ES2924950T3 - Novedosos compuestos para el tratamiento, alivio o prevención de trastornos asociados con los agregados Tau - Google Patents

Novedosos compuestos para el tratamiento, alivio o prevención de trastornos asociados con los agregados Tau Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos novedosos que pueden emplearse en el tratamiento, alivio o prevención de un grupo de trastornos y anomalías asociados con los agregados de proteína Tau (unidad asociada a tubulina), incluidos, entre otros, ovillos neurofibrilares (NFT), tales como Enfermedad de Alzheimer (EA). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Novedosos compuestos para el tratamiento, alivio o prevención de trastornos asociados con los agregados Tau
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos novedosos que pueden emplearse en el tratamiento, alivio o prevención de un grupo de trastornos y anormalidades asociadas a los agregados de la proteína Tau (unidad asociada a la tubulina), incluyendo, pero sin limitarse a, los Ovillos Neurofibrilares (NFT), tales como la enfermedad de Alzheimer (EA).
Antecedentes de la invención
Muchas enfermedades del envejecimiento se basan o se asocian a depósitos extracelulares o intracelulares de amiloide o de proteínas similares al amiloide que contribuyen a la patogénesis así como a la progresión de la enfermedad. La proteína amiloide mejor caracterizada que forma agregados extracelulares es la beta amiloide (Ap). Otros ejemplos de proteínas amiloides que forman agregados extracelulares son el prión, la ATTR (transtiretina) o la ADan (ADanPP). Las proteínas similares a los amiloides, que forman principalmente agregados intracelulares, incluyen, pero no se limitan a la Tau, la alfa-sinucleína, la proteína de unión al a Dn TAR 43 (TDP-43) y la huntingtina (htt). Las enfermedades en las que intervienen los agregados de Tau suelen denominarse tauopatías, como la EA.
Los depósitos amiloides o similares a los amiloides son el resultado de un plegamiento erróneo de las proteínas seguido de una agregación que da lugar a conjuntos de láminas p en los que múltiples péptidos o proteínas se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno intermoleculares. Aunque las proteínas amiloides o similares a las amiloides tienen diferentes secuencias de aminoácidos primarias, sus depósitos suelen contener muchos componentes moleculares compartidos, en particular la presencia de estructuras cuaternarias de lámina p. La asociación entre los depósitos de amiloide y las enfermedades sigue siendo poco clara. Se ha descubierto que una gran variedad de agregados proteicos, tanto los asociados como los no asociados a patologías, son tóxicos, lo que sugiere que las características moleculares comunes del amiloide están implicadas o son responsables del inicio de la enfermedad (Bucciantini et al., Nature, 2002, 416, 507-11). También se han asociado a la toxicidad varios multímeros de péptidos o proteínas agregados en forma de lámina p, desde dímeros hasta oligómeros solubles de bajo peso molecular, protofibrillas o depósitos fibrilares insolubles.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurológico que se cree que está causado principalmente por las placas amiloides, una acumulación extracelular de depósitos anormales de agregados (amiloide-beta) Ap en el cerebro. Las otras características neuropatológicas principales de la EA son los ovillos neurofibrilares (NFT) intracelulares que se originan por la agregación de la proteína Tau hiperfosforilada, plegamiento erróneo de Tau o Tau patológica y sus conformadores. La EA comparte su etiopatología con muchas tauopatías neurodegenerativas, en particular con determinados tipos de demencia frontotemporal (DFT). La proteína Tau es una proteína libremente soluble y "naturalmente desplegada" que se une ávidamente a los microtúbulos (MT) para promover su ensamblaje y estabilidad. Los MT son de gran importancia para la integridad del citoesqueleto de las neuronas y, por tanto, para la correcta formación y funcionamiento de los circuitos neuronales y, por ende, para el aprendizaje y la memoria. La unión de Tau a MT está controlada por la fosforilación y desfosforilación dinámicas, como se ha demostrado principalmente in vitro y en células no neuronales. En el cerebro de la EA, la patología de Tau (tauopatía) se desarrolla más tarde que la patología amiloide, pero todavía se discute de forma controvertida si la proteína Ap es el agente causante de la EA, lo que constituye la esencia de la llamada hipótesis de la cascada amiloide (Hardy et al., Science 1992, 256, 184-185 Musiek et al., Nature Neurosciences 2015, 18(6), 800-806). Los mecanismos exactos que relacionan el amiloide con la patología de Tau siguen siendo en gran medida desconocidos, pero se propone que implican la activación de vías de señalización neuronal que actúan sobre o por GSK3 y cdk5 como las principales "Tau-quinasas" (Muyllaert et al., Rev. Neurol. (París), 2006, 162, 903-7 Muyllaert et al., Genes Brain and Behav. 2008, Suppl 1, 57-66). Aunque la tauopatía se desarrolle más tarde que el amiloide, no es sólo un efecto secundario inocente, sino un importante ejecutor patológico en la EA. En modelos experimentales de ratón, los defectos cognitivos causados por la patología amiloide se alivian casi por completo con la ausencia de la proteína Tau (Roberson et al., Science, 2007, 316(5825), 750-4) y la gravedad de la disfunción cognitiva y la demencia se correlaciona con la tauopatía, no con la patología amiloide.
Las enfermedades que implican agregados de Tau suelen denominarse tauopatías e incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Alzheimer (EA), la EA familiar, la PART (Tauopatía primaria relacionada con la edad), la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, la demencia pugilística, el síndrome de Down, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), la miositis por cuerpos de inclusión, la angiopatía amiloide cerebral por proteínas priónicas, la lesión cerebral traumática (LCT), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad de las neuronas motoras no guamaniana con ovillos neurofibrilares, enfermedad de los granos argirófilos, degeneración corticobasal (CDB), ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17), enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia multisistémica (AMS), enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración pálido-ponto-nigral, enfermedad de Pick (PiD), gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva (PSP), panencefalitis esclerosante subaguda, demencia con predominio de ovillos, parkinsonismo postencefalítico, distrofia miotónica, panencefalopatía esclerosante subaguda, mutaciones en LRRK2, encefalopatía traumática crónica (ETC), demencia familiar británica, demencia familiar danesa, otras degeneraciones lobulares frontotemporales, Parkinsonismo guadalupano, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, retraso mental relacionado con SLC9A6, tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares, epilepsia, demencia por cuerpos de Lewy (DCL), deterioro cognitivo leve (DCL), esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el VIH, diabetes de inicio en la edad adulta, amiloidosis cardíaca senil, glaucoma, accidente cerebrovascular isquémico, psicosis en la EA y enfermedad de Huntington. (Williams et al., Intern. Med. J., 2006, 36, 652-60 Kovacs et al., J Neuropathol Exp Neurol. 2008; 67(10): 963-975 Higuchi et al., Neuropsicofarmacología - kinasa: 1339-1354 Hilton et al., Acta Neuropathol. 1995;90(1):101-6 Iqbal et al., Biochimica et Biophysica Acta 1739 (2005) 198-210 McQuaid et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 1994 Abr;20(2):103-10 Vossel et al., Lancet Neurol 2017; 16: 311-22 Stephan et al., Molecular Psychiatry (2012) 17, 1056-1076 Anderson et al., Brain (2008), 131, 1736-1748 Savica et al., JAMA Neurol. 2013;70(7):859-866 Brown et al. Molecular Neurodegeneration 2014, 9:40 El Khoury et al., Front. Celular. Neurosci, 2014, Volumen 8, Artículo22: 1-18 Tanskanen et al., Ann. Med.
2008;40(3):232-9 Gupta et al., CAN J OPHTHALMOL-VOL. 43, NO. 1, 2008: 53-60 Dickson etal., Int J Clin Exp Pathol 2010;3(1):1-23 Fernández-Nogales et al., Nature Medicine, 20, 881-885 (2014) Bi et al., Nature Communications volumen 8, número de artículo: 473 (2017) Murray et al., Biol Psychiatry. 2014 1 de abril; 75(7): 542-552).
De todos los agentes que se encuentran en ensayos clínicos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en 2017, los que se dirigen a Tau son muy escasos y representan solo el 8 % de los ensayos clínicos de fase II (Cummings et al., Alzheimer's & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions 3 (2017) 367-384). Los enfoques terapéuticos actuales que se dirigen a la proteína Tau comprenden principalmente enfoques basados en anticuerpos con la principal limitación de dirigirse sólo a la Tau extracelular. Entre los enfoques que utilizan moléculas pequeñas, se han desarrollado varios inhibidores de la quinasa Tau, a pesar de ser muy desafiantes con respecto a la toxicidad y la especificidad. Sin embargo, en la actualidad sólo se está probando un inhibidor de la quinasa, el nilotinib, en ensayos clínicos. Por último, entre los inhibidores de la agregación de Tau solo uno, el LMTX, se encuentra actualmente en ensayos clínicos (Cummings et al., 2017). Aunque en los últimos años, los tratamientos basados en Tau se han convertido en un punto de atención creciente, sigue habiendo una gran necesidad de agentes terapéuticos adicionales que se dirijan a los conformadores patológicos de Tau que se sabe o se presume que causan las tauopatías.
El documento WO2011/128455 se refiere a compuestos específicos que son adecuados para el tratamiento de trastornos asociados con proteínas amiloides o proteínas similares a las amiloides.
El documento WO2010/080253 se refiere a compuestos derivados de dipiridil-pirrol que son útiles en el tratamiento de enfermedades susceptibles de inhibición, regulación y/o modulación de la transducción de señales de la proteína quinasa.
Sumario de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar compuestos que puedan emplearse en el tratamiento, el alivio o la prevención de un grupo de trastornos y anormalidades asociados con los agregados de la proteína Tau, incluyendo, pero sin limitarse a, los NFT, como la enfermedad de Alzheimer (EA). Además, existe la necesidad en la técnica de compuestos que puedan utilizarse como agentes terapéuticos para (a) disminuir los agregados de Tau/NFTs reconociendo la Tau agregada y desagregando Tau, por ejemplo cambiando la conformación molecular de los agregados de Tau, y/o (b) prevenir la formación de agregados de Tau, y/o (c) interferir intracelularmente con los agregados de Tau, y/o (d) reducir el plegamiento erróneo y la hiperfosforilación de Tau in vivo y/o (f) reducir los marcadores neuroinflamatorios. Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que estos objetos pueden ser alcanzados por los compuestos de fórmula (I) como se describe a continuación.
Los compuestos de fórmula (I) (a) muestran una alta capacidad para disminuir los agregados de Tau mediante el reconocimiento de la Tau agregada y la desagregación de Tau, por ejemplo, cambiando la conformación molecular de los agregados de Tau y/o, (b) impiden la formación de agregados de Tau, y/o (c) interfieren intracelularmente con los agregados de Tau, y/o (d) reducen el plegamiento erróneo y la hiperfosforilación de Tau in vivo y/o (f) reducen los marcadores neuroinflamatorios. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se supone que los compuestos de fórmula (I) inhiben la agregación de Tau o desagregan los agregados de Tau preformados, incluso cuando están presentes intracelularmente. Debido a sus características de diseño únicas, estos compuestos presentan propiedades como la lipofilicidad y el peso molecular adecuados, la captación cerebral y la farmacocinética, la permeabilidad celular, la solubilidad y la estabilidad metabólica, con el fin de ser un medicamento exitoso para el tratamiento, el alivio o la prevención de las tauopatías.
Se ha demostrado que la acumulación de lesiones de Tau NFT se correlaciona bien con los déficits cognitivos en la EA, tanto a través de análisis histopatológicos como a través de imágenes Tau PET in vivo . Los compuestos de esta invención pueden prevenir la formación de agregados de Tau, o disgregar los agregados de Tau preexistentes y, por lo tanto, se puede esperar que prevengan o reduzcan los déficits cognitivos asociados en la EA.
Los análisis ultraestructurales han demostrado que las inclusiones de Tau están compuestas por filamentos helicoidales pareados (PHF) o filamentos rectos (SF). Los análisis estructurales de alta resolución han demostrado que estos filamentos están compuestos por una región central que comprende los aminoácidos 306-378 de Tau y que adapta una estructura de hélice beta/beta cruzada. Los compuestos de esta invención pueden reconocer la Tau agregada y disgregarla, por ejemplo, cambiando la conformación molecular del agregado de Tau, y por lo tanto se puede esperar que faciliten la eliminación de Tau.
Además, se ha demostrado que Tau es capaz de propagarse de célula a célula y que ciertas formas de Tau (que actúan como semillas) son capaces de inducir el cambio estructural de la proteína Tau nativa dentro de la célula sana para que sufra un plegamiento erróneo y agregación. Se considera que la Tau agregada es responsable de la siembra y, por tanto, de la propagación de la patología Tau. Los compuestos de esta invención pueden interferir intracelularmente con la Tau agregada y, por lo tanto, se puede esperar que reduzcan la propagación de la patología de Tau y, finalmente, prevengan o reduzcan los déficits cognitivos asociados en la EA.
La cascada de agregación de Tau se inicia con el plegamiento erróneo y la hiperfosforilación de Tau. Se cree que estos acontecimientos preceden a la formación de las inclusiones neuronales intracelulares de Tau y, por tanto, al establecimiento y propagación de la patología de Tau. Los compuestos de esta invención pueden reducir el plegamiento erróneo de Tau y la hiperfosforilación in vivo y, por lo tanto, se puede esperar que sean beneficiosos para tratar, aliviar o prevenir las enfermedades asociadas con la patología de Tau.
Por último, la relación entre la patología de Tau y la neuroinflamación está ahora bien establecida. La neuroinflamación es un evento clave ya en las primeras etapas de la EA y se cree que es una de las causas que desencadenan la agregación de Tau en la FPH. Además, varios modelos de ratón con tauopatía mostraron una neuroinflamación significativa una vez que la patología de Tau está bien establecida en el cerebro, lo que indica que la patología de Tau también puede inducir un proceso neuroinflamatorio. Estos dos hallazgos indican que la patología de Tau y la neuroinflamación están vinculadas en un bucle de retroalimentación positiva. Los compuestos de esta invención reducen los marcadores neuroinflamatorios en el concurso de la patología Tau.
La presente invención divulga compuestos novedosos de fórmula (I) que tienen capacidad para (a) disminuir los agregados de Tau, reconocer la Tau agregada y desagregarla, por ejemplo cambiando la conformación molecular de los agregados de Tau y/o, (b) prevenir la formación de agregados de Tau, y/o (c) interferir intracelularmente con los agregados de Tau, y/o (d) reducir el plegamiento erróneo y la hiperfosforilación de Tau in vivo y/o (f) reducir los marcadores neuroinflamatorios.
