WO2014131374A1 - Chaperoninas químicas como nuevos moduladores moleculares de la beta agregación proteica presente en las enfermedades conformacionales - Google Patents

Chaperoninas químicas como nuevos moduladores moleculares de la beta agregación proteica presente en las enfermedades conformacionales Download PDF

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WO2014131374A1
WO2014131374A1 PCT/CU2013/000009 CU2013000009W WO2014131374A1 WO 2014131374 A1 WO2014131374 A1 WO 2014131374A1 CU 2013000009 W CU2013000009 W CU 2013000009W WO 2014131374 A1 WO2014131374 A1 WO 2014131374A1
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chaperonins
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salts
fibers
diseases
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Marquiza Sablon Carrazana
Chrislayne RODRIGUEZ-TANTY
Myriam Marlene ALTAMIRANO BUSTAMANTE
Lina Andrea RIVILLAS ACEVEDO
Rosa Maria LOPEZ BARROSO
Reyna LARA MARTINEZ
Isaac FERNANDEZ GOMEZ
Suchitil Rivera Marrero
Fernand VEDRENNE GUTIERREZ
Alberto BENCOMO MARTINEZ
Maria Guadalupe DOMINGUEZ MACOUZET
Rafaela Perez Perera
Luis Felipe JIMENEZ GARCIA
Massiel DIAZ MIRANDA
Andrade Julio MORAN
Alejandro Perera Pintado
Anais Prats Capote
Pedro Valdes Sosa
Sergio Agustin ISLAS ANDRADE
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Centro De Neurociencias De Cuba (Neuronic)
Instituto Mexicano De Seguro Social, Imss
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    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • alkyl and alkyl refer to linear or branched aliphatic chains of saturated and hydrogen carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, comprised between the methyl, ethyl, / 7-propyl, / ' so-propyl groups , n-butyl or / so-butyl.
  • alkylenyl refers to divalent analogs of linear or branched alkyl groups, preferably ethynyl (-CH 2 CH 2 -) or butynyl (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -) radicals.
  • the present invention provides a new method of prevention and therapeutic treatment of CDs, by inhibition, reduction, disaggregation of (as prefibrillar structures, protofibrils, fibers and amyloid plaques, all characterized by presenting ⁇ -crossed toxic structures (eg. Disease Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Type 2 Diabetes Mellitus (DM2), among others), through the administration of the compounds of Formula I, considered in this invention as chemical chaperonins, in any acceptable pharmaceutical composition of one or more compounds or their salts, prodrug or solvate, which are capable of inhibiting, reducing, eliminating, etc., the formation of these structures that cause an abnormal folding of the proteins, as well as the disaggregation of the already formed fibers.
  • ⁇ -crossed toxic structures eg. Disease Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Type 2 Diabetes Mellitus (DM2), among others
  • AD Alzheimer's disease
  • PD Parkinson's disease
  • DM2 Type 2 Diabetes Mel
  • This invention relates to Chemistry and Biochemistry applied to the field of medicine and relates to a new method to inhibit, reduce or prevent the formation of ⁇ -crossed toxic structures: prefibrils, protofibrils, fibers and amyloid plaques present in the Diseases Conformational (EC) (Table 1) and in particular those of amioid origin, through the administration of one or several compounds of Formula I, considered as chemical chaperonins, capable of inhibiting, reducing, disaggregating, refolding and preventing, among others, formation of the aforementioned structures.
  • EC Diseases Conformational
  • these proteins can form oligomers and protofibrils that will give rise to the fibers that, depending on the affected organ and the cytotoxicity of each of these structures, promote the late or episodic appearance of these diseases.
  • Carrell, R. W. and Lomas, D. A. Lancet, 1997, 350, 134-138 More than 15 proteins that can form these amyloid fibrils clearly associated with various pathological conditions have been reported.
  • Table 1 shows a non-exhaustive list of several CDs together with their white protein.
  • Cystatin C Hereditary cerebral angiopathy
  • Rhodopsin Retinitis pigmentosa Rhodopsin Retinitis pigmentosa
  • the oligomers have been reported to be toxic at the cellular level, regardless of the amioid protein from which they are formed. This shows that this cytotoxic effect has a common molecular mechanism in all cases.
  • amyloid proteins The predominant structure of amyloid proteins is the ⁇ -cross lamina. This structure remains stable in protein aggregation and oligomerization, which explains the entrenchment and deposition of amyloid aggregates in various organs causing tissue damage and organic dysfunction (Yanker BA et al. Science 1990, 250, 279-282; Lorenzo A. and col. Nature 1994, 368, 756-760; O'Brien TD et al. T. n. J. Pathol. 1995, 147, 609-616; Pike Ch. J. et al. Brain Res. 1991,
  • ⁇ -cross sheets The formation of ⁇ -cross sheets is caused by multiple pathophysiological conditions that trigger the production of these structures. Among these factors are the alteration of the physicochemical properties of the
  • DM2 is a metabolic disease characterized by the progressive death of pancreatic ⁇ cells, the deposition of cytotoxic amyloid amyloid fibers in white tissue and insulin resistance.
  • Amylin also known as IAPP, is a 37 amino acid peptide secreted along with insulin.
  • AD is characterized by the presence in the brain of neurofibrillar lattices and senile plaques. These neuropathological deposits are involved in the process that leads to progressive degeneration and neuronal death.
  • Senile plaques are located in the extracellular space of neurons and are mainly formed by deposits of ⁇ -amyloid ( ⁇ ) peptides, between 39 and 42 amino acids.
  • D SO dimethylsulfoxide
  • NOV V-octyl-h-valienamine
  • N-alkylated deoxynorjirimycin 4-phenylbutyric acid
  • anthracyclines porphyrins and azo compounds, among others.
  • WO 03/063880 provides a methodology to block the toxicity of amyloid proteins in cells with the use of one or more polycyclic compounds. Among them, preferably polyacenes, substituted or not, containing three or four rings.
  • this invention relates to the methods of irruption of the transition from amylin (IAPP) from its native soluble state to the oligomeric and / or insoluble fibrillar state, as well as the inhibition of pre or protofibrillar amyloid aggregates and fibers. These compounds also decrease the production of amyloid proteins so that they can be used in the prevention and treatment of pancreatic amyloidosis.
  • a treatment method for DM2 is specifically described.
  • quinacrine is quinacrine
  • chlorpromazine is acridine
  • phenothiazines is acridine
  • anthracyclines is acridine
  • quinacrines is acridine
  • chlorpromazine is acridine
  • Congo Red RC
  • Watanabe K. et al in US 8, 106,045B2 state that polycyclic compounds of the type 2-morpholino-4-pyrimidone and its derivatives may be effective for the prevention and treatment of AD caused by the hyperactivity of the tau protein , claiming the action of these compounds against the structures amyloid present in other neurodegenerative pathologies, DM2 and certain neoplastic.
  • myricetin exifone, pyrogallol, tannic acid, pyrocatechol, quercetin, ellagic acid, 1,2,4-benzenethriol, 5- hydroxidepamine, gallamide trihydrate, gallic acid, ethyl gallate and quinic acid among others.
  • this invention provides a method and the pharmacology composition for the treatment of amyloidosis.
  • Other types of molecules that specifically bind to the deposits of the insoluble amyloid protein are those derived from styrylbenzenes ⁇ Zhuang et al. in J. Med. Chem., 2001, 44, 12, 1905-14) and pyridine (Kung et al. in Mol. Imaging Bioi, 2003; 5, 6, 418-26).
  • the stilbenzene derivatives shown by Kung et al. in WO 03018070 and in WO 2006066104 they have been effective as inhibitors of amyloid aggregation.
  • pamoic acid is a derivative of naphthoic acid that has two naphthyl groups in its structure.
  • Minetti et al. in WO 2007045593 describe other naphthyl derivatives that also inhibit amyloid aggregation and which according to their inventors cross the BHE.
  • Hays et al. in WO 9716194 they describe some naphthyl-azo compounds, which also inhibit amyloid aggregation and can be used in pharmaceutical compositions to treat the pathologies derived from these structures.
  • the Food and Drug Administration of the United States of America has approved the use of donepezil, rivastigm / na or galantamine, however these drugs do not stop the evolution or reinvest the neurodegenerative process of EA and are only temporarily effective for a few months or a few years.
  • the present invention provides a new method of prevention and therapeutic treatment of CDs and in particular those of amyloid origin, through the inhibition, reduction, disaggregation of prefibrillar structures, protofibrils, fibers and plaques, all characterized by presenting toxic structures.
  • These compounds can be used in any acceptable pharmaceutical composition and administered by different routes, as monotherapy or in combination of one or more compounds, their salts, prodrugs or solvates that are capable of inhibiting, reducing, eliminating or disaggregating among others, these originated structures. by an abnormal folding of proteins. These compounds could also be administered to completely reverse the formation of said fibers.
  • the extension of this invention includes the treatment of diseases susceptible to benefit from the biological activities shown by the compounds described in the present invention, or of a pharmaceutically acceptable salt, derivative, prodrug or solvate thereof.
  • derivative includes both pharmaceutically acceptable compounds, that is, derivatives of the compounds of Formula I that can be used in the manufacture of a medicament, as well as pharmaceutically acceptable derivatives, since these could be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable derivatives.
  • prodrug includes any compound derived from a compound of Formula I, for example, esters, including carboxylic acid esters, amino acid esters, phosphate esters, metal salt sulphonate esters, carbamates , amides, without being limited to these examples, which, when administered to an individual, is capable of providing, directly or indirectly, said compound of Formula I.
  • said derivative is a compound that increases the bioavailability of the compound of
  • the compounds of the invention may be in crystalline form as free compounds or as solvates and it is intended that both forms are within the scope of the present invention.
  • the term "solvate”, as used herein, includes both pharmaceutically acceptable solvates, that is, solvates of the compounds of Formula I that can be used in the manufacture of a medicament, such as pharmaceutically acceptable solvates, which may be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable solvates or salts.
  • the compounds of Formula I, their isomers, salts, prodrugs or solvates will preferably be found in a pharmaceutically acceptable or substantially pure form, that is, having a pharmaceutically acceptable level of purity excluding additives.
  • the purity levels for the active ingredient are preferably greater than 90%. In a preferred embodiment, they are greater than 95% of the compounds of Formula I, or their salts, solvates or prodrugs.
  • the compounds of the invention can be used together with other additional drugs to provide a combination therapy.
  • Said additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or alternatively, they may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or non-simultaneous administration to the pharmaceutical composition comprising one or more compounds of Formula I or a prodrug, solvate. , derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the term "effective amount” refers to the amount of the agent or compound capable of developing the therapeutic action determined by its pharmacological properties, calculated for
  • the patient's clinical data such as age, state of! patient, the severity of the disorder or disorder, and the route and frequency of administration.
  • Amyloidegenic protein It refers to any polypeptide.
  • polypeptides include those that are relevant in medicine or biotechnology such as antibodies, insulin, amylin, ⁇ -amyloid peptide, toxins, hormones, etc. (Table 1)
  • the first is one in which the polypeptide to be refolded is in an unfolded or abnormally folded state or both. In this case, the correct refolding is promoted by the method of invention.
  • the misfolded peptide is already forming protofibrils and / or amyloid fibers and in this case the method of the invention serves to reduce and / or inhibit the formation of protofibrils and amyloid fibers or to disaggregate and destroy the already formed fibers.
  • Chemical chaperonin In general it is a chemical compound of low molecular weight, without this being a limitation in its definition, which participates in the promotion of the folding of proteins in a non-enzymatic way, and avoids anomalous conformations facilitating the structural alignment of the polypeptide and correcting anomalies in the process. It binds to polypeptides that are unstable or in a non-native structural state or with an incorrect secondary or tertiary structure.
  • These chemical chaperonins include the compounds of Formula I.
  • Aggregation refers to the polymerization of misfolded oligomers that have the ability to form interactions with each other.
  • Amyloidogenic which has the property of forming fibers with ⁇ -cross structures.
  • Apoptosis It is a process of programmed cell death, in which the cell destroys itself in order to prevent the progression of damage both locally and tissue.
  • BHC Blood-brain barrier
  • Therapeutic Targets Organ, tissue, cell, receptor, gene, protein, or others, which are the therapeutic target or the center of attack of a certain treatment.
  • Cytotoxic It is any compound that has the power to interfere with normal cellular processes, causing damage and sometimes cell death.
  • Conformation It is the three-dimensional structure that a chemical compound adopts in relation to the rotation that occurs through one or more simple covalent bonds.
  • Functional conformation refers to the structure of a protein, in which it can carry out all the functions for which it is designed.
