ES2456702T3 - Bolsillo de unión del inhibidor de la polimerasa NS5B del virus de la hepatitis C - Google Patents

Bolsillo de unión del inhibidor de la polimerasa NS5B del virus de la hepatitis C Download PDF

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ES2456702T3 ES04731118.8T ES04731118T ES2456702T3 ES 2456702 T3 ES2456702 T3 ES 2456702T3 ES 04731118 T ES04731118 T ES 04731118T ES 2456702 T3 ES2456702 T3 ES 2456702T3
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Abstract

Un método de identificar un compuesto que se une a NS5B del VHC, que comprende las etapas de a) aplicar un algoritmo de modelo molecular tridimensional a las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión de NS5B del VHC definido por las coordenadas estructurales de al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503, y opcionalmente uno de los residuos aminoácidos 37 y 496 de una NS5B del VHC nativa (SEC ID Nº: 1), para determinar las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS5B del VHC, en donde las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión de NS5B del VHC son las coordenadas estructurales de (iii) Figura 4 para el bolsillo de unión de NS5B del VHC formado por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503 de SEC ID Nº: 1, y en donde esta etapa implica utilizar coordenadas estructurales correspondientes a cada uno de los átomos de los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503 de SEC ID Nº: 1 dentro de 5 Å del complejo proporcionado en la Figura 4, o (iv) Figura 5 para el bolsillo de unión de NS5B del VHC formado por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503 de SEC ID Nº: 1, y en donde esta etapa implica utilizar coordenadas estructurales correspondientes a cada uno de los átomos de los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503 de SEC ID Nº: 1 dentro de 5 Å del complejo proporcionado en la Figura 5; b) rastrear electrónicamente las coordenadas espaciales almacenadas del compuesto frente a las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS5B del VHC para determinar si el compuesto se une con el bolsillo de unión de NS5B del VHC.

Description

Bolsillo de unión del inhibidor de la polimerasa NS58 del virus de la hepatitis C
CAMPO DE LA INVENCiÓN
La presente invención se refiere a la polimerasa NS5B del Virus de la Hepatitis C (NS58 del VHC) y, en particular, a un nuevo bolsillo de unión del inhibidor de NS58 del VHC. Se proporciona la estructura cristalina de la NS58 del VHC que incluye las coordenadas que definen el nuevo bolsillo de unión del inhibidor y modelos tridimensionales para el uso en el rastreo de inhibidores. También se proporcionan métodos de diseño y rastreo de inhibidores de NS58 utilizando la estructura cristalina y la información de unión del inhibidor.
ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN
El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal agente etiológico de la post-transfusión y hepatitis no A y no-B adquirida en la comunidad en todo el mundo. Se estima que más de 200 millones de personas en todo el mundo están infectadas por el virus. Un alto porcentaje de portadores se vuelven crónicamente infectados y muchos progresan a una enfermedad crónica del higado, la denominada hepatitis C crónica. A su vez, este grupo está en alto riesgo de padecer una enfermedad grave del higado tal como cirrosis hepática, carcinoma hepatocelular y la enfermedad hepática terminal que conducen a la muerte.
El mecanismo por el cual el VHC establece la persistencia viral y causa una alta tasa de enfermedad hepática crónica no se ha elucidado a fondo. No se sabe cómo el VHC interactúa con y se evade del sistema inmune del huésped. Además, los papeles de las respuestas inmunes celular y humoral en la protección contra la infección por el VHC y la enfermedad todavia no se han establecido.
El VHC es un virus de ARN de cadena positiva con envoltura de la familia Flaviviridae. El genoma del ARN del VHC de cadena sencilla es de polaridad positiva y comprende un marco de lectura abierto (ORF -siglas en inglés) de aproximadamente 9600 nucleótidos de longitud, que codifica una poliproteina lineal de aprox. 3010 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteina es escindida en múltiples sitios por proteasas celulares y virales para producir proteinas estructurales y no estructurales (NS). Las proteinas estructurales (C, E1, E2 Y E2-p7) comprenden polipéptidos que constituyen la particula del virus. Las proteinas no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS48, NS5A, NS58) codifican enzimas o factores accesorios que catalizan y regulan la replicación del genoma de ARN del VHC. El procesamiento de las proteinas estructurales es catalizado por proteasas de la célula huésped. La generación de las proteinas no estructurales maduras es catalizada por dos proteasas codificadas por el virus. La primera es la metaloproteasa NS2/3 zinc-dependiente, la cual auto-cataliza la liberación de la proteina NS3 de la poliproteina. La proteina NS3 liberada contiene un dominio serina proteasa N-terminal y cataliza las escisiones restantes de la poliproteina. La proteina NS4A liberada tiene al menos dos papeles. El primer papel es la formación de un complejo estable con la proteina NS3 y la ayuda en la localización en la membrana del complejo NS3/NS4A; el segundo es actuando como un cofactor para la actividad de proteasa NS3. Este complejo asociado a membrana cataliza a su vez la escisión de los sitios restantes en la poliproteina, efectuando asi la liberación de NS4B, NS5A y NS58. El segmento C-terminal de la proteina NS3 también alberga actividad nucleósido trifosfatasa y ARN helicasa. La función de la proteina NS4B es desconocida. NS5A es una proteina altamente fosforilada que parece ser la responsable de la resistencia al intenerón de diversos genotipos del VHC. NS5B es una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) que está implicada en la replicación del VHC.
El marco de lectura abierto del genoma de ARN del VHC está flanqueado en su extremo 5' por una región no traducida (NTR) de aprox. 340 nucleótidos que funciona como el sitio de entrada interna del ribosoma (IRES), y en su extremo 3' por una NTR de aproximadamente 230 nucleótidos. Tanto las NTRs 5' como 3' son importantes para la replicación del genoma de ARN. La secuencia de variación genómica no está uniformemente distribuida por el genoma y la NTR 5' Y partes de la NTR 3' son las porciones más altamente conservadas.
