ES2449640A2

ES2449640A2 - Compuestos para su uso en el tratamiento de la enfermedad de alzheimer

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Publication number: ES2449640A2
Application number: ES201231452A
Authority: ES
Inventors: Javier Sancho Sanz; Laura Catalina LÓPEZ RODRIGUEZ; Jose Alberto Carrodeguas Villar; Salvador VENTURA ZAMORA
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universidad de Zaragoza
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universidad de Zaragoza
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2014-03-20
Anticipated expiration: 2032-09-19
Also published as: ES2449640B1; ES2449640R1

Abstract

Compuestos para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.#La presente invención se refiere a uso del compuesto N-(4-cloro-2-nitrofenil)- N?-fenilurea y sus derivados como inhibidores de la agregación del péptido beta-amiloide, por tanto, y más particularmente para su uso como medicamento en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Description

Compuestos para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I) para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

(I) 10

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común que causa demencia en los

15 seres humanos. Afecta a alrededor de 30 millones de personas en todo el mundo, con una incidencia del 10% en individuos mayores de 65 años y el 30-40% en aquellos de más de 85 años. Histológicamente, la EA se caracteriza por la presencia de placas seniles extracelulares, compuestas principalmente del péptido amiloide β (A1), y ovillos neurofibrilares intracelulares formados por la proteína tau hiperfosforilada. Las placas seniles están compuestas por péptidos beta amiloides (A1), principalmente fragmentos peptídicos de 40–42 residuos de una proteína precursora

20 (APP) codificada en el cromosoma 21. Se ha demostrado que el péptido A1 y fragmentos del mismo son tóxicos in vitro e in vivo, lo que indica un papel importante de A1 en la patogénesis de EA.

La naturaleza precisa de la forma tóxica de A1 no ha sido establecida por completo pero, recientemente, la toxicidad se ha relacionado con formas tempranas de agregados peptídicos llamadas ADDLs (ligandos difundibles derivados 25 de A1), protofibrillas u oligómeros solubles (Walsh D.M., Selkoe D.J., Protein Pept Lett, 2004. 11(3): p. 213-28).

Las dianas principales para intervención terapéutica en la cascada A1 se clasifican en: (i) Inhibición de la producción de A1, (ii) Inhibición de la agregación de A1 y de la formación de fibras (iii) Inhibición de la respuesta inflamatoria causada por el depósito de A1 (Grundman y Thal., Neurol Clin, 2000. 18(4): p. 807-28). La inhibición de formación de 30 fibras y, mejor aún, de agregación de A1 es de interés terapéutico en el tratamiento de EA (Findeis y Molineaux., Methods Enzymol, 1999. 309: p. 476-88) porque los agregados de bajo peso molecular de A1 son extremadamente tóxicos para neuronas (Pike et al., J Neurosci, 1993. 13(4): p. 1676-87). Aunque se ha hecho mucho esfuerzo para desarrollar agentes terapéuticos tales como inmunoterapia (Thatte., Curr Opin Investig Drugs, 2001. 2(5): p. 663-7) así como compuestos que rompan láminas 1 (Findeis y Molineaux., Methods Enzymol, 1999. 309: p. 476-88), la

35 terapia específica disponible para combatir EA está limitada a la basada en la mejora de la función colinérgica y el efecto clínico no es suficiente (Grundman y Thal., Neurol Clin, 2000. 18(4): p. 807-28).

Actualmente los tratamientos disponibles para EA incluyen el uso de inhibidores de acetilcolinesterasa (AchE), en particular los disponibles clínicamente para tratar EA suave o moderado son galantamina, donepecil-hidrocloruro y

40 rivastigmina (Matharu et al., J Neurol Sci, 2009. 280(1-2): p. 49-58). Sin embargo, estos compuestos no curan la enfermedad sino que únicamente tratan sus síntomas (Sugimoto H., Yakugaku Zasshi . 2010 Apr; 130(4):521-6). Además, la utilidad de los compuestos que reducen la agregación de A1 o su neurotoxicidad in vitro se ve a menudo comprometida por su toxicidad in vivo.