  • Cellular Control They are the cell's own mechanisms that have as their objective the maintenance of the integrity of the cell and its environment.
  • Naphthalene derivatives They are those substances chemically similar to a parent substance.
  • Naphthalene derivatives They are those chemical compounds that contain an aromatic bicyclic group equal to that of naphthalene in its structure. In this document, refer to derivatives of Formula I.
  • Conformational Diseases They are the set of diseases whose pathophysiology is based on the accumulation of fibers and the formation of toxic oligomers of a peptide or misfolded protein of ⁇ -cross conformation (Table 1).
  • Thermal stress refers to the phenomenon in which cell damage occurs due to exposure to temperatures higher than optimal. Enzymes and proteins are affected during thermal stress, causing damage to the cellular machinery and in some cases cell death.
  • Glycosylation or glycosylation implies the conjugation of both terminal and lateral amino groups with molecules with mono, di and oligosaccharides.
  • Inhibition It refers to a decrease in normal activity. In the case of the present, it refers to the decrease in the kinetics of aggregation of peptides and proteins due to the presence of a compound.
  • Modulation It refers to the intervention of chaperonins in the aggregation process of misfolded peptides. It can be positive or negative modulation. Modulator It refers to the compounds of Formula I capable of inhibiting, reducing, eliminating and disaggregating the structures that cause an abnormal folding of the proteins.
  • Monotherapy It is the administration of a single substance to combat a pathology.
  • Neurodegenerative A process is said to be neurodegenerative when it causes chronic death or neuronal malfunction.
  • Oligomer They are soluble aggregates of high molecular weight.
  • Amyloid Peptide It refers to fibrous and insoluble aggregates that share several characteristics, among which is a high content of domains in the form of ⁇ -cross-laminate.
  • Senile plates They are aggregates of amyloid proteins on the outside of neurons.
  • Prefibrillate It is said of those aggregated and soluble oligomers that have not formed fibers.
  • Prodrug are substances, which can be transformed in the body into a drug with therapeutic activity.
  • Protofibrils are peptide oligomers that when interacting with other similar oligomers can give rise to fibers.
  • Figure 1 The structures and IUPAC name of the selected compounds are presented, as non-limiting examples of Formula I, whose evaluations are exemplified, as well as of the reference compounds used (naproxen and curcumin).
  • FIG. 2 Transmission electron micrographs of the fibrogenesis process of Human Serum Albumin (HSA) (3,017 ⁇ ) in the presence of chaperonin A (3,017 ⁇ and 9,051 ⁇ ) are shown. Incubated at 65 ° C for 72 hrs in Tris (pH 7.4; 20 mM).
  • HSA Human Serum Albumin
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • FIG. 5 Fluorescence Electron Microscopy images of the BSA fibrinogenesis process (100 ⁇ 100) are shown in the presence or absence of the
  • Figure 10 The kinetics of fibril formation of fragment 20-29 of the IAPP (100 ⁇ ) at 25 ° C in PBS (pH 7.4; 100 mM; 100 mM NaCI) in the presence or absence of chaperonins A, B, are presented.
  • C, D, E, and F 100 ⁇
  • Part A of the figure and the inhibitory effect of the formation of fibrils by their action chaperonins LAPP.ThT molar ratio of 50: 1.
  • Figure 11 the effect of chaperonin B concentration (molar ratios of lAPP: Chap B: 1: 0.5; 1: 1, 1.5), selected as a non-limiting example of Formula I, on the kinetics of formation of fibrils of the 20-29 fragment of lAPP (100 ⁇ ) at 25 ° C in PBS (pH 7.4; 100 mM; 100 mM NaCI).
  • Figure 12 the evaluation of the cell viability of cerebellar Granular Cell (CGC) cell cultures of rats, exposed to fragments of lAPP (fragment 20-29 of lAPP: monomer not added and aggregated), in the presence or absence of Chaperonins B and D, selected as non-limiting examples of Formula I.
  • FIG 13 The evaluation of cell apoptosis of Cerebellar Granular Cell (CGC) cell cultures exposed to lAPP fragments (fragment 20-29 of lAPP: monomer not added and aggregated) is presented, in the presence or absence of chaperonins B and D, selected as non-limiting examples of Formula I.
  • Reference compound Curcumin.
  • Figure 14 The evaluation of the protective and / or reconditioning activity of chaperonins B, C and D is presented, as non-limiting examples of Formula I, when administered to Cerebellar Granular Cell (CGC) cultures, which in unison are subjected to a medium low in potassium, -KCI. Part A of the figure presents the results with respect to the control of -KCI (protective effect) and part B of the figure presents the results with respect to the control of standard potassium + KCI (reconditioning effect).
  • Figure 15 The evaluation of the protective and / or reconditioning activity of chaperonins B, C and D is presented, when administered to Cerebellar Granular Cell (CGC) cultures 4 h after they were exposed to a culture medium low potassium (-KCI). Part A of the figure presents the results with respect to -KCI (protective effect) and part B of the figure presents
  • Example 1 Evaluation of the chaperonin modulator character in the formation of HSA fibers by transmission electron microscopy (TEM).
  • the HSA solution (5 ⁇ ) is placed on 300 mesh copper gratings coated with formvar for 3 minutes. Excess solution is removed with micropipette. Subsequently, uranyl acetate (5 pL, 2%) is added, previously centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes. The excess contrast is removed after 2 min. and the louvers are air dried for sufficient time.
  • the observation and recording of the samples is carried out using a Jeol microscope model JEM-1010 operated at 80 keV and coupled to an MTI digital camera model CCD-300-RC.
  • Figure 2 shows that in the absence of chaperonins, abundant long, contoured HSA fibers are produced after 48 hours. In contrast, in the presence of chaperonin A, the fibers are very small and short. Likewise, it is observed that at a higher concentration of chaperonin A the fibers practically disappear and only oligomers are observed, whereby the inhibitory character of chaperonin A is inferred.
  • Example 2. Evaluation of the modulating capacity of chaperonins in the formation of human serum albumin fibers (HSA).
  • Th-T Thioflavin-T (ThT): Th-T (Sigma, 47 mg) is dissolved in water and made up to a final volume of 25 mL.
  • Chaperonin The selected chaperonin is dissolved, as a non-limiting example of Formula I, (75.4 pmol; A, B, C, D, figure 1) in 25 mL of DMSO.
  • IF fluorescence intensity
  • Example 3 Evaluation of the modulatory character of the chaperonins in the kinetics of bovine serum albumin fiber (BSA), by fluorescence spectroscopy. Preparation of study solutions.
  • BSA bovine serum albumin fiber
  • Thioflavin-T Th-T ⁇ Sigma, 10 mg is dissolved in water and made up to a final volume of 5 mL.
  • Chaperonin The selected chaperonin is dissolved, as a non-limiting example of Formula I, (75.4 ⁇ ; A; B, C, D, E, F and G, figure 1) in 1.2 mL of DMSO and flush to a final volume 10 mL with the buffer.
  • the BSA fibrinogenesis process did not present a well-defined lag phase and stabilized after 120 min. approximately.
  • IF fluorescence intensity
  • Example 4. Evaluation of the modulatory character of the chaperonins in the formation of BSA fibers by fluorescence microscopy.
  • Sample preparation is carried out in a similar way to that described in Example 3.
  • the plate is incubated at 65 ° C for 3 h., Then 100 pL of sample is deposited in an eppendorf tube and ThT is added to reach a final concentration. of 20 ⁇ .
  • the samples were centrifuged at 1300rpm, for 2 minutes. 6 pL of sample are deposited on a slide with its coverslip. They are observed through the Zeiss Axiostar plus fluorescence microscope, with HBO 50 / AC lamp, with blue filter. The images are registered at 10x.
  • Example 5 Evaluation of the chaperonin modulating character in the fiber formation kinetics of BSA, by fluorescence spectroscopy.
  • ThT Thioflavin T
  • Chaperonin The selected chaperonin is dissolved as a non-limiting example of Formula I (75.4 pmol: A, B, C, D, E, F and G, figure 1) in DMSO and is flush to a final volume of 10 mL with the selected buffer.
  • BSA solutions (BSA in the absence of chaperonin at 50 ⁇ ) and mixtures of BSA at the same concentration with chaperonins (molar ratios of BSA: chaperonin: 1: 0; 1: 0.0025; 1: 0.005; 1: 0.01; 1 : 0.02; 1: 0.1; 1: 1; 1: 2) are passed through syringe filters of the acrodisk type with 0.2 ⁇ pore (Sigma-Aldrich). These solutions are incubated at a temperature between 20 and 75 ° C, without stirring.
  • ThT 10mg / mL
  • ThT 10mg / mL
  • the table with the IC50 values, obtained for each inhibitor evaluated is shown as a non-limiting example.
  • the calculation is carried out through the interpolation of the data by means of a logarithmic function. It is found that aggregation inhibitory activity is dependent on the concentration of the chaperonins.
  • the inhibitory activity of chaperonins A and B are similar to each other and twice higher than C.
  • chaperonin D was 17 times higher than the previous ones.
  • Example 6 Evaluation of the modulating character of tas chaperonins in the formation of BSA fibers by transmission electron microscopy ⁇ ).
  • Example 7 Evaluation of the chaperonin modulating character in the fiber formation kinetics of IAPP (20-29 aa by fluorescence spectroscopy.
  • ThT Thioflavin T
  • IAPP fragment 20-29 of IAPP is synthesized according to the procedure described (Kates, E. and Albericio, F. in Solid-Phase Synthesis; Marcel Dekker Inc .: New York, 2000; Hood, CA; et al. Pepf. Sci. 2008, 14, 97-101).
  • SP-HPLC high resolution semipreparative Reverse Chromatography
  • MM 1029 Da
  • ESI-MS mass spectrometry
  • Chaperonin The selected chaperonin is dissolved as a non-limiting example of Formula I (75.4 ⁇ ) in 1.2 mL of DMSO and flush to a final volume of 10 mL with the buffer (PBS, pH 7.4, 100 mM; NaC1 00 mM) .
  • the buffer PBS, pH 7.4, 100 mM; NaC1 00 mM
  • the IAPP solution (20-29, 100 ⁇ ) without and with chaperonins (100 ⁇ ) is incubated at 25 ° C in methacrylate cells (Sigma-Aldrich) volume 4.5 mL, optical path 10 mm, in the presence of ThT (20 ⁇ ) at an IAPP: ThT molar ratio of 50: 1 and stirred during kinetics.
  • the IF Cary Eclipse spectrofluorometer
  • All signals are corrected with the background signal, for which a blank containing ThT in water is prepared, in the absence of protein.
  • Figure 10 shows the modulating effect of chaperonins A, B, C, D, E and F on the formation of fibrils of fragment 20-29 of the IAPP at 25 ° C. All the chaperonins modulated this process at the concentration evaluated (molar ratio peptide: chap 1: 1). Chaperonins E and F accelerated the formation of IAPP fibers. In contrast, chaperonins A, B, C and D increased the average time of fiber formation, that is, delayed the fibrinogenesis process ( Figure 10, Part B). In the case of chaperonin B, this inhibitory behavior was maintained for protein.chaperonin molar ratios less than or equal to 1: 1 ( Figure 1 1). On the other hand, when the molar ratio is higher, the process was accelerated and the concentration of fibers formed increased.
  • Example 8 Evaluation of the cellular viability of cerebellar granular cells (CGC) in the presence of IAPP 20-29 (monomer and aggregate). Cytoprotective effect of chaperonins.
  • Chaperonin Solutions are prepared in 1.2 mL of DMSO and made up to a final volume of 10 mL with the buffer of chaperonin B and D (25 ⁇ ), selected as non-limiting examples of Formula I.
  • curcumin 5.5 mM prepared in ethanol is used.
  • the viability of the CGC cell cultures was evaluated with fragment 20-29 of the IAPP, in its mono-American and aggregate form or with mixtures of protein chaperonin at different molar ratios.
  • fragment 20-29 of the IAPP in its mono-American and aggregate form or with mixtures of protein chaperonin at different molar ratios.
  • curcumin acts as a potent cytoprotector when cells are exposed to proteins in aggregate form and do not exert this function against monomeric ones.
  • the novel cytoprotective effect of the chaperonins evaluated on the CGCs in the presence of the cytotoxic monomer of the IAPP could be explained through a mechanism of action of the type: inhibition of aggregation, reduction of aggregation or elimination of the monomer, among others.
  • Example 9 Evaluation of the apoptotic effect of fragments of IAPP 20-29 (monomer and aggregate) and chaperonins on cerebellar granular cells (CGC).
  • the solutions of chaperonins B and D are prepared at 25 ⁇ each, in DMSO and curcumin (5.5 ⁇ ) in ethanol.