Las secuencias parciales y completas clonadas y caracterizadas del genoma del VHC han sido analizadas en relación con los objetivos apropiados para una terapia antiviral prospectiva. Las siguientes cuatro actividades enzimáticas virales proporcionan posibles objetivos: (1) la proteasa NS2/3; (2) el complejo de proteasas NS3f4A, (3) la helicasa NS3 y (4) la ARN polimerasa dependiente de ARN de NS5B (RdRp de NS58). También se ha cristalizado la ARN polimerasa dependiente de ARN de NS58 para revelar una estructura reminiscente de otras polimerasas de ácidos nucleicos (Ago et al. 1999; 8ressanelli et al. 1999; Lesburg et al. 1999) con un sitio activo cerrado.
Funciones especificas para virus, esenciales para la replicación, son los objetivos más atractivos para el desarrollo de fármacos. La ausencia de ARN polimerasas ARN dependientes en mamiferos, y el hecho de que esta enzima parece ser esencial para la replicación viral, sugieren que la polimerasa NS58 del VHC es una diana ideal para la terapéutica anti-VHC. Recientemente se ha demostrado que mutaciones que destruyen la actividad de NS5B suprimen la infectividad del ARN del VHC en un modelo de chimpancé (Kolykhalov, A.A. et al. 2000). La etapa inicial de la replicación del ARN viral es el reconocimiento del extremo 3' del molde de ARN por parte de NS5B (RdRp), que puede ocurrir directa o indirectamente con la ayuda de proteinas celulares (Lai, 1998; Strauss et al. ,
1999). La polimerasa del VHC procede entonces a alargar este molde y a formar un producto de ARN complementa rio.
Varios grupos han descrito la estructura cristalina de la polimerasa NS5B del VHC (Ago et al. 1999 supra; Bressanelli el al. 1999 supra; Lesburg el al. 1999 supra) . Se asemeja a una esfera achatada con unas dimensiones aproximadas de 70 A x 60 A x 40 A. La cadena de polipéptido rodea el sitio activo, formando una cavidad en el centro de la molécula, y dando como resultado una apariencia que es muy diferente de otras polimerasas en forma de U. La organización de los dominios de NS5B es consistente con otras polimerasas, debido a que se subdivide en dominios de dedo, palma y pulgar en que se conserva el dominio de palma, es decir, los residuos 188-225 y 287
370. En contraposición con otras polimerasas, los contactos del dominio de pulgar y dedo extensivos resultan en una polimerasa del VHC de forma globular. Estos contactos están mediados, en parte, por los bucles que se extienden desde el dominio de dedo a pulgar. El conocimiento de la estructura cristalina de NS5B es útil para el diseño de fármacos basado en la estructura y, de hecho, se han reseñado recientemente las estructuras de los complejos de polimerasa I inhibidores de NS5B (Wang el al. 2003; Lave et al., 2003; documento EP 1 256628). Se encontró que inhibidores de análogos no nucleósidos se unian de una manera similar a una cuña a un bolsillo de unión hidrofóbico situado cerca de la región C-terminal del dominio pulgar de la polimerasa. En este estudio, se determinó que la enzima sólo sufría cambios conformacionales de menor importancia en el complejo enzimafinhibidor. Al menos dos sitios de unión de NTP se han caracterizado en NS5B, uno en el sitio activo en la palma y un segundo sitio potencial alostérico en el pulgar (Q'Farrell et al., 2003; Bressanelli el al. 2002).
Curiosamente, Labonté el al. 2002 han informado que una mutación de Leu30 en el bucle de dedo N-terminal de la NS58 afecta a su actividad de polimerasa y especulan que una alteración local en la estructura del mutante Leu30 es la responsable de esta disminución en la actividad. Sin embargo, los autores no dicen nada sobre la presencia de un bolsillo de unión que está "enmascarado" por el bucle de dedo en su estado nativo y queda expuesto por una mutación o desplazamiento del residuo Leu30. El descubrimiento de este bolsillo de unión peCUliar es el objeto de la presente invención.
En consecuencia, el esfuerzo para desarrollar tratamientos eficaces contra la infección por VHC puede ser facilitado por un mayor conocimiento de la estructura de enzimas criticas para la replicación del VHC, más notablemente, la polimerasa NS5B. Un mayor conocimiento de la estructura de la enzima, particularmente cuando forma complejo con inhibidores específicos, dará lugar a medios de identificación de sitios de unión en la enzima, así como la conformación de los complejos enzimalinhibidor y residuos susceptibles en la enzima, el conocimiento de cada uno de los cuales es critico para el proceso de diseno y optimización de fármacos.
SUMARIO DE LA INVENCiÓN
Se ha encontrado ahora que la polimerasa del VHC, cuando forma complejo con determinados inhibidores, adopta una conformación en la que la región del bucle de dedo, definida por los residuos aminoácidos 18 a 35, es desplazada para dejar al descubierto un bolsillo de unión definido generalmente por residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503. Esto está en contraposición con las estructuras cristalinas de NS5B descritas en la técnica anterior en las que el bucle de dedo definido por los residuos aminoácidos 18 a 35 oculta este bolsillo de unión en su estado nativo. Este recién "expuesto" bolsillo de unión define una nueva diana en la búsqueda de entidades quimicas adicionales que son capaces de unirse a NS58 de VHC y a modular, o preferiblemente inhibir, la actividad de la polimerasa de NS5B del VHC.
La presente invención proporciona el método de la reivindicación 1.
