CN100457776C - 丙型肝炎病毒ns5b聚合酶抑制剂结合袋 - Google Patents
丙型肝炎病毒ns5b聚合酶抑制剂结合袋 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100457776C CN100457776C CNB2004800194730A CN200480019473A CN100457776C CN 100457776 C CN100457776 C CN 100457776C CN B2004800194730 A CNB2004800194730 A CN B2004800194730A CN 200480019473 A CN200480019473 A CN 200480019473A CN 100457776 C CN100457776 C CN 100457776C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- binding pocket
- compound
- ns5b
- hcv ns5b
- hcv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108700008776 hepatitis C virus NS-5 Proteins 0.000 title claims abstract description 209
- 229940123066 Polymerase inhibitor Drugs 0.000 title description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 119
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 187
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 158
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 101
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 100
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 88
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 79
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 58
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 58
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 51
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 43
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 34
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 25
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 20
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 19
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 13
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 claims description 12
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 claims description 10
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 9
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 6
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 claims description 4
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 238000013139 quantization Methods 0.000 claims description 3
- 238000003041 virtual screening Methods 0.000 claims description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229940093916 potassium phosphate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003339 sodium phosphate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011548 crystallization buffer Substances 0.000 claims 1
- UWJJYHHHVWZFEP-UHFFFAOYSA-N pentane-1,1-diol Chemical class CCCCC(O)O UWJJYHHHVWZFEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 abstract description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 abstract 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 62
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 59
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 57
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 54
- 210000003811 finger Anatomy 0.000 description 42
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 230000006870 function Effects 0.000 description 29
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 25
- 230000008859 change Effects 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N corticosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@H](CC4)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N 0.000 description 4
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 4
- 101710118188 DNA-binding protein HU-alpha Proteins 0.000 description 3
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 3
- 101800001014 Non-structural protein 5A Proteins 0.000 description 3
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 3
- HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 1H-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC=NC2=C1 HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 2
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 102220369445 c.668T>C Human genes 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002288 cocrystallisation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000047612 human CCN2 Human genes 0.000 description 2
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102220023257 rs387907546 Human genes 0.000 description 2
- 238000002922 simulated annealing Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-YHPVEMKJSA-N 1,1,2,3,3-pentadeuterio-1,2,3-trideuteriooxypropane Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])C([2H])(O[2H])C([2H])([2H])O[2H] PEDCQBHIVMGVHV-YHPVEMKJSA-N 0.000 description 1
- STRAHSCTRLRZNU-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-carbazol-3-ylamino)phenol Chemical group C1=CC(O)=CC=C1NC1=CC=C(NC=2C3=CC=CC=2)C3=C1 STRAHSCTRLRZNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 1
- 241001232809 Chorista Species 0.000 description 1
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 1
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 102220369446 c.1274G>A Human genes 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002124 flame ionisation detection Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 1
- 238000000079 presaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 102220231029 rs104894774 Human genes 0.000 description 1
- 102220004457 rs11567847 Human genes 0.000 description 1
- 102220023256 rs387907547 Human genes 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 235000010334 sodium propionate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007614 solvation Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 238000002910 structure generation Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000008957 viral persistence Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001363 water suppression through gradient tailored excitation Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
HCV聚合酶，当与某些抑制剂复合时，会采用取代手指环区而暴露结合袋的构象，其中所述手指环区由氨基酸残基18至35定义，结合袋通常由氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，496，500和503定义。这种新的暴露型结合袋为寻找能结合HCVNS5B，并调节或优选抑制HCV NS5B聚合酶活性的其它化学实体定义了一种新的靶标。
Description
发明领域
本发明涉及丙型肝炎病毒NS5B聚合酶(HCV NS5B)，尤其是，新型HCVNS5B抑制剂结合袋(binding pocket)。提供的HCV NS5B的晶体结构包括定义该新型抑制剂结合袋的坐标和用于抑制剂筛选的三维模型。同时，提供了利用该晶体结构和抑制剂结合信息设计和筛选NS5B抑制剂的方法。