  • the apoptotic effect of proteins and the cytoprotective effect of chaperonins B and D, selected as non-limiting examples of Formula I, are evaluated in CGC cell cultures and curcumin is used as the reference compound. Briefly, in all the samples half of its volume is extracted from the culture medium to add, independently, the corresponding amounts of test protein (IAPP, in its mono-American and aggregate form), protein mixtures: chaperonins at different molar ratios ( 1: 0.3 or 1: 1) or chaperonins. Then, the enriched medium is reincorporated into the cell culture and again, incubated for 4 h. additional. Cellular apoptosis is estimated by immunofluorescent determination of caspase-3 levels (J.
  • chaperonins B, C and D selected as non-limiting examples of Formula I, are evaluated in CGC cultures at low concentrations of potassium (-KCI).
  • the culture medium of the wells with 25 mM KCI (+ KCI) is removed by aspiration and replaced by a -KCI medium (5 mM).
  • Chaperonins B, C and D are added separately, at the initial time (Group I) or after 4 h. (Group II) of induction of the pro-apoptotic stimulus (-KCI) and incubate 4 h. additional, including the two control groups: -KCI and + KCI.
  • Apoptosis is estimated by immunofluorescent determination of caspase-3 levels (J. Morán et al. In J. Neurochem. 1999, 73, 2, 568-77), using the Synergy-Bioteck spectrofluorometer.
  • Figure 14 shows a reduction in caspase-3 levels in the Group I CGCs with respect to the control group -KCI. This reduction was 92, 80 and 78% for samples treated with B, C and D, respectively (Part A, figure 14). On the other hand, caspase-3 levels (Part B, figure 14) for samples with chaperonins B, C and D of Group I were lower by 84, 54 and 52%, respectively, in relation to the Control Group + KCI. These results show the protective effect of the chaperonins evaluated with respect to both controls.
  • Figure 15 shows that in Group II, the caspase-3 level was lower for the samples treated with chaperonins B, C and D (56%, 66% and 26%, respectively) with respect to to the Control Group -KCI, so a protective effect is evident.
  • this level of caspase-3 is compared with that of the + KCI control ( Figure 5, Part B) it is observed that in the case of chaperonins B and C there are no appreciable differences.
  • the caspase-3 level is 94% higher compared to the control + KCI.
  • the presence of chaperonins B and C have a regenerating effect similar to that induced by the medium + KCI.

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Abstract

Esta invención se relaciona con la Química y la Bioquímica aplicadas al campo de la medicina y se refiere a un nuevo método de prevención y tratamiento terapéutico de las Enfermedades Conformacionales (EC), en particular a las enfermedades de origen amiloideo a través de la administración de una cantidad efectiva de uno o varios compuestos, sus sales, profármacos o solvatos, considerados en esta invención como chaperoninas químicas, de Fórmula I, en donde: R1: -alquilenil-C(O)NH-alquilenil-R3, -alquilenil-C(O)O-R4; R3: -COOH, -OH, -SH, -NH2, -NH-alquil, -NH-ditiocarbamato de alquilo, -N/-(alquil)-ditiocarbamato de sales de metales alcalino-térreos, o sales de los grupos anteriormente relacionados, farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento de enfermedades amiloidegénicas. R4: grupo succinimido; R2: -H, -alquil.

Description

DESCRIPCION
CHAPERONINAS QUÍMICAS COMO NUEVOS MODULADORES MOLECULARES DE LA BETA AGREGACION PROTEICA PRESENTE EN LAS ENFERMEDADES CONFORMACIONALES
Los términos "alquilo y alquil" se refieren a cadenas alifáticas lineales o ramificadas de átomos de carbono saturados e hidrógenos, preferentemente de 1 a 4 átomos de carbono, comprendido entre los grupos metilo, etilo, /7-propilo, /'so-propilo, n- butilo o /so-butilo. El término "alquilenil" se refiere a análogos divalentes de grupos alquílicos lineales o ramificados, preferentemente a radicales etinilo (-CH2CH2-) o butinilo (-CH2CH2CH2CH2-).
Estos compuestos son neutros, lipofílicos y de bajo peso molecular. Los compuestos de la Fórmula I y sus procedimientos de obtención se describen en la patente Cubana N° 2009-57, PCT-CU2010-000001 , WO/2010/1 18706, EP 2 436 666 A20, y en las solicitudes de Patentes: México N° 29/201 , Brasil: 27/2011 , EEUU 10/2012, Malasia 12/2012, Japón 9/2012, Canadá 7/2012, Sudafrica 18/12012.
La presente invención proporciona un nuevo método de prevención y tratamiento terapéutico de las EC, mediante la inhibición, reducción, desagregación de (as estructuras prefibrilares, protofibrillas, fibras y placas amiloides, todas ellas caracterizadas por presentar estructuras tóxicas β-cruzadas (ej. Enfermedad de Alzheimer (EA), Enfermedad de Parkinson (EP), Diabetes Mellitus Tipo 2 (DM2), entre otras), a través de la administración de los compuestos de Fórmula I, considerados en esta invención como chaperoninas químicas, en cualquier composición farmacéutica aceptable de uno o varios compuestos o sus sales, profármaco o solvato, que son capaces de inhibir, reducir, eliminar, etcétera, la formación de estas estructuras que provocan un plegamiento anómalo de las proteínas, así como la desagregación de las fibras ya formadas.
No tenemos conocimiento de que este método novedoso de prevención y tratamiento terapéutico de enfermedades conformacionales, a través de la modulación de la formación de estructuras toxicas B cruzadas, prefibrilares, protofibrillas, fibras y placas, con la administración de uno o varios compuestos considerados como chaperoninas químicas, de fórmula I, en cualquier composición farmacéutica aceptable o sus sales, profármaco o solvato, haya sido descrito anteriormente. Esta invención se relaciona con la Química y la Bioquímica aplicadas al campo de la medicina y se relaciona con un nuevo método para inhibir, reducir o prevenir la formación de estructuras tóxicas β-cruzadas: prefibrilos, protofibrillas, fibras y placas amiloides presentes en las Enfermedades Conformacionales (EC) (Tabla 1) y en particular las de origen amiioideo, por medio de la administración de uno o varios compuestos de la Fórmula I, considerados como chaperoninas químicas, capaces de inhibir, reducir, desagregar, replegar y prevenir entre otros la formación de las estructuras antes mencionadas.
Las EC definidas por Carrell y cois. {Lancet 1997, 350 (9071 ), 134-138), agrupan a una serie de enfermedades diversas que en la actualidad constituyen un desafío para la medicina en cuanto a su diagnóstico, tratamiento y prevención. Estas enfermedades se caracterizan por una alteración a nivel estructural, que da como resultado el desencadenamiento del proceso de formación de fibras amiloides y su deposición en los tejidos. La expresión de estas enfermedades puede estar relacionada ya sea con la actividad tóxica de los intermediarios fibrilares, denominados oligómeros, o con la pérdida de la función biológica de la proteína en su estado nativo. Si bien no existe homología en la secuencia de aminoácidos de las distintas proteínas involucradas en las EC, estas enfermedades comparten desde el punto de vista molecular la misma fisiopatología, que implica un proceso de plegamiento anómalo de la proteína en cuestión y su acumulación en forma de fibras.
En una etapa inicial, estas proteínas pueden formar oligómeros y protofibrillas que darán origen a las fibras que en dependencia del órgano afectado y de la citotoxicidad de cada una de estas estructuras promueve la aparición tardía o episódica de estas enfermedades. (Carrell, R. W. y Lomas, D. A. Lancet, 1997, 350, 134-138). Se han reportado más de 15 proteínas que pueden formar estos fibrilos amiloideos claramente asociados a diversas condiciones patológicas.
En la Tabla 1, se presenta un listado no exhaustivo de varias EC junto con su proteína blanco.
Tabla 1 : Algunas proteínas asociadas con enfermedades conformacionales. (Chiti, F. y Dobson.C.M. Annu. Rev. Biochem. 2006; 75, 333-66; Surguchev, A Surguchov, A. Brain Res Bull 2010, 81 : 12-24; Gaestel, M., Molecular Chaperones in Health And Disease, HEP, 2006, 72:1-42, Springer-Verlag Berlín Heidelberg).
Proteína Enfermedad
ABri Demencia familiar británica
ADan Demencia familiar danesa
Amilina Diabetes Mellitus tipo 2
Amiioidosis sistemica primaria Cadenas ligeras de inmunoglobulinas
Antitrombina Enfermedad tromboembólica
Apolipoproteína A1 Polineuropatía amiloide familiar
Apolipoproteína All Amiioidosis ApoAII
Apolipoproteína AIV Amiioidosis ApoAIV
Ataxina Ataxia espinocerebelar
Ataxina poli-glutamina Ataxias espinocerebelosas
Calcitonina Carcinoma medular tiroideo
Cistatina C Angiopatía cerebral hereditaria
Citoqueratina Amiioidosis macular
Y-Cristalina Cataratas
Factor natriurético atrial Amiioidosis auricular
Fenilalanina hidroxilasa Fenilcetonuria
Fibrilina Síndrome de Marfan
Amiioidosis renal hereditaria
Fibrinógeno
Amiioidosis fíbrínogénica
Amiioidosis AA
Fragmentos de la proteína amiloide A sérica
Fiebre mediterránea familiar
Gelsolina Amiioidosis sistémíca hereditaria finlandesa
Hemoglobina Anemia de células falciformes
Huntingtina poli-glutamina Enfermedad de Huntington
Inhibidor C1 Angioedema por deficiencia del inhibidor C1
Lactoferrina Amiioidosis Corneal lactoferrina
Lisozima Amiioidosis visceral familiar
Mutantes de lisozima Amiioidosis por lisozima
utantes de péptido β-amiloide Hemorragia cerebral hereditaria con amiioidosis p53 Cáncer
Alzheimer
Péptido β-amiloide iositis por cuerpos de inclusión
Glaucoma
Prolactina Prolactinoma pituitario
3 Amiloidosis APro
Proteína ácida fibrilar glial Síndrome de Alexander
Proteína C del surfactante pulmonar. Proteinosis alveolar pulmonar
Proteína prión Encefalopatías espongiformes
Queratinas Amiloidosis cutánea liquen
Receptor de andrógeno Atrofia muscular espinal y bulbar
Rodopsina Retinosis pigmentaria
Superóxido dismutasa 1 Esclerosis lateral amiotrófica
Tau Demencia frontotemporal con parkinsonismo
Amiloidosis sístémica senil
Transtiretina
Polineuropatía amiioide familiar
a-1 antitripsina Enfisema
Parkinson
a-sinucleína
Demencia de cuerpos de Lewy
2-Mícroglobulina Amiloidosis asociada a hemodiálisis
y-cristalinas Catarata
Se ha reportado que los oligómeros son tóxicos a nivel celular, independientemente de la proteína amiioide de la cual están formados. Esto evidencia que este efecto citotóxico tiene un mecanismo molecular común en todos los casos. (Bucciantini M. y col. en Nature 2002, 416: 507-51 1 ; Walsh D. M. y Selkoe D.J. J Neurochem 2007, 101 , 72-84; Yankner y col. en Science 1990, 250, 279-282, Lorenzo y col. en Nature 1994, 368, 756-760, Pike y col. en Brain Res. 1991 , 563, 31 1-314, Lorenzo y Yankner en Proc. Nati. Acad. Sci. 1994, 91 , 12243-12247 y Schubert y col. en Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1995, 92, 1989-1993).