Aspectos y realizaciones de la presente invención se describen con más detalle en esta memoria con referencia a los dibujos que se acompañan, en los que:
BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1A representa la estructura de apo-enzima NS5B sin el compuesto;
la Figura 1B representa el compuesto A unido a la NS5B, en que los aminoácidos 18-35 están desplazados y no se ven en la estructura;
la Figura 1C representa el compuesto A unido dentro de una representación de la superficie accesible para el disolvente del bolsillo de unión de la presente invención;
la Figura 2 representa el compuesto B ligado en una representación de la superficie accesible para el disolvente del bolsillo de un ión de la presente invención;
la Figura 3 representa un modelo acoplado de la conformación ligada derivada por RMN del compuesto e ligado en la representación accesible del bolsillo de unión de la presente invención;
la Figura 4 muestra las coordenadas de la estructura atómica de NS58 del VHC de la SEC ID N° 1 formando complejo con el compuesto A;
la Figura 5 muestra las coordenadas de la estructura atómica de NS58 del VHC de la SEC ID N° 1 formando complejo con el compuesto B;
la Figura 6 muestra las coordenadas de la estructura atómica de NS58 del VHC de la SEC ID N° 1 formando complejo con el compuesto C.
DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, los términos y la nomenclatura científicos y tecnológicos utilizados aqui tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona con conocimientos ordina rios a los que pertenece esta invención. Generalmente, los procedimientos para el cultivo de células, infección, métodos de biología molecular y similar son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales técnicas estándares pueden encontrarse en manuales de referencia tales como, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1994).
La expresión "NS58 del VHC" se refiere a la ARN polimerasa ARN dependiente (RdRp) de un virus de la hepatitis C (VHC) que está involucrada en la replicación del VHC. Tal como es bien conocido por un experto en la técnica, el término VHC abarca una familia viral que incluye muchas cepas, materiales aislados y subtipos diferentes. Además de ello, la polimerasa NS58 de cada uno de los miembros de esta familia, aunque funcionalmente equivalente y altamente homóloga estructuralmente, variará algo en la secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de una polimerasa NS5B del VHC, NS5B del VHC de genotipo 1 b, se muestra en SEC ID N°: 1. A las secuencias de otras polimerasas NS58 del VHC aisladas se puede acceder en bases de datos de secuencias disponibles al público.
La expresión "bolsillo de unión", tal como se usa aqui, se refiere a una región de una molécula o complejo molecular que, como resultado de su configuración, se asocia favorablemente con o está ocupada por una entidad
o región de la misma molécula o complejo molecular, o una entidad o región de una molécula diferente, complejo molecular, compuesto químico u otro compuesto. De acuerdo con la presente invención, el bolsillo de unión de NS58 definido en esta memoria queda expuesto por el desplazamiento del dominio de bucle de dedo de los residuos 18-35, permitiendo de este modo la unión de un compuesto que es capaz de afectar a la actividad de NS58, por ejemplo, inhibiendo la actividad de NS58. Tipicamente, un bolsillo de unión, o al menos una parte del mismo, comprende una cavidad que es el sitio de interacción con una entidad de la misma o de diferente molécula. Como se apreciará por los expertos en la técnica, la naturaleza de la cavidad dentro de un bolsillo de unión puede variar de una molécula a otra.
La expresión "aislado y purificado", tal como se utiliza con respecto a polipéptidos de acuerdo con la presente invención, se refiere a un polipéptido que está sustancialmente libre de otros componentes.
La expresión "NS58 de HCV nativa", tal como se utiliza en esta memoria con respecto a la secuencia de aminoácidos del bolsillo de unión de la presente invención, se refiere a la secuencia de aminoácidos natural del bolsillo de unión en una NS58 del VHC dada.
La expresión "configuración funcional nativa", tal como se utiliza con respecto al bolsillo de unión de la presente invención, se refiere a la disposición natural, incluida la disposición espacial, de aminoácidos que forman un bolsillo que se puede asociar con o puede ser ocupado por ciertos compuestos/entidades.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "complejo" se refiere a la combinación de dos o más entidades, de las que por lo menos una es una proteína o enzima. En particular, complejos de acuerdo con la presente invención se forman entre una proteina NS58, incluidos análogos de los mismos, Que pueden incluir sustituciones de aminoácidos, truncamientos o inserciones, y otro compuesto. La combinación o "complejación" de un compuesto o entidad Química con una proteina se refiere a la naturaleza de la asociaciónfunión entre el compuesto o entidad quimica y la proteína. La asociación entre los componentes del complejo es la condición de proximidad entre los mismos y puede ser de naturaleza no covalente, en el que la yuxtaposición se ve energética mente favorecida por enlaces hidrógeno, fuerzas de van der Waals o interacciones electrostáticas, o puede ser covalente.
El término "análogo", tal como se utiliza en esta memoria, designa, con respecto a un compuesto molecular, una secuencia de aminoácidos modificados de la secuencia nativa o natural de aminoácidos que conserva la actividad biológica (ya sea funcional o estructural) de la secuencia nativa de aminoácidos. Este análogo puede ser de la misma o diferentes especies y puede ser un análogo natural o se puede preparar sintéticamente. Tales análogos incluyen secuencias de aminoácidos que tienen sustituciones, deleciones o adiciones de uno o más aminoácidos, con la condición de Que se conserve la actividad biológica de la proteína. En particular, la expresión "análogo conservador" designa un análogo que tiene modificaciones de aminoácidos Que conservan la actividad biológica. Análogos que incluyen sustituciones de aminoácidos pueden incluir sustituciones Que tienen similitud, ya sea fuerte o débil (véase, por ejemplo, Dayhoff, M.O., (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, supl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) tal como se define según la siguiente ~Tabla de Similitud de Aminoácidos~:
Aminoácido
Fuerte Débil
A
G , S C, T, V
e
A, s
D
E G, H, K, N, a , R, s
E
D H,K,N,a, R,S
F
W , Y H, 1, L, M
G
A D,N,S
H
y D, E, F, K, N,a, R
I
L.M, V F
K
R D, E, H, N, a, S, T
L
I M,V F
M
1, L, V F
N
Q D,E,G,H, K,R,S,T
p
S, T
Q
N D,E,H,K, R,S
R
K D, E, H, N, a
s
A , T C,D,E,G, K,N,p,a
T
s A,K,N,P, V
V
I L, M A, T
W
F , Y
y
F H W
El significado de la expresión ~análogo funcionalmente equivalente", tal como se utiliza en esta memoria con respecto al polipéptido del bolsillo de unión de la invención se refiere a sustituciones, deleciones o inserciones de uno o más de los aminoácidos del bolsillo de unión. Las sustituciones pueden hacerse tal como se establece anteriormente, por ejemplo, con un aminoácido conservativo apropiado o un análogo de aminoácido sintético
10 conservativo. En esencia, el término ~análogo~ se corresponde con la definición que antecede. La frase "funcionalmente equivalente~ indica que el análogo conserva la actividad biológica de la molécula nativa.