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se resume en los siguientes puntos:
1. Un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000004_0001
y todos los estereoisómeros. mezclas racémicas. tautómeros. sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos, en los que
B se selecciona del grupo que consiste en O y NRa;
E es N y V es S, E es S y V es N, E es N y V es O o E es O y V es N;
X se selecciona del grupo que consiste en N-R6 y HC-N(Me)2 ;
R se selecciona independientemente del grupo que consiste en
y
Figure imgf000004_0002
Ra se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo;
R6 es alquilo;
2. El compuesto según el punto 1, que es un compuesto de fórmula (la):
Figure imgf000005_0001
3. El compuesto según el punto 1, que es un compuesto de fórmula (Ib):
Figure imgf000005_0002
donde B, R y R6 son como se definen en el punto 1.
4. El compuesto según el punto 1, que es un compuesto de fórmula (Ic):
Figure imgf000005_0003
donde B y R son como se definen en el punto 1.
5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como el definido en uno cualquiera de los puntos 1 a 4 y opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. El compuesto definido en uno cualquiera de los puntos 1 a 4 para su uso como medicamento.
7. El compuesto definido en uno cualquiera de los puntos 1 a 4 para su uso en el tratamiento, el alivio o la prevención de un trastorno o una anomalía asociada a los agregados de la proteína Tau.
8. Una mezcla que comprende un compuesto como el definido en uno cualquiera de los puntos 1 a 4 y al menos otro compuesto biológicamente activo seleccionado entre un agente terapéutico diferente del compuesto definido en uno cualquiera de los puntos 1 a 4, un portador farmacéuticamente aceptable, un diluyente y un excipiente.
9. La mezcla según el punto 8, en la que el compuesto biológicamente activo adicional es un compuesto utilizado en el tratamiento de la amiloidosis.
10. La mezcla según el punto 8 o 9, en la que el compuesto biológicamente activo adicional se selecciona del grupo que consiste en compuestos contra el estrés oxidativo, compuestos antiapoptóticos, quelantes de metales, inhibidores de la reparación del ADN como pirenzepina y metabolitos, ácido 3-amino-1-propanosulfónico (3APS), 1,3-propanodisulfonato (1,3PDS), activadores de a-secretasa, inhibidores de p- y Y-secretasa, proteínas Tau, neurotransmisores, rompedores de lámina p, atrayentes para el aclaramiento de la beta amiloide / componentes celulares agotadores, inhibidores de la beta amiloide truncada N-terminal, incluyendo la beta amiloide piroglutamada 3-42, moléculas antiinflamatorias, o inhibidores de la colinesterasa (ChEls) como la tacrina, rivastigmina, donepezilo y/o galantamina, agonistas M1, otros fármacos incluyendo cualquier fármaco modificador del amiloide o Tau y suplementos nutritivos, un anticuerpo, incluyendo cualquier anticuerpo funcionalmente equivalente o partes funcionales del mismo o una vacuna.
11. El compuesto para uso según el punto 7, en el que el trastorno se selecciona entre la enfermedad de Alzheimer (EA), la eA familiar, la tauopatía primaria relacionada con la edad (PART), la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, la demencia pugilística, el síndrome de Down, Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), miositis por cuerpos de inclusión, angiopatía amiloide cerebral por proteínas priónicas, lesión cerebral traumática (TBI), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad de las neuronas motoras no guamaniana con ovillos neurofibrilares, enfermedad de los granos argirófilos, degeneración corticobasal (DCB), ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17), Enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia multisistémica (AMS), enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración pálido-ponto-nigral, enfermedad de Pick (PiD), gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva (PSP), panencefalitis esclerosante subaguda, demencia con predominio de ovillos, parkinsonismo postencefalítico, distrofia miotónica, panencefalopatía esclerosante subaguda, mutaciones en LRRK2, encefalopatía traumática crónica (ETC), demencia familiar británica, demencia familiar danesa, otras degeneraciones lobares frontotemporales, parkinsonismo guadalupano, neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral, retraso mental relacionado con SLC9A6, tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares, epilepsia, demencia por cuerpos de Lewy (DCL), deterioro cognitivo leve (DCL), esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el VIH, diabetes del adulto, amiloidosis cardíaca senil, glaucoma, accidente cerebrovascular isquémico, psicosis en la EA y la enfermedad de Huntington, preferentemente la enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración corticobasal (DCB), la enfermedad de Pick (EP) y la parálisis supranuclear progresiva (PSP).
12. Uso del compuesto definido en cualquiera de los puntos 1 a 4 como referencia analítica o herramienta de cribado in v itro .
Definiciones
En el sentido de la presente solicitud, se aplican las siguientes definiciones:
"Alquilo" se refiere a una fracción orgánica saturada, recta o ramificada, formada por átomos de carbono e hidrógeno. Los ejemplos de grupos alquilos adecuados tienen de 1 a 6 átomos de carbono, preferentemente de 1 a 4 átomos de carbono, e incluyen el metilo, el etilo, el propilo, el isopropilo, el n-butilo, el t-butilo y el isobutilo.
Los compuestos de la presente invención que tienen uno o más carbonos ópticamente activos pueden existir como racematos y mezclas racémicas (incluyendo mezclas en todas las relaciones), estereoisómeros (incluyendo mezclas diastereoméricas y diastereómeros individuales, mezclas enantioméricas y enantiómeros individuales, mezclas de conformadores y conformadores individuales), tautómeros, atropisómeros y rotámeros. Los compuestos descritos en esta invención que contienen dobles enlaces olefínicos incluyen isómeros geométricos E y Z. También se incluyen en esta invención todas las sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables.
El término "polimorfos" se refiere a las diversas estructuras cristalinas de los compuestos de la presente invención. Esto puede incluir, pero no se limita a, las morfologías de los cristales (y los materiales amorfos) y todas las formas de la red cristalina. Las sales de la presente invención pueden ser cristalinas y pueden existir como más de un polimorfo.
Los solvatos, los hidratos y las formas anhidras de la sal también se incluyen en la invención. El disolvente incluido en los solvatos no está particularmente limitado y puede ser cualquier disolvente farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos son el agua y los alcoholes C1-4 (tales como el metanol o el etanol).
Las "sales farmacéuticamente aceptables" se definen como derivados de los compuestos divulgados en los que el compuesto madre se modifica haciendo sales ácidas o básicas del mismo. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales minerales o de ácidos orgánicos de residuos básicos como las aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos como los ácidos carboxílicos; y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales convencionales no tóxicas o las sales de amonio cuaternario del compuesto madre formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales convencionales no tóxicas incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como, pero no limitadas a, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como, pero no limitados a, acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maleico hidroximaléico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etano disulfónico, oxálico, isetiónico y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden sintetizarse a partir del compuesto madre que contiene una fracción básica o ácida mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, dichas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas libres de ácido o base de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de ambos. Los disolventes orgánicos incluyen, pero no se limitan a, medios no acuosos como éteres, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, p. 1445, cuya divulgación se incorpora por referencia. Tal como se utiliza en lo sucesivo en la descripción de la invención y en las reivindicaciones, el término "profármaco" significa cualquier compuesto unido covalentemente que libera el fármaco padre activo debido a la biotransformación in vivo .
(Referencia a Goodman and Gilman (The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8 ed, McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, "Biotransformation of Drugs", p 13-15)).
"Farmacéuticamente aceptable" se define como aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
Los pacientes o sujetos de la presente invención son típicamente animales, particularmente mamíferos, más particularmente humanos.
"Tau", tal como se utiliza aquí, se refiere a una proteína de unión a microtúbulos altamente soluble que se encuentra principalmente en las neuronas e incluye las 6 isoformas principales, las formas escindidas o truncadas y otras formas modificadas, como las que surgen de la fosforilación, la glicosilación, la glicación, la isomerización de prolilos, la nitración, la acetilación, la poliaminación, la ubiquitinación, la sumoilación y la oxidación.
"Tau agregada" se refiere a monómeros agregados de péptidos o proteínas Tau que se pliegan en las estructuras oligoméricas o poliméricas.
Los "Ovillos Neurofibrilares" (NFTs), tal y como se utilizan aquí, se refieren a agregados insolubles de la proteína Tau hiperfosforilada que contienen filamentos helicoidales pareados (PHF) y filamentos rectos. Su presencia es un rasgo distintivo de la EAy de otras enfermedades conocidas como tauopatías. Las definiciones y las definiciones preferidas que figuran en la sección "Definición" se aplican a todas las realizaciones descritas a continuación, a menos que se indique lo contrario.
Descripción de las Figuras
Figura 1: Prueba de comportamiento de Morris Water Mazer en ratones rTg4510 tratados con el Ejemplo 1 y el Ejemplo 12.
Figura 2: Cuantificación de la atrofia del córtex (A) y del plegamiento erróneo de Tau (B) en ratones rTg4510 tratados con el Ejemplo 1 y el Ejemplo 12.
Figura 3: Cuantificación de CD68 en ratones rTg4510 tratados con el Ejemplo 1 y el Ejemplo 12.
Figura 4: Prueba de comportamiento Morris Water Mazer en ratones rTg4510 tratados con el Ejemplo 2.
Figura 5: Cuantificación de Tau insoluble en sarkosilo en ratones rTg4510 tratados con el Ejemplo 2.
Figura 6: Atrofia de la corteza (A) y cuantificación de microglía positiva a Iba1 (B) en ratones rTg4510 tratados con el Ejemplo 2.
Descripción detallada de la invención
Los compuestos de la presente invención se describirán a continuación. Debe entenderse que también se contemplan todas las combinaciones posibles de las siguientes definiciones.
En una realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I):
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y todos los estereoisómeros, mezclas racémicas, tautómeros, sales farmacéuticamente aceptables, hidratos y solvatos de los mismos.
Una realización preferida del compuesto de fórmula (I) es
Figure imgf000008_0001
Otra realización preferida
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Las siguientes definiciones se aplican a la fórmula (I) y a sus realizaciones preferidas, según corresponda.
B se selecciona del grupo que consiste en O y NRa. Más preferentemente B es NRa, más preferentemente NMe. E es N y V es S, E es S y V es N, E es N y V es O o E es O y V es N. Esto significa que los siguientes grupos pueden estar presentes en el compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000008_0004
Más preferentemente E es N y V es S o E es N y V es O. Aún más preferentemente E es N y V es S. X se selecciona del grupo que consiste en N-R6 y HC-N(Me)2 ; . En una realización, X es N-R6. En otra realización, X es HC-N(Me)2. En una realización preferida, X es
Figure imgf000008_0005
o HC-N(Me) 2 ;, aún más preferentemente HC-N(Me)2 ; . R se selecciona independientemente del grupo que consiste en
y
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, preferentemente R es
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Ra se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo, más preferentemente H y Me, incluso más preferentemente Me.
R6 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo, más preferentemente alquilo, aún más preferentemente isopropilo.
Los compuestos preferidos también se ilustran en los ejemplos.
Cualquier combinación de las realizaciones, las realizaciones preferidas y las realizaciones más preferidas divulgadas en el presente documento también se contempla en la presente invención.
Composiciones farmacéuticas
Aunque es posible que los compuestos de la presente invención se administren solos, es preferible formularlos en una composición farmacéutica de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar. Así, la invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) opcionalmente en mezcla con un portador, diluyente, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en el arte farmacéutico y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1975). El excipiente farmacéutico puede seleccionarse teniendo en cuenta la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica habitual. El excipiente debe ser aceptable en el sentido de no ser perjudicial para el receptor del mismo.
Los excipientes farmacéuticamente útiles que pueden utilizarse en la formulación de la composición farmacéutica de la presente invención pueden comprender, por ejemplo, portadores, vehículos, diluyentes, disolventes como alcoholes monohídricos como el etanol isopropanol y alcoholes polihídricos como los glicoles y aceites comestibles como el aceite de soja, el aceite de coco, el aceite de oliva, el aceite de cártamo y el aceite de semilla de algodón, ésteres oleosos como el oleato de etilo, el miristato de isopropilo, aglutinantes, adyuvantes, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores, desintegrantes, deslizantes, agentes lubricantes, agentes tamponadores, emulsionantes, agentes humectantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, colorantes, aromas, agentes de recubrimiento, conservantes, antioxidantes, agentes de procesamiento, modificadores y potenciadores de la administración del fármaco como el fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, monosacáridos, disacáridos, almidón, gelatina, celulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, dextrosa, hidroxipropil-p-ciclodextrina, polivinilpirrolidona, ceras de baja fusión y resinas de intercambio iónico.
Las vías de administración (suministro) de los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, una o más de las siguientes: oral (por ejemplo, en forma de comprimido, cápsula o como solución ingerible), tópica, mucosa (por ejemplo, como aerosol nasal o para inhalación), nasal, parenteral (por ejemplo, en forma inyectable). mediante una forma inyectable), gastrointestinal, intraespinal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina, intraocular, intradérmica, intracraneal, intratraqueal, intravaginal, intracerebroventricular, intracerebral, subcutánea, oftálmica (incluida la intravítrea o intracameral), transdérmica, rectal, bucal, epidural y sublingual.
Por ejemplo, los compuestos pueden administrarse por vía oral en forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes saborizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retardada, modificada, sostenida, pulsada o controlada.
Los comprimidos pueden contener excipientes como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina, desintegrantes como almidón (preferentemente de maíz, patata o tapioca) almidón glicolato de sodio, croscarmelosa sódica y ciertos silicatos complejos, y aglutinantes de granulación como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (Hp Mc ), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y acacia. Además, pueden incluirse agentes lubricantes como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco. Las composiciones sólidas de tipo similar también pueden emplearse como relleno en cápsulas de gelatina. Los excipientes preferidos a este respecto son la lactosa, el almidón, la celulosa, el azúcar de la leche o los polietilenglicoles de alto peso molecular. Para las suspensiones acuosas y/o elixires, el agente puede combinarse con diversos agentes edulcorantes o saborizantes, materias colorantes o tintes, con agentes emulsionantes y/o suspensores y con diluyentes como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.
Si los compuestos de la presente invención se administran por vía parenteral, entonces los ejemplos de dicha administración incluyen uno o más de los siguientes: administrar los compuestos por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intrasternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea; y/o utilizando técnicas de infusión. Para la administración parenteral, los compuestos se utilizan mejor en forma de solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para que la solución sea isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben estar convenientemente tamponadas (preferentemente a un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas en condiciones de esterilidad se realiza fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.