发明背景
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后和群体获得性的全球性非甲非乙肝炎的主要致病因子。已证实全球超过2亿人感染有这种病毒。很高比例的携带者成为慢性感染者并且大多数发展为慢性肝病，即所谓的慢性丙型肝炎。这些群体随后有患严重肝病的危险，例如肝硬化、肝细胞癌和晚期肝病而导致死亡。
HCV形成病毒持久性和导致慢性肝病高发病率的机制还没有完全得到阐明。还不知道HCV是如何与宿主免疫系统相互作用并逃避该系统的。另外，细胞免疫应答和体液免疫应答在防止HCV感染和疾病中的作用也还没有得以确立。
HCV是黄病毒科的有包膜、正链RNA病毒。单链HCV RNA基因组是正极性的，包含一个约9600个核苷酸长的开放读框(ORF)，编码约3010个氨基酸的线性多蛋白。在被感染的细胞中，该多蛋白被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶在多个位点切割，产生结构和非结构(NS)蛋白。结构蛋白(C、E1、E2和E2-p7)包括构成病毒颗粒的多肽。非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)编码催化和调节HCV RNA基因组复制的酶或辅助因子。宿主细胞蛋白酶催化结构蛋白的加工。成熟非结构蛋白是由两种被病毒编码的蛋白酶催化产生的。第一种是NS2/3锌依赖性金属蛋白酶，该酶自动催化NS3蛋白从多蛋白中释放。释放的NS3蛋白包括N-末端丝氨酸蛋白酶结构域，并催化从多蛋白中的剩余裂解。释放的NS4A蛋白至少具有两种作用。第一个作用是与NS3蛋白形成稳定的复合物，并辅助NS3/NS4复合物在膜中定位；第二个作用是作为NS3蛋白酶的辅因子。这种膜结合的复合物随后催化多蛋白上剩余位点的切割，从而影响NS4B、NS5A和NS5B的释放。NS3蛋白的C-末端片段也具有核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。蛋白NS4B的功能还不清楚。NS5A是高度磷酸化蛋白，很可能负责各种HCV基因表型干扰素抗性。NS5B是一种参与HCV复制的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。
HCV RNA基因组开放阅读框5’端侧翼是约340个核苷酸的非翻译区(NTR)，它的作用是作为内部核糖体结合位点(IRES)，3’端侧翼是约230个核苷酸的NTR。5’和3’NTR对于RNA基因组复制均非常重要。基因组中甚至存在不均衡的基因组序列变异，5’NTR和部分3’NTR都是最高度保守的部分。
对经过克隆并鉴定的HCV基因组部分和完整序列进行分析，确定预期抗病毒治疗的适宜靶标。下面这4种病毒酶活性提供了可能的靶标：(1)NS2/3蛋白酶；(2)NS3/4A蛋白酶复合物，(3)NS3解旋酶和(4)NS5B RNA-依赖性RNA聚合酶(NS5B RdRp)。另外还将NS5B RNA依赖性RNA聚合酶结晶，以揭示具有所附活性位点的其它核酸聚合酶的结构(Ago等1999；Bressanelli等1999；Lesburg等1999)。
复制所必需的病毒特异性功能是药物开发中最具吸引力的靶。哺乳动物中不存在RNA依赖性RNA聚合酶，以及该酶是病毒复制所必需的事实，暗示HCV NS5B聚合酶是抗HCV疗法的理想靶标。最近还证实：破坏NS5B活性的突变可以消除黑猩猩(chimp)模型中的HCV RNA感染性(Kolykhalov，A.A.等，2000)。病毒RNA复制的起始步骤是NS5B(RdRp)识别RNA模板3’端，它可以直接或者间接在细胞蛋白的帮助下来实现(Lai，1998；Strauss等，1999)。然后，HCV聚合酶继续延伸该模板，形成互补的RNA产物。
许多小组已经描述了HCV NS5B聚合酶的晶体结构(Ago等1999见上；Bressanelli等1999见上；Lesburg等1999见上)。它像一个扁平球，维数约为
多肽链围绕活性位点在分子中心形成空穴，使其外形与其它U形聚合酶有很大不同。由于NS5B被细分为手指(finger)、手掌(palm)和拇指(thumb)域，其中手掌域(第188位至第225位和第287位至第370位残基)是保守的，所以NS5B域的排列与其它聚合酶是相一致的。相比于其它聚合酶，拇指和手指域的广泛接触形成了球形HCV聚合酶。这些接触部分地借助手指延伸到手掌域的环作为媒介。NS5B晶体结构知识在以结构为基础的药物设计中是有用的，事实上，最近已经对NS5B聚合酶/抑制剂复合物的结构进行了报道(Wang等2003；Love等，2003；EP 1 256 628)。已发现，非核苷类似物抑制剂以楔形方式与位于聚合酶拇指域C末端区域附近的疏水结合袋结合。这项研究中，该酶在酶/抑制剂复合物中只能发生微小的构象变化。在NS5B上至少具有两个NTP结合位点，一个在活性位点手掌内，第二个是拇指上的潜在变构位点(O′Farrell等2003；Bressanelli等2002)。
有意思地是，Labonté等2002年报道：NS5B N-末端手指环(finger loop)内的Leu30突变会影响NS5B聚合酶活性，据推测是Leu30突变体结构的局部改变导致该活性降低。但是，作者并未对结合袋的存在发表任何看法，该结合袋在其自然状态下被手指环掩盖，由于Leu30残基突变或取代使该结合袋暴露。发现这种奇特的结合袋是本发明的一个主题。
因此，深入认识酶结构对HCV复制的重要性，尤其是NS5B聚合酶，能促进开发有效治疗HCV感染的方法。深入认识酶结构，特别是当它与特异性抑制剂复合时的结构，将会产生一种鉴定该酶中结合位点的方法，并获得酶/抑制剂复合物以及该酶中敏感残基的构象，这些知识对药物设计和优化方法来讲都是至关重要的。
发明概述
已经发现，HCV聚合酶，当与某些抑制剂复合时，会采用取代手指环区而暴露结合袋的构象，其中所述手指环区由氨基酸残基18至35定义，结合袋通常由氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义。这与现有技术发现的NS5B晶体结构相反，现有技术认为在自然状态下，由氨基酸残基18至35定义的手指环会遮盖此结合袋。这种新的“暴露型”结合袋为寻找能结合HCV NS5B，并调节或优选抑制HCV NS5B聚合酶活性的其它化学实体定义了一种新的靶标。
因此，在一个方面，本发明提供了一种分离和纯化的多肽，它包含由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义的，或者由其功能等同类似物定义的HCV NS5B抑制剂结合袋，其中所述结合袋由于由至少氨基酸残基18至35定义的手指环被取代而暴被露出来，并且该所述结合袋保持其天然功能构型。
在本发明的第二个方面，提供了一种分离和纯化的HCV NS5B多肽类似物，它包含由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义的，或者由其功能等同类似物定义的HCV NS5B结合袋，其中所述结合袋保持其天然功能构型，并且所述结合袋是可暴露的。
在进一步的方面，提供了一种分离和纯化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义的，或者由其功能等同类似物定义的HCV NS5B结合袋组成，其中所述结合袋保持其天然功能构型。
在另一方面，提供了一种HCV NS5B多肽变体，其在由HCV NS5B的氨基酸残基18至35定义的手指环内包含至少一个氨基酸突变，其中所述突变引起所述手指环发生取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义的，或者由其功能等同类似物定义的结合袋暴露，其中所述结合袋保持其天然功能构型。
本发明的另一个方面提供了一种HCV NS5B多肽，或其功能等同类似物，其特征是取代了氨基酸残基18至35。
本发明的另一个方面提供了一种HCV NS5B多肽，或其功能等同类似物，其中删除了至少氨基酸残基18至35。
在发明的另一个方面，提供了HCV NS5B晶体结构，包含由天然HCVNS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的结构坐标(structural coordinate)定义的，或由其功能等同类似物的结构坐标定义的结合袋，其中取代了由至少氨基酸18至35的结构坐标定义的天然手指环链，使所述结合袋暴露。
在本发明的另一个方面，提供了一种复合物，包含如上定义的HCVNS5B多肽、多肽变体或多肽类似物以及一种化合物，其中该化合物与NS5B多肽、多肽变体或多肽类似物内的结合袋结合，所述结合袋由天然HCVNS5B的氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义，或由其功能等同类似物定义。
在本发明的进一方面，提供了一种制备结晶的HCV NS5B复合物的方法，所述复合物包含如上定义的NS5B多肽、多肽变体或多肽类似物和与所述多肽、多肽变体或多肽类似物结合的化合物，其中所述化合物与由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义的，或由其功能等同类似物定义的NS5B结合袋结合。该方法包含下述步骤：
a)在结晶缓冲液中保温纯化的HCV NS5B多肽，获得结晶的NS5B多肽；
b)将所述化合物溶解；和
c)在浸泡缓冲液中，将结晶的NS5B多肽与溶解的化合物一起浸泡适当的浸泡时间，获得HCV NS5B复合物。
在制备如上定义的结晶HCV NS5B复合物的可选方法中，是将化合物加到含有结晶的HCV NS5B的结晶缓冲液中。
在制备如上定义的结晶HCV NS5B复合物的另一个可选方法中，包含下述步骤：
a)将纯化的HCV NS5B与溶解的化合物混合，形成NS5B复合物；
b)在结晶缓冲液中让复合物结晶。
在本发明的另一方面，提供了复合物的X-射线晶体结构坐标，所述复合物包含如上定义的HCV NS5B多肽、多肽变体或多肽类似物和化合物，其中所述化合物与NS5B多肽、多肽变体或多肽类似物内的结合袋结合，所述结合袋由天然HCV NS5B的氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义，或由其功能等同类似物定义。
在本发明的另一方面，提供了计算机可读性存储介质，在该介质上存储有复合物的晶体结构模型，所述复合物包含如上定义的HCV NS5B多肽、多肽变体或多肽类似物和化合物，其中所述化合物与由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的结构坐标定义的，或由其功能等同类似物的结构坐标定义的结合袋结合。
在本发明的进一方面，提供了一种鉴定结合HCV NS5B的化合物的方法，包括下述步骤：
a)将三维分子模型算法应用于由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的结构坐标定义的，或由其功能等同类似物的结构坐标定义的HCV NS5B结合袋的结构坐标，确定HCV NS5B结合袋的空间坐标；和
b)在HCV NS5B结合袋空间坐标的背景下对存储的化合物的空间坐标进行电子筛选，测定该化合物是否结合在HCV NS5B结合袋内。
在本发明的另一方面，提供了一种鉴定潜在HCV抑制剂的虚拟筛选方法，包括下述步骤：
a)构建HCV NS5B结合袋的计算机模型，其中所述HCV NS5B结合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的结构坐标定义，或由其功能等同类似物的结构坐标定义；
b)利用计算机工具，在待评化合物和NS5B结合袋的计算机模型之间进行吻合度(fitting)程序操作，从而提供结合袋中化合物的能量最小化构型；和
c)对该吻合度操作的结果进行评价，量化化合物和结合袋间的结合，其中与结合袋结合并获得低能量、稳定复合物的化合物就是潜在的NS5B抑制剂。
还在本发明的另一方面，提供了一种筛选候选HCV NS5B抑制剂化合物的方法，包括下述步骤：
a)在适宜结合的条件下，保温如上定义的HCV NS5B多肽、多肽变体或多肽类似物和候选抑制剂化合物；和
b)测定候选抑制剂化合物是否与多肽结合，其中与多肽结合的化合物是潜在的HCV NS5B抑制剂。
在发明的另一方面，提供了一种设计能结合如上定义的NS5B多肽、多肽变体或多肽类似物的化合物的方法，包括下述步骤：评估互补性，即化合物和NS5B多肽中结合袋间的“吻合度”，其中所述结合袋由天然HCVNS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义，或由其功能等同类似物定义。
在发明的另一方面，提供了一种产生抑制HCV NS5B的RNA复制活性的药物的方法，包括鉴定或设计与NS5B结合袋吻合的化合物，所述NS5B结合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义，或由其功能等同类似物定义，其中由于取代了由至少氨基酸残基18至35定义的手指环链而使所述结合袋暴露。
下面，将会参考所附图片对本发明的方面和实施例进行更详细的描述，其中：
附图说明
图1A描述没有化合物时的NS5B apo酶结构；
图1B描述与NS5B结合的化合物A，其中取代了氨基酸18至35，因此该结构中看不到它们；
图1C描述结合到代表本发明结合袋的溶剂可及表面内的化合物A；
图2描述结合到代表本发明结合袋的溶剂可及表面内的化合物B；
图3描述结合到代表本发明结合袋的溶剂可及表面内的化合物C的NMR衍生的结合构象对接模型(docked model)；
图4显示与化合物A复合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子结构坐标；
图5显示与化合物B复合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子结构坐标