La expresión ~cadena lateral" con referencia a un aminoácido o residuo de aminoácido, significa un grupo fijado al átomo de carbono o. del a-aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral del grupo R para glicina es hidrógeno, para alanina es metilo, para valina es isopropilo. Para los grupos R especificos o cadenas laterales de los a-aminoácidos
15 se hace referencia al texto sobre Bioquimica de A.L. Lehninger (véase el capitulo 4).
El término "truncamiento" se refiere a cualquier segmento acortado o abreviada de una molécula que, para los fines de la presente invención, conserva su actividad biológica. Truncamiento puede referirse al acortamiento de una molécula de proteina nativa, o a un análogo de la misma.
La expresión ~desviación de la raiz cuadrada media" o "desviación rms~ o "rmsd" significa la raiz cuadrada de la
20 media aritmética del cuadrado de las desviaciones de la media. En el contexto de objetos atómicos, los números se proporcionan en angstroms (A). Es una forma de expresar la desviación o variación de una tendencia u objeto.
En esta memoria se util iza n las sigu ientes abreviatu ras :
DLB: ampliación de la linea diferencial;
DMSO: dimetilsulfóxido;
25 TDT: ditiotreitol;
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético;
FID: decaimiento de inducción libre
IPTG: isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido
HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
30 MES: ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico,
MPD: 2-metil-2,4-pentanodiol
RMN: resonancia magnética nuclear;
NOESY: Espectroscopia Nuclear de Efecto Overhauser
PEG: polietilenglicol;
PEG5kmme: éter mono metílico de polietilenglicol 5000;
Tris: tris(hidroximetil)aminometano;
TSP: 3-trirnetilsililletradeuteriopropionato de etilo.
la presente invención proporciona un método de identificación de compuestos que pueden unirse a NS5B de VHC, que comprende las etapas de:
a) aplicar un algoritmo de modelado molecu lar tridimensional a las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión de NS58 del VHC definido por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y503 (y, opcionalmente, uno de: los residuos aminoácidos 37 y 496) de una NS58 del VHC nativo (SEC ID N°: 1) para determinar las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS58 del VHC, y
b) rastrear electrónicamente las coordenadas espaciales almacenadas de compuestos candidatos frente a las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS58 del VHC para identificar compuestos que pueden unirse dentro de la cavidad de unión de NS58 del VHC.
En formas de realización preferidas de este aspecto de la invención, el bolsillo de unión se puede definir adicionalmente por uno o más residuos aminoácidos 36, 426, 498 Y 499, o por uno o más de los grupos de aminoácidos definidos por los residuos aminoácidos 36 -37,392-399,424-429 Y492-503.
las coordenadas estructurales del bolsillo de unión son las recogidas en una cualquiera de las Figuras 4 ó 5.
De acuerdo con este aspecto de la invención, cualquier compuesto dado puede ser evaluado por ordenador en cuanto a su capacidad de asociarse con el bolsillo de unión de NS58 del VHC definido en esta memoria y, por lo tanto, se puede determinar su potencial como un inhibidor de NS58. Tal como se aludió anteriormente, un modelo de ordenador de un polipéptido que consiste en un bolsillo de unión de NS58 del VHC tal como se define en esta memoria se construye utilizando software bien conocido tal como QUANTA [Molecular Simulations Inc, San Diego, California], Sybyl [Tripas Associates, SI. louis, Mo.], InsightU [Accelrys], MOE [Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá]. Compuestos seleccionados a evaluar pueden luego disponerse en una diversidad de orientaciones, o acoplarse, dentro del bolsillo de unión. El acoplamiento puede realizarse utilizando el software tal como GRID, DOCK, AUTODOCK, FlexX y GOlD. Cuando un compuesto está acoplado dentro del bolsillo de unión para formar una representación Rvirtuar de un complejo de NS58, se pueden emplear además medios de ordenador para generar mapas cuantitativos y cualitativos del complejo, incluyendo, por ejemplo, mapas de farmacóforos, mapas de propiedades de superfiCie (que representan en mapa superficies de Conolly, Gauss y de van der Waals) y mapas de Potenciales de Receptores ProbabiHsticos usando software tal como QUANTA, Sybyl, InsighUl y MOE.
la eficacia con la que un compuesto seleccionado se une al presente bolsillo de unión de NS58 del VHC puede ser testada y optimizada por evaluación por ordenador. la calidad del ajuste de un compuesto dado dentro del bolsillo de unión de NS58 puede ser evaluada, por ejemplo, por la forma, el tamaño y la complementariedad electrostática como se determinó cualitativamente mediante inspección visual o como se determina cuantitativamente mediante el uso de funciones de puntuación tales como lUDI, PlP, PMF, SCORE, GOlD y Flex>:.. Estos métodos de evaluación cualitativa y cuantitativa se pueden emplear individualmente o en combinación, por ejemplo tal como en una forma de puntuación de consenso.
Altemativamente, la eficacia de unión se puede determinar en base a la energía de interacción de un complejo formado por la unión o asociación de un compuesto con la NS58 del VHC. Por ejemplo, un compuesto determinado para formar un "complejo estable de baja energía" con NS58, en la manera descrita en esta memoria, merece un análisis adicional como un potencial inhibidor de NS58. la expresión "complejo estable de baja energía", tal como se utiliza en esta memoria, se define como un complejo de NS58 en el que el valor de la energia de interacción de van der Waals, es decir, la energía de interacción de van der Waals entre el compuesto y NS58, es menor que aproximadamente 8000 kcal!mol. El valor de la energía de interacción de van der Waals se puede determinar utilizando el software MOE, y se basa en el campo de fuerza MMFF94. En consecuencia, un compuesto determinado para formar un complejo que tiene un valor de la energia de interacción de van der Waals menor que aproximadamente 8000 kcalfmol es un inhibidor potencial de NS58. Preferiblemente, un complejo estable de baja energia de acuerdo con la presente invención tendrá un valor de la energia de interacción de van der Waals de
menos de aproximadamente 6000 kcal/ mol, y más preferiblemente, un valor de menos de aproximadamente 4000 kcalfmol.