La estructura predominante de las proteínas amiloidegénicas es la lámina β- cruzada. Esta estructura se mantiene estable en la agregación y oligomerización proteica, lo que explica el atrincheramiento y depósito de agregados amiloides en diversos órganos provocando daño tisular y disfuncíón orgánica (Yanker B. A. y col. Science 1990, 250, 279-282; Lorenzo A. y col. Nature 1994, 368, 756-760; O'Brien T. D. y col. T n. J. Pathol. 1995, 147, 609-616; Pike Ch. J. y col. Brain Res. 1991 ,
563, 311-314; Lorenzo A. y Yanker B. A., Proc. Nati. Acad Sci. 1994, 91 , 12243-
12247; Schubert, D. y col. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1995, 92, 1989-1993)
La formación de láminas β-cruzada se origina por múltiples condiciones fisiopatológicas que desencadenan la producción de estas estructuras. Entre estos factores se encuentran la alteración de las propiedades fisicoquímicas de la
4 proteína originadas por ia temperatura, la fuerza iónica y los cambios de pH. También se puede inducir por proteólisis, fosforilación y glicosilación. (Chaudhuri, T. K. y P. Subhandar, P. FEBS Journal, 2006, 273, 1331-1349; Gaggelli E. y col. Chem Rev. 2006, 106: 1995-2044)
Por lo general, en los sistemas biológicos que funcionan dentro de los parámetros de normalidad, no se observa la formación de agregados proteicos debido a que in vivo, la célula posee diversos mecanismos que inhiben su formación, los cuales forman parte de una maquinaria molecular que se encarga de la degradación de proteínas y complejos proteicos con plegamiento anómalo. Esta maquinaria está formada por el sistema de transporte microtubular, las chaperonas, las chaperoninas, el sistema ubiquitina-proteosoma y las vesículas autofágicas. Entender la naturaleza de estos procesos protectores junto con los factores que inhiben y/o desactivan la maquinaria de regulación celular es crucial para desarrollar estrategias de prevención y tratamiento de las EC. (ZerovniK, E., Current Alzheimer Research, 2010, 7, 74-83; Cohén, F. y Kelly, J. Nature 2003, 426, 905-909)
Numerosos estudios muestran evidencias de la ¡nterrelación entre estas EC y en especial entre la DM2 y la EA (Nicolls, M. R., Curr. Alzheimer Res. 2004, 1 (1 ), 47- 54; Chillaron, J. J. y col. Med. Clin. (Barc.) 2008, 130 (12), 466-470; Nishimura, R.; y col. Am. J. Kidney Dis. 2003, 42 (1), 117-124; Pambianco, G. y col. Diabetes 2006, 55 (5), 1463-1469). La DM2 es una enfermedad metabólica caracterizada por la muerte progresiva de las células β pancreáticas, la deposición de fibras amiloides citotóxicas de amilina en el tejido blanco y la resistencia a la insulina. La amilina, también conocida como IAPP, es un péptido de 37 aminoácidos secretado junto con la insulina. Por su parte, la EA se caracteriza por la presencia en el cerebro de enrejados neurofibrilares y placas seniles. Estos depósitos neuropatológicos están involucrados en el proceso que conduce a la degeneración y muerte neuronal progresivas. (Zhao, W-Q y Townsend, M., Biochimica et Biophysica Acta 2009, 1792, 482-496; Profenno, L. y col. Biol. Psychiatry 2010, 67, 505-512) Las placas seniles se encuentran en el espacio extracelular de las neuronas y están formadas fundamentalmente por depósitos de péptidos β- amiloides (βΑ), de entre 39 y 42 aminoácidos. (Gong y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2003, 10 (18), 10417-22) Estas estructuras amiloideas han sido blancos terapéuticos para el hallazgo de nuevos tratamientos. Actualmente, las investigaciones están dirigidas a la búsqueda de productos farmacéuticos capaces de inhibir, reducir o prevenir la formación de las mismas. (Frisardi, V. y col. Ageing Research Reviews 2010, 9 (4), 399-417)
Entre los agentes antes mencionados para el control de las EC, se encuentran las chaperonas, cuyas funciones son unirse a las cadenas nacientes de polipéptidos a fin de lograr el retraso transitorio en su plegamiento hasta que la síntesis se complete. (Benjamín I y McMillan DR. en. Circ. Res. 1998; 83: 1 17-32)
Existen estudios que reportan la acción moduladora o inhibitoria de estas chaperonas en la formación de estructuras con plegamiento anómalo. Estas moléculas se pueden clasificar en moleculares, químicas y farmacológicas. Mogk, A. y col. (en EMBO J. 1999, 18, 6934-6949), Seong, I. S. y col. (en FEBS Lett. 2000, 477, 224-229J y Zahn R. y col. (en J. Mol Biol. 1996, 261 , 43-61) han evaluado in vitro diferentes chaperonas moleculares (E. coli: IbpB, DnaK, DnaJ, GroEL, HtpG y SecB y protesas como DegP, HslU y Ion) y han comprobado que previenen la agregación y facilitan la solubilización de las estructuras fibrilares. En otros estudios realizados (Schirmer E. C. y col. en Trends Biochem Sci. 1996, 21 , 289-296; Sánchez, Y. y col. en J. Bacterio/., 1993, 175, 6484-6491 ) se evidencian que las chaperonas Hsp40, Hsp70, Hsp100 y Hsp104 participan concertadamente y que ellas pueden ser cruciales en la progresión de la enfermedad por priones, por lo que incluso se ha postulado que la Hsp104 podría ser una candidata terapéutica. Sin embargo, no se han reportado estudios concluyentes y se limitan a ensayos in vitro e in vivo a nivel celular y en animales de experimentación sin dejar clara la relación riesgo/beneficio.
Por otra parte, se puede inhibir y corregir el mal plegamiento de proteínas mutadas a través del empleo de otras chaperonas denominadas químicas y farmacológicas (Chaudhuri, T. y Paul, S. en FEBS Journal 2006, 273, 331-1349, Morello J. P. y col. Trends Pharmacol Sci 2000, 21 , 466-469). Estas moléculas también llamadas chaperoninas, de bajo peso molecular, permiten estabilizar la conformación de las proteínas frente al estrés térmico así como inhibir la formación de estructuras mal plegadas y subsecuentemente impedir la formación de fibras amiloideas. (Yoshida H., y col. en Neurobiol. Dis. 2002, 10, 88-99) Se ha demostrado que éstas pueden invertir la retención intracelular de diferentes proteínas mal plegadas como en el caso del regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística, (Sato S. y col. en J. Biol. Chem. 1996, 271 , 635-638; Tamarappoo B. K. y Verkman A. S. en J Clin. Invest. 1999, 101 , 2257-2267), en la α-antitripsina (Burrows J. A. J. y col. en Proc Nati Acad Sci USA, 2000, 97, 1796-1801 ), en la aquaporina-2 (Tamarappoo B. K. y Verkman A. S. en J. Clin. Invest. 1999, 101 , 2257-2267), en el receptor V2 de la vasopresina (Galkin O. y Vekilov P. G. en J. Mol. Biol. 2004, 336, 43-59), en la galactosidasa A (Chapple J. P. y col. Trends Mol Med. 2001 , 7, 414-421), en la p-53 y en la P-glicoproteína (Loo T. W. y Clarke D. M. en J. Biol. Chem. 1997, 272, 709-712). Un ejemplo de chaperona química es el glicerol, el cual ha demostrado ser capaz de incrementar la estabilidad de una proteína al disminuir el área superficial de contacto de la misma con el disolvente (Yoshida H. y col. Neurobiol. Dis. 2002, 10, 88-99; Reibekas A. A. y Massey V. en J Biol Chem. 1997, 272, 22248-22252). Existen otros ejemplos como son: el dimetilsulfóxido (D SO), diversas quinacrinas, /V-octil-h-valienamina (NOV), desoxinorjirimicina N- alquilada, ácido 4-fenilbutirico, antraciclinas, porfirinas y compuestos azo, entre otros. (Lin H. y col. en Biochim. Biophys Acta: Mol Basis Dis. 2004, 1-10; Sawkar A. R. y col. en Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2002, 99, 15428-15433; Burrows J. A. J. y col. en Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2000, 97, 1796-1801 , Korth C, y col. en Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2001 , 98, 9836-9841 ; May B. C. y col. en Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2003, 100, 3416-3421) Entre las chaperonas farmacológicas se encuentran la SR121463A, el VPA985, la 1-desoxigalactonojirimicina, el CP31398, el CP257042, la capsaicina, la cicloporina, la vinblatina y el verapamilo. (Morello J. P. y col. Trends Pharmacol Sci 2000, 21 , 466-469)
La mayoría de estos compuestos no han sido evaluados en humanos como inhibidores del β-plegamiento. Solo la quinacrina ha sido clínicamente aprobada y los ensayos clínicos se han realizado para evaluar la utilidad de esta molécula en pacientes con la enfermedad de Creutzfeldt- Jacob (Vogtherr M. y col. en J. Med. Chem. 2003, 46, 3563-3564)
En el caso de la EA no se ha descrito hasta el momento una terapia efectiva sobre la base del principio de funcionamiento de las chaperonas.
La inhibición de la formación de los fibrilos de βΑ resulta una estrategia terapéutica razonable. (Findies M. A. Curr. Top Med. Chem. 2002, 2, ΛΜ-Α2 ,. Yang D. S. y col. Amyioid 2001 , 8, 10-19) Así, en la literatura se describe la evaluación in vitro de péptidos miméticos, basados en la secuencia aminoacídica LVFFA a partir del βΑ, modificados en los aminoácidos N- y C- terminales y su conversión en dextrógiros y otros retro-péptidos-miméticos, pero su aplicación farmacológica aún está lejos de ser una realidad. (Chaudhuri, T. y Paul, S. en FEBS Journal 2006, 273, 1331-1349, McFadden, F. en CA 2, 240,05_A1 ; Fezoui, Y. y Soto-Jara, C. en US 2007/0155955 A1)
Existen también numerosas patentes relacionadas con el uso de compuestos no peptídicos, cuyo uso ha sido descrito como inhibidor o desestabilizador de las fibras amiloides, sin embargo hasta el momento los mismos no han sido totalmente eficaces contra el blanco terapéutico.
Así, en la patente de Szarek y col. {US 5,869,469) se reivindica un método para modular los depósitos βΑ en humanos, con la administración de un compuesto o su sal farmacológicamente aceptable, que contiene un grupo fosfonato y un carboxilato, sin que se expongan resultados experimentales que avalen lo propuesto.
Cooper, G. y col. en WO 03/063880 proporciona una metodología para bloquear la toxicidad de las proteínas amiloides en células con el uso de uno o varios compuestos policíclicos. Entre ellos, preferiblemente los poliacenos, sustituidos o no, que contengan tres o cuatro anillos. En particular, esta invención relata los métodos de irrupción de la transición de la amilina (IAPP) desde su estado nativo soluble al estado oligomérico y/o fibrilar insoluble, así como la inhibición de los agregados amiloideos pre- o protofibrilares y fibras. Estos compuestos también disminuyen la producción de las proteínas amiloides de manera que pueden ser usados en la prevención y tratamiento de la amiloidosis pancreática. En específico se describe un método de tratamiento para la DM2. Entre los compuestos empleados están la quinacrina, la clorpromazina y la tetraciclina. Así también, como otros compuestos relacionados con las tetraciclinas, la acridina, la fenotiazinas, la antraciclinas, quinacrinas, clorpromazina y Rojo Congo (RC).
Por otra parte Watanabe K. y col en US 8, 106,045B2 plantean que compuestos policíclicos del tipo 2-morfolino-4-pirimidona y sus derivados pueden ser eficaces para la prevención y el tratamiento de la EA causada por la hiperactividad de la proteína tau, reivindicando la acción de estos compuestos frente a las estructuras amiloideas presentes en otras patologías neurodegenerativas, DM2 y ciertas neoplásicas.
El empleo de derivados aromáticos polihidroxilados para el tratamiento de la amiloidosis presente en la EA y en las enfermedades caracterizadas por la presencia de fibrilos de la proteína α-sinucleina en la EP y en los cuerpos de Lewis, ha sido reivindicado en la patente US 2001/004703A21 , por Castillo G. y colaboradores. Asimismo, se reivindica el tratamiento de otras enfermedades amiloidegénicas sobre la base de un método que podría ser efectivo para reducir, eliminar o prevenir la formación de depósitos fibrilares en el cerebro de pacientes humanos. Entre los compuestos evaluados están: miricetina, exifona, pirogallol, acido tánico, pirocatecol, quercetina, ácido elágico, 1 , 2, 4-bencenotriol, 5- hidroxidopamina, gallamida trihidratado, ácido gálico, galato de etilo y ácido quínico entre otros.
Borje V. y Kurt L. (US 5,637,571) declara el empleo de acétales de podofilotoxina D-glucopiranosida y 4'-dimetilpodofilotoxina D-glucopiranosida, derivados de lignano, en la preparación dé composiciones farmacológicas para el tratamiento o profilaxis de enfermedades amiloidegénicas, entre ellas la EA.