45 Por tanto, existe la necesidad de localizar compuestos útiles para el tratamiento de esta enfermedad y que además posea una baja o nula citotoxicidad.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

50 La presente invención proporciona unos compuestos que son útiles para la elaboración de un medicamento para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Los autores de la presente invención han demostrado en los ejemplos el compuesto de la invención, en concreto el compuesto N-(4-cloro-2-nitrofenil)- N’-fenilurea inhibe, in vitro e in vivo, fuertemente la agregación del péptido A1 humano, más particularmente se ha demostrado en los ensayos descritos en la presente invención que dicho compuesto inhibe la formación de fibras amiloides A1 17-40, además de presentar baja citotoxicidas hacia células HeLa.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (I) (a partir de ahora compuesto de la invención)

(I)

donde:

10 R1 y R2 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C4); R3, R4, R5 y R6 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno, halógeno o un grupo alquilo (C1-C4) y donde al menos uno de estos radicales es un halógeno; y R7, R8, R9, R10 y R11 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno, halógeno o un grupo alquilo (C1-C4); preferiblemente hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C4).

15 para la inhibición de la agregación del péptido A1, preferiblemente del péptido A1 humano, y aún más preferiblemente para la elaboración de un medicamento, y aún más preferiblemente para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

El término “alquilo” se refiere, en la presente invención, a cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a

20 4 átomos de carbono, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, etc., preferiblemente el grupo alquilo tiene de 1 a 3 átomos de carbono y más preferiblemente es un grupo metilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como arilo, halógeno, (denominándose haloalquilo), hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto o tioalquilo. Preferiblemente el grupo alquilo no esta sustituido.

Por “halógeno” se entiende en la presente invención a un átomo de bromo, cloro, yodo o flúor. Preferiblemente es cloro.

En una realización preferida, R1 y R2 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o metilo. Más preferiblemente, R1 y R2 son hidrógeno.

30 En otra realización preferida, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o halógeno. Más preferiblemente R4 es un halógeno y aún más preferiblemente R3, R5 y R6 son hidrógeno. En una realización aún más preferida, R4 es Cl.

35 En otra realización preferida, R7, R8, R9, R10 y R11 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o metilo. Más preferiblemente R7, R8, R9, R10 y R11 son hidrógeno.

En una realización más preferida el compuesto de fórmula general (I) es N-(4-cloro-2-nitrofenil)- N’-fenilurea:

Los compuestos de la invención pueden presentarse en forma de sales farmacéuticamente aceptables, solvatos o esteroisómeros.

45 El término "sales farmacéuticamente aceptables, solvatos o estereoisómeros" se refiere a cualquier sal farmacéutica, éster, solvato o cualquier otro compuesto que, siendo administrado a un receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto descrito en el presente documento. Sin embargo se observará que las sales farmacéuticamente inaceptables están también en el ámbito de la invención ya que estas últimas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, estereoisómeros y derivados pueden ser llevadas a cabo por medio de métodos conocidos en la materia.

Otro aspecto de la presente invención se refiera una composición farmacéutica que comprende el compuesto N-(4cloro-2-nitrofenil)- N’-fenilurea, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Dicha composición se pueden utilizar junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, ser provistos en una forma de una composición separada para su administración simultanea o no, con la composición farmacéutica que comprende un compuesto de de la invención. Por tanto, la composición farmacéutica de la invención puede comprender además otro principio activo.

Los “vehículos farmacéuticamente aceptables” que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos

conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.

Las formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral incluyen cualquier composición sólida (tabletas, pastillas, cápsulas, formas granuladas, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, etc.) y pueden contener excipientes convencionales conocidos en la materia.

Los compuestos descritos en esta invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros y/o solvatos, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen, pueden ser administrados de forma oral o parenteral. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intratecal o intraósea pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral. La administración puede ser también sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.

A lo largo de la presente descripción, el término “tratamiento” se refiere a eliminar, reducir o disminuir la causa o efectos de la enfermedad. Para los propósitos de esta invención, tratamiento incluye, aunque sin quedar limitados a los mismos, aliviar, disminuir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad; reducir el grado de enfermedad, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, aliviar o mejorar el estado de la enfermedad y remitir (ya sea total o parcial).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1 Muestra la fluorescencia de tioflavina asociada a la agregación del péptido en presencia y ausencia del compuesto. u.a. es unidades arbitrarias.

Fig. 2. Representa el incremento de dispersión de luz en solución asociado a agregación del péptido en presencia del compuesto.

Fig. 3. Muestra las imágenes por microscopía electrónica de la formación de fibras amiloides en distintas condiciones: control negativo: en ausencia de péptido A1 control positivo: péptido A1 (17-40) a concentración 50 μM, compuesto: péptido A1 (17-40) a concentración 50 μM + compuesto a una concentración100 μM.

Fig. 4. Muestra la viabilidad celular de células humanas de neuroblastoma y células HeLa mediante un ensayo con XTT. MCC es concentración mínima citotóxica.