Como se ha indicado, los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía intranasal o por inhalación y se suministran convenientemente en forma de un inhalador de polvo seco o una presentación de aerosol desde un recipiente presurizado, bomba, aerosol o nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano como el 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA134AT) o el 1,1,2,3,3-heptafluoropropano (HFA227EA), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. El contenedor presurizado, la bomba, el aerosol o el nebulizador pueden contener una solución o suspensión del compuesto activo, por ejemplo, utilizando una mezcla de etanol y el propulsor como disolvente, que puede contener además un lubricante, por ejemplo, trioleato de sorbitán. Las cápsulas y los cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, como la lactosa o el almidón.
Alternativamente, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en forma de supositorio o pesario, o pueden aplicarse tópicamente en forma de gel, hidrogel, loción, solución, crema, pomada o polvo. Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse por vía dérmica o transdérmica, por ejemplo, mediante el uso de un parche cutáneo.
También pueden administrarse por vía pulmonar o rectal. También pueden administrarse por vía ocular. Para el uso oftálmico, los compuestos pueden formularse como suspensiones micronizadas en solución salina estéril isotónica con pH ajustado, o, preferentemente, como soluciones en solución salina estéril isotónica con pH ajustado, opcionalmente en combinación con un conservante como el cloruro de benzilalconio. Como alternativa, pueden formularse en una pomada como petrolato.
Para su aplicación tópica en la piel, los compuestos de la presente invención pueden formularse como una pomada adecuada que contenga el compuesto activo suspendido o disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o más de los siguientes: aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, cera emulsionante y agua. Alternativamente, pueden formularse como una loción o crema adecuada, suspendida o disuelta en, por ejemplo, una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de sorbitán, un polietilenglicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Normalmente, un médico determinará la dosificación real que será más adecuada para un sujeto individual. El nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier individuo en particular pueden ser variados y dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el modo y el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad de la condición particular, y el individuo sometido a la terapia.
Una dosis propuesta de los compuestos según la presente invención para su administración a un ser humano (de aproximadamente 70 kg de peso corporal) es de 0,1 mg a 1 g, preferentemente de 1 mg a 500 mg del principio activo por dosis unitaria. La dosis unitaria puede administrarse, por ejemplo, de 1 a 4 veces al día. La dosis dependerá de la vía de administración. Se apreciará que puede ser necesario hacer variaciones rutinarias a la dosis dependiendo de la edad y el peso del paciente, así como de la gravedad de la condición a tratar. La dosis precisa y la vía de administración quedarán, en última instancia, a discreción del médico o veterinario que lo atienda. Los compuestos de la invención también pueden utilizarse en combinación con otros agentes terapéuticos. Cuando un compuesto de la invención se utiliza en combinación con un segundo agente terapéutico activo contra la misma enfermedad, la dosis de cada compuesto puede diferir de la que se utiliza cuando el compuesto está solo.
Las combinaciones mencionadas anteriormente pueden presentarse convenientemente para su uso en forma de formulación farmacéutica. Los componentes individuales de dichas combinaciones pueden administrarse secuencial o simultáneamente en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas por cualquier vía conveniente. Cuando la administración es secuencial, se puede administrar primero el compuesto de la invención o el segundo agente terapéutico. Cuando la administración es simultánea, la combinación puede administrarse en la misma o en diferente composición farmacéutica. Cuando se combinan en la misma formulación, se aprecia que los dos compuestos deben ser estables y compatibles entre sí y con los demás componentes de la formulación. Cuando se formulan por separado, pueden proporcionarse en cualquier formulación conveniente, convenientemente de la manera que se conoce para tales compuestos en el arte.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden producirse de una manera conocida per se por el experto como se describe, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1975).
Las enfermedades o afecciones que pueden ser tratadas, aliviadas o prevenidas con los compuestos de la presente invención son trastornos o anormalidades asociadas con los agregados de la proteína Tau, como los trastornos neurodegenerativos. Ejemplos de enfermedades y afecciones que pueden ser tratadas, aliviadas o prevenidas son causadas poro asociadas con la formación de lesiones neurofibrilares. Esta es la patología cerebral predominante en la tauopatía. Las enfermedades y afecciones comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o afecciones neurodegenerativas que incluyen enfermedades o afecciones que muestran la coexistencia de patologías de Tau y amiloide.
Los ejemplos de las enfermedades y afecciones que pueden ser tratadas, aliviadas o prevenidas incluyen, pero no se limitan, a la enfermedad de Alzheimer (EA), la EA familiar, la PART (Tauopatía Primaria Relacionada con la Edad), la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, la demencia pugilística, el síndrome de Down, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), la miositis por inclusión, la angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica, la lesión cerebral traumática (TBI), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad de las neuronas motoras no guamaniana con ovillos neurofibrilares, enfermedad de los granos argirófilos, degeneración corticobasal (CDB), ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17), enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia multisistémica (AMS), enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración pálido-ponto-nigral, enfermedad de Pick (PiD), gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva (PSP), panencefalitis esclerosante subaguda, demencia con predominio de ovillos, parkinsonismo postencefalítico, distrofia miotónica, panencefalopatía esclerosante subaguda, mutaciones en LRRK2, encefalopatía traumática crónica (ETC), demencia familiar británica, demencia familiar danesa, otras degeneraciones lobulares frontotemporales, Parkinsonismo guadalupano, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, retraso mental relacionado con SLC9A6, tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares, epilepsia, demencia por cuerpos de Lewy (DCL), deterioro cognitivo leve (DCL), esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el VIH, diabetes de inicio en la edad adulta, amiloidosis cardíaca senil, glaucoma, accidente cerebrovascular isquémico, psicosis en la EA y enfermedad de Huntington. Preferentemente, las enfermedades y afecciones que pueden tratarse, aliviarse o prevenirse incluyen la enfermedad de Alzheimer (EA), así como otras tauopatías neurodegenerativas como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, la demencia pugilística, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de los granos argirófilos, la degeneración corticobasal (DCB) la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligada al cromosoma 17 (FTDP-17), la enfermedad de Pick (PiD), la parálisis supranuclear progresiva (PSP), la demencia con predominio de ovillos, el complejo de demencia de Parkinson de Guam, la enfermedad de Hallervorden-Spatz, la encefalopatía traumática crónica (ETC), el traumatismo craneoencefálico (TCE) y otras degeneraciones lobulares frontotemporales. Más preferentemente la enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración corticobasal (DCB), la enfermedad de Pick (EP) y la parálisis supranuclear progresiva (PSP).
Los compuestos de la presente invención también pueden emplearse para disminuir la agregación de proteínas, en particular la agregación de Tau. La capacidad de un compuesto para disminuir la agregación de Tau puede, por ejemplo, determinarse utilizando el ensayo ThT (Hudson et al., FEBS J., 2009, 5960-72).
Los compuestos de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de una amplia gama de trastornos en los que el proceso de neuroinflamación se asocia con el plegamiento erróneo y/o la agregación patológica de la proteína Tau.
Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse como una referencia analítica o una herramienta de cribado in vitro para la caracterización de tejidos con patología Tau y para el ensayo de compuestos dirigidos a la patología Tau en dichos tejidos.
Los compuestos según la presente invención también pueden proporcionarse en forma de mezcla con al menos otro compuesto biológicamente activo y/o un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente. El compuesto y/o el compuesto biológicamente activo adicional están preferentemente presentes en una cantidad terapéuticamente eficaz.
La naturaleza del compuesto biológicamente activo adicional dependerá del uso previsto de la mezcla. La sustancia o compuesto biológicamente activo adicional puede ejercer su efecto biológico por el mismo mecanismo o uno similar al del compuesto según la invención o por un mecanismo de acción no relacionado o por una multiplicidad de mecanismos de acción relacionados y/o no relacionados.
Generalmente, el compuesto biológicamente activo adicional puede incluir potenciadores de la transmisión neutrónica, fármacos psicoterapéuticos, inhibidores de la acetilcolinesterasa, bloqueadores de los canales de calcio, aminas biógenas, tranquilizantes con benzodiazepinas, potenciadores de la síntesis de acetilcolina, potenciadores de la síntesis, almacenamiento o liberación de acetilcolina, agonistas de los receptores postsinápticos de acetilcolina, inhibidores de la monoaminooxidasa A o B, antagonistas de los receptores de glutamato N-metil-D-aspartato, antiinflamatorios no esteroideos, antioxidantes y antagonistas de los receptores serotoninérgicos. En particular, el compuesto biológicamente activo adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en un compuesto utilizado en el tratamiento de la amiloidosis, compuestos contra el estrés oxidativo, compuestos antiapoptóticos, quelantes de metales inhibidores de la reparación del ADN, como la pirenzepina y sus metabolitos, el ácido 3-amino-1-propanosulfónico (3APS), el 1,3-propanodisulfonato (1,3PDS), activadores de la a-secretasa, inhibidores de la p -y ysecretasa, proteínas Tau, neurotransmisores, rompedores de la hoja p atrayentes para el aclaramiento de la beta amiloide / agotamiento de componentes celulares, inhibidores de la beta amiloide truncada N-terminal, incluyendo la beta amiloide piroglutamada 3-42, moléculas antiinflamatorias, o inhibidores de la colinesterasa (ChEls) como la tacrina, rivastigmina, donepezilo y/o galantamina, agonistas M1, otros fármacos, incluido cualquier fármaco modificador del amiloide o Tau y suplementos nutritivos, un anticuerpo, incluido cualquier anticuerpo funcionalmente equivalente o partes funcionales del mismo, o una vacuna.
En otra realización, las mezclas según la invención pueden comprender niacina o memantina junto con un compuesto según la presente invención y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente.
En otra realización de la invención se proporcionan mezclas que comprenden como un compuesto biológicamente activo adicional "antipsicóticos atípicos" como, por ejemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol u olanzapina para el tratamiento de síntomas psicóticos positivos y negativos, incluyendo alucinaciones, delirios, trastornos del pensamiento (que se manifiestan por una marcada incoherencia, descarrilamiento, tangencialidad) y comportamiento extraño o desorganizado, así como anhedonia, afecto aplanado, apatía y retraimiento social, junto con un compuesto según la invención y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente.
Otros compuestos que pueden utilizarse adecuadamente en mezclas en combinación con el compuesto según la presente invención se describen, por ejemplo, en WO 2004/058258 (véanse especialmente las páginas 16 y 17), incluidos los fármacos terapéuticos (páginas 36 a 39), los ácidos alcanosulfónicos y los ácidos alcanosulfúricos (páginas 39 a 51), los inhibidores de la colinesterasa (páginas 51 a 56) Antagonistas de los receptores NMDA (páginas 56 a 58), estrógenos (páginas 58 a 59), antiinflamatorios no esteroideos (páginas 60 y 61), antioxidantes (páginas 61 y 62), agonistas de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR) (páginas 63 a 67) agentes reductores del colesterol (páginas 68 a 75), inhibidores del amiloide (páginas 75 a 77), inhibidores de la formación de amiloide (páginas 77 a 78), quelantes de metales (páginas 78 y 79), antipsicóticos y antidepresivos (páginas 80 a 82), suplementos nutricionales (páginas 83 a 89) y compuestos que aumentan la disponibilidad de sustancias biológicamente activas en el cerebro (véanse las páginas 89 a 93) y profármacos (páginas 93 y 94), documento que se incorpora al presente documento por referencia.
La invención también incluye todas las variaciones isotópicas adecuadas de los compuestos de la invención. Una variación isotópica del compuesto de la invención se define como aquella en la que al menos un átomo se sustituye por un átomo que tiene el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica que se encuentra habitualmente en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse a los compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, flúor y cloro como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 35S, 18F y 36Cl respectivamente. Ciertas variaciones isotópicas de la invención, por ejemplo, aquellas en las que se incorpora un isótopo radiactivo como el 3H o el 14C, son útiles en los estudios de distribución tisular de fármacos y/o sustratos. Los isótopos tritiados, es decir, el 3H, y el carbono-14, es decir, el 14C, son particularmente preferidos por su facilidad de preparación y su exquisitez. los compuestos marcados con 18F son especialmente adecuados para aplicaciones de imagen como la PET. Además, la sustitución con isótopos como el deuterio, es decir, el 2H, puede ofrecer ciertas ventajas terapéuticas derivadas de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, un aumento de la vida media in vivo o una reducción de las necesidades de dosificación y, por tanto, puede ser preferible en algunas circunstancias. Las variaciones isotópicas de los compuestos de la invención pueden prepararse generalmente por procedimientos convencionales, como los métodos ilustrativos, o por las preparaciones descritas en los Ejemplos y Preparaciones siguientes, utilizando variaciones isotópicas apropiadas de reactivos adecuados.
Los compuestos de la presente invención pueden ser sintetizados por uno de los métodos generales mostrados en los siguientes esquemas. Estos métodos sólo se dan a título ilustrativo y no deben interpretarse como limitativos.
Esquemas sintéticos generales para la preparación de los bloques de construcción de esta invención:
Los compuestos de la presente invención pueden sintetizarse mediante uno de los métodos generales mostrados en los esquemas siguientes. Estos métodos se dan sólo a título ilustrativo y no son limitativos.
Esquema sintético general para la preparación de los bloques de construcción tricíclicos A y A' con X = NCH(CH3)2 y X = CHN(CH3)2
Figure imgf000013_0001
La N,N-dimetil-1,4-dioxaespiro[4.5]decan-8-amina se preparó mediante aminación reductora de la 1,4-dioxaespiro[4.5]decan-8-ona disponible en el mercado con dimetilamina y se obtuvo tras su purificación. La ruptura del grupo acetal con ácido dio lugar a la 4-(dimetilamino)ciclohexanona tras la purificación, que se hizo reaccionar con hidroxilamina para dar lugar a la oxima de 4-(dimetilamino)ciclohexanona tras la purificación. El desplazamiento nucléofilo del átomo de flúor de la 2-bromo-6-fluoropiridina con la oxima de 4-(dimetilamino)ciclohexanona o con la oxima de 1 -isopropilpiperidin-4-ona, disponible en el mercado, dio lugar a los derivados de la oxima con X=CHN(CH3)2 o X=NCH(CH3)2 tras la purificación. El cierre del anillo del derivado de la oxima empleando las condiciones de síntesis de Fischer-Indol permitió obtener los bloques de construcción tricíclicos A con X=NCH(CH3)2 o A' con X=CHN(CH3)2 después de la purificación.