Método de Uso de las VariantesfAnálogos del Polipéptido de NS58
Una vez que se ha rastreado una serie de compuestos utilizando métodos virtuales tales como los descritos anteriormente, los compuestos determinados como potenciales inhibidores de VHC se pueden evaluar adicionalmente para determinar la propensión real de cada uno de ellos de interactuar con el bolsillo de unión de la presente invención y para inhibir el VHC.
Por lo tanto, se describe un método de rastrear compuestos inhibidores de NS5B del VHC candidatos, que comprende las etapas de:
a) incubar un compuesto inhibidor candidato en condiciones adecuadas para la unión con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
i) un polipéptido aislado y purificado que comprende un bolsillo de unión de NS5B del VHC funcional definido por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 (y opcionalmente uno de: residuos aminoácidos 37 y 496) de una NS5B del VHC nativa, o definido por un análogo funcionalmente equivalente de la misma, en donde dicho bolsillo de unión queda expuesto por el desplazamiento de una cadena de bucle de dedo definida por al menos los residuos aminoácidos 18 a 35 y en donde dicho bolsillo de unión conserva su configuración funcional nativa;
ii) un polipéptido de NS58 del VHC aislado y purificado que consiste de un bolsillo de unión de NS58 del VHC definido por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429 , 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 (y, opcionalmente, uno de: los residuos aminoácidos 37 y 496) de una NS5B del VHC nativa, o definido por un análogo funcionalmente equivalente de la misma, en donde dicho bolsillo de unión conserva su configuración funcional nativa;
iii) un análogo de polipéptido de NS58 del VHC aislado y purificado que comprende un bolsillo de unión de NS58 del VHC definido por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 (y, opcionalmente, uno de: residuos aminoácidos 37 y 496) de una NS58 del VHC nativa,
o definido por un análogo funcionalmente equivalente de la misma, en donde dicho bolsillo de unión conserva su configuración funcional nativa y en donde dicho bolsillo de unión puede quedar expuesto;
iv) una variante del pOlipéptido de NS5B del VHC que comprende al menos una mutación de aminoácido dentro de un bucle de dedo definido por los residuos aminoácidos 18 a 35, en donde dicha mutación provoca un desplazamiento de dicho bucle de dedo para exponer un bolsillo de unión definido esencialmente por los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 (y, opcionalmente, uno de: los residuos aminoácidos 37 y 496) de NS58 del VHC nativa, o definido por un análogo funcionalmente equivalente de la misma, en donde dicho bolsillo de unión conserva su configuración funcional nativa;
v) un polipéptido de NS5B del VHC, o un análogo funcionalmente equivalente de la misma, caracterizado por el desplazamiento de los restos aminoácidos 18 a 35; y
vi) un polipéptido de NS58 del VHC, o un análogo funcionalmente equivalente de la misma, en donde se han suprimido al menos los residuos aminoácidos 18 a 35;, y
b) determinar si o no el compuesto inhibidor candidato se une al polipéptido, en donde un compuesto que se une al polipéptido es un inhibidor potencial de NS58 del VHC.
La unión del compuesto candidato dentro del bolsillo de unión de NS5B del VHC definido se puede determinar utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos de unión en los que el compuesto candidato queda expuesto a un polipéptido que contiene el bolsillo de unión de NS58 de la invención en condiciones adecuadas para que se produzca la asociación o unión. La unión se evalúa después, por ejemplo utilizando RMN u otras técnicas de detección conocidas.
Los expertos en la técnica reconocerán que la asociación de ligandos o sustratos naturales con el bolsillo de unión de sus receptores o enzimas correspondientes es la base de muchos mecanismos de acción biológicos. De manera similar, muchos fármacos ejercen sus efectos biológicos a través de la asociación con las cavidades de unión de receptores y enzimas. Tales asociaciones pueden ocurrir con la totalidad o con cualquier parte del bolsillo de unión. Una comprensión de tales asociaciones ayudará a conducir al diseño de fármacos que tengan asociaciones más favorables con su receptor diana o enzima y, por lo tanto, a efectos biológicos mejorados. Por lo tanto, esta información es valiosa en el diseño de ligandos o inhibidores potenciales de receptores o enzimas tales como los inhibidores de polipéptidos similares a NS58 del VHC y, lo más importante, NS58 del VHC.
En el diseño de fármacos iterativo, se obtienen cristales de una serie de complejos de proteina/compuesto y luego se resuelve la estructura tridimensional de cada uno de los complejos. Una estrategia de este tipo proporciona una idea de la asociación entre las proteinas y los compuestos de cada uno de los complejos. Esto se logra mediante la selección de compuestos con actividad inhibidora, obteniendo cristales de este nuevo complejo de proteina/compuesto, resolviendo la estructura tridimensional del complejo, y comparando las asociaciones entre el nuevo complejo de proteinafcompuesto y complejos de proteina/compuesto previamente resueltos. Mediante la observación de cómo los cambios en el compuesto afectaban a las asociaciones proteínafcompuesto, estas asociaciones pueden ser optimizadas.