图6显示与化合物C复合的SEQ ID No.1的HCV NS5B的原子结构坐标
发明详述
定义
除非另外定义，本文所用的科学和技术术语以及名称具有与本发明所属领域普通技术人员常规理解相同的意思。通常，细胞培养、感染步骤、分子生物学方法等都是本领域技术人员所熟知的。这些常规技术可参阅参考手册，如Sambrook等(1989)和Ausubel等(1994)。
术语“HCV NS5B”指参与HCV复制的丙型肝炎病毒(HCV)RNA-依赖性RNA聚合酶(RdRp)。如本领域技术人员所知，术语HCV包含含有许多不同菌株、分离体和亚型的病毒家族。另外，虽然此家族各成员的NS5B聚合酶功能等同且结构高度同源，它们在氨基酸序列上还是会有些区别。HCVNS5B聚合酶(来自HCV 1b基因型的NS5B)的氨基酸序列示于SEQ ID No.1中。其它分离的HCV NS5B聚合酶序列可获自现有的公共序列数据库。
本文所用术语“结合袋”指分子或分子复合物的区域，由于其构型所致，其有利于与相同分子或分子复合物实体或部分，或者不同分子、分子复合物、化学化合物或其它化合物实体或部分结合；或者被相同分子或分子复合物实体或部分，或者不同分子、分子复合物、化学化合物或其它化合物实体或部分占据。根据本发明，本文所定义的NS5B结合袋会由于取代了残基18至35的手指环域而暴露出来，从而使能影响NS5B活性，如抑制NS5B活性的化合物结合NS5B结合袋。通常，结合袋或其至少一部分包含一空穴，此空穴是可与相同或不同分子实体相互作用的部位。本领域技术人员可以理解，结合袋内的空穴特性会由于分子和分子的不同而有不同。
用于本发明多肽的术语“分离和纯化的”是指基本与其它成分分离的多肽。
用于本发明结合袋的氨基酸序列的术语“天然HCV NS5B”是指给定HCV NS5B中的结合袋的天然氨基酸序列。
用于本发明结合袋的术语“天然功能构型”是指氨基酸天然重排，包括空间重排，形成可与某些化合物/实体结合或被某些化合物/实体占据的结合袋。
本文所用术语“复合物”是指两个或多个实体相混合，至少其中一个实体是蛋白或酶。具体地，本发明复合物是NS5B蛋白和另一化合物形成的复合物，其中NS5B蛋白包括可含氨基酸取代、截断或插入的NS5B蛋白类似物。化合物或化学实体与蛋白混合或“复合”是指化合物或化学实体和蛋白结合(association/binding)的特性。复合物组分间的结合是各组分之间的接近状态，这种结合可以是天然非共价键的，其中该接近能量上受氢键或范德华力或静电相互作用支持，或者可以是共价键结合。
用于分子化合物的术语“类似物”表示自天然或自然氨基酸序列修饰过的氨基酸序列，并且该氨基酸序列保持着天然或自然氨基酸序列的生物活性(功能或结构的生物活性)。这种类似物可以获自相同或不同种类，并且可以是天然类似物，或者是合成制备的。所述类似物包括取代、删除或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，只要其保持了蛋白的生物活性。术语“保守性类似物”表示含有保持生物活性的氨基酸修饰的类似物。含氨基酸取代的类似物包括具有强或弱相似性的取代(参见，如Dayhoff，M.O.，(1978)，蛋白序列和结构图谱，5，suppl.3，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)，根据下述“氨基酸相似性表”所定义：
| 氨基酸 | 强 | 弱 |
| A | G，S | C，T，V |
| C | A，S | |
| D | E | G，H，K，N，Q，R，S |
| E | D | H，K，N，Q，R，S |
| F | W，Y | H，I，L，M |
| G | A | D，N，S |
| H | Y | D，E，F，K，N，Q，R |
| I | L，M，V | F |
| K | R | D，E，H，N，Q，S，T |
| L | I，M，V | F |
| M | I，L，V | F |
| N | Q | D，E，G，H，K，R，S，T |
| P | S，T | |
| Q | N | D，E，H，K，R，S |
| R | K | D，E，H，N，Q |
| S | A，T | C，D，E，G，K，N，P，Q |
| T | S | A，K，N，P，V |
| V | I，L，M | A，T |
| W | F，Y | |
| Y | F，H，W |
用于本发明结合袋多肽的术语“功能等同类似物”是指取代、删除或插入了一个或多个氨基酸的结合袋。取代可以是根据如上所述进行的，例如用合适的保守性氨基酸或保守性合成氨基酸类似物来进行取代。本质上，术语“类似物”与前述定义相一致。短语“功能等同”说明类似物保持着天然分子的生物活性。
用于氨基酸或氨基酸残基的术语“侧链”意思是α-氨基酸的α碳原子上所附的基团。例如，例如，R-基侧链对于甘氨酸是氢，对于丙氨酸是甲基，对于缬氨酸是异丙基。关于α-氨基酸的特定的R-基团或侧链参考A.L.Lehninger’s text on Biochemistry(参见第四章)。
术语“截短”是指任何弄短或缩短的分子片段，且其为了本发明的目的保持其生物活性。截短可以指缩短天然蛋白分子或其类似物。
术语“均方根差(root mean square deviateon)”或“rms偏差”或“rmsd”是指平均值方差的算术平均值的平方根。在原子目标的上下文中，数字单位为埃
它表示与趋势(trend)或目标(object)的差异。
本文使用下述缩写：
DLB：差示谱线增宽(differential line broadening)；
DMSO：二甲亚砜；
DTT：二硫苏糖醇；
EDTA：乙二胺四乙酸；
FID：自由感应衰变(free induction decay)；
IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；
HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；
MES：2-(N-吗啉)乙磺酸；
MPD：2-甲基-2，4戊二醇)；
NMR：核磁共振；
NOESY：核Overhauser效应谱；
PEG：聚乙二醇；
PEG5k mme单甲醚聚乙二醇5000；
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷；
TSP：3-三甲代甲硅烷基四氘丙酸钠。
优选实施方式
HCV NS5B聚合酶
第一方面，本发明提供了包括功能HCV NS5B结合袋的分离和纯化的多肽，所述结合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个或多个)定义，其中由于取代了由至少氨基酸残基18至35定义的手指环链，而使所述结合袋暴露，并且所述结合袋保持其天然功能构型。
在本发明的此方面，还提供了由暴露的HCV NS5B结合袋组成的分离和纯化的HCV NS5B多肽，所述结合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个或多个)定义，并且所述结合袋保持其天然功能构型。
在本发明的此方面，对本发明的多肽来说，引入呈现其天然构型(即在天然HCV NS5B聚合酶中所呈现的天然构型)的结合袋是很重要的，从而可以正确地模拟结合袋，成为有用的HCV NS5B抑制剂筛选工具。
另外，为了使多肽能有效地起到HCV NS5B抑制剂筛选工具的作用，使抑制剂结合袋暴露或者抑制剂结合袋至少是可暴露的也是很重要的，这样才能让抑制剂接近结合袋。在HCV NS5B中，发明人确定：当NS5B手指环链的至少氨基酸残基18至35被取代时，本文所定义的结合袋就会暴露。因此，在此方面，提供了包含有暴露构型的结合袋的多肽。
在本文中，由于一种HCV基因型或菌株与另一种HCV基因型或菌株的预期序列相似性，本发明的结合袋参考HCV NS5B蛋白中的氨基酸位置进行定义。取代的或可取代的手指环区也参考氨基酸位置进行定义，即氨基酸18至35。本领域技术人员很容易理解：因为氨基酸插入或删除，所有HCV NS5B中的氨基酸编号可能会与本文所示的HCV NS5B氨基酸编号略有不同。本文所示的氨基酸编号是以示于SEQ ID NO：1的天然HCV 1bNS5B聚合酶序列为基础的。而且，其它HCV NS5B中的相应氨基酸可以通过目测氨基酸序列或利用可商购的同源性软件程序如Vector NTI来进行鉴定(由InfoMax Inc.提供)。从这方面来讲，为了鉴定NS5B蛋白，应注意HCVNS5B序列的前4个氨基酸通常是-SMSY-(SEQ ID NO：2)，这4个氨基酸在各变体之间是保守的。
在本发明的一个实施方式中，将结合袋定义为下述氨基酸序列：
(37)*392-393 395-396 399 424-425 428-429 492-495(496)*500 503
(SEQ ID NO：3)
*(括号表示任意的氨基酸残基)
或，可选地
(V37)，L392，A393，A395，A396，T399，I424，L425，H428，F429，L492，G493，V494，P495，(P496)，W500和R503。
本领域技术人员可以理解，多肽的功能等同类似物也包括在本发明的范围之内。本发明多肽的一个或多个氨基酸残基，不管它在结合袋内还是在结合袋域外，都可以用功能等同的氨基酸，通常是上述“氨基酸相似性表”中所列的保守性氨基酸替代，其合成氨基酸类似物或其它HCV基因型中发现的天然存在的氨基酸取代，并且它们仍然保持结合袋的功能形态或构型。也可以对多肽进行氨基酸删除和/或插入。所述氨基酸取代、插入或删除可以使多肽更利于在筛选试验中使用，或使多肽更容易制备。不同HCV基因型中的结合袋内天然存在的氨基酸取代的粗略例子包括但不限于：含有T499V取代的HCV基因型1b NS5B；含有M36L，I424V和T499A取代的HCV基因型1a NS5B；含有M36L，I424V，L425M和V494C取代的HCV基因型3a NS5B；含有M36K，L392I，A393S，I424V，L425I和V494A取代的HCV基因型2b NS5B；含有V494A取代的HCV基因型2a，2k，6b；含有V494I取代的HCV基因型3b；含有P495L取代的HCV基因型6a；和含有A396V取代的HCV基因型4a。
应该知道：结合袋通常是由多肽的所有氨基酸原子来定义的，例如：当抑制剂与多肽复合时，NS5B就在抑制剂所有原子内。可利用各种计算机分析来测定含有本文所定义结合袋的多肽是否与上述HCV NS5B结合袋充分相似，甚至于功能。可以在熟知的应用软件中进行分析，如MolecularSimilarity applications of QUANTA[Molecular Simulations Inc，San Diego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]和MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]。
从本发明的这个方面衍生出了许多实施方式。例如，除了用上述氨基酸定义本发明的结合袋之外，结合袋可以额外包括一个或多个HCV NS5B的氨基酸残基36，426，498或499。优选这些位置分别被M36，M426，R498和T/V499占据。
在此方面的另一个实施方式中，多肽可以包括以天然构型存在的HCVNS5B的氨基酸残基决定簇36和37。优选位置36和37被下述氨基酸占据：M36和V37，或者具有氨基酸序列M-V。
在另一个实施方式中，多肽可以包括以天然构型存在的HCV NS5B的氨基酸残基决定簇392-399。优选位置392-399被下述氨基酸占据：L392，A393，R394，A395，A396，W397，E398和T399，或者具有氨基酸序列L-A-R-A-A-W-E-T(SEQ ID NO：4)。
在另一个实施方式中，多肽可以包括以天然构型存在的HCV NS5B的氨基酸残基决定簇424-429。优选位置424-429被下述氨基酸占据：I424，L425，M426，T427，H428和F429，或者具有氨基酸序列I-L-M-T-H-F(SEQID NO：5)。
在另一个实施方式中，多肽可以包括以天然NS5B构型存在的HCVNS5B的氨基酸残基决定簇492-503。在此，优选位置492-503被下述氨基酸占据：L492，G493，V494，P495，P496，L497，R498，T499，W500，R501，H502和R503，或者具有氨基酸序列L-G-V-P-P-L-R-T-W-R-H-R(SEQID NO：6)。
HCV NS5B多肽类似物
第二方面，本发明提供了分离和纯化的HCV NS5B多肽类似物，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的HCV NS5B结合袋，其中所述结合袋保持其天然功能构型，且所述结合袋是可暴露的。
保持本文所公开的天然结合袋功能构型的上述NS5B多肽类似物，极方便地提供了天然NS5B多肽的模拟物，可将它设计成在抑制剂筛选试验中使用时胜过天然NS5B多肽。例如，可将多肽类似物设计成更易制备和使用的，或者更加稳定的。还可以对它进行设计，从而能提供更易获得的结合袋。
通过上面更详细描述的定义中的，尤其是术语“类似物”定义中的氨基酸取代、删除或插入来改变NS5B多肽，获得NS5B多肽类似物。在此，优选对由氨基酸残基18至35定义的手指环链进行修饰，提供更易被取代而使本发明结合袋暴露的手指环链，或者提供取代或删除的手指环链而暴露结合袋。
如上所述，取代NS5B手指环链的至少氨基酸残基18至35时，就会使本发明的HCV NS5B结合袋暴露。现在已经确定某些化合物能够取代手指环，而接近结合袋。因此，提供的多肽类似物中的结合袋是可暴露的，即天然NS5B构型被部分NS5B蛋白，如由氨基酸18至35定义的手指环掩盖，通过用有结合袋倾向的化合物取代而使结合袋暴露。