Esquema sintético general para la preparación de los bloques de construcción tricíclicos E, G y H con X = NCH(CH3)2 o CHN(CH3)2 y Ra = H o CH3
E s q u e m a 2
1. acido
diso vente
B o C o O
2. base base
Figure imgf000014_0002
disolvente
Figure imgf000014_0001
disolvente
RdNH-NH
diso vente 1. d a is c o id lv o ente
Figure imgf000014_0005
Figure imgf000014_0003
so vene
El calentamiento de la 2,6-di-bromopiridina o de la 2-bromo-6-fluoropiridina disponibles en el mercado con hidrazina o metilhidrazina en un disolvente adecuado permitió obtener los correspondientes derivados de 2-bromo-6-hidrazino piridina (Ra= H o CH3) tras su purificación. La síntesis de Fischer-Indol de los derivados de la 2-bromo-6-hidrazinopiridina (Ra= H o CH3) con la N,3,3-trimetil-1,5-dioxaespiro[5.5]undecan-9-amina, disponible en el mercado, dio lugar al compuesto tricíclico C, que se trató con dicarbonato de di-tert-butilo para obtener el compuesto tricíclico D tras su purificación. La eliminación del grupo protector Boc con ácido, seguida de una aminación reductora con formaldehído, dio lugar al compuesto tricíclico E con X=CHN(CH3)2 yRa= CH3 tras la purificación. El compuesto tricíclico E con X=CHN(CH3)2 y Ra=H o con X=CHN(CH3)2 y Ra=CH3 también se preparó mediante síntesis de Fischer-Indol a partir de la condensación de los derivados de 2-bromo-6-hidrazino piridina (Ra=H o CH3) con N,N-dimetil-1,4-dioxaespiro[4.5]decan-8-amina y obtenida tras la purificación, la síntesis de Fischer-Indol del derivado de 2-bromo-6-hidrazino piridina con Ra=CH3 con 4-oxopiperidin-1-carboxilato de terc-butilo disponible en el mercado proporcionó el compuesto tricíclico F tras la purificación. La aminación reductora del compuesto tricíclico F con acetona dio lugar al compuesto tricíclico G con X=NCH(CH3)2 yRa=CH3 tras la purificación. El compuesto tricíclico G con X=NCH(CH3)2 y Ra=CH3 también se preparó mediante la síntesis de Fischer-Indole a partir de la condensación del derivado de 2-bromo-6-hidrazino-piridina (Ra=CH3) con la 1-isopropilpiperidin-4-ona disponible en el mercado y se obtuvo tras la purificación, El tratamiento del compuesto tricíclico E con amoníaco y óxido de cobre(I) permitió obtener el compuesto tricíclico H tras la purificación.
Esquema sintético general para la preparación de bloques de construcción de benzotiazol y benzoxazol
Figure imgf000014_0004
Los bloques de construcción de cloro (W = Cl o NH2) donde E es N y V esS, o E es S y V es N, o E es N y V es O o E e sO y V esN,se hicieron reaccionar con bloques de construcción de aminas secundarias disponibles en el mercado (R= morfolina, 3-fluoropiperidina, 4-fluoropiperidina) mediante sustitución nucleofílica utilizando un protocolo de aminación apropiado en un disolvente adecuado para obtener los bloques de construcción de benzotiazol y benzoxazol deseados después de la purificación.
Esquema sintético general para la preparación de los compuestos de esta invención
Esquema
Figure imgf000015_0001
Los bloques de construcción tricíclicos con Y = Br o NH2 se hicieron reaccionar con bloques de construcción de benzoxazol o benzotiazol (W = NH2 o Cl) donde E es N y V es S, o E es S y V es N, o E es N y V es O o E es O y V es N), utilizando la química de acoplamiento de paladio con un catalizador de paladio apropiado y un ligando apropiado en un disolvente adecuado para obtener los productos de aminación deseados después de la purificación.
La desagregación de Tau K18 y Tau de longitud completa (fl) puede medirse utilizando cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica. Se describe un ensayo estándar in vitro para medir la capacidad de desagregación.
Ejemplos
Todos los reactivos y disolventes se obtuvieron de fuentes comerciales y se utilizaron sin mayor purificación. los espectrosde 1H-RMN se registraron en espectrómetros Bruker AV 300 y 400 MHz en disolventes deuterados. Los desplazamientos químicos (8) se indican en partes por millón y las constantes de acoplamiento (valores J) en hercios. Las multiplicidades de giro se indican con los siguientes símbolos: s (singlete), d (doblete), t (triplete), q (cuarteto), m (multiplete), bs (singlete amplio). Los espectros de masas se obtuvieron en un espectrómetro Agilent 1290 Infinity II con una Chemstation 6130 y en un espectrómetro Agilent 1200 Infinity II con una Chemstation 6130. Los datos de GC-MS se recogieron utilizando un cromatógrafo de gases Agilent 7890B y un espectrómetro de masas 5977B. La cromatografía se realizó con gel de sílice (Fluka: Silica gel 60, 0,063-0,2 mm) y disolventes adecuados como se indica en los ejemplos específicos. La purificación instantánea se realizó con un Biotage Isolera con cartuchos HP-Sil o KP-NH SNAp (Biotage) y el gradiente de disolvente indicado en los ejemplos específicos. La cromatografía en capa fina (TLC) se realizó en placas de gel de sílice con detección UV.
Ejemplo de preparación 1
Figure imgf000015_0002
Paso A
A una suspensión de 2,6-dibromopiridina disponible en el mercado (10 g, 42,2 mmol) en etanol (50 ml) se añadió N-metilhidrazina disponible en el mercado (11,11 ml, 211 mmol). La mezcla se calentó a 80 °C (temperatura de la mezcla de reacción) durante 48 h. La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía sobre sílice utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One que empleaba un gradiente de acetato de etilo/n-heptano (15/75 -> 35/65) para obtener el compuesto del título como aceite rojizo que se convierte en un sólido al permanecer a temperatura ambiente (7,6 g, 89 %).
1H-RMN (400 MHz, CDCh): 8 = 7,27 (t, 1H), 6,82 (d, 1H), 6,70 (d, 1H), 4,00 (br-s, 2H), 3,23 (s, 3H)
Paso B
Una suspensión de clorhidrato de 4-(metilamino)ciclohexanona-2,2-dimetiltrimetileno cetal (3,7 g, 14,8 mmol) y el compuesto del título del paso A anterior (3 g, 14,8 mmol) en dioxano (30 ml) se colocó en un baño de hielo. A la suspensión agitada se añadió lentamente ácido sulfúrico concentrado (3 ml). Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 5 h utilizando un baño de arena (-140 °C). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se descartó la capa de dioxano y se añadió agua helada (20 ml). La mezcla se agitó hasta que se disolvió el material gomoso. A continuación, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH = 14 utilizando solución ac. de NaOH. La capa acuosa se extrajo con diclorometano (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida para obtener la base libre cruda (4,7 g). El producto crudo se utilizó directamente en el siguiente paso.
Paso C
A una solución del compuesto del título del paso B anterior (4,7 g) en THF (50 ml) se añadió trietilamina (5 ml) y dicarbonato de di-tert-butilo (10 g, 45,8 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, la mezcla de reacción se concentró y el residuo se disolvió en diclorometano (200 ml). La fase orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se filtró. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó en una columna HP-Sil utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One empleando un gradiente de EtOAc/n-heptano (20/80 -> 50/50) para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (3,55 g, 61 % en 2 pasos).
1H-RMN (400 MHz, CDCla): 8 =) 7.54 (d, 1H), 7,12 (d, 1H), 4,50-4,21 (br-m, 1H), 3,70 (s, 3H), 2,90-2,70 (m, 7H), 2,10­ 2,00 (m, 2H), 1,46 (s, 9H)
Paso D
El compuesto del título del paso C anterior (1 g, 2,54 mmol) se disolvió en diclorometano (32 ml) y se añadió una solución 4 M de ácido clorhídrico en dioxano (16 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y los disolventes se eliminaron a presión reducida. El residuo se suspendió en diclorometano (25 ml) y agua (20 ml) y se añadió una solución acuosa 1 M de hidróxido de sodio hasta pH -12. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 * 20 ml). La fase orgánica combinada se secó sobre Na2SO4, se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida para obtener el compuesto del título como un sólido blanquecino (0,745 g, 99 %).
1H-RMN (400 MHz, CDCla): 8 = 7,57 (d, 1H), 7,13 (d, 1H), 4,50-4,21 (br-m, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,02-2.94 (m, 2H), 2,89­ 2,81 (m, 1H), 2,79-2,70 (m, 1H), 2,55 (s, 3H), 2,52-2,45 (m, 1H), 2,22-2,15 (m, 1H), 1,88-1,80 (m, 1H)
Paso E
El compuesto del título del paso D anterior (0,745 g, 2,53 mmol) se disolvió en agua (2 ml) y ácido acético (0,61 g, 10,12 mmol). A continuación se añadió una solución acuosa de formaldehído al 37 % (1,11 g, 13,77 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras la adición del polvo de zinc (1,19 g, 18,35 mmol), la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. A continuación se añadió amoníaco acuoso concentrado (10 ml) y se sonicó la mezcla durante 2 minutos. La suspensión se extrajo con diclorometano (3 * 30 ml), se separó la fase orgánica, se secó sobre Na2SO4 y se eliminó el disolvente a presión reducida. El residuo se purificó en una columna KP-NH utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One que empleaba un gradiente de diclorometano/metanol (100/0 -> 90/10) para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (0,44 g, 56 %).
1H-RMN (400 MHz, CDCh): 8 = 7,60 (d, 1H), 7,16 (d, 1H), 3,72 (s, 3H), 2,97-2,90 (m, 2H), 2,85-2,76 (m, 2H), 2,73­ 2,63 (m, 1H), 2,48 (s, 6H), 2,35-2,28 (m, 1H), 1,92-1,84 (m, 1H)
Ejemplo de preparación 2
Figure imgf000016_0001
El material quiral de partida (2 g, 5,67 mmol, pureza química 99.2 %; pureza quiral: 99.2 % ee), preparada de manera similar a la reportada entonces en WO2011/128455 Ejemplo Preparatorio 337, utilizando DMF en lugar de MeOH como disolvente) se disolvió en diclorometano (80 ml) y se añadieron 40 ml de una solución 4 M de cloruro de hidrógeno en 1,4-dioxano. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y los disolventes se eliminaron a presión reducida. El residuo se disolvió en diclorometano (250 ml) y agua (120 ml) y el pH de la fase acuosa se ajustó a pH~12 añadiendo pellas de hidróxido de sodio. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (120 ml). La fase orgánica combinada se secó sobre Na2SO4, se filtró y los disolventes se eliminaron a presión reducida para obtener el compuesto del título como un aceite incoloro (1,46 g, 98 %; la TLC coincidió con el material racémico).
1H-RMN (400 MHz, CDCh) 6 = 7,57 (d, 1H), 7,13 (d, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,02-2,94 (m, 2H), 2,88-2,70 (m, 3H), 2,56 (s, 3H), 2,53-2,45 (m, 1H), 2,21-2,15(m, 1H), 1,88-1,80 (m, 1H)
Paso B
El compuesto del paso A anterior (1,46 g, 4,96 mmol) se suspendió en metanol (30 ml) y se añadió una solución acuosa de formaldehído al 37 % (3 ml, 35,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos y se añadió cianoborohidruro de sodio (1,25 g, 20,26 mmol). A continuación, se añadió ácido acético (4,5 ml) (¡exotermia!) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. Los disolventes se eliminaron a presión reducida y el residuo se disolvió en diclorometano (80 ml) y agua (40 ml). El pH de la fase acuosa se ajustó a pH~12 añadiendo pellas de hidróxido de sodio. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (40 ml). El orgánico combinado se lavó con una mezcla de agua y salmuera (40 ml (1/1)), se separó, se secó sobre Na2SO4, se filtró y los disolventes se eliminaron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía utilizando un cartucho KP-NH en un sistema Biotage Isolera empleando un gradiente de diclorometano/metanol (100/0 -> 90/10) para obtener el compuesto del título como sólido blanquecino (1,36 g, 86 %; la TLC hizo coincidir el material racémico).
1H-RMN (400 MHz, CDCh): 6 = 7,60 (d, 1H), 7,16(d, 1H), 3,73 (s, 3H), 2,95-2,87 (m, 2H), 2,82-2,63 (m, 3H), 2,44 (s, 6H), 2,29-2,24 (m, 1H), 1,90-1,80(m, 1H)
Ejemplo de preparación 3
Figure imgf000017_0001
Paso A
La 1-isopropilpiperidin-4-ona comercial (500 g, 3,541 mol), el clorhidrato de hidroxilamina (369,1 g, 5,315 mol) y el carbonato de potasio (1221 g, 8,855 mol) en etanol (2.5 L) se calentó a 80 °C en un baño de aceite durante 3 h. Una vez completada la reacción por TLC, la mezcla de reacción se enfrió a 25 °C y el sólido se filtró lavándose con agua (5 L) y éter dietílico (2,5 L). El compuesto se secó en línea de vacío durante 24 h para obtener la 1 -isopropilpiperidin-4-ona oxima como un sólido blanco (525 g, 95 %)
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 6 = 10,22 (s, 1H), 2,72-2,73 (m, 1H), 2,48-2,50 (m, 4H), 2,43 (s, 2H), 2,17 (t, J = 5,68 Hz, 2H), 0,95 (d, J = 6,56 Hz, 6H).
MS: 157.2 (M+H)+.
Paso B
A una solución agitada del compuesto del título de la etapa Aanterior (500 g, 3,201 mol) en DMF (5 L) se añadió NaH 60 % en aceite mineral (192 g, 4,801 mol) en porciones a 0 °C. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 1 h y luego la mezcla de reacción se enfrió de nuevo a 0 °C .A esto se añadió gota a gota 2-bromo-6-fluoropiridina (563 g, 3,201 mol) disuelta en DMF (1 L) a 0 °C, y la mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 2 h. Tras completar la reacción por TLC, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y s e inactivó con agua helada (1 L), seguida de extracción con acetato de etilo (10 L). La capa de acetato de etilo se lavó con agua (3 x 5 L )y solución de salmuera (1 x 5 L). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se evaporó para obtener el producto crudo, que se purificó mediante cromatografía en columna utilizando entre el 30 % y el 50 % de acetato de etilo en éter de petróleo para obtener el compuesto del título como un líquido marrón pálido (650 g, 65 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6)6 = 7,76 (t, J = 8,00 Hz, 1H), 7,32 (d, J =7,20 Hz, 1H), 7,24 (d, J =8.40 Hz, 1H), 2,80­ 2,82 (m, 1H), 2,70-2,71 (m, 4H), 2,51-2,57 (m, 2H), 2,40-2,42 (m, 2H), 0,98 (d, J = 6,80 Hz, 6H).
MS: 314.1 (M+2H)+.