Los siguientes ejemplos específicos no deben ser considerados como limitativos.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 -EXPRESiÓN Y PURIFICACiÓN DE NS5B DEL VHC
El genotipo 1b del VHC recombinante (cepa J4) de NS5B polimerasa (cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEC ID N°: 1) se produjo en forma soluble mediante la expresión de una variante que carece de los 21 aminoácidos C-terminales que se encuentran normalmente en la NS5B madura. Para los fines de la presente invención, este NS5Bfl.21 se expresó con una secuencia de hexa-histidina C-terminal. La expresión de la NS5B partir de un vector pET en la cepa de E. coN JM109 (DE3) se indujo con IPTG 0,4 mM durante 3 horas a 24°C. Las células se recogieron (en Tris 25 mM pH 7,5, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, NaCI500 mM, 2-mercaptoetanol2 mM y cóctel de inhibidores de la proteasa (cóctel estándar que se puede adquirir de Roche Biochemicals Inc.) y se lisaron en un microfluidizador. Ellisado, después de la centrifugación (30.000 X), se pUrificó de acuerdo con las siguientes etapas cromatográficas secuenciales que son conocidas para un experto en la técnica: (i) afinidad de metal usando resina Ni-NTA (Qiagen) y la elución con un tampón que contiene una concentración creciente de imidazol (de 10 mM a 500 mM); (ii) cromatografía de DEAE-Sepharose, en donde la NS5B fluía a través de la columna en una disolución tamponada que contiene NaCI 300 mM; (iii) cromatografia en heparina-Sepharose, en donde la NS5B estaba en una solución tamponada con NaCI 200 mM, y luego NS5B unido se eluyó a continuación con un tampón que contiene un gradiente de hasta NaCI 1 M. fracciones eluidas, enriquecidos con la proteina NS5B, se concentraron en una columna Resource S, y después se aplicaron a una columna Superdex 200 en Tris-HCI 20 mM pH 7,5, glicerol al 10%, DTT 5 mM, NaCI 300 mM. Las fracciones pico que contenían NS5B etiqueta His altamente pura se almacenaron a -800C hasta su uso.
EJEMPLO 2 -CRISTALIZACiÓN DE NS5B DEL VHC
La cepa 1b/J4 de la polimerasa NS5B del VHC (SEC, ID N°: 1), obtenida como se describe en detalle en el Ejemplo 1, se cristalizó en su forma apo utilizando éter monometílico de polietilenglicol5000 (PEG5Kmme) como un agente precipitante. Se obtuvieron cristales individuales grandes por la técnica de difusión de vapor de gota colgante (McPherson, supra). En particular, se añadió 1 ¡.tL de NS5B (7,66 mgfmL en tampón de purificación que contiene Tris 20 mM, pH 7,3, NaCI300 mM, glicerol al 10%) a 1 I-lL de una disolución hecha de PEG5Kmme aI21%, MES 0,1 M, pH 5,4, glicerol al 10% y sulfato de amonio 0,4 M. La gota de 2 ¡.tL resultante se suspendió por encima de 1 mL de una disolución de depósito de PEG5Kmme al 21%, MES 0,1 M, pH 5,4, 20% de glicerol y sulfato de amonio 0,4
M. Los cristales del complejo NS5B obtenido pertenecen al grupo espacial P2(1)2(1)2(1) con una dimensión de celdilla unidad de a = 105,1, b = 106,6 Y c = 133,5 Y contienen dos moléculas por unidad asimétrica. Se demostró que los cristales difractan a una resolución de hasta 2 A utilizando rayos X de una fuente de ánodo rotatorio regular.
EJEMPLO 3 -PREPARACiÓN DE COMPUESTOS INHIBIDORES A, B Y C
El compuesto inhibidor A se preparó como se describe en detalle en la solicitud co-pendiente de EE.UU. 101755.256 presentada el12 de enero de 2004.
El compuesto inhibidor B se preparó como se describe en detalle en la solicitud co-pendiente de EE.UU. 101755.256 presentada el12 de enero de 2004.
El compuesto inhibidor C se preparó como se describe en detalle en el documento WO 03/007945 publicado el 22 de enero de 2003.
EJEMPLO 4 -FORMACiÓN DEL COMPLEJO NS5B-INHIBIOOR
Empapamiento del inhibidor
Los cristales se transfirieron a una gota de 5 ¡.tL de una solución de empapamiento hecha de PEG5Kmme al 14%, Tris 14 mM, pH 7,5, MES 70 mM, pH 7,0, glicerol al 14%, NaCI 210 mM, 10 mgfmL de lisozima y 280 mM de sulfato de amonio. La molécula de inhibidor se disolvió en DMSO a una concentración de 25 mM. Solución de inhibidor (0,2
IlL) se af'iadió a la gota de cristal de 5 IlL de NS5B y se incubó durante 5-6 horas a 11OC. Después de la incubación, los cristales del complejo NS5B-inhibidor se transfirieron de la disolución con un Cryoloop (Hampton Research, California, EE.UU.) y se crio-enfriaron en nitrógeno liquido. Complejos de NS5B se prepararon utilizando los Compuestos A y B.
Recogida de datos
Los datos de difracción se recogieron en un generador de rayos x de ánodo giratorio MicroMax-007 equipado con un detector de placa de la imagen Raxis-IV + + (Rigaku I MSC, Texas, EE.UU. ). Los datos a una resolución de 2,8 A se recogieron en un único cristal crio-enfriado a -180°C para complejos de NS5B preparados con el Compuesto A y el Compuesto B.
Ajuste de fase construcción del modelo y refinamiento
Los datos de difracción fueron ajustados en fase por reemplazo molecular (MR), utilizando la estructura públicamente disponible de NS5B del VHC (código pdb: 1C2J). La rotación y la búsqueda de traslación se realizaron utilizando el programa CNX (Accelrys). La construcción del modelo se realizó con el software O (Alwyn Jones, Universidad de Upsala, Suecia) y el refinamiento del modelo se realizó con el software CNX (Accelrys). El modelo se mejoró por la repetición del proceso de construcción de modelos y refinamiento hasta que se obtuvo un resultado deseable. El modelo final en cada caso inclura dos moléculas de NS5B, identificadas como NS5B A y NS5B B (es decir, residuos A1 a A149, A154 a A563, B1 a B17, B36 a B148 y B153 a B563) y una molécula del compuesto A o B asociado con la molécula de NS5B B. Las coordenadas de la estructura atómica resultante de los complejos de NS5B compuesto A y compuesto B se muestran en la fig. 4 Y la fig. 5, respectivamente. El factor R cristalográfico final del complejo NS5B-Compuesto A fue de 21,9% y el factor R1ibre fue de 28,0% a una resolución de 2,8 A. Para el complejo de NS5B-Compuesto B, el factor R cristalográfico final fue de 21,9% Y el factor Rlibre fue de 25,7% a una resolución de 2,7 A.