En el 2007, se publico una patente (US 2007/0015737 A1) por Clark A. y col. la cual reivindica el empleo de una amplia gama de compuestos orgánicos que poseen una cadena alquílica, formada a lo sumo por dos átomos de carbono tri- sustituidos, con múltiples variantes. Los sustituyentes pueden ser un simple elemento (ej: H, O, N), grupos funcionales (ej: esteres), grupos aniónicos o heterociclos de diferente complejidad. De manera específica, ellos reportan como compuestos terapéuticos al ácido 3-(3-hidroxi-1-propil)amino-1 -propanosulfónico, al ácido DL-2-amino-5-fosforovalérico, a la 4-fenil-1-(3'-sulfopropil)-1 , 2, 3, 6- tetrahidropiridina, al ácido ciclohexilsulfámico, a la O-fosfo-L-serina, al ácido hexafluoroglutárico, al ácido 8-metoxiquinolina-5-sulfónico, al ácido 3-amino-2- hidroxi-1-propano sulfónico y al ácido 3-dimetilamino-1-propano sulfónico, así como sus esteres, ácidos o sales farmacéuticamente aceptables. Estos compuestos de acuerdo a los autores, pueden ser usados para inhibir, reducir o irrumpir los depósitos amiloideos in vivo. Así esta invención provee un método y la composición farmacología para el tratamiento de la amiloidosis. Otros tipos de moléculas que se unen de manera específica a los depósitos de la proteína insoluble amiloide son los derivados de estirilbencenos {Zhuang y col. en J. Med. Chem., 2001, 44, 12, 1905-14) y de piridina (Kung y col. en Mol. Imaging Bioi, 2003; 5, 6, 418-26). También, los derivados de estilbenceno que muestran Kung y col. en WO 03018070 y en WO 2006066104 han sido efectivos como inhibidores de la agregación amiloidea.
Se sabe a raíz de los estudios epidemiológicos, que el empleo de fármacos antiinflamatorios no-esteroideos (NSAIDs de sus siglas en inglés Non Steroidal Anti-inflammatory Drugs) retarda la aparición de la EA. (Breitner J.C.S. y col. en Neurobiol Aging. 1995; 16, 523-530; Stewart W. F. y col. en Neurology 1997; 48, 626-632; Lim G.P. y col. en J. Neuroso. 2001 ; 20, 15, 5709-5714; Rogers J. y col. en Neurology 1993; 43: 1609-1611 ; Agdeppa E. D. y col. Neurosciences. 2003, 117, 723-730) Todos estos fármacos contienen anillos aromáticos en su estructura general. Diferentes investigaciones, orientadas a la búsqueda de moléculas que puedan ser empleadas en el diagnóstico o en el tratamiento de la EA se basan en estas estructuras químicas.
Algunas de estas moléculas han sido marcadas con 18F para la detección de placas amiloides por técnicas imageneológicas con resultados alentadores. (Shoghi-Jadid K y col. en Am. J. Geriatr. Psychiatry. 2002,10, 24-35; Braskie M.N. y col. en Neurobiol. Aging. 2010; 31 , 10, 1669-1678; Barrio JR y col. en J. Nutr. Health Aging. 2008, 12, 1 , 61 S-65S; Henriksen G y col. en Eur. J. Nucí. Med. Mol. Imaging. 2008, 35 (Suppl 1),S75-S81 )
En la patente US 5,276,059, titulada "Inhibición de enfermedades asociadas con la formación de fibras amiloides", se plantea que el empleo del RC, un derivado de él o una sal aceptable del mismo, puede ser empleado para el tratamiento de las enfermedades que se originan por la formación de fibras amiloidegénicas. Esta invención reporta que los compuestos reivindicados son capaces de interferir en el proceso de amilodogénesis o en la inestabilidad de la estructura de la proteína formada, preferentemente las involucradas en los tejidos del sistema nervioso y en el páncreas en el caso de la DM2. En los años 90 del siglo pasado, se describieron resultados en los que se corroboraba la acción inhibitoria in vitro del RC frente a los depósitos βΑ (Burgevin y col. en NeuroReport 1994, 5, 2429; Lorenzo y Yanker en Proc. Nati. Acad. Sci 1994, 91 , 12243; Pollack y col. Neuroscience Letters 1995,
10 184, 1 13; Po!lack y col. Neuroscience Letters 1995, 197, 21 1). Sin embargo, en el caso que se desee emplear este compuesto, sus sales o sus derivados en el tratamiento in vivo de alguna enfermedad del sistema nervioso central, se tendría que tener en cuenta que sólo el 0.03% de RC es capaz de atravesar la barrera hematocefálica (BHC). (Tubis y col. J. Amer. Pharm. Assn. 1960, 49, 422) Asimismo, se conoce que determinados azo-colorantes pueden ser cancerígenos (Morgan y col. Environmental Health Perspectives 1994, 102 (supp.), 2, 63) por lo que el empleo terapéutico de este tipo de compuestos debe estar avalado por amplios estudios.
Klunk W. y col. describen en su patente {US 6, 133,259) la utilización de derivados no-azo de la Chrysamina G en composiciones farmacéuticas para el tratamiento y diagnostico de enfermedades originadas por la aparición de fibras amiloidegénicas, como: la EA, el síndrome de Down, la DM2, la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, entre otras...
El empleo de otros compuestos aromáticos como el ácido pamoico, sus derivados y análogos aparecen en la patente de Gallo y col. (en WO 0200603), para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por la deposición de agregados amiloideos. En particular, el ácido pamoico es un derivado del ácido naftoico que tiene en su estructura dos grupos naftilo. Minetti y col. en WO 2007045593 describen otros naftil-derivados que también inhiben la agregación amiloidea y que según sus inventores atraviesan la BHE. Asimismo, Hays y col. en WO 9716194 describen algunos compuestos naftil-azo, que también inhiben la agregación amiloide y pueden emplearse en composiciones farmacéuticas para tratar las patologías derivadas de estas estructuras.
Hasta el momento no se ha desarrollado un tratamiento efectivo que retrase la aparición y/o la evolución de ECs (amiloidogénicas), entre ellas la EA y la DM2. La Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos de América (FDA por sus siglas en Inglés Food Drug Administration) ha aprobado el empleo de donepezilo, rivastigm/na o galantamina, sin embargo estos fármacos no detienen la evolución o reinvierten el proceso neurodegenerativo de la EA y sólo son efectivos transitoriamente por unos meses o pocos años. La presente invención proporciona un nuevo método de prevención y tratamiento terapéutico de las ECs y en particular las de origen amiloideo, a través de la inhibición, reducción, desagregación de las estructuras prefibrilares, protofibrillas, fibras y placas, todas ellas caracterizadas por presentar estructuras tóxicas β cruzadas como las mencionadas en la Tabla 1 , entre otras muchas que pudieran surgir en el futuro, por la administración de compuestos, considerados en esta invención como chaperoninas químicas, de Fórmula I. Estos compuestos y sus procedimientos de obtención se describen en la patente Cubana N° 2009-57, PCT- CU2010-000001, WO/2010/ 18706, EP 2 436 666 A20, y en las solicitudes de Patentes: México N° 29/2011 , Brasil: 27/2011 , EEUU 10/2012, Malasia 12/2012, Japón 9/2012, Canadá 7/2012, Sudáfrica 18/12012, entre otros.
Estos compuestos pueden ser utilizados en cualquier composición farmacéutica aceptable y administrados por diferentes vías, como monoterapia o en combinación de uno o varios compuestos, sus sales, profármacos o solvatos que son capaces de inhibir, reducir, eliminar o desagregar entre otras, estas estructuras originadas por un plegamiento anómalo de las proteínas. Estos compuestos también podrían ser administrados para revertir por completo la formación de dichas fibras.
Como extensión de esta invención se incluye el tratamiento de enfermedades susceptibles de beneficiarse de las actividades biológicas mostradas por los compuestos descritos en la presente invención, o bien de una sal, derivado, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo.
Tal como aquí se utiliza, el término "derivado" incluye tanto a compuestos farmacéuticamente aceptables, es decir, derivados de los compuestos de Fórmula I que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como a derivados farmacéuticamente no aceptables, ya que éstos podrían ser útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente aceptables.
El término "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto de la Fórmula I, por ejemplo, ésteres, incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos, amidas, sin limitarse a estos ejemplos, que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, dicho compuesto de Fórmula I. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de
12 Fórmula I cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de la Fórmula I en un compartimento biológico. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos de los compuestos de la Fórmula I que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. Para su aplicación en terapia, los compuestos de la Fórmula I, sus isómeros, sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% de los compuestos de la Fórmula I, o de sus sales, solvatos o profármacos.
Los compuestos de la invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y/o solvatos, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen, pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende uno o varios compuestos de la Fórmula I o un profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para
13 producir el efecto deseado y en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos.
Se deben considerar los datos clínicos del paciente, como la edad, estado de! paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
En la presente invención otros objetos, ventajas y características se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
DEFINICIONES:
Proteína amiloidegénica. Se refiere a cualquier polipéptido. Preferiblemente polipéptido que se encuentra desplegado o mal plegado el cual requiere que se repliegue; alternativamente puede ser un polipéptido plegado que no se mantiene en su estado bien plegado o bien se encuentra formando protofibrillas y fibras amiloides. Ejemplos de polipéptidos incluye aquellos que son relevantes en medicina o biotecnología como anticuerpos, insulina, amilina, péptido β amiloide, toxinas, hormonas, etc. (Tabla 1)
Promoción del plegamiento: Se refiere a dos situaciones. La primera es aquella en la cual el polipéptido que se va a replegar está en un estado desplegado o con plegamiento anómalo o en ambos. En este caso, el replegamiento correcto es promovido por el método de invención. En la segunda situación el péptido mal plegado ya está formando protofibrillas y/o fibras amiloides y en este caso el método de invención sirve reducir y/o inhibir, la formación de protofibrillas y fibras amiloides o para desagregar y destruir las fibras ya formadas.
Chaperonina química. En general es un compuesto químico de bajo peso molecular, sin que esto sea una limitante en su definición, que participa en la promoción del plegamiento de las proteínas en forma no enzimática, y evitan conformaciones anómalas facilitando el alineamiento estructural del polipéptido y corrigiendo anomalías en el proceso. Se une a los polipéptidos que están inestables o en un estado estructural no nativo o con una estructura secundaria o terciaria incorrecta. Estas chaperoninas químicas incluyen a los compuestos de la Fórmula I.
14 Acumulación. Almacenamiento, en este caso, de péptidos fibrilares y/o sus precursores oligoméricos en el interior o exterior de la célula.
Agregación. Se refiere a la polimerización de oligómeros mal plegados que tienen la capacidad de formar interacciones entre ellos.
Amiloidogénico. Que tiene la propiedad de formar fibras con estructuras β- cruzadas.
Apoptosis. Es un proceso de muerte celular programada, en el que la célula se autodestruye con la finalidad de evitar la progresión de un daño tanto a nivel local como tisular.
Barrera Hematoencefálica (BHC). Es la separación entre el sistema circulatorio y el entorno extracelular del sistema nervioso central. Está conformada por las paredes vasculares formadas por células íntimamente unidas en los capilares del SNC.
Blancos Terapéuticos. Órgano, tejido, célula, receptor, gen, proteína, u otros, que son la diana terapéutica o el centro de ataque de cierto tratamiento.
Citotóxico. Es cualquier compuesto que tiene la facultad de interferir con los procesos celulares normales, causando daños y en ocasiones la muerte celular. Compuestos azo. Se refiere a compuestos que contienen en su estructura un grupo azo (-N=N-).
Conformación. Es la estructura tridimensional que adopta un compuesto químico en relación con la rotación que ocurre a través de uno o más enlaces covalentes sencillos.
Conformación Funcional. Se refiere a la estructura de una proteína, en la que ésta puede llevar a cabo todas las funciones para las que está diseñada.
Control Celular. Son los mecanismos propios de la célula que tienen como objeto el mantener la integridad de la misma y de su entorno.
Derivado. Son aquellas sustancias químicamente similares a una sustancia madre. Derivados del Naftaleno. Son aquellos compuestos químicos que contienen un grupo bicíclico aromático igual al del naftaleno en su estructura. En el presente documento se refiera a los derivados de la Fórmula I.
Enfermedades Conformacionales. Son el conjunto de enfermedades cuya fisiopatología está basada en la acumulación de fibras y la formación de oligómeros tóxicos de un péptido o proteína mal plegado de conformación β-cruzada (Tabla 1).
15 Estrés térmico. Se refiere al fenómeno en el que ocurre daño celular por exposición a temperaturas mayores a las óptimas. Durante el estrés térmico se afectan enzimas y proteínas generando daños a la maquinaria celular y en algunos casos la muerte celular.
Farmacéuticamente aceptable. Referente a las sales que pueden ser administrados como agentes terapéuticos.
Glicosilación o Glucosilación. Implica la conjugación de los grupos amino tanto terminales como laterales con moléculas con mono, di y oligosacáridos.
Inhibición. Se refiere a una disminución en la actividad normal. En el caso del presente, se refiere a la disminución en la cinética de agregación de los péptidos y proteínas por la presencia de un compuesto.
Lámina β-cruzada. Es una de las conformaciones secundarias que pueden adoptar las proteínas, en las que varias cadenas lineales se estabilizan entre sí por medio de interacciones cruzadas.
Modulación. Se refiere a la intervención de las chaperoninas en el proceso de agregación de péptidos mal plegados. Puede ser modulación positiva o negativa. Modulador. Se refiere a los compuestos de Fórmula I capaces de inhibir, reducir, eliminar y desagregar las estructuras que provocan un plegamiento anómalo de las proteínas.
Monoterapia. Es la administración de una sola sustancia para combatir una patología.
Neurodegenerativo. Se dice que un proceso es neurodegenerativo cuando produce de manera crónica la muerte o el mal funcionamiento neuronal.
Oligómero. Son agregados solubles de alto peso molecular.
Péptido Amiloide. Se refiere a agregados fibrosos e insolubles que comparten varias características, entre las cuales está un alto contenido de dominios en forma de lámina β-cruzada.
Placas seniles. Son agregados de proteínas amiloides en el exterior de las neuronas.
Plegamiento. Es el proceso mediante el cual una proteína adopta su conformación nativa. En algunas ocasiones es asistido por las chaperoninas.
Prefibrilar. Dícese de aquellos oligómeros agregados y solubles que no han formado fibras.
16 Principio Activo. Es aquella sustancia que tiene un efecto biológico dentro de una preparación farmacéutica.
Profármaco. Son sustancias, que se pueden transformar en el organismo en un fármaco con actividad terapéutica.
Protofibrillas. Son oligómeros de péptidos que al interactuar con otros oligómeros similares pueden dar origen a fibras.
Vía de Administración. Es la forma en la que se va introducir un fármaco al cuerpo de un paciente. DESCRIPCION DE LAS FIGURAS.
Figura 1: se presentan las estructuras y nombre IUPAC de los compuestos seleccionados, como ejemplos no limitativos de la Fórmula I, cuyas evaluaciones son ejemplificadas, así como de los compuestos de referencia utilizados (naproxeno y curcumina).
Figura 2: se muestran micrografías electrónicas de transmisión del proceso de fibrilogénesis de la Albúmina de Suero Humana (HSA) (3.017 μΜ) en presencia de la chaperonina A (3.017 μΜ y 9.051 μΜ). Incubadas a 65 °C durante 72 hrs en Tris (pH 7.4; 20 mM).
Figura 3: se presenta la cinética de formación de fibras de la HSA (300 μΜ) a 42 °C con el tampón de Glicina (pH=3; 50 mM; NaCI 100 mM), en presencia o no de las chaperoninas A; B, C, D evaluadas (300 μΜ), medida a través de espectroscopia de fluorescencia con Tioflavina-T (ThT 24 μΜ)..
Figura 4: se presenta la cinética de formación de fibras de la Albúmina de Suero Bovino (BSA) (100 μΜ) en presencia o no de las chaperoninas A, B, C, D, E, F y G (1 μΜ), a 65 °C en Glicina (pH=3; 50mM; NaCI 100mM), medida a través de espectroscopia de fluorescencia con Tioflavina-T (ThT 24 μΜ).
Figura 5: se muestran las imágenes de Microscopía Electrónica de Fluorescencia del proceso de fibrilogénesis de la BSA (100 μΜ) en presencia o no de las
17 chaperoninas A, B, C, D, E, F y G (1 μΜ), a 65 °C en Glicina (pH=3; 50 mM; NaCI 100 mM), con Tioflavina-T (ThT, 20 μΜ).
Figura 6: se presenta la cinética de formación de fibrilos de la BSA (50 μΜ) en presencia o no de las chaperoninas B, C, D, E, F y G, seleccionadas como ejemplos no limitativos de la Fórmula I (Parte A de la figura) y el efecto inhibidor (Parte B de la figura) de la formación de los fibrilos por acción de estas chaperoninas a 50 μΜ, 75 °C en PBS (pH=8.9; 100 mM), medida a través de espectroscopia de fluorescencia con Tioflavina-T (ThT 24 μΜ).
Figura 7: se presenta el efecto de la concentración de las chaperoninas A, B, C y D, seleccionadas como ejemplos no limitativos de la Fórmula I, sobre la cinética de formación de fibrilos de BSA (100 μΜ; relación molar de BSA: Chap 1 :0, 1 :0.0025; 1 :0.005; 1 :0.01 ; 1 :0.02; 1 : 0.1 y 1 :1) a 65 °C en Glicina (pH=3; 50mM; NaGI 100mM), en presencia de ThT (24 μΜ).
Figura 8: se presenta los valores de IC50 experimentales para las chaperoninas A, B, C y D, determinados a partir del efecto inhibitorio de las mismas sobre el proceso de la fibrilogénesis de la BSA (300 μΜ; relaciones molares de BSA: Chap: 1:0; 1 :0.01 ; 1 :0.05; 1 :0.5; 1 :1 ; 1 :2.5; 1 :5) a 42 °C en Glicina (pH=3; 50 mM; NaCI 100 mM), en presencia de ThT (24 μΜ).
Figura 9: se muestran micrografías electrónicas de transmisión del proceso de fibrilogénesis de la BSA (75 μΜ) en presencia o no de las chaperoninas A, B, C, D, E, F y G (50 μΜ) seleccionadas como ejemplos no limitativos de la Fórmula l, en Tris (pH=7.4;, 20 mM), 75 °C, 3 h., sin agitación.
Figura 10: se presenta la cinética de formación de fibrilos del fragmento 20-29 del IAPP (100 μΜ) a 25 °C en PBS (pH 7.4; 100 mM; NaCI 100 mM) en presencia o no de las chaperoninas A, B, C, D, E, y F (100 μΜ), seleccionadas como ejemplos no limitativos de la Fórmula I (Parte A de la figura) y el efecto inhibidor (Parte B de la figura) de la formación de los fibrilos por acción de estas chaperoninas. Relación molar lAPP.ThT de 50:1.
18 Figura 11: se presenta el efecto de la concentración de la chaperonina B (relaciones molares de lAPP: Chap B: 1 :0.5; 1 :1 , 1.5), seleccionada como ejemplo no limitativo de la Fórmula I, sobre la cinética de formación de fibrilos del fragmento 20-29 del lAPP (100 μΜ) a 25 °C en PBS (pH 7.4; 100 mM; NaCI 100 mM). Relación molar IAPP:ThT de 50: .
Figura 12: se muestra la evaluación de la viabilidad celular de cultivos celulares de Células Granulares de Cerebelo (CGC) de ratas, expuestos a fragmentos de lAPP (fragmento 20-29 del lAPP: monomérico no agregado y agregado), en presencia o no de las chaperoninas B y D, seleccionados como ejemplos no limitativos de la Fórmula I. Compuesto de referencia: Curcumina.
Figura 13: se presenta la evaluación de la apoptosis celular de cultivos celulares de Células Granulares de Cerebelo (CGC) expuestos a fragmentos de lAPP (fragmento 20-29 del lAPP: monomérico no agregado y agregado), en presencia o no de las chaperoninas B y D, seleccionados como ejemplos no limitativos de la Fórmula I. Compuesto de referencia: Curcumina. Figura 14: se presenta la evaluación de la actividad protectora y/o reacondicionante de las chaperoninas B, C y D, como ejemplos no limitativos de la Fórmula I, al ser administradas a cultivos de Células Granulares de Cerebelo (CGC), que al unísono son sometidas a un medio bajo en potasio, -KCI. La parte A de la figura presenta los resultados con respecto al control de -KCI (efecto protector) y la parte B de figura presenta los resultados con respecto al control de potasio estándar +KCI (efecto reacondicionante).
Figura 15: se presenta la evaluación de la actividad protectora y/o reacondicionante de las chaperoninas B, C y D, al ser administradas a cultivos de Células Granulares de Cerebelo (CGC) 4 h después de que éstos fueron expuestos a un medio de cultivo bajo en potasio (-KCI). La parte A de la figura presenta los resultados con respecto a -KCI (efecto protector) y la parte B de la figura presenta
19 los resultados con respecto al control de potasio estándar (+KCI) (efecto reacondicionante).
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos, los cuales no deben interpretarse en forma alguna como limitativos de la presente invención, ilustran el nuevo método de prevención y tratamiento terapéutico de las ECs y en particular las de origen amiloideo (EA, DM2, EP, EH, ETT, entre otras), a través de la inhibición, reducción, desagregación de las estructuras prefibrilares, protofibrillas, fibras y placas amiloides, con empleo de los compuestos de la Fórmula I, considerados en esta invención como chaperoninas químicas.
Ejemplo 1.~ Evaluación del carácter modulador de las chaperoninas en la formación de fibras de HSA mediante microscopía electrónica transmisión (TEM).
La preparación de las muestras se realizó a una concentración final de HSA de 3.017 μΜ en el tampón Tris (pH= 7.4; 20 mM), en presencia o no de la chaperonina A (3.017 μΜ y 9.051 μΜ). Se incuba a 65 °C durante 72 horas. Se toman alícuotas cada 2 h. para el estudio de TEM.
Se coloca la solución de HSA (5 ί) en rejillas de cobre de 300 mesh recubiertas con formvar durante 3 minutos. El exceso de solución se retira con micropipeta. Posteriormente, se agrega acetato de uranilo (5 pL, 2%), previamente se centrifugó a 12000 rpm por 10 minutos. El exceso de contrastante se retira a los 2 min. y las rejillas se secan al aire durante un tiempo suficiente. La observación y registro de las muestras se realiza utilizando un microscopio Jeol modelo JEM-1010 operado a 80 keV y acoplado a una cámara digital MTI modelo CCD-300-RC.
La figura 2 se muestra que en ausencia de chaperoninas se producen abundantes fibras largas y contorneadas de HSA, al cabo de 48 horas. En cambio, en presencia de la chaperonina A, las fibras son muy pequeñas y cortas. Asimismo, se observa que a mayor concentración de chaperonina A las fibras prácticamente desaparecen y se observan sólo oligómeros, por lo que se infiere el carácter inhibidor de la chaperonina A.
20 Ejemplo 2.- Evaluación de la capacidad moduladora de las chaperoninas en la formación de fibras de albúmina de suero humano (HSA).
Preparación de las soluciones de estudio.
Tioflavina-T (ThT): Se disuelve Th-T (Sigma, 47 mg) en agua y se enrasa a un volumen final de 25 mL.
HSA: Se disuelve HSA a concentración final de 300 μΜ y se enrasa a un volumen final de 10 mL con el tampón (Glicina, pH=3; 50 mM; NaCI 100 mM). La disolución se filtra a través de un filtro de jeringa del tipo acrodisco con poro 0.20 pm (Supelco Analytical).
Chaperonina: Se disuelve la chaperonina seleccionada, como ejemplo no limitativo de la Fórmula I, (75.4 pmol; A, B, C, D, figura 1) en 25 mL de DMSO.
Procedimiento experimental.
Se toman 250 pL de la solución de HSA (300 μΜ) y las mezcla de HSA con las chaperoninas (300 μΜ) y se depositan en los pocilios (placas de poliestireno de 96 pocilios, Costar 3615, Special Optics Píate) correspondientes adicionando ThT (1 pL) a cada pocilio para obtener una concentración final de 24 μΜ. Las señales de fluorescencia se miden a Aem¡s = 482 nm (Aexc¡t = 450 nm) en un espectrofotómetro de fluorescencia Infinite M1000, TECAN, Austria. Las lecturas se realizaron cada 20 min a 42 °C. Todas las señales son corregidas con la señal de fondo, para lo cual se prepara un blanco que contiene ThT en agua, sin la HSA.
En la figura 3 se muestran los resultados obtenidos de la cinética de formación de las fibras de HSA (300μΜ) a 42 °C con el tampón de Glicina (pH=3; 50mM; NaCI 100 mM), en presencia o no de las chaperoninas evaluadas (300 μΜ). Se observa que en el proceso de fibrilogénesis de la HSA no presenta una fase lag. Cuando se adicionó la chaperonina se apreció una disminución en la intensidad de fluorescencia (IF) de la ThT, lo que se corresponde con una menor cantidad de fibrilos. Esto demuestra la capacidad inhibitoria de las chaperoninas el proceso de fibrilogénesis de la HSA.
21 Ejemplo 3.- Evaluación del carácter modulador de las chaperoninas en la cinética de formación de fibras de albúmina de suero bovino (BSA), mediante espectroscopia de fluorescencia. Preparación de las soluciones de estudio.
Tioflavina-T (ThT): Se disuelve Th-T {Sigma, 10 mg) en agua y se enrasa a un volumen final de 5 mL.
BSA: Se disuelve BSA (fracción V, MM: 66 296 Da, 500 mg) y se enrasa a un volumen final de 10 mL con el tampón (Glicina, pH=3; 50 mM; NaCI 100 mM). La disolución se filtra a través de un filtro de jeringa del tipo acrodisco con poro 0.45 pm (Sigma-Aldrich). Se calcula la concentración exacta de la BSA, considerando el valor reportado del coeficiente de extinción molar (ξ=43 824 AU-cm~1-M~1).
Chaperonina: Se disuelve la chaperonina seleccionada, como ejemplo no limitativo de la Fórmula I, (75.4 μιτιοΙ; A; B, C, D, E, F y G, figura 1) en 1.2 mL de DMSO y se enrasa a un volumen final de 10 mL con el tampón.
Procedimiento experimental.
Se toman 250 pL de la solución de BSA (100 μΜ) y las mezclas de BSA con las chaperoninas (1 μΜ) y se depositan en los pocilios correspondientes adicionando ThT (1 pL) a cada pocilio para obtener una concentración final de 24 μΜ. Las señales de fluorescencia se miden a Aem¡s = 482 nm (AexC¡t = 450 nm) en un espectrofotómetro de fluorescencia Infinite M1000, TECAN, Austria, (placas de poliestireno de 96 pocilios, Costar 3615, Special Optics Píate). Las lecturas se realizaron cada 10 min con previa incubación a 65 °C. Todas las señales son corregidas con la señal de fondo, para lo cual se prepara un blanco que contiene ThT en agua, sin la BSA.
En la figura 4 se muestran los resultados obtenidos de la cinética de formación de las fibras de BSA (100mM) a 65 °C con el tampón de Glicina (pH=3; 50mM; NaCI 100 mM), en presencia o no de las chaperoninas evaluadas (1 μΜ). Como se observa, el proceso de fibrilogénesis de la BSA no presentó una fase lag bien definida y se estabilizó a partir de los 120 min. aproximadamente. Cuando se adiciono la chaperonina se apreció una disminución en la intensidad de fluorescencia (IF) de la ThT, lo que se corresponde con una menor cantidad de
22 fibrilos. Esto evidencia que en presencia de la chaperonina el proceso de fibrilogénesis se inhibe.
Ejemplo 4.- Evaluación del carácter modulador de las chaperoninas en la formación de fibras de BSA mediante microscopía de fluorescencia.
La preparación de las muestras se realiza de forma similar al descrito en el ejemplo 3. La placa se incuba a 65°C durante 3 h., después se depositan 100 pL de muestra en un tubo eppendorf se le agrega ThT para alcanzar una concentración final de 20 μΜ. Se centrifugaron las muestras a 1300rpm, durante 2 minutos. Se depositan 6 pL de muestra en un portaobjeto con su cubreobjeto. Se observan a través del microscopio de fluorescencia Zeiss Axiostar plus, con lámpara HBO 50/AC, con filtro de color azul. Las imágenes de se registran a 10x.
En la figura 5, se muestran ejemplos de las micrografías obtenidas al final del experimento. En la micrografía corresponde a la BSA sin chaperoninas se observaron fibras largas y abundantes. En cambio, cuando se usan chaperoninas se apreciaron fibras cortas y menos abundantes. Este resultado demuestra la capacidad de las chaperoninas para inhibir el proceso de fibrilogénesis proteica.
Ejemplo 5.- Evaluación del carácter modulador de las chaperoninas en la cinética de formación de fibras de BSA, mediante espectroscopia de fluorescencia.
Peparación de las soluciones de estudio.
Tioflavina T (ThT): Se disuelven 100 mg de ThT (Sigma) en agua y se enrasa a un volumen final de 10 mL.
BSA: Se disuelven de BSA (fracción V, MM: 66 296 Da; 500 mg) y se enrasa a un volumen final de 25 mL en el tampón (PBS 0.1 M, pH=8.9¡ Tris 20 mM, pH=7.4 o Glicina 50 mM, sin y con NaCI 100 mM, pH=3). Se calcula la concentración de la BSA, considerando el valor reportado del coeficiente de extinción molar (ξ =43824 AU-crn ^M"1).
Chaperonina: Se disuelve la chaperonina seleccionada como ejemplo no limitativo de la Fórmula I (75.4 pmol: A, B, C, D, E, F y G, figura 1 ) en DMSO y se enrasa a un volumen final de 10 mL con el tampón seleccionado.
23 Procedimiento experimental.
Las soluciones de BSA (BSA en ausencia de chaperonina a 50 μΜ) y las mezclas de BSA a la misma concentración con chaperoninas (relaciones molares de BSA: chaperonina: 1 :0; 1 :0.0025; 1 :0.005; 1 :0.01 ; 1 :0.02; 1 :0.1 ; 1 :1 ; 1 :2) se pasan a través de filtros de jeringa del tipo acrodisco con poro 0.2 μιη (Sigma-Aldrich). Estas soluciones se incuban a una temperatura de entre 20 y 75 °C, sin agitación. A continuación, se extrae una alícuota homogénea de estas mezclas y se adiciona ThT (10mg/mL) para obtener una solución con una relación molar BSA.ThT de 50:1. Las señales de fluorescencia se miden a Aem¡s = 482 nm (Aexcit = 450 nm) en un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse (formato de celdas) o Infinite M1000, TECAN, Austria, (formato de placas de poliestireno de 96 pocilios, Costar 3615, Special Optics Píate), ambos equipados con control de temperatura. Todas las señales son corregidas con la señal de fondo, para lo cual se prepara un blanco que contiene ThT en agua, sin la BSA.
Para el cálculo de IC50 se prepararon soluciones de BSA (300 μΜ) y mezclas de BSA con chaperoninas a relaciones molares de BSA: chaperonina: 1 :0; 1 :0.01 ; 1 :0.05; 1 :0.5; 1 :1 ; 1 :2.5; 1 :5. Las muestras fueron tratadas de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente. En la figura 6 (Parte A), se muestra los resultados obtenidos de la cinética de formación de las fibras de BSA (50 μΜ) a 75 °C en PBS (pH=8.9; 100 mM), en ausencia y presencia de las chaperoninas evaluadas a la misma concentración. Como se observa, el proceso de fibrilogénesis de la BSA no tiene una fase lag y se alcanza la meseta en los primeros 50 minutos. De manera general, existe una disminución de la concentración de fibrilos de la BSA en presencia de las chaperoninas expresada por el decremento de la IF de la ThT con respecto al control de BSA.
En la Parte B de la figura 6, se observa que en presencia de cualquiera de las chaperoninas evaluadas, existe una disminución significativa de la IF de la ThT al cabo de los 150 minutos. Este efecto es más evidente cuando se usan las chaperoninas F y G, siendo notoriamente mayor que el efecto del compuesto de referencia (chaperonina C o Naproxeno). Esto indica una inhibición en el proceso de formación de fibrilos de BSA.
24 Asimismo en la figura 7, se observan los resultados del proceso de fibrilogénesis de la BSA en presencia de las chaperoninas A, B, C y D en tampón Glicina (pH= 3; 50 mM; NaCI 100 mM). La inhibición de la formación de fibras sigue siendo efectiva a relaciones molares BSA.Chap inferiores a 1 :1 , con respecto a 1 :0. De manera general, se evidencia que el proceso de fibrilogénesis se ve modulado en dependencia de las concentraciones empleadas para una misma chaperonina, disminuyendo significativamente la concentración de fibras obtenidas.
En la figura 8, se muestra la tabla con los valores de IC50, obtenido para cada inhibidor evaluado, como ejemplo no limitativo. El cálculo se realiza a través de la interpolación de los datos por medio de una función logarítmica. Se comprueba que la actividad inhibitoria de la agregación es dependiente de la concentración de las chaperoninas. La actividad inhibitoria de las chaperoninas A y B son similares entre si y dos veces superior a C. Por otro lado, la chaperonina D fue 17 veces superior a las anteriores. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en la figura 7 y confirman la actividad moduladora de las chaperoninas evaluadas en la agregación proteica.
Ejemplo 6.- Evaluación del carácter modulador de tas chaperoninas en ta formación de fibras de BSA mediante microscopía electrónica de transmisión ΠΈΜ).
Se toman alícuotas (10 pL) del experimento descrito en el ejemplo 5 y se diluye convenientemente cada muestra en el tampón definido en ese ejemplo (dilución 1/10 ó 1/20). Se depositan 6 pL de cada una sobre rejillas de cobre de 400 mesh, recubiertas por collodion y carbono. Después de 5 minutos, se elimina el exceso de muestra utilizando papel de filtro y las preparaciones se tiñen con U02(AcO)2 (1 %). Las imágenes de TEM se registran a 80 kV con un microscopio electrónico JEM- 1010, JEOL (Japón).
La acción moduladora de las chaperoninas seleccionadas en la fibrilogénesis de la BSA, fue evaluada mediante la técnica TEM, que permite observar fibras amiloides cuyo diámetro es del orden de los 8 nm. En la figura 9, se muestran ejemplos de las micrografías obtenidas para los experimentos preparados con BSA (50 μΜ) y BSA:Chaperoninas A; B, C, D, E, F y G (relación molar 1 :1).
25 En la primera micrografía se evidencia la presencia de fibras largas y contorneadas de BSA. En el resto de las micrografías, que reflejan los experimentos realizados en presencia de las diferentes chaperoninas, se aprecian estructuras amorfas y circulares definidas como oligómeros. Estos resultados evidencian el carácter inhibitorio o desagregante de las chaperoninas seleccionadas como ejemplos no limitativos de la Fórmula I.
Ejemplo 7.- Evaluación del carácter modulador de las chaperoninas en la cinética de formación de fibras de IAPP (20-29 aa mediante espectroscopia de fluorescencia.
Preparación de las soluciones de estudio.
Tioflavína T (ThT): Se disuelven 100 mg de ThT (Sigma) en agua y se enrasa a un volumen final de 10 mL.
IAPP: el fragmento 20-29 de IAPP se sintetiza de acuerdo al procedimiento descrito (Kates, E. y Albericio, F. en Solid-Phase Synthesis; Marcel Dekker Inc.: New York, 2000; Hood, C. A.; y col. en Pepf. Sci. 2008, 14, 97-101 ). El péptido se purifica mediante cromatografía reversa semipreparativa de alta resolución (SP-HPLC por sus siglas en Inglés Semipreparative Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography) y su pureza fue mayor que 95%. La masa molecular esperada (MM: 1029 Da) fue confirmada por espectrometría de masas (ESI-MS, de sus siglas en Inglés Electrospray lonization Mass Spectrometry).
Chaperonina: Se disuelve la chaperonina seleccionada como ejemplo no limitativo de la Fórmula I (75.4 μηηοΙ) en 1.2 mL de DMSO y se enrasa a un volumen final de 10 mL con el tampón (PBS, pH 7.4, 100 mM; NaC1 00 mM).
Procedimiento experimental.
La solución del IAPP (20-29, 100 μΜ) sin y con chaperoninas (100 μΜ) se incuban a 25 °C en celdas de metacrilato (Sigma-Aldrich) volumen 4.5 mL, paso óptico 10 mm, en presencia de ThT (20 μΜ) a una relación molar IAPP:ThT de 50:1 y se agitan durante la cinética. La IF (espectrofluorómetro Cary Eclipse) se registra continuamente a
Figure imgf000028_0001
450 nm) con un ancho de banda de 5 nm. Todas las señales son corregidas con la señal de fondo, para lo cual se prepara un blanco que contiene ThT en agua, en ausencia de proteína.
26 En la figura 10 (parte A) se presenta el efecto modulador de las chaperoninas A, B, C, D, E y F en la formación de fibrilos del fragmento 20-29 del IAPP a 25 °C. Todas las chaperoninas modularon este proceso a la concentración evaluada (relación molar péptido:chap 1 :1). Las chaperoninas E y F aceleraron la formación de fibras de IAPP. En cambio, las chaperoninas A, B, C y D aumentaron el tiempo medio de formación de fibras, es decir, retrasaron el proceso de fibrilogénesis (figura 10, Parte B). En el caso de la chaperonina B, este comportamiento inhibidor se mantuvo para relaciones molares proteína.chaperonina menores o iguales que 1 :1 (figura 1 1). En cambio, cuando la relación molar es superior, se aceleró el proceso y se incrementó la concentración de fibras formadas.
Ejemplo 8.- Evaluación de la viabilidad celular de células granulares del cerebelo (CGC) en presencia de IAPP 20-29 (monómero y agregado). Efecto citoprotector de las chaperoninas.
Preparación de las muestras.
Se preparan soluciones del fragmento 20-29 de IAPP (MM: 1029 Da) en tampón PBS (pH 7.4, 100 mM; NaCI 100 mM). La concentración del péptido monomérico fue de 5.8 mM y la del péptido agregado de 32.6 mM, en DMSO. Se calcula la concentración de las proteínas mediante curva de calibración.
Chaperonina: Se preparan soluciones, en 1.2 mL de DMSO y se enrasa a un volumen final de 10 mL con el tampón, de las chaperonina B y D (25 μΜ), seleccionadas como ejemplos no limitativos de la Fórmula I. Como compuesto de referencia se emplea la curcumina (5.5 mM) preparada en etanol. (Yang, F. y col. en J. Biol. Chem. 2005, 280, 5892-5901)
Procedimiento experimental.
Los ensayos de viabilidad se realizan según los procedimientos reportados por Morán y col. (Blancas, S. y Moran, J. en J. Neurochemistry International 201 1 , 58, 934-42.J. Se utilizan cultivos celulares de células granulares del cerebelo (CGC de 8 DIV).
En particular, en esta invención, la viabilidad de los cultivos celulares de CGC se fue evaluó con el fragmento 20-29 del IAPP, en su forma monómerica y agregada o con mezclas de proteína.chaperonina a diferentes relaciones molares. De manera abreviada, en todas las muestras de CGC, se extrae la mitad del volumen del
27 medio para adicionar, independientemente, las cantidades correspondientes de proteína de ensayo o mezclas de péptido.chaperonina con diferentes relaciones molares (1 :0.3 ó 1 :1). A continuación, se reincorpora el medio enriquecido al cultivo celular y nuevamente, se incuba por 20 h. adicionales. Se estiman los niveles de viabilidad mediante el ensayo de MTT. (Benítez, A. y Morán J. en J. Neurosci Res. 2003, 71 , 383-96)
La viabilidad celular de los cultivos celulares de CGC expuestos al fragmento 20-29 del IAPP, en su forma monomérica o agregada, y en presencia o no de las chaperoninas seleccionadas fue realizada empleando la curcumina como compuesto de referencia, por su actividad disgregante reportada. (Yang, F. y col. en J. Biol. Chem. 2005, 280, 5892-5901 )
En la figura 12, se observan los resultados obtenidos de la estimación de la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT, los cuales fueron analizados por el test estadístico ANOVA de un factor, seguido de la prueba a posteriorí LSD (LSD por sus siglas en inglés Least Significant Difference).
Los resultados indicaron que el efecto citotóxico de la proteína en su forma monomérica es casi tres veces más citotóxica sobre las CGC que en su forma agregada (p<0.05). Por otra parte, cuando las células están expuestas al monómero en presencia de las chaperoninas se encontró que la viabilidad resulta dos veces mayor para la chaperonina B en las dos relaciones molares ensayadas, siendo significativamente diferente del resto de los otros compuestos evaluados (p<0.05). En el caso de la chaperonina D, la viabilidad resulta casi dos veces mayor para una relación molar de 1 :0.3, siendo significativamente diferente (p<0.05) de la viabilidad cuando las células están expuestas al monómero solamente. En cambio, en presencia de curcumina no se observaron diferencias significativas (p>0.05). Esto concuerda con algunos reportes que indican que la curcumina actúa como un potente citoprotector cuando las células están expuestas a proteínas en forma agregada y no ejercen esta función frente a las monoméricas. (Yang F. y col. en J. Biol. Chem. 2005, 280, 5892-5901)
El efecto citoprotector novedoso de las chaperoninas evaluadas sobre las CGC en presencia del monómero citotóxico de la IAPP, pudiera ser explicado a través de mecanismo de acción del tipo: inhibición de la agregación, reducción de la agregación o eliminación del monómero, entre otros.
28 En el caso de la forma agregada del fragmento 20-29 del IAPP en presencia de la chaperonina D, la viabilidad de las CGC no se diferencia significativamente con respecto a las células expuestas al fragmento 20-29 del IAPP agregado (p>0.05). Como era de esperarse, la curcumina presentó un marcado efecto citoprotector que se diferenció estadísticamente (p<0.05) del resto de los grupos de estudio.
Ejemplo 9.- Evaluación del efecto apoptótico de los fragmentos de IAPP 20-29 (monómero y agregado) y de las chaperoninas sobre células granulares del cerebelo (CGC).
Preparación de las muestras.
Se preparan soluciones del fragmento 20-29 del IAPP (MM: 1029 Da) en tampón de PBS (pH=7.4, 100 mM; NaCI 100 mM). La concentración del péptido monomérico fue de 5.8 μΜ y la del péptido agregado de 32.6 μΜ en DMSO. Se calcula la concentración de las proteínas mediante curva de calibración.
Se preparan las soluciones de las chaperoninas B y D a 25 μΜ cada una, en DMSO y curcumina (5.5 μΜ) en etanol.
Procedimiento experimental.
Los ensayos de apoptosis celular se realizan según los procedimientos reportados por J. Moran y col. (en J. Neurochem. 1999, 73, 568-77,). Se utilizan cultivos de CGC de 8 DIV.
El efecto apoptótico de las proteínas y el efecto citoprotector de las chaperoninas B y D, seleccionadas como ejemplos no limitativos de la Fórmula I, se evalúan en cultivos celulares de CGC y se utiliza como compuesto de referencia la curcumina. Brevemente, en todas las muestras se extrae del medio de cultivo la mitad de su volumen para adicionar, independientemente, las cantidades correspondientes de proteína de ensayo (IAPP, en su forma monómerica y agregada), mezclas de proteína:chaperoninas a diferentes relaciones molares (1 :0.3 ó 1 :1) o chaperoninas. A continuación, se reincorpora el medio enriquecido al cultivo celular y nuevamente, se incuba por 4 h. adicionales. La apoptosis celular se estima mediante la determinación inmunofluorescente de los niveles de caspasa-3 (J.
29 Morán y col. en J. Neurochem. 1999, 73, 2, 568-77), con el empleo del espectrofluorometro Synergy-Bioteck.
Los niveles de caspasa-3 de las CGC expuestas a las diferentes formas del fragmento 20-29 del lAPP monomérico o agregado no fueron significativamente diferentes (p>0.05), y se obtuvieron los mayores niveles apoptóticos observados (figura 13).
Se comprobó que al añadir las mezclas de lAPP (fragmento 20-29 del lAPP monomérico o agregado) con chaperoninas en la CGC, los niveles de caspasa-3 disminuyen significativamente. Así, se obtiene una inhibición seis veces mayor que los controles sin chaperonina cuando se utiliza la máxima concentración de chaperoninas B y D. Estos resultados novedosos evidencian que las chaperoninas evaluadas inhiben y/o reducen el efecto citotóxico originado por la lAPP, sobre las células de CGC, que provocan la muerte celular programada. Ejemplo 10.- Evaluación del efecto protector de las chaperoninas B, C y D sobre células granulares del cerebelo (CGC).
Preparación de las muestras.
Se preparan soluciones de las chaperoninas B, C, y D (20 mM) en DMSO.
Procedimiento experimental.
Los ensayos de apoptosis celular se realizan según los procedimientos reportados por J. Morán y col. (en J. Neurochem. 1999, 73, 568-77 . Se utilizan cultivos de CGC de 8 DIV. Los experimentos se realizan por triplicado.
El efecto reacondicionante y/o protector de las chaperoninas B, C y D, seleccionadas como ejemplos no limitativos de la Fórmula I, se evalúan en cultivos de CGC a bajas concentraciones de potasio (-KCI). El medio de cultivo de los pocilios con KCI 25 mM (+KCI) se elimina por aspiración y se sustituye por un medio -KCI (5 mM).
Las chaperoninas B, C y D (25 μΜ) se adiconan por separado, al tiempo inicial (Grupo I) o al cabo de las 4 h. (Grupo II) de la inducción del estimulo pro-apoptótico (-KCI) y se incuba 4 h. adicionales, incluyendo a los dos grupos controles: -KCI y +KCI. La apoptosis se estima mediante la determinación inmunofluorescente de los niveles de caspasa-3 (J. Morán y col. en J. Neurochem. 1999, 73, 2, 568-77), con el empleo del espectrofluorometro Synergy-Bioteck.
30 En las figuras 14 y 15 se muestran los resultados obtenidos.
En la figura 14 se observa una reducción de los niveles de caspasa-3 en las CGC del Grupo I con respecto al Grupo control -KCI. Esta reducción fue de un 92, un 80 y un 78 % para las muestras tratadas con B, C y D, respectivamente (Parte A, figura 14). Por otro lado, los niveles de caspasa-3 (Parte B, figura 14) para las muestras con las chaperoninas B, C y D del Grupo I fueron menores en un 84, 54 y un 52%, respectivamente, en relación al Grupo control +KCI. Estos resultados evidencian el efecto protector de las chaperoninas evaluadas con respecto a ambos controles.
En la figura 15 (Parte A) se observa que en el Grupo II, el nivel de caspasa-3 fue menor para las muestras tratadas con las chaperoninas B, C y D (56 %, 66% y 26%, respectivamente) con respecto al Grupo control -KCI, por lo que se evidencia un efecto protector. Sin embargo, en el caso de que se compare este nivel de caspasa-3 con el del control +KCI (figura 5, Parte B) se observa que en el caso de las chaperoninas B y C no existen diferencias apreciables. En el caso, de la chaperonina D el nivel de caspasa-3 es un 94% mayor con relación al control +KCI. De manera general, se puede concluir que la presencia de las chaperoninas B y C tienen un efecto regenerador similar al inducido por el medio +KCI.
Finalmente, estos resultados evidencian el efecto protector de las chaperoninas B, C y D sobre la apoptosis inducida debido a que compensan positivamente el estimulo estresante.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un método para el tratamiento de las enfermedades conformacionales, en las cuales están presentes fibras con estructuras β-cruzadas en mamíferos, caracterizado por la administración de una cantidad efectiva de uno o la combinación de varios compuestos, sus sales, profármacos o solvatos de la Fórmula I.
Figure imgf000034_0001
En donde: Ri: -alquilenil-C(O)NH-alquilenil-R3, -alquilenil-C(0)0-R ;
R3: -COOH, -OH, -SH, -NH2, -NH-alquil, -NH- ditiocarbamato de alquilo, -/V-(alquil)- ditiocarbamato de sales de metales alcalino-térreos, o sales de los grupos anteriormente relacionados, farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento de enfermedades amiloidegénicas.
R4: grupo succinimido;
R2: -H, -alquil
2 - La reivindicación 1 caracterizada por considerar a los compuestos de la Formula I como chaperoninas químicas, cuyo mecanismo de acción resulte de la inhibición, reducción, replegamiento, aceleración en condiciones controladas y/o desagregación de oligómeros solubles, estructuras prefibrilares, protofibrillas, fibras y placas amiloides.
3.- Método según la reivindicación 1 en donde las chaperoninas son preferentemente: /V1-(2-aminoetil)-/V4-(1-naftil)succinimida, metil (2-{[4-(1- naftilamino)-4-oxobutanoil]amino}etill)ditio carbamato, A/-[4-(1 -naftilamino)-4- oxobutanoil]- -alanina, 6-{[4-(1-naftilamino)-4-oxobutanoil]amino} ácido hexanoico, Λ/3, /V3 -butano-1 ,4-bis(A/1 -1 -naftilsuccinamida), Λ/1 -(2-aminobutil)-/V4-(1 -
32 naftil)succinimida o sales, profármacos o solvatos farmacéuticamente aceptables de ellos.
4. - Un método según las reivindicaciones 1 , 2 y 3 para el tratamiento de enfermedades conformacionales en general, preferentemente de la Diabetes
Mellitus tipo 2, la Enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Enfermedad de Huntington, las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET), entre otras.
5. - Un método de prevención de la formación de oligómeros solubles, estructuras prefibrilares, protofibrillas, fibras y placas amiloides, presente en enfermedades conformacionales en mamíferos, caracterizado por la administración de una cantidad efectiva de una o varias chaperoninas reivindicado en 1 , 2, 3 y 4.
6. - Un método para la disminución del efecto citotóxico de las estructura β-cruzadas presentes en las enfermedades conformacionales, caracterizado por la administración de una cantidad efectiva de una o varias chaperoninas en cualquier composición farmacéutica aceptable de los compuestos, sus sales, profármacos o solvatos, reivindicados en 1 , 2 y 3.
7.- Un método para la proteger y regenerar las células in vitro e in vivo ante diferentes estímulos citotóxicos, caracterizado por la administración de una cantidad efectiva de una o varias chaperoninas en cualquier composición farmacéutica aceptable de los compuestos, sus sales, profármacos o solvatos, reivindicados en 1 , 2 y 3.
33
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