从本发明的这个方面衍生出了许多实施方式。例如，除了用上述氨基酸定义本发明的结合袋之外，结合袋可以额外包括HCV NS5B的氨基酸残基36，426或498或499中的一个或多个。优选，结合袋包括所有这些氨基酸残基。同时，优选这些位置各自被M36，M426，R498和T/V499占据。
在此方面的另一个实施方式中，多肽的结合袋可以包括以天然构型存在的HCV NS5B的氨基酸残基36和37。优选位置36和37被下述氨基酸占据：M36和V37，或者具有氨基酸序列M-V。
在此方面的另一个实施方式中，多肽的结合袋可以包括以天然构型存在的HCV NS5B的氨基酸残基392至399。优选位置392至399被下述氨基酸占据：L392，A393，R394，A395，A396，W397，E398和T399，或者具有氨基酸序列L-A-R-A-A-W-E-T(SEQ ID NO：4)。
在另一个实施方式中，多肽的结合袋可以包括以天然构型存在的HCVNS5B的氨基酸残基424至429。优选位置424至429被下述氨基酸占据：I424，L425，M426，T427，H428和F429，或者具有氨基酸序列I-L-M-T-H-F(SEQ ID NO：5)。
在另一个实施方式中，多肽的结合袋可以包括以天然NS5B构型存在的HCV NS5B的氨基酸残基492至503。在此，优选位置492至503被下述氨基酸占据：L492，G493，V494，P495，P496，L497，R498，T499，W500，R501，H502和R503，或者具有氨基酸序列L-G-V-P-P-L-R-T-W-R-H-R(SEQID NO：6)。
在进一步的实施方式中，结合袋残基的优选序列是与SEQ ID NO：1所列序列一致的序列。
如上所述，由于HCV基因型之间存在高水平的序列同源性，在本文中，结合袋和可取代的/取代的手指环区是参考以SEQ ID NO：1所列的HCV 1b基因型NS5B序列为基础的氨基酸位置来进行定义的。但是，本领域的技术人员应该理解，结合袋或手指环的一个或多个氨基酸残基位置上的微小变化，例如结合袋中一个氨基酸位置由1变为2(其可能由于插入或删除一个或多个N-末端氨基酸而自然发生)，或者将单个氨基酸转移到NS5B蛋白其它位置(如，不影响结合袋构型的区域)，仍然可以获得与本发明相一致的结合袋和具有暴露结合袋功能的手指环。因此，这种位置差异在本发明的保护范围之内。
HCV NS5B多肽变体
在另一方面，本发明提供了HCV NS5B多肽变体，其在由氨基酸残基18至35定义的手指环内包括至少一个氨基酸突变，其中所述突变能导致该手指环被取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的结合袋暴露，其中所述结合袋保持其天然功能构型。
本发明此方面所述的NS5B变体可以包括任何能引起由氨基酸18至35定义的手指环发生取代的突变。例如，对与本文所述结合袋内的一个或多个残基形成结合的氨基酸进行突变，可以阻止这种结合，从而引发取代或“打开”手指环而暴露结合袋。
在本发明的一个实施方式中，对HCV NS5B第30和31位氨基酸残基中的至少一个进行突变，会使手指环发生取代。在优选的实施方式中，将氨基酸残基30突变为除亮氨酸之外的氨基酸残基。更优选，氨基酸残基30选自：P，F，W，M，G，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R和H。
如上所述的关于结合袋、包含结合袋的附加氨基酸残基，以及结合袋残基具体序列的实施方式是关于NS5B多肽和类似物的。
本发明的另一个方面提供了HCV NS5B多肽，或其功能等同类似物，其特征是取代了氨基酸残基18至35。
本发明的另一个方面提供了HCV NS5B多肽，或其功能等同类似物，其中删除了至少氨基酸残基18至35。
如前所述，取代或删除氨基酸残基18至35会暴露本文所定义的新型结合袋，该结合袋在开发HCV治疗剂中具有重要作用。
HCV NS5B晶体结构
在发明的进一方面中，提供了HCV NS5B晶体结构，包括由天然HCVNS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)的结构坐标定义的，或由其功能等同类似物的结构坐标定义的结合袋，其中取代了由至少氨基酸18至35的结构坐标定义的天然手指环链而使所述结合袋暴露。优选地，结构坐标如图4，5或6中任一所示。
暴露抑制剂结合袋的结构对于设计和开发候选NS5B抑制剂是很有价值的工具，因为该结构提供了更清楚理解结合袋构型和总体性质的手段和指导开发治疗性NS5B抑制剂的重要知识。
在优选的实施方式中，提供的HCV NS5B晶体结构中的结合袋还额外由氨基酸残基36，426，498和499来定义。在另一优选的实施方式中，提供的HCV NS5B晶体结构中的结合袋由氨基酸残基36-37，392-399，424-429和492-503决定簇定义。
HCV NS5B复合物
在本发明的另一个实施方式中，提供了包括HCV NS5B多肽和化合物的复合物，其中所述化合物与NS5B多肽内的结合袋结合，所述结合袋由天然HCV NS5B的氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)来定义，或由其功能等同类似物来定义。
本发明的NS5B抑制剂-结合袋在由氨基酸残基18至35定义的手指环区发生取代时而暴露。结合袋本身由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义。而且，它还可以进一步由附加的氨基酸残基36，426，498和499中的一个或多个来定义，或甚至另外由下述氨基酸残基决定簇：36-37，392-399，424-429和492-503定义。
根据本发明的此方面，HCV NS5B多肽可以是天然NS5B多肽，或者是选自下组的HCV NS5B多肽、变体或类似物：
i)分离和纯化的多肽，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的功能HCV NS5B结合袋，其中所述结合袋由于取代了由至少氨基酸残基18至35定义的手指环链而暴露出来，其中所述结合袋保持其天然功能构型；
ii)分离和纯化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的HCV NS5B结合袋组成，其中所述结合袋保持其天然功能构型；
iii)分离和纯化的HCV NS5B多肽类似物，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的HCV NS5B结合袋，其中所述结合袋保持其天然功能构型且所述结合袋是可暴露的；
iv)HCV NS5B多肽变体，其在由氨基酸残基18至35定义的手指环内包括至少一个氨基酸突变，其中所述突变能导致该手指环被取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的结合袋暴露，其中所述结合袋保持其天然功能构型；
v)HCV NS5B多肽或其功能等同类似物，其特征是取代了氨基酸18至35；和
vi)HCV NS5B多肽或其功能等同类似物，其中删除了至少氨基酸残基18至35。
在此方面的优选实施方式中，复合物包含与选自下述专利文献：WO01/047883，WO 02/004425，WO 03/000254，WO 03/007945，WO 03/010140，WO 03/010141和WO 03/026587中的化合物家族的化合物结合的如上定义的HCV NS5B，类似物或变体。在此方面可选的优选实施方式中，复合物包含与选自描述于美国共同未决申请：10/755,256，10/755,544和60/546,213(在此引入以供参考)中的化合物家族的化合物结合的上述HCVNS5B多肽、类似物或变体。以前，未显示这些化合物会与本申请所要求保护的NS5B结合袋结合，形成本发明所述NS5B复合物。
在更优选的实施方式中，HCV NS5B复合物包含与下述化合物A，B或C中之一种化合物结合的NS5B多肽、类似物和变体：
化合物A
化合物B
化合物C
图4，5和6显示分别与化合物A，B和C结合的SEQ ID No：1 HCV NS5B的结构坐标。获得这些结构坐标的方法，对坐标进行解释，并解释该坐标在理解蛋白结构，尤其是本文所述结合袋的效用都是本领域技术人员可以理解的。也可以参考常规教科书，如《晶体结构分析》(Crystal StructureAnalysis)，Jenny Pickworth Glusker和Kenneth N.Trueblood，第二版，OxfordUniversity Press，1985，New York；和《蛋白结构原理》(Principles of ProteinStructure)，G.E.Schulz和R.H.Schirmer，Springer-Verlag，1985，New York，书中进行了深入的指导。
另外，本领域技术人员应懂得酶复合物的一组结构坐标，如图4，5和6所示，是三维空间上确定形状的相对的一组点。因此，很有可能完全不同的一组坐标可以定义出相似或相同的形状，即天然NS5B结合袋的功能等同类似物，从而落在本发明的范围之内。另外，各个坐标中的微小差别对整体形状没什么影响。对结合袋来说，期望这些变化不会明显改变可与这些结合袋结合的化合物的性质。
还应引起注意的是：由于突变、添加、取代和/或删除氨基酸而对晶体结构进行修饰，或者构成晶体的任何组分的其它改变都会引起结构坐标改变。如果这种改变在误差可接受标准内，如与原始坐标相比，对于包含结合袋的α-碳来说
那么就认为所得三维形状相同。因此，例如，与本文所述NS5B结合袋活性位点结合的化合物也可以与其限定形状的结构坐标在可接受的误差范围内的其它结合袋结合。
结晶方法
在本发明的另一个方面，提供了制备包括HCV NS5B多肽和化合物的结晶的HCV NS5B复合物的方法，其中所述化合物结合到NS5B结合袋内，所述结合袋是由HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)的结构坐标定义，或由其功能等同类似物定义。
优选的结晶方法包括下述步骤：
a)在结晶缓冲液中保温纯化的HCV NS5B多肽，获得结晶的NS5B多肽；
b)将化合物溶解；和
c)将晶体多肽与溶解的化合物一起在浸泡缓冲液(soaking buffer)中浸泡合适的时间，获得结晶的Ns5B复合物。
在制备上述结晶的HCV NS5B复合物的可选方法中，直接将化合物加到含结晶的HCV NS5B的结晶缓冲液中。
在另一个可选方法中，通过使NS5B蛋白与化合物一起共结晶来制备上述的结晶的HCV NS5B复合物。该方法包括下述步骤：
a)将纯化的HCV NS5B多肽与溶解的化合物混合，形成NS5B复合物；和
b)复合物在结晶缓冲液中结晶。
在此方面的优选实施方式中，将NS5B与选自上述化合物家族的化合物复合。更优选，化合物是选自上述化合物A、B或C中的一个，或其相关化合物。如上所述，结晶方法可以包括直接将化合物加到含有结晶的HCVNS5B的结晶缓冲液中，或者以溶解形式将纯化的HCV NS5B多肽与化合物混合。当使用溶解形式的化合物时，优选将化合物溶解在浓度约25mM的100％DMSO中。
将浓度约5mg/mL-约15mg/mL的NS5B与纯化缓冲液混合。优选，纯化缓冲液中所用的NS5B浓度是约7-10mg/mL。纯化缓冲液的性质通常在本领域中是已知的，其包括用于稳定HCV NS5B的盐和/或甘油，使用的纯化缓冲液pH在约6和约9之间。纯化缓冲液的优选pH是约7.5。缓冲液如但不限制到：Tris-HCl，HEPES或bis-Tris，使用的浓度是约0mM-约50mM。优选缓冲液是浓度约20mM的Tris-HCl。
为了稳定HCV NS5B，可将浓度约200mM-约800mM的盐如NaCl，(NH4)2SO4或KCl加到缓冲液中。优选盐是浓度约300mM的NaCl。
为了进一步稳定HCV NS5B，可加入浓度约0％-约30％的甘油。优选甘油浓度是约10％。
更优选，纯化缓冲液约pH 7.5，包括浓度约20mM的Tris-HCl，浓度约10％的甘油，浓度约5mM的DTT，和浓度约300mM的NaCl。
可利用本领域已知的任何一种技术来让NS5B多肽结晶，包括如油下分批结晶(batch crystallization under oil)、悬滴式蒸汽扩散(hanging drop vapordiffusion)和直滴式蒸汽扩散(sitting drop vapor diffusion)技术。实现本发明目的的优选结晶方法是如McPherson等(Preparation and Analysis of ProteinCrystals，Krieger Pub.1989)中所述的悬滴式蒸汽扩散技术。简单的讲，该结晶方法包括将含纯化的NS5B的液滴置在储存溶液(reserveoir solution)上方的结晶缓冲液中。液滴的蒸汽扩散使蛋白浓度增加，从而促进结晶。
使用的结晶缓冲液选自本领域技术人员已知的任一种适合本目的的缓冲液，包括但不限于：浓度约50mM-约0.2M的MES，磷酸钠，磷酸钾，乙酸钠或琥珀酸钠。优选结晶缓冲液是浓度约0.1M的MES。
结晶缓冲液的pH通常在约4.5-约6.5之间，优选使用的结晶缓冲液pH是约5.4。
结晶缓冲液可以额外包括至少一种促NS5B结晶的沉淀剂。合适的沉淀剂的例子包括但不限于：PEG，PEG5K mme(单甲醚聚乙二醇5000)，硫酸铵，MPD，异丙醇，乙醇或叔丁醇。使用的沉淀剂浓度通常为约30％-约40％。在优选的实施方式中，沉淀剂是浓度约21％的PEG5K mme和浓度约0.4mM的硫酸铵。
在常规的结晶条件下诱导NS5B结晶。例如，在约0℃-约22℃的温度下进行结晶。诱导结晶的优选温度在约4℃-约11℃之间。
在优选的结晶方法中，在存在浸泡缓冲液的条件下，将溶剂的化合物浸入结晶的NS5B多肽中。浸泡缓冲液可包含任意一种常规缓冲液，包括但不限于：浓度约50mM到约0.2M的MES，Tris，磷酸钠，乙酸钠和琥珀酸钠。优选使用的浸泡缓冲液浓度是约0.1M。浸泡缓冲液的pH通常是约5-约8，优选使用的浸泡缓冲液pH是约7.0。
通过添加任何合适的蛋白，包括但不限于：溶菌酶，BSA或甚至额外的NS5B，可将浸泡缓冲液的蛋白含量补充到浓度高至约10mg/mL。