EJEMPLO 5 -MODELO DE COMPLEJO NS5B-COMPUESTO C EN BASE A UNA CONFORMACION LIGADA A
RMN
El sitio de unión del Compuesto C en la polimerasa del VHC se determinó mediante varias etapas que se describen en esta memoria en detalle. Inicialmente, se emplearon métodos espectroscópicos de RMN (NOESY transferido) para determinar la estructura del Compuesto C cuando se unen a la polimerasa del VHC. Otra técnica de RMN, ensanchamiento diferencial de linea (OLB -siglas en inglés), ayudó a identificar los segmentos del Compuesto e que entran en contacto con la polimerasa frente a los que están expuestos al disolvente en el estado ligado. A continuación, la estructura ligada se acopló a la estructura derivada de rayos X del complejo NS5B-Compuesto A. El proceso de acoplamiento se inició mediante la superposición de la caracteristica común de los 5f6 an illos aromáticos del indol y bencimidazol del compuesto A y el compuesto C. Todos los datos del ensancham iento diferencial de la linea se evaluaron a continuación, y el complejo se redujo en energra utilizando MOE.
El NOESY transferido y los datos OLB fueron adquiridos de la siguiente manera. Un tubo de muestra (5 mm) que contiene el Compuesto C se preparó mediante la adición de 15 j.tL de disolución concentrada en DMSQ-ds (que contiene 0,31 mg de Compuesto C) a un tampón acuoso compuesto por Tris-d11 20 mM, OTT-d 1o 2 mM, EDTA-d12 1 mM, NaCI 300 mM, y D20 a110% (vlv) dotado con TSP-2,2,3,3-d4. Se añadió tampón hasta un volumen final de 600 j.tL, Y el pH se ajustó a 6,0. Se tomaron espectros del Compuesto e libre. Una solución patrón concentrada de la polimerasa del VHC se añadió dos veces al tubo de RMN y se adqui rieron los espectros. El material concentrado contenía 21,7 mgfmL de polimerasa del VHC (NS5B.ó.21C-Hise) en tampón que consiste en Tris-d ll 20 mM, OTT-dl0 2 mM, EOTA-d 12 1 mM, NaCI300 mM y glicerol-deal 10% (vlv).
Los espectros de RMN se adquirieron en espectrómetros de RMN a 600 y 800 MHz de Bruker AVANCE a 22 y 27OC. La supresión de la señal de disolvente se consiguió mediante el uso de pre-saturación o mediante la inserción de un módulo 3-9-19 WATERGATE antes de la adquisición de datos. Se recogieron espectros unidimensionales en los dos tubos de muestra para las comparaciones con OLB, y se recogieron 128 exploraciones para cada uno de los espectros. Experimentos NOESY en un tubo de muestra que no contiene polimerasa resultó en la observación de ningún pico cruzado significativo, como era de esperar. Por otro lado, los espectros NOESY en un tubo de muestra que contiene polimerasa resultó en la observación de muchos picos cruzados que contenian la información valiosa de la distancia entre-hidrógeno del inhibidor e cuando se unen a polimerasa del VHC. Se registró una serie de tiempos de mezcladura NOESY que incluían 75, 100, 150, 200 y 300 ms (en campos de 600 y 800 MHz). Conjuntos de datos bidimensionales se adquirieron típicamente con 2048 puntos en h y 512 puntos en ti. Se promediaron 128 exploraciones NOESY FID. Los datos fueron procesados y analizados utilizando el software XWinNMR y WinNMR de Bruker (Bruker Canada, 555 Steeles Ave. East, Milton, Onta rio). Los conjuntos de datos fueron rellenados a cero para producir 2048 por 2048 puntos reales después de la transformación utilizando una función de ventana sinebell desplazada en fase.
La estructura del Compuesto C se calculó mediante un protocolo de apareamiento simulado personalizado que se implementó en el programa de modelado molecular MOE (CCG, Monlreal, Oc, Canadá). Todos los cálculos se
realizaron con el campo de fuerza mmff94 tal como se implementa en la versión MOE 2202.03. Restricciones de fondo plano derivadas de RMN se generaron a partir de la serie de datos de NOESY. La intensidad relativa de picos cruzados NOESY se clasificó en tres categorías que a continuación se utilizaron como sistemas de retención, fuerte (1,8 -2,7 A), media (1,8 -3,5 A) o débil (1,8 -5,0 A). Las constantes de fuerza en las restricciones de fondo plano derivadas de RMN se incrementaron gradualmente durante las etapas de enfriamiento. Se realizó una única operación dinámica, a alta temperatura, sin restricciones a 1000 K, recogiéndose 100 estructuras a intervalos de 10 ps para generar un conjunto inicial de conformaciones. Cada una de las estructuras se enfrió y se minimizó utilizando el siguiente protocolo de apareamiento simulado. Durante las simulaciones, la temperatura y los pesos de retención se cambiaron de 1000K a 50K, y de 111000000 a 20, respectivamente. Se minimizó la energía de las estructuras finales, se calcularon las energías totales, se calcularon las energías de retención, y se determinaron las violaciones de retención. Se aislaron las estructuras RMN-consistentes, y se identificaron dos familias de estructuras.
