中溃疡性结肠炎模型中WT和ANKRD22敲除小鼠的结肠长度的变化；
图4为实施例1中溃疡性结肠炎模型中WT和ANKRD22敲除小鼠的结肠病理学检测及组织学评分；
图5为实施例1中溃疡性结肠炎模型中WT和ANKRD22敲除小鼠的结肠组织炎性细胞因子mRNA的表达水平；
图6为实施例1中溃疡性结肠炎模型中WT和ANKRD22敲除小鼠的生存曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本领域技术人员可在权利要求范围内对本发明的方法和使用仪器等做出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明在对炎症性肠道疾病发病机理进行研究的过程中发现一个新的治疗靶标，即ANKRD22。通过研究证实，ANKRD22敲除加重溃疡性结肠炎模型小鼠的腹泻、便血、隐血、肠粘膜损伤程度和结肠组织细胞因子紊乱等症状，以及显著降低结肠炎小鼠生存率。可以理解，只要能够上调ANKRD22基因的表达，就可以达到治疗或延缓炎症性肠病的效果；因此，除了使用ANKRD22蛋白以外，化学药物上调ANKRD22基因表达诱导剂，也可以起到相同的效果。因此，可以使用ANKRD22蛋白及其诱导剂制备用于治疗或延缓炎症性肠病的药物。其中，
ANKRD22蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)：
MGILYSEPICQAAYQNDFGQVWRWVKEDSSYANVQDGFNGDTPLICACRRGHVRIVSFLLRRNANVNLKNQKERTC LHYAVKKKFTFIDYLLIILLMPVLLIGYFLMVSKTKQNEALVRMLLDAGVEVNATDCYGCTALHYACEMKNQSLIPLLLE ARADPTIKNKHGESSLDIARRLKFSQIELMLRKAL。
ANKRD22的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)：
ATGGGAATCCTATACTCTGAGCCCATCTGCCAAGCAGCCTATCAGAATGACTTTGGACAAGTGTGGCGGTGGGTGAAAGAAGACAGCAGCTATGCCAACGTTCAAGATGGCTTTAATGGAGACACGCCCCTGATCTGTGCTTGCAGGCGAGGGCATGTGAGAATCGTTTCCTTCCTTTTAAGAAGAAATGCTAATGTCAACCTCAAAAACCAGAAAGAGAGAACCTGCTTGCATTATGCTGTGAAGAAAAAATTTACCTTCATTGATTATCTACTAATTATCCTCTTAATGCCTGTTCTGCTTATTGGGTATTTCCTCATGGTATCAAAGACAAAGCAGAATGAGGCTCTTGTACGAATGCTACTTGATGCTGGCGTCGAAGTTAATGCTACAGATTGTTATGGCTGTACCGCATTACATTATGCCTGTGAAATGAAAAACCAGTCTCTTATCCCTCTGCTCTTGGAAGCCCGTGCAGACCCCACAATAAAGAATAAGCATGGTGAGAGCTCACTGGATATTGCACGGAGATTAAAATTTTCCCAGATTGAATTAATGCTAAGGAAAGCATTGTAA。
实施例1
一、方法
1、动物：采用ANKRD22敲除小鼠及相应的对照野生型小鼠(C57BL/6背景)，购买于赛业生物科技有限公司，饲养于暨南大学动物实验中心，周龄为10-12周，待体重至25g左右进行实验，每组8例小鼠。所有动物的程序，按照动物福利伦理委批准的程序进行。
2、小鼠结肠炎模型的诱导：采用MP公司的分子量为36000-50000的葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)，将其配置成浓度为3％DSS的水溶液；采用自由饮用方式连续给小鼠饮用3％DSS的水溶液7天，之后将3％DSS溶液换成正常的饮用水连续饮用3天，以完成DSS诱导的溃疡性结肠炎模型的制备。
3、体重测定：从正式实验的当天开始，每天在相同时间点测量小鼠体重并记录在案，第10天实验结束后计算所有小鼠的体重百分比变化。
4、疾病活动度指数(DAI)评分的测定：实验期间，每天记录小鼠体重变化、观察粪便性状及便血情况，以测定DAI评分。DAI是体重减失率，大便性状和便血程度三个指标评分之和(总分值在0～12之间)。评分标准如下：1)体重减失率评分：体重减轻在1％以内为0分，减轻在1％-5％为1分，减轻在5％-10％为2分，减轻在10％-20％为3分，减轻在20％以上为4分。2)大便性状评分：正常为0分，松散为1分，半成型稀为2分，不成型稀为3分，水样泄为4分。3)便血评分：便血阴性(－)为0分；便血弱阳性(+)为1分；便血阳性(++)为2分；便血强阳性(+++)为3分；肉眼可见血便为4分。
5、结肠长度测定：第10天实验结束后，收集结肠组织样品，量取结肠长度并拍照。
6、病理检测及组织学评分：第10天实验结束后，剪取约0.5cm长度的小鼠结肠组织于4％多聚甲醛溶液中固定；采用石蜡包埋法进行组织切片(纵切5μm)；脱蜡后进行HE染色(苏木素染核，伊红染胞浆)；待中性树脂封片后，采用光学显微镜观察病理组织学变化并拍照。组织学评分是肠粘膜损伤评分和炎性细胞浸润评分之和(总分值在0～8之间)，评分标准如下：1)肠粘膜损伤评分：无损伤记0分，少量杯状细胞丢失记1分，大量杯状细胞丢失记2分，少量隐窝消失及大量杯状细胞丢失记3分，大量隐窝消失记4分。2)炎性细胞浸润评分：无浸润记0分，浸润到隐窝底部记1分，浸润到黏膜肌层记2分，黏膜肌层大量浸润伴水肿记3分，浸润到黏膜下层记4分。
7、QPCR检测结肠组织中细胞因子的相对表达：第10天实验结束后，取约0.5cm长度的小鼠结肠组织，用无菌PBS清洗干净后放置于EP管中，采用Trizol法提取RNA，具体步骤如下：