浸泡缓冲液可以包括起NS5B稳定剂作用的补充剂。可将一种或多种浓度约100mM-约500mM的盐，如NaCl，(NH4)2SO4或KCl加到缓冲液中去。优选加入的盐浓度在约150mM到约300nM之间。更优选，加入浓度分别约210mM和约280mM的NaCl和(NH4)2SO4。
为了进一步稳定HCV NS5B，可将浓度约10-20％的甘油加到浸泡缓冲液中去。优选加入的甘油浓度是约14％。
结晶缓冲液可以额外包括至少一种促结晶的沉淀剂。合适的沉淀剂的例子包括但不限于：PEG，PEG5K mme(单甲醚聚乙二醇5000)，硫酸铵，MPD，异丙醇，乙醇或叔丁醇。使用的沉淀剂浓度通常为约10％-约18％。在优选的实施方式中，沉淀剂是浓度约14％的PEG5K mme和浓度约0.4mM的硫酸铵。
将结晶的NS5B和溶解的化合物浸泡在浸泡缓冲液中约1到约12小时，优选约3到约8小时，更优选约5到约6小时的适宜浸泡时间。浸泡时的温度是约5-约15℃，优选温度是约11℃。
在可选的结晶方法中，将化合物加到含结晶的NS5B的结晶缓冲液中。在该方法中，将化合物简单地喷洒到缓冲液上，随后保温合适的时间让其溶解和结晶。
在另一个可选的结晶方法中，让NS5B和化合物在如上所述仅用于NS5B的结晶缓冲液中共结晶。在该方法中，将NS5B和溶解的化合物在结晶缓冲液中混和，在如上所述的结晶条件下结晶。
按照本发明，结晶的NS5B复合物能按照X-射线晶体学进行处理是很重要的。利用X-射线晶体学分析，获得的NS5B复合物晶体空间群(spacegroup)属P2(1)2(1)2(1)，单位晶胞大小为a＝105.1，b＝106.6，c＝133.5，每个不对称单位有两个分子。利用配有R-axis IV++影像平板监视器(image platearea detector)的MicroMax007 home source X射线发生器(Rigaku，Japan)收集衍射数据。优选，对单个复合物晶体收集分辨率为
的数据。
X-射线坐标
另一个方面，提供了上述NS5B复合物的X-射线晶体结构坐标。甚至更优选，NS5B复合物的结构坐标由图4，图5和图6中之一来限定。
本发明的NS5B复合物的三维结构由图4，图5和图6中任一所示的一组结构坐标来限定。术语“结构坐标(structure coordinate)”是由数学操作获得的Cartesian坐标，所述操作与对晶体复合物的原子(散射中心)进行X-射线单色光束衍射所获得的图形相关。用衍射数据计算晶体重复单元的电子密度图。然后用电子密度图确定已知结构坐标的结合袋的各个原子的位置。
本领域技术人员应懂得一组蛋白或蛋白抑制剂复合物或其部分的结构坐标是在三维空间上确定形状的的相对的一组点。因此，很有可能完全不同的一组坐标能定义出相似或相同的形状。
通过对结构坐标进行数学操作可以使坐标改变。例如，通过对图4，5或6所示的结构坐标进行结构坐标晶体学排列、分级或对所述多组结构坐标或其组合进行矩阵操作，即可对结构坐标进行操作。
必需测定分子或分子复合物或其部分是否与本文所述的全部或部分HCV NS5B蛋白或NS5B复合物足够类似以致于可以认为两者是等效的。利用目前所用的应用软件，如QUANTA的分子相似性应用软件[MolecularSimulations Inc，San Diego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]和MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]即可进行这种分析。
分子相似性应用能比较不同的结构，相同结构的不同构象以及相同结构的不同部分。在比较结构的分子相似性中使用的方法分为下述四步：1)输入待比较的结构；2)限定这些结构中的等效原子，3)进行吻合度(重叠)操作；和4)分析结果。
计算机-可读性存储介质
另外，在本发明的另一方面，提供了一种计算机可读性存储介质，其上存储有HCV NS5B复合物的晶体结构模型，所述HCV NS5B复合物包括HCV NS5B多肽和化合物，其中所述化合物与由图4、5和6所示的天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)的结构坐标定义的，或由其功能等同类似物的结构坐标定义的NS5B结合袋结合。
计算机可读性数据存储介质是本领域技术人员所熟知的，包括如硬盘、CD-ROM、磁盘(软盘)和DVD。
根据本发明的此方面，可将NS5B复合物和其部分的结构坐标存储在机器可读性存储介质中。该数据可用于各种目的，如药物开发和蛋白晶体的X-衍射晶体学分析。
在此方面的优选实施方式中，HCV NS5B复合物包括与上述确定的化合物家族中的化合物复合的NS5B。更优选，NS5B复合物包括与化合物A、B或C中的一种化合物结合的NS5B。
如前所述，结合袋可以额外由选自氨基酸残基36，426，498和499中的一个或多个附加氨基酸残基来定义，或甚至另外由氨基酸簇36-37，392-399，424-429和492-503定义。
NS5B复合物的坐标数据，如图4、5和6所示，当与计算机联合使用时，其中所述计算机装有将这些坐标翻译成三维结构的软件程序，就可用于各种目的，尤其是有关药物开发的目的。产生上述三维图解图像的软件是已知且可以商购的。例子包括Quanta和WebLite Viewer。现用的坐标数据需要以计算机可读格式存储。因此，按照本发明，将能以三维结构显示的数据存储在计算机可读介质上，当在装有指示利用该数据程序的机器上使用时，该介质能显示本文所述HCV NS5B复合物或HCV NS5B结合袋的图解三维图像。
HCV NS5B X-射线坐标数据对筛选潜在NS5B抑制活性的化合物是有用的。例如，可以利用计算机对由数据编码的多肽NS5B结合袋结构结合指定化合物的能力来进行评价。同时，通过某种类型的结合而确定“适合”本文所述结合袋的化合物可能会阻止HCV NS5B聚合酶的生物活性，这样，该化合物就代表一种潜在的药物候选物。另外，可以在计算机屏幕上显示数据的图解三维图像，从而可以目测HCV NS5B结合袋和化合物在NS5B复合物中的结合袋内的结合。
鉴定HCV NS5B结合化合物的虚拟方法
在进一步的方面，本发明提供了一种评价化合物复合HCV NS5B潜力的虚拟方法。该方法描述为第一轮筛选搜索与本发明结合袋结合的化合物，并最终搜索到由于结合结合袋导致HCV抑制而具备治疗效力的化合物。
因此，在本发明的进一步方面，提供了一种鉴定潜在HCV抑制剂的虚拟筛选方法，其包括下述步骤：
a)构建HCV NS5B结合袋的计算机模型，所述HCV NS5B结合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)的结构坐标定义，或由其功能等同类似物定义；
b)用计算工具对待测化合物和NS5B结合袋的计算机模型进行吻合度程序操作，从而提供所述化合物在该结合袋内的能量最小化构型；和
c)对吻合度操作的结果进行评价，量化化合物和结合袋间的结合，其中与结合袋结合、产生低能量、稳定复合物的化合物是潜在的NS5B抑制剂。
另外，本发明提供了一种鉴定结合HCV NS5B的化合物的方法，包括步骤：
a)将三维分子模型算法应用于HCV NS5B结合袋的结构坐标，确定HCV NS5B结合袋的空间坐标，其中所述HCV NS5B结合袋由天然HCVNS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)来定义；和
b)在HCV NS5B结合袋空间坐标的背景下对存储的候选化合物的空间坐标进行电子筛选，鉴定能结合到HCV NS5B结合袋内的化合物。
在本发明此方面的优选实施方式中，结合袋可以额外由氨基酸残基36，426，498和499中的一个或多个来定义，或者由氨基酸残基36-37，392-399，424-429和492-503定义的一个或多个氨基酸簇来定义。
在本发明的另一个优选实施方式中，结合袋的结构坐标是如图4，5和6所示的结构坐标，或者是本领域技术人员能理解的功能等同的结构坐标。
根据本发明的此方面，任何给定化合物都可以在计算机上评价其与本文所述HCV NS5B结合袋的结合能力，以及其作为确定的NS5B抑制剂的潜力。如上暗示，利用已知软件，如QUANTA[Molecular Simulations Inc，SanDiego，Calif.]，Sybyl[Tripos Associates，St.Louis，Mo.]，InsightII[Accelrys]，MOE[Chemical Computing Group Inc.，Montreal，Quebec，Canada]可构建出由本文所述HCV NS5B结合袋构成的多肽的计算机模型。然后将要评价的待选化合物置于结合袋内的多个定位内，或者停靠在结合袋内。可利用软件如GRID，DOCK，AUTODOCK，FlexX和GOLD实现停靠。当化合物停靠在结合袋内产生NS5B复合物“虚拟”图像时，可进一步使用计算工具，利用软件如QUANTA，Sybyl，InsightII和MOE获得复合物的定量和定性图，包括如，药效团图，表面性质图(绘制Conolly，Gaussian and van der Waalssurfaces)和随机受体潜力图。
可通过计算机评估来检测和优化所选化合物与本发明HCV NS5B结合袋结合的效力。例如通过目测定性确定的或者利用评分函数如LUDI，PLP，PMF，SCORE，GOLD和FlexX定性确定的形状、大小和静电互补来对给定化合物在NS5B结合袋内的配合等级进行评价。可单独或组合，例如以一致评分法使用这些定性和定量评价法。
另外，可以在化合物与HCV NS5B结合形成复合物的相互作用能量基础上对结合效力进行评价。例如，以本文所述方式与NS5B形成“低能量稳定复合物”的确定化合物，保证会进一步分析作为潜在的NS5B抑制剂。本文所用术语“低能量稳定复合物”解释为NS5B复合物中的范德华(van derWaals)相互作用能量值，即化合物和NS5B相互作用的范德华能量小于约8000kcal/mol的NS5B复合物。可利用软件MOE，并在MMFF94力场基础上确定范德华相互作用能量值。因此，确定形成范德华相互作用能量值小于约8000kcal/mol的复合物的化合物是潜在的NS5B抑制剂。优选，本发明的低能量稳定复合物的范德华相互作用能量值小于约6000kcal/mol，更优选小于约4000kcal/mol。
利用本发明NS5B多肽变体/类似物的方法
一旦利用虚拟方法，如上面描述的虚拟方法对许多化合物进行了筛选，就可以对已确定是潜在HCV抑制剂的化合物进行进一步的评价，来确定其与本发明结合袋相互作用和抑制HCV的实际倾向。
这样，本发明的另一个方面，提供了一种筛选候选HCV NS5B抑制剂化合物的方法，包括下述步骤：
a)在适合与多肽结合的条件下，保温候选抑制剂化合物，其中所述多肽选自下组：
i)分离和纯化的多肽，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的功能HCV NS5B结合袋，其中所述结合袋由于取代了由至少氨基酸残基18至35定义的手指环链而暴露出来，其中所述结合袋保持其天然功能构型；
ii)分离和纯化的HCV NS5B多肽，其由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的HCV NS5B结合袋组成，其中所述结合袋保持其天然功能构型；
iii)分离和纯化的HCV NS5B多肽类似物，包括由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的HCV NS5B结合袋，其中所述结合袋保持其天然功能构型且所述结合袋是可暴露的；
iv)HCV NS5B多肽变体，其在由氨基酸残基18至35定义的手指环内包括至少一个氨基酸突变，其中所述突变能导致该手指环被取代，而使基本由天然HCV NS5B的氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义的，或由其功能等同类似物定义的结合袋暴露，其中所述结合袋保持其天然功能构型；
v)HCV NS5B多肽或其功能等同类似物，其特征是取代了氨基酸18至35；和
vi)HCV NS5B多肽或其功能等同类似物，其中删除了至少氨基酸残基18至35；和
b)测定候选抑制剂化合物是否与多肽结合，其中与多肽结合的化合物是潜在的HCV NS5B抑制剂。
可以利用本领域的固定方法对候选化合物在定义的HCV NS5B结合袋内的结合进行测定。例如，可以使用结合试验，该试验在适合发生结合的条件下，将候选化合物与含有本发明NS5B结合袋的多肽接触。然后，例如利用NMR或其它已知的检测技术对结合进行评估。
设计HCV NS5B抑制剂的方法
在本发明的进一步方面，提供了设计与本文所述NS5B结合袋结合的化合物的方法。因此，本发明提供了以NS5B中的新结合袋结构为基础，利用分子设计技术鉴定、选择或设计潜在HCV NS5B抑制剂的机会。该预测模型对于高成本的制备和测定可能或不可能结合HCV NS5B蛋白的多种不同化合物来讲是有价值的。
根据本发明，可以在实际合成和检测前，对潜在NS5B抑制剂与本文所述NS5B结合袋的结合能力进行评价。如果推测拟用化合物不足以与结合袋相互作用或结合，那就排除制备和检测该化合物。但如果计算机模型显示相互作用很强，那就可以制备该化合物并完全测定其结合能力。可利用本领域技术人员范围内的常规试验来进行测定，从而确定结合。
在此，所提供的设计能与上述NS5B多肽结合的化合物的方法包括下述步骤：评价化合物和NS5B多肽内结合袋的互补性，即“符合度”，其中所述结合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义，或由其功能等同类似物定义。
类似地，提供的制备抑制HCV NS5B的RNA复制活性的药物的方法包括：鉴定或设计正好符合NS5B结合袋的化合物，所述NS5B结合袋由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503(且任选氨基酸残基37和496中的一个)定义，或由其功能等同类似物定义，其中所述结合袋由于取代了由至少氨基酸残基18至35定义的手指环链而暴露出来。