A continuación, un representante de cada una de las familias de estructuras derivadas de RMN se acopló a la estructura derivada por rayos X del complejo NS5B-Compuesto A. El proceso de acoplamiento se inició mediante la superposición de los 5f6 anillos aromáticos comunes de las estructuras de indol y bencimidazol de los Compuestos A y C. Sólo una estructura de compuesto C emparejaba simultáneamente los datos de OLB y la forma del bolsillo de unión. En este complejo, el lado derecho del Compuesto e se encuentra sobre o en las proximidades de Pro 495 y Pro 496. Utilizando el programa de modelado molecular MOE, las orientaciones de la cadena lateral de aminoácidos en las posiciones 503, 498 Y 499 fueron ligeramente re-ajustadas para mejorar el ajuste inhibidorpolimerasa. Se protonaron His 428 y 502. Una combinación de descenso más agudo, gradiente de conjugado y algoritmos de Newton truncados se utilizaron para minimizar la energia del complejo que dio lugar a sólo cambios menores en la estructura. El protocolo se estableció de tal manera que los residuos de inhibidor y polimerasa dentro de 6 A del inhibidor se les permitiÓ moverse durante la minimización, mientras que todos los demás residuos se fijaron, y se utilizó un corte de fuerzas de largo alcance a 9,5-10 A. El campo de fuerzas mmff94s como se aplica en el programa de modelado molecular MOE versión 2002.03 se aplicó para los cálculos que incluian solvatación. La visualización del complejo se llevó a cabo utilizando el programa de modelado molecular MOE.
Las coordenadas estructurales del complejo NS5B-Compuesto e se generaron a partir de la minimización final y se muestran en la Figura 6.
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LISTADO DE SECUENCIAS
5
<110> <120> <130> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH BOLS ILLO DE UN iÓN DEL INHIBIDOR DE LA POLlMERASA N$5B DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C 13/123
10
<140> <141> <160> 60/469.604 6
<170>
FastSEQ pa ra Windows versión 4.0
15
<210> <211> <212> <213> 1 576 PRT VHC
<400,. 1 Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala 1 S 10 ~5 Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg 20 25 30 Hi~ Hi8 Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Leu Arg
35 4. 45
Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln val Leu ASp ASp His Tyr
50 55 6. Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val "Lys Ala 65 70 75 80 Lys Leu Leu Ser Ile Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser
8. 9. ,. Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp val Arg Asn Leu Ser 100 105 110 Ser Arg Ala Val Asn Bis Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu 115 120 125 Thr Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys ser Glu Val
130 135 140 Phe Va.l Gln Pro Olu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile
0,' 145 150 1SS 160 Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val o,a olu Lys Met Ala Leu Tyr
165 170 1" Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ser Ser 'l'yr Gly 180 185 190 Phe Gln Tyr Ser Pro Lys Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Thr Trp 195 200 205 Lys Ser Lys Lys Cys Pro Met 01y Phe Ser l)'r Aap Thr Arg Cys Phe 210 215 ". Mp Ser Thr val Thr Glu Ser Asp Ile Arg val Olv Glu Ser Ile Tyr 230 235
". "O
01n Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gln Ala Ile Arg Ser Leu 245 250 255
Thr" Olu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser ~ys Gly Gln 260 265 270 Asn Cys Gly Tyr ~rg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser 275 280 285 Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Thr Ala Ala Cys Arg
290 295 300 Ala Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Leu 30' 310 31' 320 Val Val Ile Cys Glv Ser Ala Gly Thr Gln Glv Asp Ala Ala Ala Leu
325 330 335 Arg Ala Phe Thr Glv Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro oly Asp 340 345 350 Pro Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser 355 360 365 Aan Val Ser val Ala Bis Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu
370 375 380 Thr Arg Asp Pro Thr Thr P¡:-o Leu Ala. Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala 385 390 395 400 Arg His Thr pro !le Asn Ser Trp Leu oly Asn I le Ile Met Tyr Ala
405 410 415 Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Mot Thr His Phe Phe Ser ¡le 420 430
4"
Leu Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu Lys Ala Leu Asp 0" oln Ile Tyr 435 4.0 445 Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Oln Ile Ile Glu
450 455 460 Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly 465 470 47. 480 Glu Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro
485 490 495 Leu Arg Thr Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val AI"g Ala Lys Leu Leu 500 505 510 Ser Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp 515 5~0 525 Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Gln
530 535 540 Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly ASp" Ile 545 550 555 560 Tyr gis Ser Leu ser Arg Ala Arg Pro Arg His His His Bis Bis Hia
565 570 575
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> VHC
<4.00> 2
Ser Met Ser Tyr 1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<21 3> VHC
<4.00> 3
Leu <Uy Val Pro 1
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> VHC
<4.00> 4.
I.oeU Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr 1 ,
<210> 5
<21 1> 6
<212> PRT
<213> VHC
<400> 5 !le LeU M't Thr Mi. phe
, ,
<210> 6
<211 > 12
<212> PRT
<213> VHC
<4 00> 6
Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Thr Trp Arg His Arg 1 5 10

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método de identificar un compuesto que se une a NS5B del VHC, que comprende las etapas de
    a) aplicar un algoritmo de modelo molecular tridimensional a las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión
    5 de NS58 del VHC definido por las coordenadas estructurales de al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503, Y opcionalmente uno de los residuos aminoácidos 37 y 496 de una NS58 del VHC nativa (SEC ID N°: 1), para determinar las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS5B del VHC, en donde las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión de NS58 del VHC son las coordenadas estructurales de
    10 (¡ji) Figura 4 para el bolsillo de unión de NS5B del VHC formado por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 de SEC ID N°: 1, Y en donde esta etapa implica utilizar coordenadas estructurales correspondientes a cada uno de los átomos de los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424,425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 de SEC ID N°: 1 dentro de 5 A del complejo proporcionado en la Figura 4, o
    15 (iv) Figura 5 para el bolsillo de unión de NS5B del VHC formado por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 de SEC ID N°: 1, Y en donde esta etapa implica utilizar coordenadas estructurales correspondientes a cada uno de los átomos de los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424,425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 de SEC ID N°: 1 dentro de 5 A del complejo proporcionado en la Figura 5;
    20 b) rastrear electrónicamente las coordenadas espaciales almacenadas del compuesto frente a las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS5B del VHC para determinar si el compuesto se une con el bolsillo de unión de NS58 del VHC.
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