Fig. 5. Muestra la supervivencia celular en levadura relacionada con la inhibición de la agregación del péptido A1 (142). Las barras se refieren a ensayos equivalentes realizados en presencia de 10 !M (columna negra) y 20 !M (columna blanca) de MTX (metotrexato), el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR).

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.

En todos los ejemplos se ha utilizado el compuesto N-(4-cloro-2-nitrofenil)- N’-fenilurea (en adelante llamado compuesto o C3), disponible comercialmente (Maybridge, Thermo Fisher Scientific) y con una pureza mayor al 90 %.

Como se demuestra en los ejemplos, el compuesto inhibe fuertemente la agregación del péptido A1 humano. Se han realizado tres ensayos secuenciales in vitro que cuantifican el grado de agregación del péptido A1 (fragmento 1740).

Ejemplo 1

El primer ensayo se llevó a cabo como está descrito en LeVine, Protein Sci, 1993. 2(3): p. 404-10. Este ensayo monitoriza la fluorescencia de tioflavina (excitación a 450nm y emisión a 500nm) , medido en un, asociada a la agregación del péptido A1 (fragmento 17-40) y compara la agregación de dicho péptido que tiene lugar en ausencia y en presencia del compuesto C3 (Fig. 1).

El compuesto se adquirió liofilizado y fue resuspendido en DMSO 100% a una concentración stock 4 mM y posteriormente diluido en PBS hasta una concentración final 100 μM. Todas las muestras contenian 6,5!M de tioflavina, la muestra de control positiva de agregación (A1), que además contenía 50 !M del péptido, y la muestra de control negativo de agregación (no A1) y la muestra con el compuesto (6,5!M de tioflavina +50 !M del péptido

+100 μM del compuesto).

La fluorescencia de la tioflavina fue medida usando un fluorómetro FluoDia T 70 (Photal) con una longitud de onda de excitación y emisión de 450 y 500 nm, respectivamente.

La cinética de agregación se llevó a cabo a 37ºC durante 13 horas. Las se realizaron cada 153 segundos con un paso de agitación de 3 segundos antes de cada medida.

Como se observa en la figura 1, el compuesto disminuye la fluorescencia de tioflavina y por tanto la agregación del péptido A1.

Ejemplo 2

El segundo ensayo monitoriza el incremento de dispersión de luz en solución asociado a agregación del péptido A1 (fragmento 17-40) en presencia del compuesto C3 (Fig. 2). La presencia de este compuesto impide la formación de las fibras amiloides.

El péptido A117-40 se resuspendió en una solución de NH4OH al 0,02% hasta obtener una solución stock 500 μM, posteriormente fue centrifugado a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos a 4º C, y diluido en una solución de tampón fosfato (PBS) hasta una concentración final 50 μM. A la solución del péptido A117-40 fue adicionado el compuesto a una concentración final 100 μM, el cual previamente había sido resuspendido en DMSO 100% (concentración stock

del compuesto de 20 mM).

El valor de absorbancia a 360 nM, fue analizado cada 30 minutos durante 8 horas y comparado con el control negativo, el cual es una muestra de NH4OH al 0,002%, DMSO 0,5% y PBS, y el control positivo, el cual es una muestra del péptido A117-40 50 μM en PBS y DMSO 0,5%.

El ensayo se llevo a cabo utilizando un espectrofotómetro Varian Cary 100 Bio, y cubetas de cuarzo Hellma 104QS de 10 mm de paso de luz. Este ensayo permite cuantificar y confirmar el efecto inhibidor de la formación de fibras amiloides que presenta el compuesto, ya que en una muestra donde ocurre el proceso de agregación (control positivo), los valores de absorbancia incrementan proporcionalmente a la formación de agregados amiloides en el tiempo.

Ejemplo 3

El tercer ensayo permite visualizar directamente la formación de fibras amiloides (o la ausencia de formación en presencia del compuesto) por microscopía electrónica (Fig. 3). Como muestra la figura 3, el compuesto redujo significativamente la formación de fibras amiloides.

Como control negativo (no A1) se empleó NH40H al 0,002%, DMSO 0,5% y PBS. Como control positivo (A1) se empleó el péptido A1 (17-40) 50 μM, PBS y DMSO 0,5%. El péptido A1 solución de NH4OH 0,02% a una concentración inicial 500 μM, centrifugado a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos a 4º C y posteriormente diluido en solución PBS hasta obtener una concentración 50 μM, el cual fue incubado durante 24 horas a 37º C en presencia del compuesto , el cual estaba a una concentración final 100 μM (y que había sido

previamente resuspendido en DMSO 100%, solución stock 20 mM).

Para la observación de las muestras (control positivo, control negativo y péptido A1 incubado con el compuesto), se realizó el siguiente procedimiento: sobre una rejilla de cobre se adicionaron 10 μl de la muestra, que se dejó reposar 5 minutos, se retiró el exceso de muestra con ayuda de una tira de papel Watman, se adicionaron 10 μl del colorante Acetato de Uranilo, el cual se dejó actuar durante 1 minuto. Posteriormente, se retiró el exceso de colorante y las rejillas se dejaron secando a 37º C para su posterior observación en un microscopio electrónico HITACHI H-7000 a 75 kV.

Ejemplo 4

La toxicidad del compuesto hacia células humanas de neuroblastoma SH-SY5Y y células HeLa se determinó por ensayo con el compuesto XTT. El compuesto muestra una toxicidad razonablemente baja a juzgar por su Concentración Mínima Citotóxica (MCC) (Fig. 4).

Las células se cultivaron en DMEM con rojo fenol, suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 μg /ml de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. El cultivo se mantuvo a 37º C en una atmósfera de 5% de CO2. Las células fueron cultivadas en frascos de cultivo de 25 ml y subcultivadas cada 3 días. Para evaluar la toxicidad del compuesto en células HeLa, las células fueron cultivadas en placas de 96 pocillos. Se sembraron 3 x 104 células por pocillo en 100 μl de medio durante 24 horas. Posteriormente, las células fueron incubadas con el compuesto a diferentes concentraciones, como muestra la figura

4.

A las 24 horas de incubación con el compuesto, la viabilidad celular fue determinada utilizando el compuesto 2,3bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenil-amino)carbonil]- 2H-hidróxido de tetrazolio (XTT) (Cell Proliferation Kit II, Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del periodo de incubación de 24 horas, el medio de

cultivo es remplazado por medio DMEM sin rojo fenol y 50 μl del reactivo XTT se añaden a cada pocillo. Las placas

de cultivo se incuban nuevamente durante 4 horas a 37º C a una atmosfera de 5% de CO2. Posteriormente, la densidad óptica fue leída a 450 nm, con una longitud de onda de referencia de 650 nm, usando un lector de placas. Los valores obtenidos con controles no tratados se consideraron como 100% de viabilidad. La concentración mínima citotóxica (MCC) fue calculada por ajuste de los valores de viabilidad a cada concentración del compuesto evaluada, utilizando una función dosis-respuesta con una pendiente variable, utilizando el software Origin Pro ® 8 (Northampton, USA).

Ejemplo 5

La capacidad del compuesto de inhibir la agregación del péptido A1 (1-42) expresado en células de levadura ha sido determinada usando un ensayo que relaciona supervivencia celular con inhibición de la agregación de A1 como se describe en Morell, et al., Mol. BioSyst., 2011, 7, 1121-1128. El compuesto aumenta la supervivencia de las células de levadura Saccharomyces Cerevisiae, de manera dosis dependiente, inhibiendo la agregación intracelular del péptido A1 (1-42) (Fig. 5).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un compuesto de fórmula general (I):

(I)

donde: R1 y R2 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C4);

10 R3, R4, R5 y R6 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno, halógeno o un grupo alquilo (C1-C4) y donde al menos uno de ellos es un halógeno; y R7, R8, R9, R10 y R11 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno, halógeno o un grupo alquilo (C1-C4);

15 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
2. Uso según la reivindicación anterior, donde R1 y R2 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o metilo.

20 3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R1 y R2 son hidrógeno.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R3, R4, R5 y R6 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o halógeno.

25 5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R4 es un halógeno.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, donde el halógeno es Cl.
7.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R3, R5 y R6 son hidrógeno. 30
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R7, R8, R9, R10 y R11 se seleccionan, de manera independiente, entre hidrógeno o metilo.
9.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R7, R8, R9, R10 y R11 son hidrógeno. 35
10.

Uso según la reivindicación 1, donde el compuesto es N-(4-cloro-2-nitrofenil)-N’-fenilurea.
11.

Composición farmacéutica que comprende el compuesto N-(4-cloro-2-nitrofenil)- N’-fenilurea, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

0 2 4 6 8101214

T (h)

Fig. 1

Fig. 2

no Aβ

Fig. 3

Fig. 4 Fig. 5