作为第一次，本发明允许使用基于结构或合理的药物设计技术来设计、选择和合成化学个体，包括能放进和/或结合本文所定义的新型NS5B结合袋的抑制性化合物。
本发明可用的一具体有用的药物设计技术是迭代药物设计。迭代药物设计是一种通过测定和评估蛋白质/化合物复合物的连续套三维结构，优化蛋白质和化合物之间结合的方法。
本领域技术人员将意识到：天然配体或底物与其对应的受体或酶的结合袋的结合是多种生物作用机制的基础。类似地，许多药物通过与受体和酶的结合空穴结合发挥其生物效应。这种结合可发生在所有或任何部分的结合袋。理解这种结合有助于设计更易于与其靶受体或酶结合的性质的药物，从而提高了生物效应。因此，该信息在设计本发明潜在受体或酶的配体或抑制剂，如HCV NS5B类多肽，尤其是HCV NS5B的抑制剂中非常有用。
在迭代药物设计时，先获得一系列蛋白质/化合物复合物的晶体。然后将各复合物的三维结构解析。这一途径提供各复合物蛋白质和化合物之间的结合的深入了解。如下达到该目的：选择具有抑制活性的化合物、获得该新蛋白质/化合物复合物的晶体、解析该复合物的三维结构以及比较新蛋白质/化合物复合物之间的结合和先前解析的蛋白质/化合物复合物之间的结合。通过观察化合物变化如何影响蛋白质/化合物结合，可以优化结合。
下面将通过具体实施例对本发明的具体实施方式进行描述，而不应将其理解为限制本发明。
实施例
实施例1-表达和纯化HCV NS5B
通过将缺失了通常在成熟NS5B中发现的C末端21个氨基酸的变体表达，来制备溶解的重组HCV1b基因型(J4株)NS5B聚合酶(其氨基酸序列示于SEQ ID NO：1中)。为了本发明的目的，表达的NS5BΔ21 C末端具备6-His序列。在24℃，用0.4mM IPTG处理3小时，诱导大肠杆菌菌株JM109(DE3)中的pET载体表达NS5B。收获细胞(在25mM Tris pH 7.5，10％甘油，1mMEDTA，500mM NaCl，2mM 2-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂混合物(购自RocheBiochemicals Inc.的标准混合物)，并在微流化器(microfluidizer)中裂解。将裂解物离心(30,000X)后，按照本领域技术人员所熟知的下述连续层析步骤来纯化：(i)利用Ni-NTA树脂(Qiagen)进行金属亲和层析，用含递增浓度(从10mM-500mM)的咪唑的缓冲液洗脱；(ii)DEAE-Sepharose层析，其中NS5B溶于含300mM NaCl的缓冲液中过柱；(iii)肝素Sepharose层析，其中NS5B在含200mM NaCl的缓冲液中，然后用含梯度高至1M NaCl的缓冲液洗脱所结合的NS5B。在Resource S柱上浓缩富含NS5B蛋白的洗脱组分，然后用20mM Tris-HCl pH 7.5，10％甘油，5mM DTT，300mM NaCl过Superdex200柱。将含高纯度His-标记NS5B的峰值组分-80℃保存，直至使用。
实施例2-HCV NS5B的结晶
用单甲醚聚乙二醇5000(PEG5Kmme)作沉淀剂，将如实施例1详述获得的HCV聚合酶NS5B株1b/J4(SEQ.ID NO：1)结晶为其apo形式。利用悬滴式蒸气扩散技术(McPherson，见上)获得大的单晶体。具体地，将1μL NS5B(7.66mg/mL在含20mM Tris，pH 7.3，300mM NaCl，10％甘油的纯化缓冲液中)加到由21％PEG5Kmme，0.1M MES，pH 5.4，10％甘油和0.4M硫酸铵组成的1μL溶液中。将获得的2μL液滴悬在由21％PEG5Kmme，0.1MMES，pH 5.4，20％甘油和0.4M硫酸铵组成的1mL储液之上。所得NS5B复合物晶体属空间群P2(1)2(1)2(1)，单位晶胞大小为a＝105.1，b＝106.6，c＝133.5，每个不对称单位包括两个分子。利用由常规旋转正极源(regularrotating anode source)发出的X射线，显示晶体衍射(diffract)分辨率高至
实施例3-制备抑制剂化合物A，B和C
根据2004年1月12日提交的共同未决申请US 10/755,256制备抑制剂化合物A。
根据2004年1月12日提交的共同未决申请US 10/755,256制备抑制剂化合物B。
根据2003年1月22日公开的WO 03/007945制备抑制剂化合物C。
实施例4 NS5B-抑制剂复合物的形成
抑制剂浸泡
将晶体移至由14％PEG5Kmme，14mM Tris，pH 7.5，70mM MES，pH7.0，14％甘油，210mM NaCl，10mg/mL溶菌酶和280mM硫酸铵组成的5μL浸泡液液滴中。抑制剂分子用DMSO溶解，浓缩至25mM。将抑制剂溶液(0.2μL)加到5μL NS5B晶体液滴中，11℃保温5-6小时。保温后，用cryoloop(Hampton Research，California，USA)将NS 5B-抑制剂复合物晶体从溶液中移出，在液氮内低温冷藏(cryo-cooled)。利用化合物A和B制备NS5B复合物。
数据收集
在配有Raxis-IV++影像信号板监视器(Rigaku/MSC，Texas，USA)的MicroMax-007旋转正极x-射线发生器上收集衍射数据。在用化合物A和化合物B制备的NS5B复合物于-180℃低温冷藏的单晶体上采集分辨率
的数据。
定相(phasing)，构建模型和精加工
利用HCV NS5B的公众可得结构(pdb code：1C2J)通过分子替换(MR)对衍射数据进行定相。利用程序CNX(Accelrys)进行旋转和平移检索(translation search)。用软件O(Alwyn Jones，Upsala University，Sweden)进行模型构建，用CNX软件(Accelrys)进行模型精加工。通过多轮模型构建和精加工来改善模型，直到获得所需结果。所有情况下的最终模型包括两分子NS5B，鉴定为NS5B A和NS5B B，(即残基A1至A149，A154至A563，B1至B17，B36至B148和B153至B563)和一分子与NS5B分子B结合的化合物A或B。化合物A和化合物B NS5B复合物的最终原子结构坐标分别示于图4和图5中。NS5B-化合物A复合物的最终结晶(crystallographic)R因子是21.9％，R游离因子是28.0％，分辨率NS5B-化合物B复合物的最终结晶R因子是21.9％，R游离因子是25.7％，分辨率
实施例5 基于NMR结合构象的NS5B-化合物C复合物模型
按照本文详细描述的几个步骤来确定化合物C在HCV聚合酶上的结合位点。开始，用NMR光谱法(转移的NOESY)确定化合物C与HCV聚合酶结合时的结构。另一种NMR技术，差示谱线增宽(DLB)帮助辨认化合物C中与聚合酶结合的片段以及在结合状态下暴露于溶剂的片段。然后将该结合结构对接(dock)在NS5B-化合物A复合物的X-射线衍生结构上。通过将化合物A和化合物C的吲哚和苯并咪唑所共有的5/6芳香环重叠，开始对接过程。然后，计算所有差示谱线增宽数据，利用MOE使复合物能量最小化。
按照下述方法获得转移的NOESY和DLB数据。将15μL的DMSO-d6浓缩液(含0.31mg化合物C)加入由20mM Tris-d11，2mM DTT-d10，1mMEDTA-d12，300mM NaCl和掺有TSP-2，2，3，3-d4的10％(v/v)D2O组成的含水缓冲液中，制得含化合物C的样品管(5mm)。将缓冲液终体积加到600μL，pH调为6.0。记录游离化合物C的光谱。往NMR管中加两次HCV聚合酶浓缩贮存液，测定光谱。在缓冲液中，浓缩贮存物包含21.7mg/mL HCV聚合酶(NS5BΔ21C-His6)，其中缓冲液组成为20mM Tris-d11，2mM DTT-d10，1mM EDTA-d12，300mM NaCl和10％(v/v)甘油-d8。
于22和27℃，在Bruker AVANCE 600和800MHz NMR光谱仪上获得NMR谱。溶剂信号的抑制是通过利用预饱和或通过在获得数据前插入3-9-19 WATERGATE模块获得的。采集两个样品管的一维光谱，用于DLB对比，采集各光谱的128轮扫描。不含聚合酶的样品管的NOESY试验结果没有观察到预期的明显交叉峰。另外，含聚合酶的样品管的NOESY光谱观察到许多交叉峰，其包括抑制剂C与HCV聚合酶结合时有价值的内氢距离信息。记录的一系列NOESY混合时间包括75，100，150，200和300秒(600和800MHz场)。通常获得的二维数据组t2中是2048个点，t1中是512个点。取128轮扫描的均值用于NOESY FIDs。利用Bruker’s XWinNMR和WinNMR软件(Bruker Canada，555Steeles Ave.East，Milton，Ontario)加工和分析数据。在利用相移位sinebell窗口功能转化后，对数据组进行零填充，产生2048x2048个真实数据点。
通过定制的模拟退火方法计算出化合物C结构，该方法在MOE分子建模程序(CCG，Montreal，Qc，Canada)中实现。利用mmff94力场在MOE的2202.03版本中实现全部计算。从系列NOESY数据获得NMR-衍生的平底限制(flat-bottomed restraint)。将NOESY交叉峰的相对强度分为3级，然后作为限制，强
中
或弱
冷却阶段，NMR-衍生的平底限制中的力常数逐渐增高。在1000K进行单独的高温无限制动力学测试(run)，以10psec间隔收集100个结构，获得起始组构象。各结构利用下述模拟退火方法进行冷却和最小化。在模拟过程中，温度和限制权重(weight)分别是从1000K变到50K和从1/1000000变到20。使最终结构发生能量最小化，计算总能量，计算限制能，确定限制背离(restraint violation)。分离出NMR-一致结构，对两个家族的结构进行鉴定。
然后，将NMR-衍生结构各家族的一个代表物对接在NS5B-化合物A复合物的X-射线衍生结构上。通过将化合物A和化合物C的吲哚和苯并咪唑所共有5/6芳香环重叠开始对接过程。化合物C只有一种结构同时与DLB数据和结合袋形状匹配。在该复合物中，化合物C的右手侧位于Pro 495和Pro 496上或与Pro 495和Pro 496邻近。利用MOE分子建模程序，可以对第503，498和499位氨基酸的侧链取向进行略微重调，从而提高抑制剂-聚合酶吻合度。将His 428和502质子化。利用最陡降幅、共轭梯度和删简的Newton算法的组合使复合物能量最小化，从而使该结构只发生较小变化。建立一种方法，从而可以让抑制剂与位于抑制剂内的聚合酶残基在最小化过程中移动，而其它所有残基均固定，使用的远程力阈值是
将在MOE分子建模程序2002.03版中运行的mmff94s力场用于计算，包括溶剂化。使用MOE分子建模程序进行复合物可视化。
NS5B-化合物C复合物的结构坐标获自最终的最小化，并示于图6中。
参考文献：
·Ago等1999，Structure 7(11)：1417-1426
·Ausubel等，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，NewYork.
·Bressanelli等1999，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 96(23)：13034-13039.
·Bressanelli等，2002，J.Virol，76：3482-3492.
·Dayhoff，M.O.，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure，5，suppl.3，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.
·Kolykhalov，A.A.等，2000；J.Virol.74：2046-2051.
·Labonté等，2002，J.Biol.Chem.277(41)：38838-38846.
·Lai，M.M.C.，1998，Virology 244，1-12.
·Lehninger，A.L.，等，1993，Principles of Biochemistry(2nd edn.)Worth，New York.
·Lesburg等1999，Nat.Struct.Biol.6：937-943.
·Love等，2003，J.Virol.77：7575-7581.
·McPherson等，1989，Preparation and Analysis of Protein Crystals，Krieger Pub.
·O′Farrell等，2003，J.Mol.Biol.326：1025-1035.
·Pickworth-Glusker J.，Trueblood K.N.，Crystal Structure Analysis，2ndEd.Oxford University Press，1985，New York.
·Sambrook等，1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Labs.
·Schulz G.E.and Schirmer R.H.，1985，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag，New York
·Strauss，J.H.，and Strauss，E.G.1999，Science 283，802-804.
·Wang等，2003，J.Biol.Chem.278(11)：9485-9495.
WO 01/047883.
WO 02/004425.
WO 03/000254.
WO 03/007945.
WO 03/010140.
WO 03/010141.
WO 03/026587.
EP 1256628.
US 10/755256.
US 10/755544.