Paso C
Al compuesto del título del paso B anterior (650 g, 2,08 mol) se le añadió 10 % de H2SO4 conc. en 1,4 Dioxano (6,5 L) a 0 ° C y luego se calentó a 100 °C durante 12 h. Después de completar la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a 25 °C y el disolvente se eliminó a alto vacío para obtener el material crudo. El material crudo se basificó utilizando una solución de hidróxido de sodio al 30 %, seguida de una extracción con diclorometano (3 * 5 L). La capa de diclorometano se lavó con solución de salmuera ( 1 * 5 L). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se evaporó para obtener el producto crudo, que se purificó mediante cromatografía en columna utilizando entre el 30 % y el 50 % de acetato de etilo en éter de petróleo para obtener el compuesto del título como un líquido marrón pálido (280 g, 45 %).
MS: 297.1 (M+2H)+.
Ejemplo de preparación 4
Figure imgf000018_0001
Paso A
Se colocó una suspensión de 1 -isopropilpiperidin-4-ona (1,56 g, 7 mmol) y 2-bromo-6-(1-metilhidrazinil)piridina (2,23 g, 11,0 mmol) en 1,4-dioxano (9 ml) en un baño de hielo. A la suspensión agitada se le añadió lentamente H2SO4 concentrado (1 ml). Una vez completada la adición de H2SO4, la mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante toda la noche utilizando un baño de arena (-140 °C). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se descartó la capa de dioxano. El residuo fue y se añadió agua helada (10 ml). La mezcla se agitó hasta que se disolvió el material gomoso. A continuación, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH = 14 utilizando solución ac. de NaOH. La capa acuosa se extrajo con DCM (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida para obtener la base libre cruda. La purificación se llevó a cabo en una columna de gel de sílice utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One empleando un gradiente de MeOH/DCM (0/100 -> 20/80) para obtener el compuesto del título como sólido (0,172 g, 8 %).1
1H-RMN (400 MHz, CDCla) 8 = 7,54 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,74 (s, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,08-3,00 (m, 1H), 2,95 (m, 2H), 2,85 (m, 2H), 1,20 (d, J = 6,6 Hz, 6H).
Paso B
A una solución de 2-bromo-6-(1-metilhidrazinil)piridina (20,00 g, 99 mmol) y 4-oxopiperidin-1-carboxilato de terc-butilo (19,72 g, 99 mmol) en 1,4-dioxano (100 ml) se añadió lentamente H2SO4 (10 ml). La reacción se sometió a reflujo durante 8 h, se enfrió a temperatura ambiente y se añadió NaOH 1N hasta alcanzar un pH básico. A continuación, la fase acuosa se extrajo con DCM varias veces. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El aceite se trituró en iPrOH y el sólido se filtró y se secó (3,8 g, 14 %).
Paso C
A una solución del compuesto del título del paso B anterior (1,1 g, 4,13 mmol) y titanio(IV)-isopropóxido (1,453 ml, 4,96 mmol) en acetona (10 ml) se añadió triacetoxihidroborato de sodio (1,314 g, 6,20 mmol). A continuación, la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18h. se añadió NaOH 1N y el producto crudo se extrajo varias veces con DCM. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna utilizando 2 a 10 % de MeOH en DCM para obtener el compuesto del título como un sólido blanco.
1H-RMN (400MHz, DMSO-da) 8 = 7,75(d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 8,1Hz, 1H), 3,62 (brs, 5H), 2,98-2,91 (m, 1H), 2,83-2,78 (m, 4H), 1,08 (d, J = 6,5 Hz, 1H).
MS: 308.08 (M+H)+.
Ejemplo de preparación 5
Figure imgf000019_0001
Paso A
Una suspensión de 1,4-dioxaespiro[4.5]decan-8-ona (30 g, 192,3 mmol) en THF (30 ml), se añadió lentamente dimetilamina en THF (195 ml). Después de la adición, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C, se añadió gota a gota el propóxido de titanio (IV) (84 ml, 288,45 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. A continuación, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió metanol (350 ml), borohidruro de sodio (10,91 g, 288,45 mmol) en lote y se agitó durante 12 h. Después de completar la mezcla de reacción, se añadió agua (200 ml) y se agitó bien. El sólido se filtró y el filtrado se extrajo con diclorometano (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida para obtener el compuesto del título como líquido marrón que se utilizó directamente para el siguiente paso (30 g).
MS: 186.2 (M+H)+.
Paso B
El compuesto del título del paso A anterior (20 g, 1 eq) en 6N con. HCI (150 ml) se calentó a temperatura de reflujo durante 2 h (-100 °C). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se basificó con carbonato potásico (pH = 14) y se agitó bien. El sólido se filtró y el filtrado se extrajo con diclorometano (200 ml) y la fase orgánica se lavó con salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida para obtener el compuesto del título como líquido marrón (12 g, 79 %).
MS: 142.2 (M+H)+.
Paso C
A una solución agitada del compuesto del título del paso B anterior (10,0 g, 70,82 mmol) en etanol, se añadieron clorhidrato de hidroxilamina (7,38 g, 106,23 mmol) y carbonato de potasio (29,3 g, 212,46 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 80 °C en un baño de aceite durante 2 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se eliminó a presión reducida. El producto crudo se diluyó con acetato de etilo (150 ml) y agua (100 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4, se filtró y los disolventes se eliminaron a presión reducida para obtener el compuesto crudo como líquido marrón que se llevó directamente al siguiente paso sin purificaciones adicionales (8,8 g, 72 %).
MS: 157 (M+H)+.
Paso D
A una solución agitada del compuesto del título crudo del paso C anterior (8,8 g, 56,4 mmol) en DMF (80 ml) se añadió NaH (60 %) (4,02 g, 112,8 mmol) a 0 °C y se agitó durante 30 min. A continuación se añadió 2-bromo-6-fluoropiridina (9,9 g, 56,4 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. El producto crudo se diluyó con acetato de etilo (150 ml) y agua (100 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4, se filtró y los disolventes se eliminaron a presión reducida para obtener el compuesto crudo que se purificó en una columna HP-Sil utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One empleando un gradiente de EtOAc/n-hexano (40/60 -> 50/50) para obtener el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (8 g, 45 % ).
1H-RMN , (400 MHz, DMSO-d6) 8 = 7,76-7,72 (m, 1H), 7,30 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,23 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3.31 - 3,05 (m, 1H), 2,42-2,39 (m, 1H), 2,33-2,27 (m, 3H), 2,26 (s, 6H), 1,93-1,85 (m, 2H), 1,60-1,48 (m, 2H).
MS: 314.3 (M+H)+.
Paso E
Se colocó una suspensión del compuesto del título del paso D anterior (5 g, 24,2 mmol) en 1,4-dioxano (50 ml) en un baño de hielo. A la suspensión agitada se añadió lentamente ácido sulfúrico concentrado (5 ml). Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 12 h (-110 °C). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se descartó la capa de dioxano y se añadió agua helada (20 ml). La mezcla se agitó hasta que se disolvió el material gomoso. A continuación, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH = 14 utilizando solución ac. de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con diclorometano (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida. La purificación se llevó a cabo en una columna de gel de sílice utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One que empleaba un gradiente de MeOH/DCM (0/100 -> 20/80) para obtener el compuesto del título como sólido blanquecino (0,150 g, 21 %).
1H-RMN , (400 MHz, DMSO-d6) 8 = 7,97-7,93 (m, 1H), 7,54-7,51 (m, 1H), 2,86- .77 (m, 4H), 2,31-2,28 (m, 6H), 2,13­ 2,10 (m, 2H), 1,78 (s, 1H).
MS: 296.9 (M+H)+.
El compuesto se sometió a la separación por SFC para obtener los enantiómeros puros.
Método SFC: Caudal: 3 ml/min Nombre de la columna : Chirapak OX-H
Co-disolvente: 35 % Nombre del co-disolvente: 0.5 % de DEA en IPA Volumen inyectado: 15 pl
Presión de salida: 100 bar Temperatura: 40 °C.
Los isómeros (0,150 g) se separaron mediante la columna quiral SFC para obtener el primer isómero de elución (Rt=3,79) como un sólido blanquecino de pureza enantiomérica del 100 % (0,05 g) y el segundo isómero de elución (Rt=4,63) como un sólido blanquecino de pureza enantiomérica del 100 % (0,04 g).
Ejemplo de preparación 6
Figure imgf000021_0001
Paso A
A una suspensión de 2,6-dibromopiridina disponible en el mercado (10 g, 42,2 mmol) en etanol (50 ml) se añadió N-metilhidrazina disponible en el mercado (11,11 ml, 211 mmol). La mezcla se calentó a 80 °C (temperatura de la mezcla de reacción) durante 6 h. La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad y el residuo se extrajo con diclorometano (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida para obtener un aceite rojizo que se convierte en un sólido al permanecer a temperatura ambiente (8,2 g, 97 %).
MS: 204.2 (M+2H)+.
Paso B
Se añadió lentamente una suspensión de1,4-dioxaespiro[4.5]decan-8-ona (30 g, 192,3 mmol) en THF (30 ml), dimetilamina en THF (195 ml). Después de que la mezcla de reacción de adición se enfriara a 0 °C, se añadió gota a gota isopropóxido de titanio (IV) (84 ml, 288,45 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 4h. A continuación, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y s e añadió metanol (350 ml), borohidruro de sodio (10,91 g, 288,45 mmol) en lote y se agitó durante 12 h. Tras la finalización de la mezcla de reacción, se añadió agua (200 ml) y se agitó bien. El sólido se filtró y el filtrado se extrajo con diclorometano (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y se eliminó el disolvente a presión reducida para obtener el compuesto del título como líquido marrón (30 g, 83 %).
MS: 186.2 (M+H)+.
Paso C
Una suspensión del compuesto del título del paso B anterior (3,78 g, 27,2 mmol) y el compuesto del título del paso A anterior (5 g, 24,2 mmol) en 1,4-dioxano (50 ml) se colocó en un baño de hielo. A la suspensión agitada se añadió lentamente ácido sulfúrico concentrado (5 ml). Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 12 h (-110 °C). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se descartó la capa de dioxano y se añadió agua helada (20 ml). La mezcla se agitó hasta que se disolvió el material gomoso. A continuación, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH= 14 utilizando solución ac. de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con diclorometano (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida. La purificación se llevó a cabo en una columna de gel de sílice utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One con un gradiente de MeOH/DCM (0/100->20/80) para obtener el compuesto del título como sólido marrón.
MS: 309.2 (M+H)+.
El sólido marrón se sometió a separación quiral por SFC para obtener los enantiómeros puros.
Método SFC: Nombre de la columna: YMC Celulosa C
Co-disolvente: 20mM de amoníaco en metanol; caudal del co-disolvente: 1,6
Presión de salida: 100 bar Temperatura: 35 °C.
Los isómeros (2,2 g) se separaron mediante la columna quiral SFC para obtener el primer isómero de elución (Rt=3,13) como sólido marrón pálido de pureza enantiomérica del 100 % (0,7 g) y el segundo isómero de elución (Rt=4,32) como sólido marrón pálido de pureza enantiomérica del 100 % (0,6 g).
Ejemplo de preparación 7
Figure imgf000022_0001
Paso A
A una suspensión de 2-bromo-6-fluoropiridina disponible en el mercado (20 g, 113 mmol) en etanol (200 ml) se añadió N-metilhidrazina disponible en el mercado (36,6 ml, 568 mmol). La mezcla se calentó a 115 °C (temperatura de la mezcla de reacción) durante 6 h. La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad para obtener el producto como sólido blanco (18 g, 85 %).
1H-RMN , (400 MHz, DIVISOR) 5 = 7,87 (s, 1H), 7,32-7,36 (m, 1H), 6,64-6,65 (m, 2H).
MS: 189.9 (M+H)+.
Paso B
Se colocó una suspensión del compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 6 Paso B (2,0 g, 10,79 mmol) y el compuesto del título del Paso A anterior (2,02 g, 10,79 mmol) en 1,4-dioxano (10 ml) en un baño de hielo. A la suspensión agitada se añadió lentamente ácido sulfúrico concentrado (2mL). Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se calentó en el microondas a 150 °C durante 1 hora. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se descartó la capa de dioxano y se añadió agua helada (20 ml). La mezcla se agitó hasta que se disolvió el material gomoso. A continuación, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH = 14 utilizando solución ac. de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con diclorometano (200 ml) y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida. La purificación se llevó a cabo en una columna de gel de sílice utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One empleando un gradiente de MeOH/DCM (0/100 -> 20/80) para obtener el compuesto del título como sólido marrón (0,5 g, 16 %).
1H-RMN , (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 11,48 (s, 1H), 7,73 (d, J =8,00 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 8,00 Hz, 1H), 2,67-2,68 (m, 5H), 2,50 (s, 6H), 2,07-2,10 (m, 1H), 1,66-1,68 (m, 1H).
MS: 295.8 (M+H)+.
Ejemplo de preparación 8
Figure imgf000022_0002
Paso A
A un tubo de microondas se añadió el bromuro tricíclico del Ejemplo Preparatorio 6 (segundo pico de elución) (2 g, 6,4 mmol), y una solución de NH3 al 30 % (6 ml), Cu2O (0,003 g) y dietilenglicol (1 ml). El tubo se selló y se calentó a 140 °C durante 3 horas con un microondas Biotage Initiator. La mezcla de reacción se vertió en acetato de etilo (200 ml) y se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se separó y se secó sobre Na2SO4. Se eliminó el disolvente y el residuo se trituró con n-heptano para obtener el compuesto del título como sólido blanco (0,953 g. 61 %).
1H-RMN (400 MHz, Cloroformo-d)6 = 7,54(d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,31 (d, J =8,2Hz, 1H), 4,27(s, 2H), 3,61 (s, 3H), 2,97­ 2.80 (m, 2H), 2,79-2,65 (m, 2H), 2,67-2,56 (m, 1H), 2,42 (s, 6H), 2,37-2,18(m, 1H), 1,95 (d, J =12,8 Hz, 1H), 1,80 (qd, J =11,5, 5,7 Hz, 1H).