1)加入1mL Trizol溶液，用匀浆仪将组织磨成匀浆状态(注意需在冰上操作，以防温度过高RNA降解)。
2)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置10min。
3)在4℃条件下，12000rpm离心15min，取上清移入新EP管中。
4)加入等体积异丙醇，温和混匀，室温放置10min。
5)在4℃条件下，12000rpm离心15min，弃去上清。
6)加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀。在4℃条件下，12000rpm离心5min，弃上清，重复一次。
7)室温干燥RNA沉淀。
8)加入适量无RNA酶的超纯水，充分溶解RNA。
使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒(购买于TaKaRa公司)将上述RNA逆转录为cDNA；利用Real-time PCR仪器，采用SYBR Green法检测细胞因子Il1b、Il6、Il23a、Tnfa和Il17a/f的相对表达量。反应条件为95℃，5min；95℃，30s；引物退火温度(60℃)，30s；72℃，1min。72℃，10min；共35个循环。实验结果利用2-△△Ct进行计算。
8、小鼠结肠炎模型的生存率检测：采用MP公司的分子量为36000-50000的葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)，将其配置成浓度为3％DSS的水溶液；采用自由饮用方式连续给小鼠饮用3％DSS的水溶液7天，之后将3％DSS溶液换成正常的饮用水连续饮用7天，在饮用水喂养的7天里，每天统计小鼠生存情况。
9、统计学分析
实验结果采用(Mean±SD)表示，采用Student’s t-text进行两组之间的比较。*P<0.05具有统计学差异，**P<0.01具有统计学显著性差异，***P<0.001具有统计学极显著性差异。
二、结果
1、体重测定结果
图1所示WT和ANKRD22敲除小鼠的体重折线图。在结肠炎模型的实验周期内WT小鼠的体重呈明显下降趋势；与WT相比，ANKRD22敲除小鼠的体重下降趋势更加显著。
2、疾病活动度指数(DAI)评分结果
图2所示WT和ANKRD22敲除小鼠的DAI评分图。在结肠炎模型的实验周期内WT小鼠的DAI评分呈明显升高趋势；与WT相比，ANKRD22敲除小鼠的DAI评分升高趋势更加显著，说明ANKRD22敲除加重小鼠的腹泻、便血、隐血等临床症状。
3、结肠长度测定结果
图3所示WT和ANKRD22敲除小鼠的结肠长度测定结果。在结肠炎模型条件下，与WT小鼠相比，ANKRD22敲除小鼠的结肠长度显著缩短。
4、结肠病理学检测及组织学评分结果
图4所示WT和ANKRD22敲除小鼠的结肠病理学检测及组织学评分结果。在正常条件下，WT小鼠和ANKRD22敲除小鼠的结肠均为健康状态，说明ANKRD22敲除在生理条件下不影响小鼠结肠的正常功能。然而，在结肠炎模型条件下，WT小鼠的结肠组织明显病变，具体表现为大量杯状细胞丢失、或者少量隐窝消失及大量杯状细胞丢失、或者炎性细胞浸润到黏膜肌层、或者黏膜肌层大量浸润伴水肿；与WT小鼠相比，ANKRD22敲除小鼠的结肠组织病变情况更加严重，具体表现为少量隐窝消失及大量杯状细胞丢失、或者大量隐窝消失、或者黏膜肌层大量炎性细胞浸润伴水肿、或者炎性细胞浸润到黏膜下层，总而言之，ANKRD22敲除加重小鼠的肠粘膜损伤、结肠组织炎性细胞浸润等临床症状。
5、结肠组织炎性细胞因子mRNA的表达水平检测结果
图5所示WT和ANKRD22敲除小鼠的结肠组织炎性细胞因子mRNA的表达水平。在结肠炎模型条件下，与WT小鼠相比，ANKRD22敲除小鼠的结肠组织炎性细胞因子Il1b、Il6、Il23a、Tnfa和Il17a/f的mRNA相对表达量均显著升高，说明ANKRD22敲除加重小鼠的结肠组织炎性细胞因子紊乱。
6、结肠炎模型小鼠的生存率结果
图6所示WT和ANKRD22敲除小鼠的生存率测定结果。在结肠炎模型条件下，与WT小鼠相比，ANKRD22敲除小鼠的生存率显著降低。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.ANKRD22蛋白及其诱导剂在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的ANKRD22蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述ANKRD22蛋白的基因序列如SEQID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诱导剂选自激动剂、上调剂或稳定剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物还含有一种或者至少两种药学上可以接受的载体。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物剂型选自片剂、粉剂、注射液或胶囊剂中的一种或多种；
所述的药物剂型中活性成分含量为0.01％～99.9％。
8.一种筛选防治溃疡性结肠炎的潜在物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将候选物质与含ANKRD22蛋白或基因的体系接触；
2)观察候选物质对于ANKRD22蛋白或基因表达及活性的影响，其中，若所述候选物质能够促进ANKRD22基因表达或提高ANKRD22蛋白活性，则所述候选物质是防治溃疡性结肠炎的潜在物质。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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