US 60/546213
序列表
<110>贝林格尔.英格海姆国际有限公司(BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH)
<120>丙型肝炎病毒NS5B聚合酶抑制剂结合袋
<130>13/123
<140>60/469,604
<141>2003-05-09
<160>6
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>576
<212>PRT
<213>HCV
<400>1
Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala
1 5 10 15
Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg
20 25 30
His His Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Leu Arg
35 40 45
Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Asp His Tyr
50 55 60
Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala
65 70 75 80
Lys Leu Leu Ser Ile Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser
85 90 95
Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser
100 105 110
Ser Arg Ala Val Asn His Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu
115 120 125
Asp Thr Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Ser Glu Val
130 135 140
Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile
145 150 155 160
Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr
165 170 175
Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly
180 185 190
Phe Gln Tyr Ser Pro Lys Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Thr Trp
195 200 205
Lys Ser Lys Lys Cys Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe
210 215 220
Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr
225 230 235 240
Gln Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gln Ala Ile Arg Ser Leu
245 250 255
Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln
260 265 270
Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser
275 280 285
Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Thr Ala Ala Cys Arg
290 295 300
Ala Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Leu
305 310 315 320
Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ala Leu
325 330 335
Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp
340 345 350
Pro Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser
355 360 365
Asn Val Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu
370 375 380
Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala
385 390 395 400
Arg His Thr Pro Ile Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala
405 410 415
Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile
420 425 430
Leu Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr
435 440 445
Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu
450 455 460
Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly
465 470 475 480
Glu Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro
485 490 495
Leu Arg Thr Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Lys Leu Leu
500 505 510
Ser Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp
515 520 525
Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Gln
530 535 540
Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile
545 550 555 560
Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg His His His His His His
565 570 575
<210>2
<211>4
<212>PRT
<213>HCV
<400>2
Ser Met Ser Tyr
1
<210>3
<211>4
<212>PRT
<213>HCV
<400>3
Leu Gly Val Pro
1
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>HCV
<400>4
Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr
1 5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>HCV
<400>5
Ile Leu Met Thr His Phe
1 5
<210>6
<211>12
<212>PRT
<213>HCV
<400>6
Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Thr Trp Arg His Arg
1 5 10
Claims (42)
1、一种HCVNS5B抑制剂结合袋-抑制剂复合物，其包含由SEQ ID NO：1的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义的HCV NS5B抑制剂结合袋和抑制剂(A)：
2.一种结晶的复合物，其包含SEQ ID NO：1的HCV NS5B和抑制剂(A)：
3、一种HCVNS5B抑制剂结合袋-抑制剂复合物，其包含由SEQ ID NO：1的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义的HCV NS5B抑制剂结合袋和抑制剂(B)：
4.一种结晶的复合物，其包含SEQ ID NO：1的HCVNS5B和抑制剂(B)：
5、一种制备权利要求2或4的结晶的复合物的方法，所述方法包含下述步骤：
a)在结晶缓冲液中保温纯化的SEQ ID NO：1的HCV NS5B多肽，获得结晶的NS5B多肽；
b)将权利要求2或4的化合物溶解；和
c)在浸泡缓冲液中，将所述结晶的多肽与步骤b)的溶解的化合物一起浸泡适当的浸泡时间，获得结晶的复合物。
6、权利要求5所述的方法，其中结晶缓冲液选自2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)，磷酸钠，磷酸钾，乙酸钠或琥珀酸钠。
7、权利要求6所述的方法，其中使用的结晶缓冲液浓度在约50mM-0.2M之间。
8、权利要求7所述的方法，其中结晶缓冲液是浓度约0.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)。
9、权利要求5所述的方法，其中所述结晶缓冲液额外包括至少一种沉淀剂。
10、权利要求9所述的方法，其中沉淀剂是选自由聚乙二醇(PEG)，单甲醚聚乙二醇5000(PEG5K mme)，硫酸铵，2-甲基-2，4-2-甲基-2，4戊二醇(MPD)，异丙醇，乙醇和叔丁醇组成的组中的沉淀剂。
11、权利要求10所述的方法，其中使用的沉淀剂浓度在约30％-约40％之间。
12、权利要求11所述的方法，其中沉淀剂是浓度约21％的单甲基醚聚乙二醇5000(PEG5K mme)和浓度约0.4mM的硫酸铵。
13、权利要求5所述的方法，其中浸泡缓冲液是选自由2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，磷酸钠，乙酸钠和琥珀酸钠组成的组中的浸泡缓冲液。
14、权利要求13所述的方法，其中使用的浸泡缓冲液浓度在约50mM-约0.2M之间。
15、权利要求5所述的方法，其中浸泡缓冲液包含最高约至10mg/mL的蛋白。
16、权利要求5所述的方法，其中浸泡缓冲液额外包括选自NaCl，(NH4)2SO4和KCl的一种或多种盐。
17、权利要求16所述的方法，其中存在于浸泡缓冲液中的盐浓度是约100mM-约500mM。
18、权利要求17所述的方法，其中浸泡缓冲液包含NaCl和(NH4)2SO4。
19、权利要求18所述的方法，其中浸泡缓冲液包括浓度约210mM的NaCl和浓度约280mM的(NH4)2SO4。
20、权利要求5所述的方法，其中浸泡缓冲液额外包括浓度约10-约20％的甘油。
21、权利要求5所述的方法，其中浸泡缓冲液额外包括至少一种沉淀剂。
22、权利要求21所述的方法，其中沉淀剂是选自由聚乙二醇(PEG)，单甲醚聚乙二醇5000(PEG5K mme)，硫酸铵，2-甲基-2，4戊二醇(MPD)，异丙醇，乙醇和叔丁醇组成的组中的沉淀剂。
23、权利要求22所述的方法，其中沉淀剂的存在浓度是约10％-约18％。
24、权利要求23所述的方法，其中浸泡缓冲液包括浓度约14％的沉淀剂单甲醚聚乙二醇5000(PEG5K mme)和浓度约0.4mM的硫酸铵。
25、权利要求5所述的方法，其中浸泡时间是约3-约8小时。
26、权利要求25所述的方法，其中浸泡时间是约5-约6小时。
27、一种制备结晶的HCV NS5B复合物的方法，所述复合物包含权利要求1-12中任一项所述的SEQ ID NO：1的多肽和权利要求2或4任一项的抑制剂化合物，其中所述化合物与由天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任选氨基酸残基37或496定义的NS5B结合袋结合，所述方法包含下述步骤：
a)将纯化的SEQ ID NO：1的HCV NS5B与溶解的权利要求2或4的化合物混合，形成NS5B复合物；和
b)在结晶缓冲液中让复合物结晶。
28、权利要求2所述HCV NS5B复合物的一组X-射线晶体结构坐标，其具有图4所示的X-射线晶体坐标。
29、权利要求4所述HCV NS5B复合物的一组X-射线晶体结构坐标，其具有图5所示的X-射线晶体坐标。
30、一种鉴定结合HCV NS5B的化合物的方法，包括下述步骤：
a)获得图4-6之一的结构坐标；
b)将三维分子模型算法应用于HCV NS5B结合袋的结构坐标，确定HCV NS5B结合袋的空间坐标，其中所述结合袋的结构坐标由所述图中所示的天然HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任选氨基酸残基37或496的结构坐标定义；和
c)在HCV NS5B结合袋空间坐标的背景下对存储所述化合物的空间坐标进行电子筛选，测定该化合物是否结合在HCV NS5B结合袋内。
31、一种鉴定潜在HCV抑制剂的虚拟筛选方法，包括下述步骤：
a)获得图4-6之一的结构坐标；
b)构建HCV NS5B结合袋的计算机模型，其中所述HCV NS5B结合袋由所述图中所示的HCV NS5B的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503且任选氨基酸残基37或496的结构坐标定义；
c)利用计算机工具，在待评化合物和NS5B结合袋的计算机模型之间进行吻合度程序操作，提供结合袋中化合物的能量最小化构型；和
d)对该吻合度操作的结果进行评价，量化化合物和结合袋间的结合，其中与结合袋结合并获得低能量、稳定复合物的化合物就是潜在的NS5B抑制剂。
32、权利要求31所述的方法，其中复合物的范德华相互作用能量值小于约8000kcal/mol。
33、权利要求31所述的方法，其中复合物的范德华相互作用能量值小于约6000kcal/mol。
34、权利要求31所述的方法，其中复合物的范德华相互作用能量值小于约4000kcal/mol。
35、一种设计与NS5B多肽结合的化合物的方法，包括：获得图4-6之一的结构坐标，应用三维分子模型算法以确定如图中所示的HCV NS5B结合袋的空间坐标，并评估化合物和所述结合袋间的互补性。
36、一种评价化合物结合NS5B多肽的能力的方法，包括下述步骤：
a)使用图4-6之一的结构坐标构建HCV NS5B结合袋的计算机模型，其中所述HCV NS5B结合袋由SEQ ID NO：1的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503的结构坐标定义；
b)将待评化合物的结构坐标提供给计算机模型；
c)利用计算机工具，在待评化合物的结构坐标和结合袋的结构坐标之间进行吻合度程序操作；和
d)对该吻合度操作的结果进行评价，量化所述化合物和结合袋间的结合。
37、权利要求36所述的方法，其中所述步骤c)涉及通过计算所述化合物与结合袋的范德华相互作用能量来测定结合效力。
38、一种选择化合物的方法，该化合物用于评价抑制HCV NS5B聚合酶活性的能力，所述方法包括下述步骤：
a)将代表HCV NS5B结合袋的图4-6之一的结构坐标和已知结合此结合袋的化合物的结构坐标提供给计算机建模程序，所述HCV NS5B结合袋由SEQ ID NO：1的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义；
b)评估步骤a)中的化合物与结合袋的吻合度；
c)将第二种化合物的坐标提供给计算机建模程序，该化合物是需要评价其结合所述结合袋的能力的化合物；
d)评估步骤c)中的化合物与结合袋的吻合度；
e)将步骤a)的化合物的吻合度与步骤c)的化合物的吻合度作比较，其中具有较好吻合度的化合物是用于评价抑制HCV NS5B聚合酶活性的能力的化合物。
39、一种鉴定天然HCV NS5B多肽的聚合酶活性的抑制剂的方法，所述多肽具有SEQ ID NO：1所示的序列，该方法包括下述步骤：
a)如下述选择潜在的抑制剂：将三维分子模型算法应用于代表HCVNS5B结合袋的图4-6之一的结构坐标以确定该结合袋的空间坐标，所述结合袋由SEQ ID NO：1的至少氨基酸残基392，393，395，396，399，424，425，428，429，492，493，494，495，500和503定义，然后在所述结合袋的空间坐标的背景下对存储的候选化合物的空间坐标进行电子筛选，其中潜在的抑制剂是与所述结合袋吻合的化合物；
b)在适宜结合的条件下，将所述多肽和潜在的抑制剂保温；和
c)测定潜在的抑制剂对HCV NS5B的聚合酶活性的抑制能力。
40、权利要求39的方法，其中步骤a)进一步涉及利用计算机工具，在候选化合物的空间坐标和所述结合袋的空间坐标之间进行吻合度程序操作，以便提供所述结合袋中该化合物的能量最小化构型，并且潜在的抑制剂是与所述结合袋结合而产生低能量、稳定复合物的候选化合物，其中所述复合物的范德华相互作用能量值小于约8000kcal/mol。
41、权利要求40的方法，其中所述复合物的范德华相互作用能量值小于约6000kcal/mol。
42、权利要求40的方法，其中所述复合物的范德华相互作用能量值小于约4000kcal/mol。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US46960403P | 2003-05-09 | 2003-05-09 | |
| US60/469,604 | 2003-05-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1820022A CN1820022A (zh) | 2006-08-16 |
| CN100457776C true CN100457776C (zh) | 2009-02-04 |
Family
ID=33435247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004800194730A Expired - Fee Related CN100457776C (zh) | 2003-05-09 | 2004-05-05 | 丙型肝炎病毒ns5b聚合酶抑制剂结合袋 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7386398B2 (zh) |
| EP (1) | EP1625154B1 (zh) |
| JP (1) | JP4584909B2 (zh) |
| KR (1) | KR101164070B1 (zh) |
| CN (1) | CN100457776C (zh) |
| AU (1) | AU2004235848B2 (zh) |
| CA (1) | CA2522574C (zh) |
| DK (1) | DK1625154T3 (zh) |
| ES (1) | ES2456702T3 (zh) |
| IL (1) | IL171800A (zh) |
| MX (1) | MXPA05012101A (zh) |
| WO (1) | WO2004099241A1 (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104487442A (zh) * | 2012-05-16 | 2015-04-01 | 吉利德法莫赛特有限责任公司 | Hcv ns5b的抗病毒化合物抑制剂 |
| US9868745B2 (en) | 2011-11-16 | 2018-01-16 | Gilead Pharmasset Llc | Antiviral compounds |
| US10344019B2 (en) | 2010-11-17 | 2019-07-09 | Gilead Pharmasset Llc | Antiviral compounds |
| US11116783B2 (en) | 2013-08-27 | 2021-09-14 | Gilead Pharmasset Llc | Combination formulation of two antiviral compounds |
| US11203599B2 (en) | 2014-06-11 | 2021-12-21 | Gilead Pharmasset Llc | Solid forms of an antiviral compound |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2534649A1 (en) | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Genelabs Technologies, Inc. | Bicyclic imidazol derivatives against flaviviridae |
| US7153848B2 (en) | 2004-08-09 | 2006-12-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Inhibitors of HCV replication |
| US7816348B2 (en) | 2006-02-03 | 2010-10-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Viral polymerase inhibitors |
| US8535334B2 (en) * | 2007-04-17 | 2013-09-17 | Lazarus Effect, Inc. | Complex wire formed devices |
| US8242140B2 (en) | 2007-08-03 | 2012-08-14 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Viral polymerase inhibitors |
| JP2010535155A (ja) * | 2007-08-03 | 2010-11-18 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | ウイルスポリメラーゼ阻害剤 |
| WO2009033183A2 (en) * | 2007-09-08 | 2009-03-12 | University Of Florida Research Foundation | Compounds and methods for treatment of hcv and conditions associated with cd81 binding |
| BRPI0703586B1 (pt) * | 2007-10-19 | 2018-02-06 | Braskem S.A | Catalisador metaloceno suportado, e, copolímeros de etileno com alfa-olefinas de alto e ultra alto peso molecular |
| US8476257B2 (en) | 2007-12-19 | 2013-07-02 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Viral polymerase inhibitors |
| NZ593806A (en) * | 2008-12-03 | 2014-04-30 | Presidio Pharmaceuticals Inc | Inhibitors of hcv ns5a |
| TW201039826A (en) * | 2009-01-12 | 2010-11-16 | Glaxosmithkline Llc | Anti-viral compounds, compositions, and methods of use |
| CA2753313A1 (en) * | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Presidio Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of hcv ns5a |
| AU2010266570A1 (en) * | 2009-06-30 | 2012-01-19 | Siga Technologies, Inc. | Treatment and prevention of Dengue virus infections |
| US8993604B2 (en) | 2009-06-30 | 2015-03-31 | Siga Technologies, Inc. | Treatment and prevention of dengue virus infections |
| WO2011026024A2 (en) * | 2009-08-31 | 2011-03-03 | Glaxosmithkline Llc | Imidazo [4,5-d] pyridazine compounds for treating viral infections |