Ejemplo de preparación 9
Figure imgf000023_0001
Paso A
Se añadieron 2-clorobenzo[d]tiazol-6-amina (950 mg, 5,16 mmol) y morfolina (10 ml) en un tubo de microondas. El tubo se selló y se agitó a 180 °C durante 10 minutos en un reactor de microondas (Biotage). El disolvente se eliminó a presión reducida y se añadió agua al crudo y se trituró a temperatura ambiente durante la noche. El sólido se filtró, se lavó con agua (2x 10 ml) y se secó para obtener el compuesto del título como sólido blanquecino (2,00 g, 82 %). H-RMN (400 MHz, DMSO-d6)6 = 7,21 (d, 1H), 6,93 (d, 1H), 6,60 (dd, 1H), 4,94 (s, 2H), 3,72 (t, 4H), 3,43 (t, 5H). Ejemplo de preparación 10
Figure imgf000023_0002
Paso A
Se añadieron 2-clorobenzo[d]tiazol-5-amina (400 mg, 2,17 mmol) y morfolina (4 ml) en un tubo de microondas. El tubo se selló y se agitó a 180 °C durante 10 minutos en un reactor de microondas (Biotage). El disolvente se eliminó a presión reducida y se añadió agua al crudo y se trituró a temperatura ambiente durante la noche. El sólido se filtró, se lavó con agua (2x10 ml) y se secó para obtener el compuesto del título como sólido blanquecino (0,38 g, 76 %). 1H-RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 67,37 (d, 1H), 6,95 (d, 1H), 6,53 (dd, 1H), 3,91-3,79 (t, 4H), 3,70 (s, 2H), 3,61 (t, 4H).
MS: 236.13 (M+H)+.
Ejemplode preparación 11
Figure imgf000023_0003
Paso A
Se añadieron 2-clorobenzo[d]tiazol-5-amina (250 mg, 1,35 mmol) y clorhidrato de 4-fluoropiperidina (419 mg, 3,00 mmol) en un tubo de microondas y se añadió DMF (4 ml) seguido de DIPEA (0,402 ml, 2,3 mmol). El tubo se selló y se agitó a 150 °C durante 30 minutos en un reactor de microondas (Biotage). El disolvente se eliminó a presión reducida y el producto crudo se diluyó con DCM (15 ml) y solución saturada de cloruro amónico (15 ml). La fase orgánica se separó y la fase orgánica se lavó con agua dos veces más. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y los disolventes se evaporaron a presión reducida. El producto crudo se purificó dos veces en la columna HP-Sil (Biotage), empleando un gradiente n-Heptano/EtOAc (100/0 -> 50/50) para obtener el compuesto del título (0,25 g, 33 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 7,32 (d, 1H), 6,68 (d, 1H), 6,39 (dd, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,87 (tt, 1H), 3,70-3,57 (m, 2H), 3,57-3,43 (m, 2H), 2,08-1,88 (m, 2H), 1,88-1,72 (m, 2H).
Ejemplos de preparación 12 a 13
Siguiendo el procedimiento de aminación descrito en el Ejemplo Preparatorio 11, se prepararon los siguientes compuestos.
Tabla 1
Figure imgf000024_0002
Ejemplo de preparación 14
Figure imgf000024_0001
Paso A
Paso A
A una solución de 2,5-diclorobenzo[d]oxazol (0,35 g, 1,86 mmol) y (R)-3-fluoropiperidina (0,42 g 2,97mmol) se le añadió etanol (12,5 ml) y se calentó la mezcla de reacción mediante microondas a 100 °C durante 60 min. La reacción se enfrió a temperatura ambiente, se disolvió en acetato de etilo (100 ml) y se lavó con agua, salmuera y se secó sobre Na2SO4. Se eliminó el disolvente; el producto crudo se purificó en columna de gel de sílice utilizando el sistema de purificación Biotage con gradiente de heptano y acetato de etilo (100/0 -> 80/20) para dar el compuesto del título (0,225 g, 47%) 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5 = 7,33 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,28 (s, 0H), 7.17 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,00 (dd, J = 8,4, 2,1 Hz, 1H), 4,80 (dtt, J = 47,1, 5,6, 2,9 Hz, 1H), 4,04 (dddt, J = 13,9, 9,5, 5,4, 1,2 Hz, 1H), 3.97-3.86 (m, 1H), 3.80-3.64 (m, 1H), 3.51 (dddd, J =13.5, 9.0, 3.4, 1.8 Hz, 1H), 2.13-1.96 (m, 2H), 1.69 (tdd, J =11.3, 5.5, 3.3 Hz, 2H).
Figure imgf000025_0001
Se tomó 2-amino nitrofenol (1 g, 6,48 mmol) en piridina, se añadió xantato de etilo de potasio (1,14 g, 7,13 mmol). La mezcla se calentó a 120 °C durante 8 h. Una vez completada la reacción, la mezcla se acidificó con HCI 1,5N. El sólido obtenido se recogió por filtración y se secó al vacío para obtener el compuesto del título como sólido amarillo (1 g, 78 %).
MS: 197.18 (M+H)+.
Paso B
A una solución del compuesto del título del paso A anterior (1 g, 5,09 mmol) en xileno (10 ml), se añadió trietilamina (2,14 ml, 15,29 mmol) y 3-fluoropiperidina (0,52 g, 5,09 mmol). La mezcla resultante se calentó a 100 °C durante 16h. Una vez completada la reacción, la mezcla se evaporó, el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó con agua. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó para obtener el producto crudo, que se purificó por cromatografía instantánea utilizando etilacetato al 40-50 % en éter de petróleo para obtener el compuesto del título como sólido marrón claro (1,1 g, 81 %).1
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 8 = 8,06 (s, 1H), 7,96-7,97 (m, 1H), 7,63 (d, J = 8,80 Hz, 1H), 4,86-4,86 (m, 1H), 4,07­ 4,09 (m, 1H), 3.96-3.97 (m, 1H), 3.60-3.63 (m, 1H), 3.38-3.39 (m, 1H), 2.49-2.50 (m, 1H), 1.91-1.92 (m, 2H), 1.80-1.81 (m, 2H), 1.61-1.62 (m, 1H),
MS: 266.0 (M+H)+.
Paso C
A una solución del compuesto del título del paso b anterior (1,1 g, 4,15 mmol) en etanol y agua (proporción 2:1) se añadió polvo de hierro (1,14 g, 20,75 mmol) y cloruro de amonio ( 2,19 g, 41,5 mmol). La suspensión resultante se calentó a 90 °C durante 2 h. Una vez completada la reacción, la mezcla se filtró a través de celita, el filtrado se evaporó y el producto crudo se purificó por cromatografía instantánea para obtener 2-(3-fluoropiperidin-1-yl)-2,3-dihidrobenzo[d]oxazol-6-amina.
(0.2 g, 20 %).
MS: 236.2 (M+H)+.
Se separaron dos isómeros por separación quiral para obtener cada enantiómero.
Método: fase móvil:0,1 % DEA en n-HEXANE:ETOH::60:40
COLUMNA: CHIRALCEL OJ-H(250*4,6)mm,5|jm.
Los isómeros (0,2 g) se separaron mediante una columna quiral para obtener el primer isómero de elución (Rt=14,2) como un sólido blanquecino de pureza enantiomérica del 100 % (0,04 g) y el segundo isómero de elución (Rt=21,7) como un sólido blanquecino de pureza enantiomérica del 100 % (0,04 g).
Figure imgf000026_0001
Paso A
El 1,4-Dioxano (4 ml) se desgasificó durante 10 minutos con argón. Se añadieron acetato de paladio(N) (0,0675 g, 0,301 mmol) y diciclohexil(2',4',6'-triisopropil-[1,1'-bifenil]-2-il)fosfina (XPhos, 0,43 g, 0,902 mmol). A continuación, la suspensión se calentó a 110 °C durante 2 minutos. A continuación, se añadieron el compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 4 (0,927 mg, 3,01 mmol), el compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 9 (0,849 g, 3,61 mmol) y tercbutóxido de sodio (0,867 g, 9,02 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 110 °C durante 2 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró hasta sequedad. se añadió NaOH 1 N y la fase acuosa se extrajo con diclorometano/metanol varias veces. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El material crudo se purificó dos veces por cromatografía en columna utilizando de 2 a 10 % de metanol en diclorometano. El sólido obtenido se trituró en metanol/isopropanol, se filtró y se secó para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (0,6339 g, 46 %).
1H-RMN (400MHz, DIVISOR) 8 = 8,89 (brs, 1H), 8,49 (brs, 1H), 7,58 (d, J =8,3 Hz, 1H), 7,49 (dd, J =8,7, 1,7 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,74-3,72 (m, 4H), 3,61 (brs, 5H), 3,50-3,48 (m, 4H), 2,96-2,75 (m, 5H), 1,10 (d, J = 5,7 Hz, 6H).
MS: 463.37 (M+H)+.
Ejemplo 2
Figure imgf000026_0002
Paso A
Un matraz schlenk secado en horno, se evacuó y rellenó con gas argón. A continuación, se añadieron 2-diclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenilo (XPhos, 0,046 g, 0,10 mmol) y acetato de paladio(II) (0,007 g, 0,03 mmol), seguido de 1,4-dioxano seco (8 ml) y se calentó a 110 °C en un baño de arena durante 90 segundos para generar el catalizador (solución roja clara). Se añadieron el compuesto del título del segundo pico de elución del Ejemplo Preparatorio 6 (0,100 g, 0,32 mmol), el compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 10 (0,091 g, 0,39 mmol) y tertbutóxido de sodio (0,102 g, 1,07 mmol). La mezcla se calentó en un baño de arena a -110 °C durante 4 h. La mezcla se diluyó con diclorometano (200 ml) y se lavó con agua (100 ml) y solución de salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se eliminaron los disolventes. El residuo se purificó en un cartucho HP-SIL utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One que empleaba un gradiente de diclorometano/metanol (100/0 -> 80/20). El precipitado del compuesto recogido se trituró con una mezcla de acetato de etilo y heptano (2:8) y el sólido se secó para obtener el compuesto del título como sólido blanco (0,085 g, 57 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8,86 (s, 1H), 8,48 (d, 1H), 7,58 (d, 1H), 7,47 (dd, 1H), 7,39 (d, 1H), 6,52 (d, 1H), 3,76-3,70 (m, 4H), 3.60 (s, 3H), 3,51-3,46 (m, 4H), 2,88-2,55 (m, 5H), 2,46-2,43 (m, 1H), 2,26 (s, 6H), 2,12-2,06 (m, 1H), 1,70-1,60 (m, 1H)
Figure imgf000027_0001
Paso A
Se añadieron acetato de paladio(II) (0,00583 g, 0,026 mmol) y 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (XantPhos, (0,0451 g, 0,078 mmol) a un vial de reacción y se añadió 1,4-dioxano degradado (4 ml). El vial se llenó con gas argón y se selló. La suspensión se calentó a 110 °C durante 1 minuto y se añadieron el compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 6 (0,08 g, 0,260 mmol), el compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 11 (0,078 g, 0,311 mmol) y carbonato de cesio (0,254 g, 0,779 mmol) y la solución se calentó a 110 °C durante 4 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (10 ml) y agua (10 ml). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo dos veces más. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2SÜ4, se filtró y los disolventes se evaporaron a presión reducida. El producto crudo se purificó en una columna HP-Sil (Biotage), empleando un gradiente de DClWMeOH (100/0 -> 80/20) para obtener el compuesto del título (0,071 g, 57 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 = 8,86 (s, 1H), 8,05 (d, 1H), 7,64-7,54 (m, 2H), 7,45 (dd, 1H), 6,57 (d, 1H), 4.95 (ddt, 1H), 3,75-3,52 (m, 9H), 2,90-2,56 (m, 4H), 2,30 (s, 6H), 2,17-1,92 (m, 2H), 1,83 (ddq, 2H), 1,68 (qd, 1H).
MS: 479.14 (M+H)+.
Ejemplo 4
Figure imgf000027_0002
Paso A
Se añadieron acetato de paladio(II) diacetoxipaladio (0,0038 g, 0,017 mmol) y diciclohexil(2',4',6'-triisopropil-[1,1'-bifenil]-2-il)fosfina (XPhos, 0,024mg, 0,050 mmol) a un vial de reacción y se añadió 1,4-dioxano desgasificado (4 ml). El vial se llenó con gas Argón y se selló. La suspensión se calentó a 110 °C durante 1 minuto y se añadieron el compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 4 (0,050 g, 0,16 mmol), el compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 10 (0,0485 g, 0,20 mmol) y tert-butóxido de sodio (0,0540 g, 0,56 mmol) y la solución se calentó a 110 C durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (5 ml) y agua (5 ml). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo dos veces más. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2SO4, se filtró y los disolventes se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó en cartuchos HP-Sil SNAP utilizando un sistema de purificación Biotage Isolera One con DCM/MeOH (9:1) para obtener el compuesto del título (0,016 g, 22 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 = 8,88 (s, 1H), 8,08 (d, 1H), 7,59 (d, 2H), 7,45 (dd, 1H), 6,56 (d, 1H), 3.73 (dd, 4H), 3,62 (s, 5H), 3,56-3,46 (m, 4H), 3,04-2,88 (m, 1H), 2,84 (s, 2H), 2,75 (s, 2H), 1,09 (d, 6H).
MS: 463.20 (M+H)+.
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Paso A
A una solución agitada del compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 5 (0,10 g, 0,33 mmol) y el compuesto del título del Ejemplo Preparatorio 10 (0,063 g, 0,27 mmol) en 1,4-dioxano (5 ml) se desgasificó con nitrógeno durante 15 min. A continuación, se añadió terc-butóxido de sodio (0,086 g, 0,99 mmol), 2-diclohexilfosfino-2',6'-diisopropoxibifenilo (RuPhos, (0,016 g, 0,033 mmol) y tris(dibencilidenoacetona)dipaladio(0) (Pd2(dba)3, 0,015 g, 0.002 mmol) y se calentó a 100° C durante 6 h. Tras completar la reacción por TLC, la mezcla de reacción se filtró a través de celita y se lavó con metanol y DCM, y el filtrado se concentró. El producto crudo se purificó mediante columna de sílice, utilizando 8­ 10 % de MeOH en dCm para obtener el compuesto del título como sólido blanquecino (0,015 g, 10 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 = 9,18 (bs, 1H), 8,12 (d, J = 1,60 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 8,40 Hz, 1H), 7,62 (d, J =8,40 Hz, 1H), 7,25 (dd, J = 1.60, 8,60 Hz, 1H), 6,76 (d, J =8,40 Hz, 1H), 3,72-3,73 (m, 4H), 3,54-3,55 (m, 4H), 2,67-2,77 (m, 5H), 2,28 (s, 6H), 2,06-2,09 (m, 1H), 1,73-1,75 (m, 1H).
MS: 450.2 (M+H)+.
Ejemplos 6 a 36
Siguiendo los procedimientos de acoplamiento de paladio descritos en los Ejemplos Preparatorios 1, 2, 3, 4 y 5 , se prepararon los siguientes compuestos.
Tabla 2
Figure imgf000028_0002
continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO BIOLÓGICO
Ensayo de desagregación de Tau de longitud completa (fITau) mediante tioflavina T (ThT)
La isoforma más larga de Tau humana (2N4R; 441 aminoácidos) se expresó en bacterias y se purificó. Para el ensayo de desagregación de Tau por ThT, se agregaron 35 pM de Tau recombinante de longitud completa (fl) en PBS durante 24 horas a 37 °C en presencia de 50 pM de heparina (Sigma-Aldrich) y 10 mM de DTT (Sigma-Aldrich) bajo agitación a 750 RPM. Los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO, Sigma-Aldrich) hasta alcanzar una concentración de 10 mM. Los agregados de fITau y las diluciones seriadas de los compuestos se mezclaron en PBS (volumen 50 pL) hasta alcanzar una concentración final de 2 pM de agregados de flTau y de 160 a 0,04 pM de compuestos. La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT), y a continuación se transfirieron 40 pl de esta mezcla a una placa de ensayo negra de 384 pocillos (Perkin-Elmer) y se mezclaron con 10 pl de 100 pM de ThT en 250 mM de glicina (ambos de Sigma-Aldrich) en PBS. La fluorescencia (unidades de fluorescencia relativas; RFU) se midió por monoplicado o duplicado en un lector Tecan (excitación: 440 nm; emisión: 485 nm). A continuación, se calculó el porcentaje de desagregación de la fITau y se determinó la concentración media efectiva (EC5o) utilizando GraphPad Prism versión 5 (GraphPad Software), asumiendo un modelo de ajuste de un sitio de unión.
Ensayo de desagregación de Tau K18 por ThT
El fragmento K18 de Tau, que abarca los aminoácidos 244 a 372 de la isoforma más larga (2N4R) de Tau441 humana, se expresó en bacterias y se purificó o se compró a SignalChem. Para el ensayo de desagregación de K18 por ThT, se agregaron 35 pM de K18 recombinante en PBS durante 24 horas a 37 °C en presencia de 50 pM de heparina (Sigma-Aldrich) y 10 mM de DTT (Sigma-Aldrich) bajo agitación a 750 RPM. Los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO, Sigma-Aldrich) hasta alcanzar una concentración de 10 mM. Los agregados de K18 y las diluciones seriadas de los compuestos se mezclaron en PBS (volumen 50 j L) hasta alcanzar una concentración final de 2 j M de agregados de K18 y de 160 a 0,04 j M de compuestos. La mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT), y a continuación se transfirieron 40 j l de esta mezcla a una placa de ensayo negra de 384 pocillos (Perkin-Elmer) y se mezclaron con 10 j l de 100 j M de ThT en 250 mM de glicina (ambos de Sigma-Aldrich) en PBS. La fluorescencia (unidades de fluorescencia relativa; RFU) se midió por monobloque o por duplicado en un lector Tecan (excitación: 440 nm; emisión: 485 nm). A continuación se calculó el porcentaje de desagregación de K18 y se determinó la media concentración efectiva máxima (EC50) utilizando GraphPad Prism versión 5 (GraphPad Software) asumiendo un modelo de ajuste de un sitio de unión.
Se midieron los siguientes compuestos de ejemplo:
Tabla 3
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Reducción de la agregación intracelular de Tau
Una línea celular de neuroblastoma humano que sobreexpresa la forma de longitud completa de Tau humana portadora de la mutación P301L se cultivó en medio completo [DMEM-F124,5 g/L de Glutamax (Invitrogen), 15 % de FBS (Biochrom), 1 % de Peni/Strep (Invitrogen) complementado con 2,5 pg/ml de antibiótico de selección G418 (Sigma-Aldrich)]. El día anterior al experimento se sembraron 5*105 células/pocillo en una placa de 6 pocillos en 3 ml de medio completo. Al día siguiente, las células se incubaron con DMSO o un compuesto de la presente invención a 5 pM durante 24 horas adicionales a 37 °C. Después de la incubación, las células fueron tripsinizadas, resuprimidas en 100 pl de tampón de homogeneización [25 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM e Gt A que contenía inhibidores de fosfatasas (30 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 1 nM de ácido Okadaico, 1 mM de PMSF, 5 mM de Na4P2O7) y un cóctel de inhibidores de la proteasa (Complete™, Roche)], y luego se lisó físicamente con tres ciclos rápidos de congelación y descongelación. A continuación, las muestras se analizaron directamente en el ensayo AlphaLISA.
La Tau fosforilada, agregada y total se cuantificó mediante AlphaLisa utilizando los siguientes pares de anticuerpos:
• Perlas HT7-Aceptoras perlas de biotina (BT)-Tau13-Donante: Total Tau
• Perlas HT7-Aceptoras perlas de biotina(BT)-HT7-Donantes: Tau humana agregada
La Tau13 (Abcam) se biotiniló utilizando el kit de biotinilación en fase sólida EZ-Link® NHS-PEO (Thermo Scientific), mientras que la HT7-biotina era de una fuente comercial (Thermo Scientific).
Para cada par de anticuerpos se optimizó la concentración de perlas aceptoras y anticuerpos biotinilados. Todas las muestras se probaron primero en una serie de diluciones en PBS para identificar el intervalo lineal y la dilución óptima para cada muestra y ensayo. Para el protocolo final, se añadieron los siguientes reactivos en una OptiPlate blanca de 384 pocillos (PerkinElmer):
• 5 pL de muestra diluida para la prueba
• 20 pL de la mezcla de perlas aceptoras de biotina-mAb a las siguientes concentraciones finales:
• HT7-BT a 1,25 nM en combinación con perlas HT7-Acc a 10 pg/ml
• Tau13-BT a 5 nM en combinación con perlas HT7-Acc a 2,5 pg/ml
Tras la incubación de esta mezcla a temperatura ambiente durante 1 h, se añadieron 25 pl de perlas donadoras de estreptavidina (Perkin Elmer) a 25 pg/ml en la oscuridad. Las placas se analizaron tras 30 minutos de incubación utilizando el instrumento EnSpire Alpha y la EnSpire Workstation versión 3.00. Los datos de la Tau agregada se normalizaron con respecto a la Tau total y luego se expresaron como porcentaje de las células tratadas con DMSO.
Se midieron los siguientes compuestos de ejemplo:
Tabla 4
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Eficacia in vivo de los compuestos de la presente invención
Diseño del estudio in vivo para las pruebas del Ejemplo 1 y del Ejemplo 12
Los ratones transgénicos dobles rTg4510 son un modelo agresivo de Tauopatía que expresa la Tau humana de longitud completa con la mutación P301L (Tau4RON-P301L) bajo el control del promotor CaMKII inducible por tetraciclina (Ramsden et al., J. Neurosci., 2005 - 25(46):10637-10647). Como controles de genotipo se utilizaron animales de tipo salvaje y ratones transgénicos únicos que expresaban únicamente el transactivador controlado por tetraciclina (tTA). El estudio comprendía 6 grupos de tratamiento (n = 20 ratones/grupo) con la siguiente distribución de grupos (véase la Tabla 5). Los compuestos o el vehículo de control se administraron una vez al día por sonda durante 12,5 semanas a partir de las 5,5 semanas de edad. La prueba conductual del laberinto acuático de Morris (MWM) se realizó tras 12,5 semanas de tratamiento durante 5 días consecutivos. Durante las pruebas de MWM se continuó con la dosificación diaria. Las pruebas de comportamiento (MWM) se realizaron sólo en ratones hembra (alrededor de n=11 hembras/grupo). Las mediciones de la atrofia cortical y la histología de plegamiento erróneo de Tau (MC1) y CD68 se realizaron en 7 animales/grupo excluyendo a los animales de tipo salvaje.
Tabla 5: Diseño del estudio in vivo para las pruebas del Ejemplo 1 y del Ejemplo 12
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(a) Vehículo: 0.5 % p/v Hidroxipropilmetilcelulosa 4000 cps; 0,5 % p/v Tween 80
Prueba de comportamiento en el laberinto acuático de Morris (MWM) en ratones rTq4510 tratados con los compuestos de la invención
La MWM se realizó en un tanque circular de 48" de diámetro. El agua tenía una profundidad de aproximadamente 24­ 25" y estaba coloreada de blanco con pintura no tóxica. El agua se mantuvo a 25 °C ±1 °C. Alrededor del tanque de agua se instalaron señales extra-laberinto. Los ensayos se grabaron en vídeo y se analizaron con un programa informático (WaterMaze; Actimetrics, Wilmette, IL). Durante 5 días consecutivos de la primera semana, se realizaron sesiones de entrenamiento con la plataforma sumergida aproximadamente 1,5 cm por debajo de la superficie del agua. Cada día, se realizaron cuatro ensayos de 60 segundos de duración, con un intervalo de 15 minutos entre ensayos, aproximadamente. En el quinto día de entrenamiento, el último cuarto ensayo consistió en 60 s sin la plataforma (ensayo de sondeo). La posición de la plataforma y los puntos de liberación se contrabalancearon entre los grupos de tratamiento. Se calculó el porcentaje de tiempo empleado en cada cuadrante (objetivo, adyacente izquierdo y derecho, y opuesto) para los ensayos de sondeo. Se promediaron los datos correspondientes a los cuadrantes adyacentes. Los datos se analizaron mediante ANOVA de 2 vías seguido de comparaciones post-hoc y las estadísticas mostradas se refieren a las diferencias en comparación con los ratones rTg4510 tratados con vehículo.
Como se muestra en la Figura 1, el compuesto de la invención, Ejemplo 1, mostró un aumento dependiente de la dosis en el porcentaje de tiempo pasado en el cuadrante objetivo. Otro compuesto de la invención, Ejemplo 12, también mostró un aumento significativo en el porcentaje de tiempo empleado en el cuadrante objetivo. Estos datos indican que el tratamiento con ambos compuestos probados en rTg4510 mejoró significativamente el rendimiento de la memoria de este agresivo modelo transgénico de Tau.
Evaluación histológica de los ratones rTq4510 tratados con el Ejemplo 1 y el Ejemplo 12
Después de las pruebas de comportamiento, los ratones fueron anestesiados profundamente mediante anestesia inyectable estándar y perfundidos transcardialmente con PBS frío. A continuación, se extrajeron los cerebros y se realizó una hemisección hemisagital. Los hemisferios izquierdos se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80 °C, antes de ser utilizados para el análisis bioquímico. Los hemisferios derechos se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS durante tres horas a temperatura ambiente, se criopreservaron por inmersión en sacarosa al 15 % a 4 °C durante tres días y se prepararon para la criosección. A continuación, los hemisferios fijados se congelaron en hielo seco sobre un medio OCT en criomoldes y se crioseccionaron sagitalmente (10 pm de grosor) con el criotomo Leica CM3050S. Se recogieron secciones de 7 ratones por grupo, excluyendo a los animales de tipo salvaje, de unos 10 niveles mediolaterales comenzando a 0,2 mm de la línea media, se montaron en portaobjetos y se utilizaron para cuantificar el tamaño de la corteza. Las secciones del nivel 4 se utilizaron para la tinción histológica del MC1. En resumen, se rodearon las secciones con bloqueador de líquido de Pap Pen y se lavaron tres veces 5 minutos en PBS. El bloqueo y la permeabilización se realizaron durante 2 horas a temperatura ambiente con suero de cabra puro (NGS) al 10 % y Triton X-100 al 0,25 % en PBS. A continuación, las secciones se cubrieron con papel y se incubaron con el anticuerpo monoclonal MC-1 de ratón diluido 1:1000 en PBS con 5 % de NGS y 0,25 % de Triton-X 100 durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Tras tres lavados de 5 minutos en PBS, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios IgG antiratón de cabra AlexaFluo 555 (Invitrogen) a 1:1000 en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron tres veces 5 minutos en PBS. Para reducir la autofluorescencia del tejido, las secciones se incubaron con una solución de negro de Sudán al 0,1 % (Sigma) en etanol al 70 % durante 15 minutos a temperatura ambiente, después se lavaron cuatro veces 5 minutos en PBS y se montaron utilizando el reactivo ProLong Gold Antifade (Invitrogen). La tinción se visualizó en el microscopio Nikon Eclipse Ti, se tomaron imágenes con la cámara Nikon DS-Fi2 y se cuantificaron con el software NIS-Element AR4.13.1. Los valores indicados son la media de la cuantificación de tres imágenes individuales por muestra.
Se utilizó un conjunto aleatorio sistemático de secciones para cinco secciones sagitales por animal (un total de 175 secciones) para la tinción histológica de CD68. En resumen, las secciones fueron marcadas para el CD68 de rata anti ratón clon FA-11 (BD Biosciences) y contrateñidas con DAPI. La unión de los anticuerpos se visualizó utilizando anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia de alta absorción (Thermo Fisher). El anticuerpo se diluyó en diluyente de anticuerpos (Dako), la unión endógena inespecífica de IgG se bloqueó con suero M.O.M. (Vector) antes de la incubación primaria. Las secciones montadas se visualizaron en su conjunto en un escáner de diapositivas Axio.Scan Z1 controlado por el software ZEN con un aumento de 20x (objetivo apocromático plano), utilizando iluminación LED (Colibri2) y una cámara monocromática sensible Orca Flash 4.0. Los datos se analizaron mediante ANOVA de 1 vía seguido de comparaciones post-hoc y las estadísticas mostradas se refieren a las diferencias en comparación con los ratones rTg4510 tratados con vehículo.
Como se muestra en la Figura 2A, el compuesto de la invención, Ejemplo 1, mostró un aumento dependiente de la dosis del tamaño de la corteza. Otro compuesto de la invención, Ejemplo 12, también mostró un aumento significativo del tamaño de la corteza. Estos datos indican que el tratamiento con ambos compuestos probados en rTg4510 mejoró la atrofia cortical de este agresivo modelo transgénico de Tau.
El rescate de la atrofia cortical también se complementó con una reducción del plegamiento erróneo de Tau, medido por la histología de MC1. Como se muestra en la Figura 2B, el compuesto de la invención, Ejemplo 1, mostró una disminución dependiente de la dosis de plegamiento erróneo de Tau. Otro compuesto de la invención, Ejemplo 12, también mostró una disminución significativa de plegamiento erróneo de Tau . Estos datos indican que el tratamiento con ambos compuestos probados en rTg4510 disminuyó los niveles de Tau patológica en este modelo transgénico de Tau agresivo.
Para evaluar si el efecto descrito anteriormente de los compuestos probados sobre Tau tenía también un efecto sobre los marcadores de neuroinflamación, se evaluó el efecto de los compuestos de la invención sobre la neuroinflamación utilizando el marcador de fagocitosis de microglía CD68 que tiñe las células microgliales hiperactivas. Como se muestra en la Figura 3, el compuesto de la invención, Ejemplo 1, mostró una disminución de la microglía CD68 positiva. Otro compuesto de la invención, Ejemplo 12, también mostró una disminución significativa de la microglía CD68 positiva. Estos datos indican que el tratamiento con ambos compuestos probados en rTg4510 disminuyó los niveles de neuroinflamación en este agresivo modelo transgénico de Tau.
Diseño del estudio/n vivo para las pruebas del Ejemplo 2
Los ratones transgénicos dobles rTg4510 son un modelo agresivo de Tauopatía que expresa la Tau humana de longitud completa con la mutación P301L (Tau4R0N-P301L) bajo el control del promotor CaMKII inducible por tetraciclina (Ramsden et al., 2005). Como controles de genotipo se utilizaron animales de tipo salvaje y ratones transgénicos únicos que expresaban únicamente el transactivador controlado portetraciclina (tTA). Los ratones fueron tratados y examinados. El estudio comprendía 4 grupos de tratamiento (n = 15 ratones hembra/grupo) con la siguiente distribución de grupos (véase la Tabla 6). El compuesto de la invención o el vehículo de control se administraron una vez al día por sonda durante 12 semanas a partir de las 5,5 semanas de edad. La prueba conductual del laberinto acuático de Morris (MWM) se realizó tras 12,5 semanas de tratamiento durante 5 días consecutivos. Durante las pruebas de MWM se continuó con la dosificación diaria. Se realizaron pruebas de comportamiento (MWM) y cuantificación bioquímica de Tau insoluble en sarkosilo en todos los ratones (n=15 ratones/grupo). La medición de la atrofia cortical y la histología para Iba1 se realizaron en 10 ratones/grupo.
Tabla 6: Diseño del estudioin vivo para las pruebas del Ejemplo 2
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(a) Vehículo: 0.5 % p/v Hidroxipropilmetilcelulosa 4000 cps; 0,5 % p/v Tween 80
Prueba de comportamiento en el laberinto acuático de Morris (MWM) en ratones rTq4510 tratados con el Ejemplo 2
La MWM se realizó en un tanque circular de 48" de diámetro. El agua tenía una profundidad aproximada de 24 a 25" y estaba coloreada de blanco con pintura no tóxica. El agua se mantuvo a 25 °C ±1 °C. Alrededor del tanque de agua se instalaron señales extra-laberinto. Los ensayos se grabaron en vídeo y se analizaron con un programa informático (WaterMaze; Actimetrics, Wilmette, IL). Durante 5 días consecutivos de la primera semana, se realizaron sesiones de entrenamiento con la plataforma sumergida aproximadamente 1,5 cm por debajo de la superficie del agua. Cada día, se realizaron cuatro ensayos de 60 segundos de duración, con un intervalo de 15 minutos entre ensayos, aproximadamente. En el quinto día de entrenamiento, el último cuarto ensayo consistió en 60 s sin la plataforma (ensayo de sondeo). La posición de la plataforma y los puntos de liberación se contrabalancearon entre los grupos de tratamiento. Se calculó el porcentaje de cruce en cada cuadrante (objetivo, adyacente izquierdo y derecho, y opuesto) para los ensayos de la sonda. Los datos se analizaron mediante ANOVA de 2 vías seguido de comparaciones posthoc y las estadísticas mostradas se refieren a las diferencias en comparación con los ratones rTg4510 tratados con vehículo.
Como se muestra en la Figura 4, el compuesto de la invención, Ejemplo 2, mostró un aumento dependiente de la dosis en el porcentaje de cruces de plataforma en el objetivo en comparación con el cuadrante opuesto, alcanzando significación estadística a la dosis de 20 mg/kg. Estos datos indican que el tratamiento con el compuesto probado en rTg4510 mejora significativamente el rendimiento de la memoria de este agresivo modelo transgénico de Tau.
Evaluación bioquímica de los ratones rTq4510 tratados con el Ejemplo 2
Después de las pruebas de comportamiento, los ratones fueron anestesiados profundamente mediante anestesia inyectable estándar y perfundidos transcardialmente con PBS frío. A continuación, se extrajeron los cerebros y se realizó una hemisección hemisagital. De los hemisferios cerebrales izquierdos, se diseccionaron las cortezas, se pesaron, se sumergieron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso para el análisis bioquímico. Para la preparación de homogeneizados cerebrales totales corticales (Cx-TBH), las corticales congeladas se homogeneizaron en 9 volúmenes (ml)/peso (g) de tampón de homogeneización helado [25 mM Tris-HCI pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA que contenía inhibidores de la fosfatasa (30 mM NaF, 0,2 mM Na3VO4, 1 nM ácido okadaico, 1 mM PMSF, 5 mM Na4P2Oz) complementado con un cóctel de inhibidores de la proteasa (Complete™, Roche)]. La homogeneización se llevó a cabo utilizando un homogeneizador eléctrico con un mortero de 1,5 ml (VWR). a continuación, se mezclaron 150pl de Cx-TBH con una solución de sacarosa (100 %) hasta alcanzar una concentración final de sacarosa del 10 % y se centrifugaron a 20'000g durante 20 minutos a 4 °C. Se recogieron los sobrenadantes, se mezclaron con sarcosilo (20 %) hasta una concentración final de sarcosilo del 1 % y se incubaron bajo agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se centrifugaron a 100'000g durante 1 hora a 4 °C. La pella que contenía la fracción insoluble en sarkosilo se resuspendió en 40pl de Tris-HCI 50mM pH7,4 y se mezcló con tampón de carga (LiCor) que contenía un 10 % de p-mercaptoetanol, se calentó a 98 °C durante 10 minutos y se cargó en un gel Bolt 4-12 % Bis-Tris Plus (Novex). Las muestras se ejecutaron en el tampón de ejecución NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen) durante 2 horas a 100V. Tras la migración de las muestras, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (0,45|jm, Immobilion) durante 2 horas a 100V en tampón de transferencia frío [25mM Tris pH8,3, 190mM glicina, 20 % etanol]. A continuación, las membranas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en una dilución 1:3 de tampón de bloqueo Odyssey (LiCor) en PBS para reducir la unión inespecífica. Tras el bloqueo, las membranas se incubaron con un anti-Tau13 de ratón (SantaCruz) a 1:1000. Posteriormente, las membranas se lavaron 3 veces 15 minutos con PBS que contenía un 0,1 % de Tween 20 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario de cabra-anti-ratón-IRDye® 800CW (LiCor). Los anticuerpos secundarios se diluyeron 1:10000 en una dilución 1:3 de tampón de bloqueo Odyssey (LiCor) en PBS con 0,1 % de Tween 20. Posteriormente, las membranas se lavaron 3 veces 15 minutos en PBS que contenía 0,1 % de Tween 20, seguidas de 3 lavados de 5 minutos en PBS. Finalmente, las membranas se escanearon con el escáner LiCor (Odyssey Infrared Imager) y se cuantificaron con el software LiCor Image Studio Lite Versión 5.2. Los datos se normalizaron con respecto a una muestra de control interno cargada en cada gel.
Como se muestra en la Figura 5, el compuesto o invención, Ejemplo 2, mostró una disminución dependiente de la dosis de la Tau insoluble en sarkosilo que alcanza significación estadística a la dosis más alta de 20 mg/kg. Estos datos indican que el tratamiento con el compuesto probado en rTg4510 disminuye la Tau patológica en este agresivo modelo transgénico de Tau.
Evaluación histológica de los ratones rTq4510 tratados con el Ejemplo 2
Después de las pruebas de comportamiento, los ratones fueron anestesiados profundamente con anestesia inyectable estándar y perfundidos transcardialmente con PBS frío. A continuación, se extrajeron los cerebros y se realizó una hemisección hemisagital. Los hemisferios derechos se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS durante tres horas a temperatura ambiente, se criopreservaron por inmersión en sacarosa al 15 % a 4 °C durante tres días y se prepararon para la criosección. A continuación, los hemisferios fijados se congelaron en hielo seco sobre un medio OCT en criomoldes y se crioseccionaron sagitalmente (10 pm de grosor) con el criotomo Leica CM1950. Se recogieron secciones de 10 ratones por grupo de unos 12 niveles mediolaterales. Para cuantificar el tamaño de la corteza se utilizó un conjunto sistemático y aleatorio de secciones de siete niveles sagitales por animal. Como se muestra en la Figura 6A, el compuesto de la invención, Ejemplo 2, mostró un aumento dependiente de la dosis del tamaño de la corteza que alcanza significación estadística a la dosis más alta. Estos datos indican que el tratamiento con el compuesto probado en rTg4510 mejora la atrofia cortical de este agresivo modelo transgénico de Tau.
También se utilizó una sección por animal de la capa 6 para cuantificar la inmunorreactividad de Iba1. En resumen, las criosecciones se extrajeron de -20 °C y se secaron al aire durante 25 minutos a temperatura ambiente. El tejido cerebral se rodeó con un bloqueador de líquido de Pap Pen y se lavó una vez 5 minutos y otra vez 10 minutos en PBS a temperatura ambiente. El bloqueo y la permeabilización se realizaron durante 2 horas a temperatura ambiente con suero normal de cabra (NGS) al 10 % y Tritón X-100 al 0,25 % en PBS. A continuación, las secciones se cubrieron con papel secante y se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo contra Iba1 (Wako) diluido 1:450 en PBS que contenía un 5 % de NGS y un 0,25 % de Triton X-100 durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Las secciones se lavaron tres veces 10 minutos en PBS a temperatura ambiente y se incubaron con un anticuerpo secundario IgG de cabra (H+L) marcado con Cy3 (Jackson) diluido 1:1000 en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Después de tres lavados durante 10 minutos en PBS, las secciones se incubaron con una solución de negro de Sudán al 0,1 % (Sigma) en etanol al 70 % durante 30 segundos a temperatura ambiente para reducir la autofluorescencia del tejido. Las secciones se lavaron tres veces durante 10 minutos en PBS, se montaron con el reactivo ProLong Gold Antifade con DAPI (Molecular Probes) y se cubrieron. Las secciones se visualizaron con un escáner digital de diapositivas (Pannoramic 250 BF Flash FL, 3D Histech Ltd.) y se cuantificaron con el software de visualización de imágenes CaseViewery el módulo de software de análisis de imágenes HistoQuant (3D Histech Ltd.).
Como se muestra en la Figura 6B, el compuesto de la invención, Ejemplo 2, a 20 mg/kg mostró una disminución significativa del área inmunoreactiva de Iba1. Estos datos indican que el tratamiento con el compuesto probado en rTg4510 disminuye la microgliosis y, por tanto, la neuroinflamación en este modelo transgénico de Tau agresivo.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000045_0001
y todos los estereoisómeros mezclas racémicas tautómeros sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos,
donde
B se selecciona del grupo que consiste en O y NRa;
E es N y V es S, E es S y V es N, E es N y V es O o E es O y V es N;
X se selecciona del grupo que consiste en N-R6 y HC-N(Me)2;
R se selecciona independientemente del grupo que consiste en
y
Figure imgf000045_0002
Ra se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo; y
R6 es alquilo, donde los grupos alquilo tienen de 1 a 6 átomos de carbono.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que es un compuesto de fórmula (Ia):
Figure imgf000045_0003
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es un compuesto de fórmula (Ib):
Figure imgf000045_0004
donde B, R y R6 son como se definen en la reivindicación 1.
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es un compuesto de fórmula (Ic):
Figure imgf000046_0001
donde B, y R son como se definen en la reivindicación 1.
5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. El compuesto definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como medicamento.
7. El compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento, alivio o prevención de un trastorno o anormalidad asociada a los agregados de la proteína Tau.
8. Una mezcla que comprende un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un compuesto biológicamente activo adicional seleccionado entre un agente terapéutico diferente del compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un portador farmacéuticamente aceptable, un diluyente y un excipiente.
9. La mezcla de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el compuesto biológicamente activo adicional es un compuesto utilizado en el tratamiento de la amiloidosis.
10. La mezcla de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en la que el compuesto biológicamente activo adicional se selecciona del grupo que consiste en compuestos contra el estrés oxidativo, compuestos antiapoptóticos, quelantes de metales, inhibidores de la reparación del ADN como pirenzepina y metabolitos, ácido 3-amino-1-propanosulfónico (3APS), 1,3-propanodisulfonato (1,3PDS), activadores de a-secretasa, inhibidores de p- y Y-secretasa, proteínas Tau, neurotransmisores, rompedores de p-hoja, atrayentes para el aclaramiento de la beta amiloide / componentes celulares agotadores, inhibidores de la beta amiloide truncada N-terminal, incluyendo la beta amiloide piroglutamada 3-42, moléculas antiinflamatorias, o inhibidores de la colinesterasa (ChEIs) como la tacrina, rivastigmina, donepezilo y/o galantamina, agonistas M1, otros fármacos incluyendo cualquier fármaco modificador del amiloide o Tau y suplementos nutritivos, un anticuerpo, incluyendo cualquier anticuerpo funcionalmente equivalente o partes funcionales del mismo o una vacuna.
11. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el trastorno se selecciona entre la enfermedad de Alzheimer(EA), la EA familiar, la tauopatía primaria relacionada con la edad (PART), la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, la demencia pugilística, el síndrome de Down Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), miositis por cuerpos de inclusión, angiopatía amiloide cerebral por proteínas priónicas, lesión cerebral traumática (TBI), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad de las neuronas motoras no guamaniana con ovillos neurofibrilares, enfermedad de los granos argirófilos, degeneración corticobasal (DCB), ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17), Enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia multisistémica (AMS), enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración pálido-ponto-nigral, enfermedad de Pick (PiD), gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva (PSP), panencefalitis esclerosante subaguda, demencia con predominio de ovillos, parkinsonismo postencefalítico, distrofia miotónica, panencefalopatía esclerosante subaguda, mutaciones en LRRK2, encefalopatía traumática crónica (ETC), demencia familiar británica, demencia familiar danesa, otras degeneraciones lobares frontotemporales, parkinsonismo guadalupano, neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral, retraso mental relacionado con SLC9A6, tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares, epilepsia, demencia por cuerpos de Lewy (DCL), deterioro cognitivo leve (DCL), esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con el VIH, diabetes del adulto, amiloidosis cardíaca senil, glaucoma, accidente cerebrovascular isquémico, psicosis en la EA y la enfermedad de Huntington, preferentemente la enfermedad de Alzheimer (EA), la degeneración corticobasal (DCB), la enfermedad de Pick (EP) y la parálisis supranuclear progresiva (PSP).
12. Uso del compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como referencia analítica o herramienta de cribado in vitrn.
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