| US20110065782A1 (en) * | 2009-09-15 | 2011-03-17 | Malliavin Therese | Methods of identifying compounds that inhibit the activation of a biomolecule and methods of treatment using the compounds |
| WO2011103063A1 (en) * | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Glaxo Group Limited | Therapeutic compounds |
| US20130296311A1 (en) * | 2010-05-28 | 2013-11-07 | Presidio Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of hcv ns5a |
| WO2012040389A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Presidio Pharmaceuticals, Inc. | Substituted bicyclic hcv inhibitors |
| WO2012050918A2 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-19 | Presidio Pharmaceutical, Inc. | Tricyclic fused ring inhibitors of hepatitis c |
| AU2011320696B2 (en) | 2010-10-26 | 2016-07-21 | Presidio Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of Hepatitis C Virus |
| US8741614B2 (en) * | 2010-11-02 | 2014-06-03 | Probiodrug Ag | Crystal structure of isoglutaminyl cyclase |
| US20150232455A1 (en) * | 2010-12-15 | 2015-08-20 | Allan C. Krueger | Anti-viral compounds |
| JP6041877B2 (ja) * | 2011-08-12 | 2016-12-14 | サザン リサーチ インスティテュート | キナゾリノン類似体及び特定のウイルス感染症の治療又は予防へのキナゾリノン類似体の使用 |
| DK2794628T3 (en) | 2011-12-20 | 2017-07-10 | Riboscience Llc | 4'-AZIDO-3'-FLUORO-SUBSTITUTED NUCLEOSIDE DERIVATIVES AS INHIBITORS OF HCV RNA REPLICATION |
| US20150087045A1 (en) * | 2012-01-13 | 2015-03-26 | Gilead Pharmassset Llc | Crystal structure of hcv polymerase complexes and methods of use |
| US10034893B2 (en) * | 2013-02-01 | 2018-07-31 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | 5, 6-D2 uridine nucleoside/tide derivatives |
| US9167288B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-10-20 | Universal Electronics Inc. | System and method for optimizing memory usage in a universal controlling device |
| MY186547A (en) | 2013-05-16 | 2021-07-26 | Riboscience Llc | 4?-fluoro-2?-methyl substituted nucleoside derivatives |
| US20180200280A1 (en) | 2013-05-16 | 2018-07-19 | Riboscience Llc | 4'-Fluoro-2'-Methyl Substituted Nucleoside Derivatives as Inhibitors of HCV RNA Replication |
| MA38678A1 (fr) | 2013-05-16 | 2017-07-31 | Riboscience Llc | Dérivés nucléosidiques 4'-azido, 3'désoxy-3'-fluoro substitués |
| KR20160045136A (ko) | 2013-08-26 | 2016-04-26 | 이난타 파마슈티칼스, 인코포레이티드 | C형 간염을 예방 또는 치료하기 위한 사이클로스포린 유사체 |
| WO2016033164A1 (en) | 2014-08-26 | 2016-03-03 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Nucleoside and nucleotide derivatives |
| US9669095B2 (en) | 2014-11-03 | 2017-06-06 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Cyclosporin analogues for preventing or treating hepatitis C infection |
| US9718851B2 (en) | 2014-11-06 | 2017-08-01 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Deuterated nucleoside/tide derivatives |
| US9732110B2 (en) | 2014-12-05 | 2017-08-15 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Nucleoside and nucleotide derivatives |
| CN104530189B (zh) * | 2014-12-16 | 2017-11-14 | 郑州大学第一附属医院 | 丙型肝炎病毒ns5b rna聚合酶抑制多肽序列及其用途 |
| TW201919649A (zh) | 2017-09-21 | 2019-06-01 | 美商里伯賽恩斯有限責任公司 | 作為ｈｃｖ ｒｎａ複製抑制劑之經４′－氟－２′－甲基取代之核苷衍生物 |
| WO2023172635A1 (en) * | 2022-03-08 | 2023-09-14 | Emory University | Predictive model for variants associated with drug resistance and theranostic applications thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003007945A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-01-30 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Viral polymerase inhibitors |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5528559A (en) * | 1995-06-23 | 1996-06-18 | Motorola, Inc. | Multiple display timepiece |
| EP1076692A2 (en) * | 1998-05-04 | 2001-02-21 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Crystallizable jnk complexes |
| US6434489B1 (en) * | 2000-04-03 | 2002-08-13 | Schering Corporation | Compositions of hepatitis C virus NS5B polymerase and methods for crystallizing same |
| US6448281B1 (en) * | 2000-07-06 | 2002-09-10 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Viral polymerase inhibitors |
| EP1256628A3 (en) * | 2001-05-10 | 2003-03-19 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Hepatitis c virus (hcv) ns5b rna polymerase and mutants thereof |
| AU2002339901A2 (en) * | 2001-09-06 | 2003-03-24 | Biogen Idec Ma Inc. | Crystal structure of baff, and use thereof in drug design |
| US7223785B2 (en) * | 2003-01-22 | 2007-05-29 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Viral polymerase inhibitors |
-
2004
- 2004-05-05 JP JP2006500449A patent/JP4584909B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-05-05 ES ES04731118.8T patent/ES2456702T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-05-05 DK DK04731118.8T patent/DK1625154T3/da active
- 2004-05-05 CA CA2522574A patent/CA2522574C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-05-05 KR KR1020057021262A patent/KR101164070B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-05-05 WO PCT/CA2004/000676 patent/WO2004099241A1/en active Application Filing
- 2004-05-05 AU AU2004235848A patent/AU2004235848B2/en not_active Ceased
- 2004-05-05 CN CNB2004800194730A patent/CN100457776C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-05-05 MX MXPA05012101A patent/MXPA05012101A/es active IP Right Grant
- 2004-05-05 EP EP04731118.8A patent/EP1625154B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-05-07 US US10/842,046 patent/US7386398B2/en active Active
-
2005
- 2005-11-07 IL IL171800A patent/IL171800A/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003007945A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-01-30 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Viral polymerase inhibitors |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Crystal Structure of the RNA-dependent RNA polymeraseofhepatitis C virus. Stephane Bressanelli 等人.PNAS,Vol.96 No.23. 1999 |
| Crystal Structure of the RNA-dependent RNA polymeraseofhepatitis C virus. Stephane Bressanelli 等人.PNAS,Vol.96 No.23. 1999 * |
| Modulation of Hepatitis C Virus RNA-dependentRNAPolymerase Activity by Structure-basedSite-directedMutagenesis. Patrick Labonte 等人.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMSTRY,Vol.277 No.41. 2002 |
| Modulation of Hepatitis C Virus RNA-dependentRNAPolymerase Activity by Structure-basedSite-directedMutagenesis. Patrick Labonte 等人.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMSTRY,Vol.277 No.41. 2002 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10344019B2 (en) | 2010-11-17 | 2019-07-09 | Gilead Pharmasset Llc | Antiviral compounds |
| US9868745B2 (en) | 2011-11-16 | 2018-01-16 | Gilead Pharmasset Llc | Antiviral compounds |
| CN104487442A (zh) * | 2012-05-16 | 2015-04-01 | 吉利德法莫赛特有限责任公司 | Hcv ns5b的抗病毒化合物抑制剂 |
| CN104487442B (zh) * | 2012-05-16 | 2016-10-26 | 吉利德制药有限责任公司 | Hcv ns5a的抗病毒化合物抑制剂 |
| US11116783B2 (en) | 2013-08-27 | 2021-09-14 | Gilead Pharmasset Llc | Combination formulation of two antiviral compounds |
| US11707479B2 (en) | 2013-08-27 | 2023-07-25 | Gilead Sciences, Inc. | Combination formulation of two antiviral compounds |
| US11203599B2 (en) | 2014-06-11 | 2021-12-21 | Gilead Pharmasset Llc | Solid forms of an antiviral compound |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4584909B2 (ja) | 2010-11-24 |
| EP1625154B1 (en) | 2014-01-08 |
| KR20060011861A (ko) | 2006-02-03 |
| ES2456702T3 (es) | 2014-04-23 |
| CA2522574C (en) | 2015-07-07 |
| JP2007534292A (ja) | 2007-11-29 |
| AU2004235848B2 (en) | 2011-08-04 |
| EP1625154A1 (en) | 2006-02-15 |
| CN1820022A (zh) | 2006-08-16 |
| DK1625154T3 (da) | 2014-02-24 |
| WO2004099241A1 (en) | 2004-11-18 |
| CA2522574A1 (en) | 2004-11-18 |
| AU2004235848A1 (en) | 2004-11-18 |
| KR101164070B1 (ko) | 2012-07-12 |
| IL171800A (en) | 2013-06-27 |
| US20050003348A1 (en) | 2005-01-06 |
| US7386398B2 (en) | 2008-06-10 |
| MXPA05012101A (es) | 2006-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100457776C (zh) | 丙型肝炎病毒ns5b聚合酶抑制剂结合袋 | |
| US7894996B2 (en) | Structure of the hepatitis C NS5A protein | |
| EP0935609B1 (en) | Crystallizable compositions comprising a hepatitis c virus ns3 protease domain/ns4a complex and crystals thereby obtained | |
| Coutard et al. | Assessment of Dengue virus helicase and methyltransferase as targets for fragment-based drug discovery | |
| Balavignesh et al. | Molecular docking study ON NS5B polymerase of hepatitis c virus by screening of volatile compounds from Acacia concinna and ADMET prediction | |
| McCoy et al. | Solution structure and dynamics of the single-chain hepatitis C virus NS3 protease NS4A cofactor complex | |
| Hussain et al. | In silico targeting of non-structural 4B protein from dengue virus 4 with spiropyrazolopyridone: study of molecular dynamics simulation, ADMET and virtual screening | |
| Welsch et al. | Structural and functional comparison of the non-structural protein 4B in flaviviridae | |
| Ezat et al. | Molecular docking investigation of the binding interactions of macrocyclic inhibitors with HCV NS3 protease and its mutants (R155K, D168A and A156V) | |
| Sarwar et al. | NS4A protein as a marker of HCV history suggests that different HCV genotypes originally evolved from genotype 1b | |
| Lee et al. | Nonsubstrate based inhibitors of dengue virus serine protease: a molecular docking approach to study binding interactions between protease and inhibitors | |
| US6434489B1 (en) | Compositions of hepatitis C virus NS5B polymerase and methods for crystallizing same | |
| Praveen | Characterizing the West Nile Virus's polyprotein from nucleotide sequence to protein structure–Computational tools | |
| Kang et al. | Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of the helicase domain of hepatitis C virus NS3 protein | |
| Wahab et al. | A search for vaccines and therapeutic for dengue: a review | |
| Kulkarni-Kale et al. | Curation of viral genomes: challenges, applications and the way forward | |
| Yao et al. | Application of structural biology tools in the study of viral hepatitis and the design of antiviral therapy | |
| EP1118619B1 (en) | Method to identify agents active against HCV by using the structure coordinates of hepatitis C virus protease | |
| Kaushik et al. | In silico identification of vaccine candidate from various screening methods against hepatitis C virus | |
| Gededzha et al. | Characterization of HCV genotype 5a envelope proteins: implications for vaccine development and therapeutic entry target | |
| EP1364961B1 (en) | Crystallizable compositions comprising a hepatitis c virus ns3 protease domain/ns4a complex and crystals thereby obtained | |
| Abdalrazaq et al. | INTERNATIONAL JOURNAL OF RESEARCH IN PHARMACEUTICAL SCIENCES | |
| Ali et al. | Active Sites and Potential Inhibitors Prediction for Nonstructural 4A Protein of Dengue Virus | |
| Wang | Drug resistance mechanisms and drug design strategies for human immunodeficiency virus and hepatitis c virus proteases | |
| GOYAL | Structural and binding characterization of the antiviral host Proteins, VIPERIN and VAPC |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090204 Termination date: 20170505 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |